Artykuł metodologiczny

Ciągły nieinwazyjny pomiar czynności serca i zachowania raków

DOI:

10.3791/58555

⸱

6 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Fisheries and Protection of Waters, South Bohemian Research Center of Aquaculture and Biodiversity of Hydrocenoses, University of South Bohemia in České Budĕjovice

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia nieinwazyjny system biomonitoringu do ciągłego rejestrowania i analizowania aktywności serca i lokomotoryki raków. System ten składa się z czujnika optycznego bliskiej podczerwieni, modułu śledzenia wideo oraz oprogramowania do oceny bicia serca raków, które odzwierciedla ich stan fizjologiczny i charakteryzuje zachowanie raków podczas wahań bicia serca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak to kluczowy organizm wodny, który służy zarówno jako praktyczny model biologiczny do behawioralnych i fizjologicznych badań bezkręgowców, jak i jako użyteczny biologiczny wskaźnik jakości wody. Mimo że raki nie są w stanie bezpośrednio określić substancji, które powodują pogorszenie jakości wody, mogą natychmiast (w ciągu kilku sekund) ostrzec ludzi o pogorszeniu jakości wody poprzez gwałtowne zmiany w ich czynnościach sercowych i behawioralnych.

W tym badaniu prezentujemy nieinwazyjną metodę, która jest na tyle prosta, że można ją zastosować w różnych warunkach, dzięki połączeniu prostoty i niezawodności w jednym modelu.

To podejście, w którym organizmy biologiczne są wdrażane do procesów oceny środowiskowej, dostarcza niezawodnego i aktualnego alarmu ostrzegającego i zapobiegającego ostremu pogorszeniu jakości wody w środowisku otoczenia. W związku z tym ten nieinwazyjny system oparty na zapisach parametrów fizjologicznych i etologicznych raków został zbadany w celu wykrycia zmian w środowisku wodnym. System ten jest obecnie stosowany w lokalnym browarze do kontrolowania jakości wody używanej do produkcji napojów, ale może być używany w każdym zakładzie uzdatniania i dostarczania wody do ciągłej oceny jakości wody w czasie rzeczywistym oraz do regularnych badań laboratoryjnych fizjologii i zachowania serca raków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Temat zastosowań organizmów wodnych, zarówno jako organizmów modelowych do różnych badań laboratoryjnych1,2 jak i jako narzędzia do monitorowania jakości wody przemysłowej i naturalnej/środowiskowej3,4, wydaje się być dobrze zbadany. Niemniej jednak temat ten jest nadal godny uwagi dla ludzi, niezależnie od tego, czy należą do społeczności naukowej, czy do innych zawodów. Pomimo istnienia szeregu zaawansowanych metod monitorowania niektórych parametrów (tzw. "biomarkerów")5,6,7,8, najważniejsze wymagania dotyczące wyboru wskaźnika składają się z trzech prostych czynników: (i) prostoty, (ii) niezawodności oraz (iii) ogólnej dostępności.

Raki, jako niezbędny przedstawiciel fauny słodkowodnej, wyróżniają się tym, że występują na całym świecie, są szeroko rozpowszechnione i, w większości przypadków9, mają wystarczająco duży i twardy pancerz nadający się do manipulacji. Skorupiak ten należy do grupy wyższych bezkręgowców, które zapewniają wystarczający rozwój ważnych układów fizjologicznych i odpowiednich narządów, zachowując jednocześnie stosunkowo prostą organizację10.

Metody oparte na ocenie zakresu parametrów biologicznych i/lub behawioralnych raków, opisane w literaturze naukowej, znacząco przyczyniły się do rozwoju biomonitoringu i badań nad rakami w ogóle. Większość obecnie dostępnych inwazyjnych metod pomiaru tętna raków opiera się na zapisach elektrokardiogramu, które wymagają złożonego i precyzyjnego zabiegu chirurgicznego11,12,13; Takie manipulacje mogą powodować znaczny stres i mogą wymagać długotrwałej adaptacji raków. Nie wiadomo również, jak długo rak może nosić takie elektrody i czy z powodzeniem linieje podczas noszenia takiego mocowania. Opisane metody nieinwazyjne opierają się na zapisach pletyzmograficznych, które są skomplikowane ze względu na złożoność sprzętową i wymagają układu kondycjonującego do filtrowania sygnałów14 oraz wzmocnienia lub precyzyjnych i drogich komponentów optycznych15,16.

W tym badaniu opisaliśmy podejście, które przyczynia się do istniejących wyników i oferuje nowe alternatywy dla ulepszenia obecnych procedur pomiaru tętna raków. Wśród zalet znajdują się: (i) szybkie i nieinwazyjne mocowanie, które nie wymaga długotrwałej adaptacji fizjologicznej; (ii) zdolność raków do przenoszenia czujnika w okresie kilku miesięcy od linienia do linienia; (iii) oprogramowanie zdolne do monitorowania w czasie rzeczywistym czynności kardiologicznych i behawioralnych oraz oceny danych uzyskanych jednocześnie od wielu raków; (iv) niska cena produkcji i prostota. Opisywany przez nas system biomonitoringu pozwala na nieinwazyjne i ciągłe monitorowanie czynności serca i ruchu raków w oparciu o zmiany w cechach etofizjologicznych raków. System ten może być z łatwością stosowany w badaniach laboratoryjnych fizjologii i/lub etologii serca raków, a także we wdrożeniach przemysłowych do kontroli jakości wody w zakładach uzdatniania i zaopatrzenia w wodę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wybór raków

  1. Aby skutecznie zastosować obecne podejście do raków, wybierz odpowiednie dorosłe osobniki o wystarczających rozmiarach pancerza (czyli długości pancerza co najmniej 30 mm) do zamocowania czujnika, zbadaj go wzrokowo pod kątem braku chorób i sprawdź, czy podnosi oba chelae po dotknięciu. Powyższe parametry wskazują na kwalifikujący się stan zdrowia raków.
    nuta: Jeżeli oczekuje się, że w badaniu zostanie wykorzystanych kilka raków, które są narażone na te same warunki, grupa doświadczalna powinna zostać utworzona w oparciu o kilka parametrów: (i) podobną masę i długość; (ii) porównywalne tętno; (iii) wyraźna aktywność nocna; (iv) regularne spożywanie żywności; (v) okres między linieniami17. Czasami trudno jest określić, czy rak jest bliski linienia, na podstawie pomiarów tętna lub badań wzrokowych lub dotykowych; Dlatego pomocne mogą być analizy całkowitej zawartości białka w hemolimfie raków. Oczekuje się, że zawartość białka będzie wyższa, gdy rak jest bliżej linienia niż w stanie między linieniami18.

2. Rejestracja aktywności i zachowania serca raków

  1. Aby nieinwazyjnie zmierzyć tętno raków, należy wstępnie przygotować czujnik do tego zabiegu. Wcześniej włóż rak do zbiornika z wodą i pozwól mu się tam zaaklimatyzować przez kilka dni, ponieważ przygotowanie sensor19 również zajmie kilka dni.
    1. Sprzężenie osiowe diody elektroluminescencyjnej IR (LED) z fototranzystorem. Podłącz obwód czujnika optycznego do płytki; będzie wymagał zasilania 5 V. Aby podłączyć diodę LED, umieść rezystor 200 Ω na płytce czujnika podczerwieni; W celu podłączenia fototranzystora należy umieścić na płytce rezystor 220 Ω.
    2. Po przymocowaniu do raka wyjście czujnika jest modulowane przez ilość hemolimfy wypełniającej mięsień sercowy raka i rozprasza padające światło z diody LED. Aby uniknąć wzajemnych zakłóceń świecącego światła podczerwonego przez diodę LED i odbitego światła podczerwonego od serca raka, które jest odbierane przez fototranzystor, pomiędzy diodą LED a fototranzystorem należy umieścić małą ściankę (0,5 x 1,5 x 4 mm, grubość x wysokość x szerokość) wykonaną z czarnego antystatycznego tworzywa sztucznego.
    3. Umieść diodę LED w wodoodpornym opakowaniu i przykryj powierzchnię czujnika wodoodpornym żelem dielektrycznym od strony przylegającej do pancerza w celu ochrony elementów elektronicznych przed potencjalnym uszkodzeniem (Rysunek 1). Pozostaw żel do wyschnięcia na 3 dni, aby uzyskać jego najlepsze właściwości ochronne.
    4. W przypadku sygnału analogowego należy podłączyć cienkie elastyczne (o długości około 3 m) do czujnika i podłączyć do przetwornika analogowo-cyfrowego (ADC); z tego zdigitalizowany sygnał zostanie przesłany do komputera osobistego przez interfejs USB, w którym to momencie zapisywane są informacje o aktywności serca raków, analizowane w czasie rzeczywistym za pomocą specjalnego oprogramowania (patrz Tabela materiałów), i przechowywane do dalszych szczegółowych analiz.
  2. Jak tylko czujnik zostanie przygotowany, przymocuj go do raków. W tym celu włącz komputer i uruchom oprogramowanie. Określ liczbę raków, które mają być przymocowane do czujników, oraz zarejestrowane tętno, które ma zostać zapisane w pliku daty.
  3. Wyjmij rak z wody i wytrzyj jego grzbietową stronę pancerza ręcznikiem papierowym. Zawiń chelae i brzuch raków w ręcznik papierowy, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych ludzką ręką i wyeliminować dodatkowy stres u raków spowodowany ciepłymi ludzkimi rękami.
    nuta: Nie używaj wcześniejszego chłodzenia raków na lodzie lub w zamrażarce w celu ich unieruchomienia przed manipulacjami za pomocą nasadki czujnika. Różnica temperatur prowadzi do płaczu na grzbietowej powierzchni raków, co z kolei prowadzi do niepewnego mocowania czujnika i szybkiego odklejania się kleju od pancerza raka.
  4. Przygotuj powierzchnię (tj. weź mały płaski kawałek plastiku lub oderwij kawałek taśmy klejącej i przymocuj go do stołu) i patyczek do mieszania kleju. Wyciśnij dwie małe krople (o średnicy około 0,5 cm) z tubek A i B zawierających klej epoksydowy i szybko je wymieszaj.
  5. Przymocuj czujnik do pancerza grzbietowego raka i spróbuj znaleźć miejsce, w którym amplituda sygnału serca byłaby maksymalna. Trzymaj rak z czujnikiem w jednej ręce, a drugą wolną ręką nałóż kroplę zmieszanego kleju na każdy z czterech przewodów pomocniczych znajdujących się na czujniku (zamocuj je między krokami 2.1.1 i 2.1.4.). Nie przesuwaj czujnika co najmniej 5 minut, aż klej stwardnieje (utwardzenie kleju zależy od temperatury i wilgotności otoczenia).
    nuta: Mocując czujnik do pancerza raka, należy dokładnie zbadać cały obszar serca od strony pancerza w celu zdefiniowania obszaru o najlepszej (maksymalnej) amplitudzie sygnału serca. Pomoże to oprogramowaniu w bardziej precyzyjnych obliczeniach tętna.
  6. Dotknij kleju wolną ręką, a jeśli nie jest lepki, włóż nieowinięte raki z dołączonym czujnikiem (Rysunek 2) do pudełka bez wody na kilka minut, aż klej całkowicie wyschnie.
    nuta: Optymalna temperatura do obróbki raków i kleju waha się od 18 do 22 °C. W tych temperaturach klej twardnieje w ciągu 5 do 7 minut i całkowicie wysycha w ciągu 8 do 10 minut. W niższych temperaturach stres u raków jest mniej wyraźny; jednak klej potrzebuje więcej czasu na utwardzenie, około 15 i 20 minut odpowiednio w temperaturze 15 °C i 10 °C. W wyższych temperaturach, szczególnie powyżej 25 °C, klej twardnieje w ciągu 3 minut, ale raki są poddawane znacznie większemu stresowi; Dlatego staraj się zminimalizować narażenie skorupiaka na ekstremalne warunki bez wody.
  7. Przed przeniesieniem raka z powrotem do zbiornika zanurz jego głowotułów kilka razy w wodzie w krótkich odstępach kilku sekund, aby umożliwić odprowadzenie powietrza, które nagromadziło się w skrzelach, i pozostaw raki w wodzie na około 1 godzinę w celu usunięcia nadmiaru chemikaliów. Po zakończeniu tego procesu wypuść raki do wody i pozwól im zaaklimatyzować się przez jeden do dwóch tygodni w warunkach eksperymentalnych, w zależności od obserwowanych wskaźników fizjologicznych. Optymalna wymiana wody w okresach aklimatyzacji odbywa się co drugi dzień.
    nuta: Cechy raków, które się zaaklimatyzowały i są w dobrym stanie, obejmują wyraźną okołodobową aktywność serca i lokomotoryczną, regularne spożywanie pokarmu i spędzanie większości światła dziennego w specjalistycznym schronieniu (jeśli jest zapewnione).

3. Konfiguracja kamery i oprogramowania

  1. Uruchom oprogramowanie; kamera wideo włączy się automatycznie.
  2. Wybierz opcję wykrywania ruchu, dokładnie wykryj obszar każdego zbiornika na ekranie, a oprogramowanie zacznie śledzić zachowanie i łączyć je z zapisami aktywności serca.
    nuta: Moduł wykrywania ruchu raków składa się z kamery wideo, która śledzi zachowanie raków spod zbiornika oraz oprogramowania, które łączy to zachowanie z aktywnością serca. Dane z modułu są wykorzystywane do ułatwienia bardziej precyzyjnego przetwarzania danych dotyczących czynności serca poprzez eliminację okresów, w których rak wykazuje wysoką aktywność lokomotywy. Nagłe ruchy raków (tj. reakcja ucieczki lub rozpoczęcie karmienia) mogą powodować wahania lub krótkotrwałe skoki sygnałów sercowych, które mogą zmniejszyć precyzję obliczeń odstępów między akcjami serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W rezultacie uzyskaliśmy kombinację czynności serca i zachowania raków, nagraną i zapisaną w pliku w formacie txt (Rysunek 3). Oprócz liczby raków doświadczalnych, daty i częstotliwości próbkowania, plik składa się z trzech kolumn: (1) czasu ciągłego w formacie gg:mm:ss; (2) tętno obliczane automatycznie w uderzeniach na minutę; (3) lokomocja zarejestrowana jako brak (0) lub obecność (1) jakiegokolwiek ruchu. Gdy rak był nieaktywny, zero przypisywano do komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powszechnie sugeruje się, że pomiar pewnych parametrów fizjologicznych (takich jak tętno lub szybkość wentylacji lub jedno i drugie) jest bardziej wiarygodną metodą rejestrowania reakcji raków niż ocena reakcji behawioralnych, które nie zawsze występująnatychmiast11. Jest jednak oczywiste, że najbardziej efektywnym podejściem do oceny rzeczywistych reakcji raków na zmiany środowiskowe jest połączenie zapisów aktywności serca i zachowania, ponieważ umożliwia to dostrzeżenie przyczyny (przyczyn) zmi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej - projekty "CENAKVA" No. CZ.1.05/2.1.00/01.0024 oraz "CENAKVA II" nr LO1205 w ramach Narodowego Programu Zrównoważonego Rozwoju I, przez Agencję Grantową Uniwersytetu Południowobohemskiego w Czeskich Budziejowicach (012/2016/Z) oraz przez Agencję Grantową Republiki Czeskiej (nr 16-06498S)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dioda IR LEDKINGBRIGHT ELECTRONICKP-3216F3C
FototranzystorEVERLIGHTELPT15-21C
RezystorROYAL OHM0805S8J0201T5E
RezystorROYAL OHM0805S8F2200T5E
KondensatorKEMETC0805C334K5RACTU
TECHNOKABELFTP KAT.5E 4X2X0,14C
ZłączeHARTING21348100380005
ZłączeHARTING21348000380005
Żel dielektrycznyKRAYDENSylgard 535
Przetwornik analogowo-cyfrowyTEDIAUDAQ-1416CA
KlejKUPSITO.SK 7338723044
Kamera wideo KinectSklep ABC. CZGT3-00002
Oprogramowanie analityczneUniwersytet Południowych Czech w Czeskich Budziejowicach, Wydział Rybołówstwa i Ochrony Wód, Instytut SystemówLink do oprogramowania: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring
Nazwa użytkownika: frov
Hasło: CF2018
Złożonych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bownik, A., Sokołowska, N., Ślaska, B. Effects of apomorphine, a dopamine agonist, on Daphnia magna: Imaging of swimming track density as a novel tool in the assessment of swimming activity. Science of the Total Environment. 635, 249-258 (2018).
  2. Jeong, T. Y., Yoon, D., Kim, S., Kim, H. Y., Kim, S. D. Mode of action characterization for adverse effect of propranolol in Daphnia magna. based on behavior and physiology monitoring and metabolite profiling. Environmental Pollution. 233, 99-108 (2018).
  3. do Nascimento, M. T. L., et al. Determination of water quality, toxicity and estrogenic activity in a nearshore marine environment in Rio de Janeiro, Southeastern Brazil. Ecotoxicology and Environmental Safety. 149, 197-202 (2018).
  4. Xiao, G., et al. Water quality monitoring using abnormal tail-beat frequency of crucian carp. Ecotoxicology and Environmental Safety. 111, 185-191 (2015).
  5. Aagaard, A., Andersen, B. B., Depledge, M. H. Simultaneous monitoring of physiological and behavioral activity in marine organisms using non-invasive, computer aided techniques. Marine Ecology Progress Series. 73 (2), 277-282 (1991).
  6. Bloxham, M. J., Worsfold, P. J., Depledge, M. H. Integrated biological and chemical monitoring: in situ. physiological responses of freshwater crayfish to fluctuations in environmental ammonia concentrations. Ecotoxicology. 8 (3), 225-237 (1999).
  7. Depledge, M. H., Andersen, B. B. A computer-aided physiological monitoring system for continuous, long-term recording of cardiac activity in selected invertebrates. Comparative Biochemistry and Physiology. A, Comparative Physiology. 96 (4), 473-477 (1990).
  8. Depledge, M. H., Galloway, T. S. Healthy animals, healthy ecosystems. Frontiers in Ecology and the Environment. 3 (5), 251-258 (2005).
  9. Holdich, D. M., Reynolds, J. D., Souty-Grosset, C., Sibley, P. J. A review of the ever increasing threat to European crayfish from non-indigenous crayfish species. Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 11, 394-395 (2009).
  10. Vogt, G. Functional anatomy. Biology of freshwater crayfish. Holdich, D. M. , Blackwell Science. Oxford, UK. 53-151 (2002).
  11. Bierbower, S. M., Cooper, R. L. Measures of heart and ventilatory rates in freely moving crayfish. Journal of Visualized Experiments. (32), e1594(2009).
  12. Li, H., Listerman, L. R., Doshi, D., Cooper, R. L. Heart rate in blind cave crayfish during environmental disturbances and social interactions. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 127 (1), 55-70 (2000).
  13. Listerman, L. R., Deskins, J., Bradacs, H., Cooper, R. L. Heart rate within male crayfish: social interactions and effects of 5-HT. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 125 (2), 251-263 (2000).
  14. Burnett, N. P., et al. An improved noninvasive method for measuring heartbeat of intertidal animals. Limnology and Oceanography: Methods. 11 (2), 91-100 (2013).
  15. Fedotov, V. P., Kholodkevich, S. V., Strochilo, A. G. Study of contractile activity of the crayfish heart with the aid of a new non-invasive technique. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 36 (3), 288-293 (2000).
  16. Kholodkevich, S. V., Ivanov, A. V., Kurakin, A. S., Kornienko, E. L., Fedotov, V. P. Real time biomonitoring of surface water toxicity level at water supply stations. Environmental Bioindicators. 3 (1), 23-34 (2008).
  17. Kuznetsova, T. V., Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Evaluation of functional state of crayfish Pontastacus leptodactylus in normal and toxic environment by characteristics of their cardiac activity and hemolymph biochemical parameters. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 46 (3), 241-250 (2010).
  18. Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Total protein in hemolymph of crawfish Pontastacus leptodactylus as a parameter of the functional state of animals and a biomarker of quality of habitat. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 47 (2), 160-167 (2011).
  19. Pautsina, A., Kuklina, I., Štys, D., Císař, P., Kozák, P. Noninvasive crayfish cardiac activity monitoring system. Limnology and Oceanography: Methods. 12 (10), 670-679 (2014).
  20. Císař, P., Saberioon, M., Kozák, P., Pautsina, A. Fully contactless system for crayfish heartbeat monitoring: Undisturbed crayfish as bio-indicator. Sensors and Actuators B: Chemical. 255, 29-34 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Crayfish Cardiac ActivityNoninvasive MonitoringWater Quality EvaluationBehavioral Activity TrackingNear Infrared SensorImage Processing AnalysisHeart Rate MeasurementMovement Detection SystemEnvironmental BiomonitoringCrustacean Physiology

Powiązane artykuły