Artykuł metodologiczny

Model wysięku opłucnowego u szczurów przez dotchawicze wkroplenie poliakrylanu/nanokrzemionki

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58560

⸱

12 kwietnia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Ultrasound Medicine, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, 2Department of Occupational Medicine & Clinical Toxicology, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, 3Department of Emergency, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do budowy modelu wysięku opłucnowego u szczurów poprzez dotchawcze wkroplenie poliakrylanu/nanokrzemionki.

Streszczenie

Wysięk opłucnowy jest powszechnym objawem klinicznym wielu chorób płuc. Posiadanie użytecznego zwierzęcego modelu wysięku opłucnowego jest bardzo ważne do badania tych chorób płuc. Poprzednie modele wysięku opłucnowego zwracały większą uwagę na czynniki biologiczne niż na nanocząstki w środowisku. W tym miejscu przedstawiamy model wytwarzania wysięku opłucnowego u szczurów poprzez dotchwiarskie wkraplanie poliakrylanu/nanokrzemionki oraz metodę izolacji nanocząstek w wysięku opłucnowym. Po dotchawczym wkropleniu poliakrylanu/nanokrzemionki o stężeniach 3,125, 6,25 i 12,5 mg/kg∙mL, wysięk opłucnowy u szczurów prezentowany w dniu 3 osiągnął szczyt w dniach 7-10 w grupach 6,25 i 12,5 mg / kg∙ml, a następnie powoli zmniejszał się i zniknął w dniu 14. Gdy stężenie poliakrylanu/nanokrzemionki wzrasta, wysięk opłucnowy jest wytwarzany szybciej i szybciej. Ten płyn opłucnowy został wykryty w badaniu ultrasonograficznym lub tomografii komputerowej klatki piersiowej i potwierdzony przez sekcję szczurów. Nanocząstki krzemionki obserwowano w wysięku opłucnowym szczurów za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Wyniki te wykazały, że narażenie na poliakrylan / nanokrzemionkę prowadzi do indukcji wysięku opłucnowego, co było zgodne z naszym poprzednim raportem u ludzi. Ponadto model ten jest korzystny dla dalszych badań nad nanotoksykologią i chorobami związanymi z wysiękiem opłucnowym.

Wprowadzenie

Wysięk opłucnowy jest bardzo częstym objawem klinicznym chorób płuc o różnych przyczynach. Posiadanie użytecznego zwierzęcego modelu wysięku opłucnowego jest bardzo ważne do badania tych chorób płuc, roli dwóch warstw błony opłucnej, mechanizmów wysięku opłucnowego i jego leczenia. Jednak niektóre zgłoszone modele wysięku opłucnowego koncentrują się głównie na złośliwym wysięku opłucnowym lub czynnikach biologicznych, a nie na nanocząstkach w środowisku1,2. Tutaj wprowadzamy nowy model wysięku opłucnowego, który jest prosty, bezpieczny i skuteczny.

Wraz z rozwojem nanotechnologii i szerokim zastosowaniem nanoproduktów, istnieje obawa o potencjalne zagrożenia nanomateriałów dla środowiska i zdrowia ludzkiego3,4. Nanomateriały wprowadzają czynniki ryzyka i potencjalnie prowadzą do nowych zagrożeń w miejscu pracy lub poprzez zanieczyszczenie środowiska. Badania in vitro i in vivo pokazują, że nanomateriały mogą powodować wielonarządowe uszkodzenia płuc, serca, wątroby, nerek i układu nerwowego, a także układu rozrodczego i odpornościowegos5,6. Ponadto niektóre badania wykazały, że specyficzna toksyczność nanomateriałów wynika z ich unikalnych właściwości fizykochemicznych3,4,7.

Informowaliśmy, że grupa pracowników z zawodowym narażeniem na nanomateriały klinicznie wystąpiła u grupy pracowników z wysiękiem opłucnowym i osierdziowym, zwłóknieniem płuc i ziarniniakiem8,9. Nanocząstki krzemionki wyizolowano w wysięku opłucnowym tych pacjentów9. W celu odtworzenia i zweryfikowania wysięku opłucnowego wywołanego przez wdychane nanocząstki u ludzi, przeprowadziliśmy eksperyment, wkraplając poliakrylan / nanokrzemionkę (PA / NPSi) przez drogi oddechowe u szczurów, które naśladowały oddychanie człowieka w rzeczywistym środowisku i stwierdziliśmy, że dotchawicze wkroplenie PA / NPSi może powodować wysięk opłucnowy u szczurów. Tutaj przedstawiamy, jak wywołać wysięk opłucnowy u szczurów przez dotchawicze wkroplenie PA / NPSi i jak wyizolować nanocząstki w wysięku opłucnowym. Model ten może być przydatny do dalszych badań nad nanotoksykologią i chorobami wysięku opłucnowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie było zgodne z wytycznymi Stołecznego Uniwersytetu Medycznego (Pekin, PR Chiny) dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt doświadczalnych. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Stołecznego Uniwersytetu Medycznego w Chinach.

1. Przygotowania eksperymentalne

UWAGA: Zaaklimatyzuj samice szczurów Wistar wolne od patogenów (waga: 200 ± 10 g) do środowiska eksperymentalnego na tydzień przed podaniem (Warunki środowiskowe: jasne/ciemne:12h/12h, temperatura 22 ± 2 °C, wilgotność 50 ± 10%).

  1. Użyj świeżych 10 ml zawiesin PA/NPSi (nanokrzemionka Ø:20 ± 5 nm metodą polimeryzacji emulsyjnej in situ) rozcieńczonych w roztworze soli fizjologicznej w stężeniach odpowiednio 3,125, 6,25 i 12,5 mg/ml10. Przed podaniem należy sonikować zawiesiny przez 20-30 minut i wirować przez 10 minut, aby zapobiec agregacji nanocząstek.
  2. Równo podziel w sumie 20 szczurów na cztery grupy: jedna grupa dla każdego stężenia PA / NPSi (0, 3,125, 6,25 i 12,5 mg / ml).
  3. Aby je znieczulić, umieść szczury w zamkniętym pojemniku z 1,5 ml eteru (99,5%) lub innymi protokołami zatwierdzonymi przez IACUC. Po 60-90 s znieczulenia sprawdź, czy nie ma reakcji na odruch pedałowania. Upewnij się, że szczury oddychają.
  4. Połóż znieczulonego szczura na desce i przymocuj jego przednie zęby za pomocą wysterylizowanej linki nylonu również na desce.
  5. Otwórz usta i odsłoń szczelinę głośni za pomocą kleszczy chirurgicznych i soczewki czołowej.
  6. Wkraplanie szczurom 0,5 ml zawiesiny PA/NPSi do płuc każdego szczura w sumie 1 ml za pomocą cienkiej probówki ze sterylizowaną igłą do obustronnego oskrzela.
  7. Umieść szczury na plastikowej desce w pozycji leżącej na plecach i pozwól szczurom powoli dojść do siebie w ciągu 5-10 minut.

2. Badanie ultrasonograficzne w kierunku wysięku opłucnowego

  1. Użyj systemu ultrasonograficznego z przetwornikiem liniowym (częstotliwość: 8 MHz) do badania szczurów w dniach 1, 3, 7 i 1410.
  2. Podać szczurom znieczulenie (10% hydrat chloralu, 0,35 ml/100 g, i.p.) i sprawdzić, czy nie ma odruchów pedałowania.
  3. Usuń włosy z klatki piersiowej i górnej części brzucha szczurów za pomocą golarki elektrycznej. Następnie umieść szczura na płycie montażowej w pozycji leżącej.
  4. Pokryj skórę pokrytym żelem, a następnie umieść przetwornik w przestrzeni międzyżebrowej i obszarze podżebrowym, aby wykryć płyn opłucnowy.
    UWAGA: W celu dokładnego wykrycia wysięku, do wykonania badania ultrasonograficznego wybrano lewą i prawą pozycję boczną.
  5. Po badaniu ultrasonograficznym połóż szczura na plastikowej desce w pozycji leżącej na plecach i pozwól szczurom powoli dojść do siebie w ciągu 10 minut.

3. Tomografia komputerowa klatki piersiowej w kierunku wysięku opłucnowego

  1. W 7 i 14 dniu po podaniu znieczulić szczury 10% hydratem chloralu (i.p). Uznaj to za wystarczającą głębokość znieczulenia, gdy szczur nie reaguje na odruchy pedałowania.
    UWAGA: Dzień 7 po podaniu to najodpowiedniejszy czas na obserwację wysięku opłucnowego za pomocą tomografii komputerowej.
  2. Umieść szczura na plastikowym arkuszu w pozycji leżącej, a następnie zeskanuj jego klatkę piersiową, aby zbadać wysięk opłucnowy za pomocą 64-kanałowej tomografii komputerowej. Użyj następujących ustawień: konfiguracja detektora 64 mm x 0,625 mm, 120 kV (szczyt) i 350 mAs.

4. Zbieranie wysięku opłucnowego i izolacja nanocząstek w wysięku opłucnowym

  1. Po tomografii komputerowej klatki piersiowej szczurów i w znieczuleniu wodzianem chloralu sprawdź odruch pedałowania u szczurów, zgol włosy od brzucha do klatki piersiowej, a następnie zdezynfekuj skórę jodem.
  2. Przyprowadź szczury na salę operacyjną.
  3. W znieczuleniu szybko przetnij 1-1,5 cm skóry i mięśni brzucha do mieczykowatej wzdłuż linii środkowej z nienaruszoną przeponą.
  4. Ostrożnie otwórz klatkę piersiową i sprawdź obustronne jamy opłucnej za pomocą pęsety, zwłaszcza obustronne żebrowe kąty przeponowe. Zebrać 1-2 ml jasnożółtego wysięku opłucnowego za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 2 ml.
  5. Po zakończeniu poświęć szczury za pomocą protokołu zatwierdzonego przez IACUC.
  6. Odwirować wysięk opłucnowy w probówce o pojemności 2 ml przez 15 minut przy sile 300 x g w celu wyizolowania nanocząstek.
  7. Użyj kropli górnej warstwy, która jest jasną cieczą i obserwuj pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (TEM) przy napięciu przyspieszającym 60-80 kV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Za pomocą USG klatki piersiowej stwierdzono brak wysięku opłucnowego w 1. dniu we wszystkich grupach. Jednak w 3. dniu wysięk opłucnowy pojawił się w grupach 6,25 i 12,5 mg/kg∙mL. Wysięk występował głównie w prawym kącie przeponowo-żebrowym, podczas gdy wysięk osierdziowy wystąpił tylko w grupie 12,5 mg/kg∙mL. Ponadto w 7. dniu zarówno wysięk opłucnowy (Video 1), jak i wysięk osierdziowy (Video 2) zostały wykryte w grupie 6,25 mg/kg∙mL (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ultrasonografia jest najwygodniejszym narzędziem do określania chorób płuc, ze względu na doskonałą wrażliwość na wolny płyn w jamie opłucnej11. Dzieje się tak, ponieważ ultrasonografia może natychmiast wykryć kontrast impedancji akustycznej powietrza i płynów w płucach12. Poza tym ultrasonografia jest bardziej elastyczna w modelu małego zwierzęcia niż tomografia komputerowa. Niemniej jednak powietrze w płucach odbijało falę dźwiękową i utrudniało obserwację zmian wewnątrzp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Obecne badania i produkcja tego artykułu zostały sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant 81773373, 81172614 i Grant 81441089). Dziękujemy Dr. Jin Yan i Dr. Pan Yujie, z Oddziału Ratunkowego Szpitala Beijing Chaoyang oraz Dr. Qu Peng z Oddziału Medycyny Ultrasonograficznej Szpitala Beijing Chaoyang za pomoc w produkcji filmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System ultrasonograficzny Acuson S2000 z kolorowym doppleremSiemens Medical Solutions, Mountain View, CA&
nbsp; Poliakrylan / nanokrzemionkaFudan University, Szanghaj, Chinywykonane na zamówienie z nanokrzemionki (20± 5) nm
10% hydrat chloraluBeijing Chemical Works302-17-0
Prędkość światła 16 spiralna tomografia komputerowaGE Healthcare, USA
Specyficzne wolne od patogenówCentrum Zwierząt Wistar w Lianhelihua (Pekin, Chiny)Szczury Wistar

Bibliografia

  1. Stathopoulos, G. T., et al. Nuclear factor-kappaB affects tumor progression in a mouse model of malignant pleural effusion. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (2), 142-150 (2006).
  2. Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
  3. Nel, A., Xia, T., Mädler, L., Li, N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science. 311 (5761), 622-627 (2006).
  4. Maynard, A. D., et al. Safe handling of nanotechnology. Nature. 444 (7117), 267-269 (2006).
  5. Duan, J., et al. Toxic effects of silica nanoparticles on zebrafish embryos and larvae. PLoS One. 8 (9), 74606(2013).
  6. Skuland, T., Ovrevik, J., Låg, M., Schwarze, P., Refsnes, M. Silica nanoparticles induce cytokine responses in lung epithelial cells through activation of a p38/TACE/TGF-α/EGFR-pathway and NF-κΒ signaling. Toxicology and Applied Pharmacology. 279 (1), 76-86 (2014).
  7. Oberdörster, G., Oberdörster, E., Oberdörster, J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 823-839 (2005).
  8. Song, Y., Li, X., Du, X. Exposure to nanoparticles is related to pleural effusion, pulmonary fibrosis and granuloma. European Respiratory Journal. 34 (3), 559-567 (2009).
  9. Song, Y., et al. Nanomaterials in humans: identification, characteristics, and potential damage. Toxicologic Pathology. 39 (5), 841-849 (2011).
  10. Zhu, X., et al. Polyacrylate/nanosilica causes pleural and pericardial effusion, and pulmonary fibrosis and granuloma in rats similar to those observed in exposed workers. International Journal of Nanomedicine. 11, 1593-1605 (2016).
  11. Havelock, T., et al. Pleural procedures and thoracic ultrasound: British Thoracic Society Pleural Disease Guideline 2010. Thorax. 65, Suppl 2 61-76 (2010).
  12. Jha, A., Ullah, E., Gupta, P., Gupta, G., Saud, M. Sonography of multifocal hydatidosis involving lung and liver in a female child. Journal of Medical Ultrasound. 40 (4), 471-474 (2013).
  13. Hikaru, N., et al. Histological analysis of 70-nm silica particles-induced chronic toxicity in rats. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 626-629 (2009).
  14. Sun, L., et al. Cytotoxicity and mitochondrial damage caused by silica nanoparticles. Toxicology in Vitro. 25, 1619-1629 (2011).
  15. Hikaru, N., et al. Silica nanoparticles as hepatotoxicants. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 496-501 (2009).
  16. Liu, T. I., et al. Single and repeated dose toxicity of mesoporous hollow silica nanoparticles in intravenously exposed mice. Biomaterials. 32, 1657-1668 (2011).
  17. Ding, M., et al. Diseases caused by silica: Mechanisms of injury and disease development. International Immunopharmacology. 2, 173-182 (2002).
  18. Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
  19. Ji, J. H., et al. Twenty-eight-day inhalation toxicity study of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhalation Toxicology. 19 (10), 857-871 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model szczurzybadanie ultrasonograficznetomografia komputerowa klatki piersiowejtransmisyjna mikroskopia elektronowaizolacja nanocz steczekwykrywanie p ynu op ucnowegobadanie z zakresu nanotoksykologii

Powiązane artykuły