Artykuł metodologiczny

In vitro Test do badania agregacji białka tau i badań przesiewowych leków

21.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58570

⸱

20 listopada 2018

 ,  , 
1Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson

W tym artykule

Podsumowanie

Test agregacji tau opisany w tym manuskrypcie naśladuje przewidywane cechy błędnego fałdowania i agregacji tau in vivo.

Streszczenie

Agregacja białka tau i tworzenie par spiralnych włókien jest cechą charakterystyczną choroby Alzheimera i innych tauopatii. W porównaniu z innymi białkami związanymi z chorobami neurodegeneracyjnymi, kinetyka agregacji in vitro białka tau jest mniej spójna, co daje stosunkowo dużą zmienność. W tym miejscu opisujemy rozwój testu agregacji in vitro, który naśladuje oczekiwane etapy związane z nieprawidłowym fałdowaniem i agregacją tau in vivo. W teście wykorzystuje się najdłuższą izoformę tau (huTau441), która zawiera zarówno N-końcowe wstawki kwasowe, jak i cztery domeny wiążące mikrotubule (MBD). Agregacja in vitro jest wywoływana przez dodanie heparyny, a następnie w sposób ciągły następuje fluorescencja tioflawiny T w 96-dołkowym formacie mikropłytki. Test agregacji tau jest wysoce powtarzalny między różnymi studzienkami, seriami doświadczalnymi i partiami białka. Agregacja prowadzi do morfologii podobnej do tau PHF, która jest bardzo skuteczna w zasiewaniu tworzenia struktur fibrylarnych de novo. Oprócz zastosowania w badaniu mechanizmu nieprawidłowego fałdowania i agregacji tau, obecny test jest solidnym narzędziem do badań przesiewowych leków, które mogą zakłócać patogenezę tau.

Wprowadzenie

Choroba Alzheimera jest wyniszczającym zaburzeniem neurodegeneracyjnym, które jest histopatologicznie definiowane przez nagromadzenie zewnątrzkomórkowych blaszek starczych zagregowanego beta-amyloidu 1 i wewnątrzkomórkowych splątków neurofibrylarnych zawierających zagregowane hiperfosforylowane białko tau2. Fizjologiczne tau jest monomeryczne i prezentowane jako sześć unikalnych izoform zawierających 0-2 N końcowe inserty i 3 lub 4 domeny wiążące mikrotubule3,4 powstające w wyniku alternatywnego splicingu i średnio 2-3 fosforylacji. Uważa się, że hiperfosforylacja, nieprawidłowe fałdowanie i samoagregacja w struktury fibrylarne stanowią kluczowe elementy patogenezy tau, co patologicznie ocenia się u osób z demencją5,6.

Zagregowane neurofibrylarne sploty tau są znakiem rozpoznawczym nie tylko AD, ale także innych tauopatii, w tym zwyrodnienia płata czołowo-skroniowego (FTLD), choroby Picka, postępującego porażenia nadjądrowego (PSP), otępienia czołowo-skroniowego (FTD) i pierwotnej tauopatii związanej z wiekiem (PART)2. Z biochemicznego punktu widzenia zrozumienie mechanizmu nieprawidłowego fałdowania i agregacji tau może rzucić światło na patologiczne procesy związane z AD i innymi tauopatiami. Oprócz aspektu naukowego, solidne testy agregacji in vitro są cennymi narzędziami do badań przesiewowych kandydatów na leki7,8,9,10. Uważa się, że agregacja tau następuje w procesie polimeryzacji zależnej od zarodkowania (NDP)11,12,13,14. Kinetyka NDP jest sigmoidalna i rozpoczyna się od niekorzystnego energetycznie etapu zarodkowania, po którym następuje szybki energetycznie proces agregacji.

W przeciwieństwie do innych białek amyloidogennych, w tym białka prionowego, beta amyloidu i α-synukleiny, tau nie agreguje się spontanicznie w warunkach fizjologicznych i nawet ekstremalne pH lub wysokie temperatury nie sprzyjają agregacji15. Jest to najprawdopodobniej spowodowane oddziaływaniami hydrofilowymi obecnymi w granicy faz agregacji tau. Jednak tau agreguje efektywnie w stężeniach fizjologicznych, gdy używane są induktory, takie jak heparyna16 lub inne polianiony17,18.

Poprzednie próby stworzenia testów agregacji tau in vitro rzuciły nieco światła na szczegóły nieprawidłowego fałdowania i agregacji tau, ale nie udało im się naśladować tego, co uważa się za kinetykę agregacji tau in vivo. W większości przypadków kinetyka agregacji tau nie miała początkowej fazy opóźnienia związanej z zarodkowaniem tau. Mogło to być konsekwencją stosowania bardzo wysokich stężeń białka tau, obecności agregatów w wyjściowych preparatach białka tau i/lub stosowania fragmentów tau o znacznie wyższej skłonności do agregacji niż bardziej fizjologiczne białko tau o pełnej długości19,20,21,22,23. Ponadto wcześniejsze badania nie zajmowały się aspektem odtwarzalności i odporności kinetyki agregacji tau.

Tutaj opisujemy solidny test agregacji tau in vitro, który naśladuje główne cechy polimeryzacji zależnej od zarodkowania, z początkową fazą opóźnienia odpowiadającą zarodkowi tau, po której następuje faza wzrostu wykładniczego. Co więcej, wytworzone rekombinowane agregaty tau mają charakter fibrylarny i niezwykle wysoką siłę wysiewu. Test jest wysoce powtarzalny również między partiami tau i stanowi cenne narzędzie do badań przesiewowych pod kątem inhibitorów agregacji.

Protokół

1. Przygotowanie odczynnika

  1. Bufor reakcyjny
    1. Przygotować bufor reakcyjny: 0,5 mM TCEP w PBS, pH 6,7 rozpuszczając suchy proszek TCEP (MW = 286,65 g/mol) w roztworze PBSstock, pH 7,4,
      UWAGA: Obecność TCEP wynika z badań agregacji pomostowej z użyciem białka tau typu dzikiego, które zawiera cysteiny. W obecnym protokole TCEP jest używany tylko do regulacji pH PBS z 7,4 do 6,7 i nie odgrywa żadnej roli w regulacji jakichkolwiek reakcji redoks.
    2. Dokładnie wymieszaj i przefiltruj roztwór przez sterylny filtr membranowy PES o porach 0,22 μm.
    3. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. Rozmrozić na ławce i ustabilizować w temperaturze pokojowej przed użyciem.
  2. huTau441 powiedział:
    1. Usuń huTau441 (w celu ekspresji i oczyszczania białek patrz Apetri i wsp.24) od -80 °C zamrażarki.
    2. Rozmrozić na ławce i zrównoważyć do temperatury pokojowej (RT).
    3. Wiruj probówkę z białkiem przez 5 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 20-25 °C, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.
    4. Zmierz stężenie huTau441 przez absorpcję przy 280 nm przy użyciu współczynnika ekstynkcji 0,31 ml mg-1 cm-1
  3. Tioflawina T
    1. Przygotować 500 μM roztwór podstawowy tioflawiny T (ThT), rozpuszczając 10 mg suchego proszku ThT (MW = 318,86 g/mol) w 35 ml buforze reakcyjnym.
    2. Dokładnie wymieszaj, wiruj 3 razy przez 20 sekund z maksymalną prędkością i przefiltruj roztwór przez sterylny filtr membranowy PES o wielkości porów 0,22 μm.
    3. Określić stężenie na podstawie pomiarów absorpcji przy 411 nm przy współczynniku ekstynkcji 22 000 M-1 cm-1 i dostosować stężenie ThT do 500 μM. Przechowywać w temperaturze pokojowej w temperaturze pokojowej z dala od światła. Przygotowuj świeże co 2 miesiące.
  4. heparyna
    1. Przygotować świeży roztwór heparyny o stężeniu 55 μM, rozpuszczając 1 mg suchego proszku heparyny HMW (MW = 17-19 kDa) w 1 ml buforze reakcyjnym w temperaturze pokojowej.
    2. Wstrząśnij energicznie i wiruj 2 razy przez 5 sekund.
    3. Przefiltruj roztwór przez sterylny filtr membranowy PES o wielkości porów 0,20 μm (strzykawka).

2. Test agregacji ThT w trybie ciągłym na wielomodowym czytniku mikropłytek

UWAGA: Barwnik ThT jest dodawany do reakcji w celu monitorowania kinetyki agregacji huTau441 w trybie ciągłym (pomiary automatyczne). Chociaż reakcję można śledzić za pomocą zwykłego fluorometru przy użyciu konwencjonalnej kuwety, ręczny charakter operacji ogranicza częstotliwość pomiarów i pogarsza dokładność rejestrowanych krzywych kinetycznych. Z tego powodu stosowany jest automatyczny wielomodowy czytnik mikropłytek.

  1. Konfiguracja instrumentu
    1. Włącz komputer i wielomodowy czytnik mikropłytek. Pozwól sprzętowi ustabilizować się przez 10 minut.
    2. Uruchom oprogramowanie i przygotuj protokół.
      1. Wybierz typ protokołu: protokół standardowy (redukcja danych jest wykonywana niezależnie dla każdej płyty).
      2. Ustaw temperaturę na 37 °C i wybierz podgrzewanie wstępne przed kontynuowaniem protokołu.
      3. Ustaw bieg kinetyczny: Czas pracy 50 h / Interwał pomiaru: 15 min.
      4. Ustaw wytrząsanie orbitalne na 425 cpm (3 mm) w trybie ciągłym.
      5. Wybierz metodę odczytu: Intensywność fluorescencji - Punkt końcowy/Kinetyka - Monochromatory Długości fal: Wzbudzenie 440 nm (pasmo 20 nm)/ Emisja 485 nm (pasmo 20 nm) - Pozycja optyki: Góra - Normalna prędkość odczytu - Wysokość odczytu: 4,50 mm
      6. Uruchom przebieg przy użyciu utworzonego protokołu. Nazwij eksperyment, wybierz miejsce docelowe nowo utworzonego pliku i pozwól instrumentowi na wstępne wyrównanie do żądanej temperatury.
  2. Spontaniczna konwersja huTau441
    1. Przygotować próbkę reakcyjną w probówce o pojemności 1,5 ml. Użyć 200 μl mieszaniny na reakcję i co najmniej 4 kontrpróby (objętość reakcji na 4 kontrpróby = 800 μl).
    2. Przygotować 800 μl próbki reakcyjnej (w przypadku 4 kontrprób) zawierającej 15 μM huTau441, 8 μM heparyny i 50 μM ThT. Rozpocząć od wymieszania białka z buforem reakcyjnym, dodać heparynę i ThT i dobrze wymieszać, pipetując 5 razy w górę i w dół. Przestrzegaj wskazanej kolejności dodawania odczynnika.
    3. Wiruj próbki w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 25 °C przez 5 minut, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.
    4. Dozować 200 μl próbki reakcyjnej na studzienkę do 96-dołkowych mikropłytek (96-dołkowa stała mikropłytka, objętość studzienki 360 μl, płaskie dno). Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    5. Uszczelnij mikropłytkę, aby uniknąć parowania.
    6. Umieść mikropłytkę w wielomodowym czytniku mikropłytek i rozpocznij pomiary.
    7. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij płytkę ze sprzętu i wyeksportuj dane do oprogramowania do przetwarzania danych.
  3. Kontrola jakości konwersji, zbioru i przechowywania nasion.
    1. Usunąć uszczelniacz z płytki i zebrać różne kontrpróby w probówkach o pojemności 1,5 ml. Dobrze wymieszać zagregowaną próbkę w studzienkach, pipetując 2 razy w górę i w dół przed jej pobraniem. Kruszywa mają tendencję do osadzania się na dnie studni.
    2. Dokładnie wymieszać w probówce o pojemności 1,5 ml, pipetując 5 razy w górę i w dół, a następnie dozować 10-20 μl na powierzchnię miki w celu analizy agregatów za pomocą AFM (więcej informacji można znaleźć w Apetri i wsp.24).
    3. Zbierz kruszywa, obracając probówkę o pojemności 1,5 ml w temperaturze 20 000 x g i temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Agregaty tworzą granulkę.
    4. Oddzielić i przeanalizować supernatant za pomocą S-MALS w celu potwierdzenia braku monomerycznego tau w próbce, co wskazuje na udaną konwersję na agregaty (więcej szczegółów patrz Apetri i wsp.24).
    5. Oznaczyć probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą pozostałe agregaty (osady), wskazując początkowe stężenie białka huTau441 i objętość próbki. Kruszywa należy zamrozić błyskawicznie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Reakcja z nasionami
    1. Usuń agregaty huTau441 z zamrażarki -80 °C. Dodać objętość buforu reakcyjnego wskazaną na etykiecie (początkowa objętość próbki) i pozwolić probówce ustabilizować się do temperatury pokojowej. Zawiesić kruszywa, pipetując w górę i w dół 5 do 8 razy.
    2. Poddać sonifikację zagregowanej próbki. W przypadku próbki o objętości 200 μL (15 μM huTau441), sonikować na lodzie za pomocą mikrokońcówki 1/8" (od 100 μL do 10 ml) przez łączny okres 15 s, używając impulsów 1 s i przerw 2 s przy amplitudzie 30% (sonikator 250 watów). Ponownie zrównoważ próbkę do RT.
      UWAGA: Zastosowane warunki sonikacji prowadzą do jednorodnej populacji włókienek tau o długości 20-50 nm24.
    3. Przygotować próbkę reakcyjną w probówkach o pojemności 1,5 ml. Użyć 200 μl mieszaniny na reakcję i co najmniej 4 kontrpróby (objętość reakcji na 4 kontrpróby = 800 μl).
    4. Przygotować 800 μl próbki reakcyjnej zawierającej 15 μM huTau441, 8 μM heparyny i 50 μM ThT. Rozpocząć od wymieszania białka z buforem reakcyjnym, dodać heparynę i ThT i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół 5 razy. Przestrzegaj wskazanej kolejności dodawania odczynnika.
    5. Wiruj próbki w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 25 °C przez 5 minut, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.
    6. Dozować 200 μl próbki reakcyjnej na studzienkę do 96-dołkowej (96-dołkowa stała mikropłytka, objętość 360 μl, płaskie dno). Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    7. Dokładnie homogenizować wstępnie uformowaną próbkę włókienki poprzez powtarzalne pipetowanie w górę i w dół (5 razy) i dodać do każdej studzienki ilość odpowiadającą pożądanemu procentowi nasion. Dla całkowitej objętości studzienki 200 μl, 2 μl dodatku wstępnie uformowanych nasion to 1% (v/v). Mieszać, pipetując w górę i w dół 3 razy podczas dodawania do dołka i unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    8. Uszczelnij mikropłytkę, aby uniknąć parowania.
    9. Umieść mikropłytkę w wielomodowym czytniku mikropłytek i rozpocznij pomiary.
    10. Usuń płytę z urządzenia i wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego.

Wyniki

Rekombinowane białko huTau441 zawierające mutacje C291A i C322A oraz N-końcowy znacznik His i C-końcowy znacznik C zostało wyekspresowane i oczyszczone zgodnie z wcześniejszym opisem24. Partie huTau441 są wysoko czyste, co potwierdzono w analizie SDS-PAGE, oraz wirtualnie w 100% monomeryczne w ocenie S-MALS (Rycina 1). Agregację 15 µM huTau441 indukowano poprzez dodanie 8 µM heparyny HMW, a reakcję monitorowano w sposób ciągły za pomocą fluorescencji ThT przy użyciu wielofunkcyjnego czytnika mikropłytek. Długość fali wzbudzenia wynosiła 440 nm (szerokość pasma 20 nm), natomiast emisję mierzono przy 485 nm (szerokość pasma 20 nm). Test jest wysoko powtarzalny, a wyniki z 10 poszczególnych dołków są praktycznie nieodróżnialne (Rycina 2A). Morfologię agregatów huTau441 wykazujących dodatni wynik z ThT oceniono po 50 h za pomocą AFM. Zagregowane huTau441 stanowi homogeniczną mieszaninę struktur włóknistych o różnej długości, podobnych do opisanych morfologii ex vivo (Rycina 2B). Ponadto końcowa mieszanina reakcyjna nie zawiera monomeru, co sugeruje pełną konwersję w agregaty, jak wykazano w pomiarach S-MALS (Rycina 2C). Kinetyka agregacji huTau441 w niezależnych seriach eksperymentalnych jest bardzo podobna, co podkreślają zbliżone krzywe sigmoidalne oraz nieodróżnialne fazy lag i wzrostu (Rycina 3). Wysoki poziom powtarzalności jest zachowany przy użyciu różnych partii białka (Rycina 4). Co więcej, uprzednio utworzone agregaty huTau441 są bardzo wydajne w rekrutowaniu monomerów tau i indukowaniu tworzenia agregatów tau de novo. Ilości tak niskie jak 0,0025% (v/v) uprzednio utworzonych agregatów tau są w stanie pominąć etap nukleacji i wywołać generowanie włókien de novo (Rycina 5).

Wyniki oczyszczania białka; żel SDS-PAGE i wykres chromatografii wykluczania molekularnego; analiza molekularna.
Rycina 1: Rekombinowany huTau441 jest monomeryczny i wysoce czysty. A) Ocena czystości w warunkach denaturujących na żelu SDS-PAGE 4-12%, obejmująca marker masy cząsteczkowej białek (w kDA) (ścieżka 1); przelew z końcowego etapu oczyszczania powinowactwem do znacznika C (ścieżka 2); frakcja płukania kolumny (ścieżka 3), eluowany pik białka huTau441, odpowiednio przed (ścieżka 4) i po wymianie buforu (ścieżka 5). B) Analiza S-MALS białka huTau441. Białko wykazuje > 99,9% formy monomerycznej o masie molowej 51 kDa i nie zawiera agregatów ani fragmentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Kinetyka fluorescencji, włókna amyloidowe i chromatografia UV; wykres, obraz mikroskopowy i wykres kropkowy.
Rycina 2: Agregacja rekombinowanego huTau441 jest wysoce powtarzalna i prowadzi ilościowo do powstania struktur włóknistych. A) Kinetyka agregacji huTau441 indukowanej heparyną, monitorowana w sposób ciągły w formacie mikropłytek 96-dołkowych za pomocą fluorescencji ThT. Stężenia huTau441 i heparyny wynoszą odpowiednio 15 µM i 8 µM. 10 poszczególnych krzywych odpowiada konwersji tej samej partii białka w dziesięciu dołkach tej samej mikropłytki i charakteryzują się średnią (z SD) fazą lag wynoszącą 14,2 ± 0,38 h oraz t50 wynoszącym 18,8 ± 0,40 h. Dane kinetyczne dopasowano do 5-parametrowej krzywej logistycznej z liniowym spadkiem górnej asymptoty. Fazę lag i t50 obliczono poprzez interpolację między wartościami przewidywanymi za pomocą regresji liniowej. Fazę lag obliczono na podstawie 3% wzrostu sygnału fluorescencji ThT. Dopasowanie krzywych i statystyki podsumowujące zostały uzyskane przy użyciu oprogramowania IBM SPSS statistics wersja 20.0.0.2. B). Agregaty tau wykazują morfologię typu PHF, co wskazują obrazy AFM po 50 h; C). Analiza S-MALS monomerów huTau441 (t = 0 h) oraz nadosadu mieszaniny reakcyjnej po zakończeniu reakcji (t = 50 h). W punkcie czasowym 50 h mieszaninę reakcyjną wirowano przez 1 h przy 20,000 X g i 4 ˚C, a otrzymany nadosad wstrzyknięto do S-MALS. Zanik piku monomeru potwierdza całkowitą agregację białka tau. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy intensywności fluorescencji; Próba 1 i Próba 2; czas vs intensywność; analiza fałdowania białek.
Rysunek 3: Test agregacji tau wykazuje wysoką powtarzalność między niezależnymi seriami eksperymentalnymi. Dwa panele przedstawiają cztery poszczególne krzywe kinetyczne dla spontanicznej agregacji huTau441 zebranych w dwóch niezależnych eksperymentach z wykorzystaniem tej samej partii białka huTau441. Stężenia huTau441 i heparyny wynoszą odpowiednio 15 µM oraz 8 µM. Kinetyka charakteryzuje się średnią (z SD) fazą lag wynoszącą 12,2 ± 0,18 h i t50 wynoszącym 17,8 ± 0,8 h (Próba 1) oraz odpowiednio 11,6 ± 0,52 h i t50 wynoszącym 17,8 ± 0,23 h (Próba 2). Dane kinetyczne dopasowano do 5-parametrycznej krzywej logistycznej z liniowym spadkiem górnej asymptoty. Wartości T50 obliczono poprzez interpolację między wartościami przewidzianymi przez regresję liniową. Fazę lag obliczono na podstawie 3% wzrostu sygnału fluorescencji ThT. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy intensywności fluorescencji partii w czasie, przedstawiające wyniki powtórzeń eksperymentalnych.
Rysunek 4: Test agregacji tau wykazuje wysoką odtwarzalność pomiędzy różnymi partiami białka huTau441. Każdy panel przedstawia cztery powtórzenia odpowiadające konkretnej partii huTau441. Agregacja każdej partii była monitorowana w niezależnych eksperymentach. Stężenia huTau441 i heparyny wynoszą odpowiednio 15 µM i 8 µM. Kinetyka agregacji odpowiadająca czterem poszczególnym partiom tau charakteryzuje się odpowiednio: średnią (z SD) fazą lag wynoszącą 15,3 ± 0,38 h i t50 wynoszącym 21,1 ± 0,46 h (Partia 1); fazą lag 12,5 ± 0,07 h i t50 19,8 ± 0,34 h (Partia 2); fazą lag 15,1 ± 0,34 h i t50 21,9 ± 0,86 h (Partia 3) oraz fazą lag 11,5 ± 0,29 h i t50 17,8 ± 0,29 h (Partia 4). Dane kinetyczne dopasowano do 5-parametrycznej krzywej logistycznej z liniowym spadkiem w górnej asymptocie. Fazę lag oraz t50 obliczono poprzez interpolację między wartościami przewidywanymi za pomocą regresji liniowej. Fazę lag obliczono na podstawie 3% wzrostu sygnału fluorescencji ThT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres intensywności fluorescencji w funkcji czasu; wykresy amplifikacji PCR; analiza danych w eksperymencie qPCR.
Rycina 5: Wstępnie utworzone agregaty hutau441 wykazują wysoką aktywność inicjującą (seeding). Aby zainicjować proces seedingu, do monomeru hutau441 dodano sonikowane agregaty tau. Od koloru czerwonego do niebieskiego, każdy kolor różnych krzywych kinetycznych reprezentuje inną ilość dodanych zarodków: odpowiednio 1,25%, 0,63%, 0,31%, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0,02%, 0,01%, 0,005% i 0,0025% (v/v). Spontaniczną konwersję hutau441 przedstawiono kolorem czarnym. Wszystkie warunki przetestowano w czterech powtórzeniach. Cztery powtórzenia kinetyczne powiązane z określoną koncentracją zarodków są wysoce powtarzalne i w większości przypadków nieodróżnialne. Koncentracje hutau441 i heparyny wynoszą odpowiednio 15 µM i 8 µM. Dodatek niewielkich ilości wstępnie utworzonych, sonikowanych struktur włóknistych eliminuje początkową fazę lag obserwowaną podczas spontanicznej konwersji, a efekt ten jest proporcjonalny do ilości zarodków. Od koloru czerwonego do niebieskiego, obserwowana różnica w t50 (t50 spont.conv-t50 seeding) wynosi odpowiednio 18,9, 18,40, 17,8, 17,3, 16,6, 16,1, 15,4, 14,7, 14,2 i 13,7 godziny. Spontaniczna konwersja hutau441 charakteryzuje się średnim t50 (z SD) wynoszącym 19,85 ± 0,54 h. Dane kinetyczne dopasowano do 5-parametrowej krzywej logistycznej z liniowym spadkiem górnej asymptoty. Wartości t50 obliczono poprzez interpolację między wartościami przewidywanymi za pomocą regresji liniowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Pomimo licznych wysiłków, kinetyka agregacji tau opisana do tej pory w literaturze nie ma pożądanego poziomu odtwarzalności i/lub niektórych cech polimeryzacji zależnej od zarodkowania 19,20,21,22,23,25. Jest to często podkreślane przez brak fazy opóźnionej, nieefektywne wysiew i niefibrylarny charakter agregatów tau. Przyczyna tych niedociągnięć może być różna i obejmuje nieoptymalną jakość białka tau (fragmentacja, obecność agregatów, niska czystość itp.), wybór białka i odczynników indukujących i/lub warunki eksperymentalne. Innym czynnikiem komplikującym są dwie reszty cysteiny znajdujące się wokół granicy faz agregacji tau, które mogą tworzyć wewnątrz- lub międzycząsteczkowe mostki dwusiarczkowe w zależności od środowiska redoks i wpływać na efektywność agregacji tau. W większości podejść odczynniki redukujące, takie jak DTT lub TCEP, są stosowane w celu utrzymania reszt cysteiny w zredukowanych formach, a tym samym zwiększenia poziomu odtwarzalności25. Ponadto współczynnik ekstynkcji tau jest bardzo niski, co prowadzi do trudności w dokładnych pomiarach stężenia białka.

Skupiliśmy się w szczególności na kilku parametrach i atrybutach jakościowych, które uznaliśmy za kluczowe dla solidnego, powtarzalnego i reprezentatywnego profilu agregacji białka tau: wyeliminowanie możliwości tworzenia się dwusiarczku wewnątrz- i międzycząsteczkowego, generowanie monomeru tau o wysokiej czystości i poprawa dokładności oznaczania stężenia. Wszystkie te pytania związane z odczynnikami są potencjalnymi punktami uwagi, które uznaliśmy za kluczowe dla optymalnego opracowania testu. Aby rozwiązać te problemy, pełnej długości huTau441 poddano ekspresji z dwiema mutacjami, C291A i C322A, oraz ze znacznikami końcowymi N i C. Mutacja reszt cysteiny ma minimalny wpływ na białko tau, jednocześnie eliminując bardzo trudne do kontrolowania mostkowanie dwusiarczków. Ekspresja białka za pomocą stosunkowo krótkich znaczników końcowych N i C pozwoliła nam na zastosowanie dwuetapowego protokołu oczyszczania powinowactwa, który doprowadził do uzyskania bardzo wysokiej czystości, integralności i zawartości monomerów. Ponadto wprowadziliśmy mutację F8W, która zwiększyła współczynnik ekstynkcji białka i pozwoliła na znacznie dokładniejsze pomiary stężenia24.

Oprócz zastosowania wysokiej jakości odczynników białkowych zoptymalizowano również inne parametry testu. Stwierdzono, że optymalny stosunek tau do heparyny wynosi około 0,5 (M/M), co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi badaniami26. Ponadto mechaniczne i optyczne ustawienia przyrządów mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia odtwarzalności, a optymalne parametry mogą się w pewnym stopniu różnić w zależności od producenta.

Agregacja tau opisana w tym teście wykazuje cechy, które są związane z patogenezą tau w AD i pokrewnymi tauopatiami. Proces rozpoczyna się początkową fazą opóźnienia odpowiadającą tworzeniu jąder o wysokiej energii, po której następuje faza szybkiego wzrostu, która odpowiada wzrostowi włókienek. Czas opóźnienia jest wystarczająco długi, aby otworzyć szerokie okno do szczegółowego zbadania procesu wysiewu obejmującego szeroki zakres stężeń nasion (rysunek 5), a jednocześnie nie jest zbyt długi, aby uniknąć degradacji białka i/lub niespecyficznej agregacji (rysunek 2). Te wtórne zdarzenia mogą wystąpić szczególnie wtedy, gdy wewnętrznie nieuporządkowane białko, takie jak huTau441, jest wystawione przez długi czas na warunki fizjologiczne. Uzyskane agregaty tau wykazują morfologię PHF wyizolowanych z mózgów pacjentów z chorobą Alzheimera i są bardzo skuteczne w rekrutacji monomerycznego tau i przekształcaniu go w agregaty generowane de novo , w procesie zwanym wysiewem. Test jest wysoce powtarzalny, a krzywe kinetyczne są praktycznie nie do odróżnienia między odwiertami, seriami doświadczalnymi i partiami białek. Chociaż obecny test koncentruje się tylko na najdłuższej izoformie tau, huTau441, zastosowanie można dostosować do badania konwersji innych form tau (Ameijde i wsp., Acta Neuropathologica Communications, w druku) Ponadto umożliwia badania mechanistyczne skoncentrowane na wzajemnym oddziaływaniu izoform tau i być może rzucają światło na różnice między patogenezą tau w AD, gdzie zarówno izoformy 3R, jak i 4R są obecne w PHF i chorobie PICK'a lub czołowo-skroniowej otępienie, w którym patologia tau zawiera głównie izoformy tau 3R i 4R, odpowiednio27.

Bardzo wysoka odtwarzalność testu powinna pozwolić czytelnikom na jego względne wdrożenie w konkretnych warunkach laboratoryjnych. Test naśladuje to, co uważa się za nieprawidłowe fałdowanie i agregację tau in vivo , umożliwiając badania mechanistyczne, które rzucą światło na patogenezę tau i stanowią cenne narzędzie do badań przesiewowych kandydatów na leki i oceny ich interferencji z różnymi etapami procesu patogenezy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Hectorowi Quirante za wyrażenie i oczyszczenie huTau441, Hannie Inganäs i Margot van Winsen za doskonałe wsparcie techniczne oraz Martinowi Koldijkowi za analizę danych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tioflawina TSigma-AldrichT3516-5Gsuchy proszek (Mw = 318,86 g/mol)
Heparyna Suchy proszek Sigma-AldrichH3393-50KU(Mw = 17-19 kDa)
TCEPSigma-Aldrich75259-1Gsuchy proszek (MW= 286,65 g/mol)
PBSGibco-Life Technologies10010-015Sterylny, pH 7,4 (1X)
0,22 μ m sterylny filtrCorning431160membrana PES 
0,20 μ m sterylny filtr seryngeCorning431229membrana PES 
Mikropłytki 96-dołkoweThermo Scientific9502867Czarne, płaskie dolne
zgrzewarki do mikropłytek R& D SystemsDY992Paski samoprzylepne 
Wielomodowy czytnik mikropłytek Synergy Neo2 BiotekSynergy Neo2, oprogramowanie Gen5
Lampy EppendorfEppendorf 0030 120.086Probówki 1,5 ml
Ultrasonics-Branson SFX250Branson101-063-966R1/2" Solid Horn i 1/8" Microtip 
Technologia hybrydowa

Bibliografia

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).
  3. Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).
  4. Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).
  5. Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease. Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).
  6. Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau. Science. 251 (4994), 675-678 (1991).
  7. Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease. Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).
  8. Pickhardt, M., et al. Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies. Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).
  9. Paranjape, S. R., et al. Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro. ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).
  10. Seidler, P. M., et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation. Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).
  11. Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231. Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).
  12. Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).
  13. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), USA. E4376-E4385 (2014).
  14. Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro. Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).
  15. Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).
  16. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
  17. Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).
  18. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).
  19. Barghorn, S., Mandelkow, E. Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments. Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).
  20. Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution. Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).
  21. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein. Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).
  22. Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies. Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).
  23. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. Journal of Visualized Experiments. (95), e51537(2015).
  24. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43(2018).
  25. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  26. Zhu, H. L., et al. Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation. Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).
  27. Buee, L., Delacourte, A. Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease. Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Agregacja bia ka taufluorescencja tioflawiny Tagregacja indukowana heparynmikrop ytka 96 do kowawielofunkcyjny czytnik mikrop ytekmikroskopia si atomowychanaliza SEC MALSnarz dzie do przesiewania lek wrekombinowane bia ko tau
In vitro Test do badania agregacji białka tau i badań przesiewowych leków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.