Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

Podsumowanie

Prezentujemy proces inżynierii genomu do generowania nowych modeli in vitro dla zakażenia HIV-1, które podsumowują integrację prowirusową w wybranych miejscach genomu. Ukierunkowanie na osoby zgłaszające pochodzące od wirusa HIV jest ułatwione dzięki manipulacji genomem specyficznej dla danego miejsca za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Dostępne są szczegółowe protokoły generowania klonów pojedynczych komórek, badań przesiewowych i weryfikacji prawidłowego celowania.

Streszczenie

Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) integruje swoje prowirusowe DNA nielosowo z genomem komórki gospodarza w powtarzających się miejscach i gorących punktach genomu. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół generowania nowych modeli in vitro zakażenia wirusem HIV z wybranymi miejscami integracji genomowej z wykorzystaniem technologii inżynierii genomu opartej na CRISPR-Cas9. Dzięki tej metodzie wybrana sekwencja reporterowa może zostać zintegrowana z docelowym, wybranym locus genomowym, odzwierciedlającym klinicznie istotne miejsca integracji.

W protokole opisany jest projekt reportera pochodzącego od HIV oraz wybór miejsca docelowego i sekwencji gRNA. Wektor celujący z ramionami homologicznymi jest konstruowany i transfekowany do limfocytów T Jurkat. Sekwencja reporterowa jest ukierunkowana na wybrane miejsce genomowe za pomocą rekombinacji homologicznej, ułatwionej przez pęknięcie podwójnej nici za pośrednictwem Cas9 w miejscu docelowym. Klony pojedynczych komórek są generowane i badane pod kątem zdarzeń docelowych za pomocą cytometrii przepływowej i PCR. Wybrane klony są następnie namnażane, a prawidłowe celowanie jest weryfikowane za pomocą PCR, sekwencjonowania i Southern blot. Analizowane są potencjalne zdarzenia niezgodne z celem inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas9.

Korzystając z tego protokołu, można wygenerować nowe systemy hodowli komórkowych, które modelują zakażenie wirusem HIV w klinicznie istotnych miejscach integracji. Chociaż generowanie klonów jednokomórkowych i weryfikacja prawidłowej integracji sekwencji reporterowej jest czasochłonne, uzyskane linie klonalne są potężnymi narzędziami do funkcjonalnej analizy wyboru miejsca integracji prowirusa.

Wprowadzenie

Integracja DNA prowirusa z genomem gospodarza po zakażeniu jest kluczowym krokiem w cyklu życia ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Po integracji HIV utrzymuje się poprzez ustanowienie opóźnienia w długożyciowych podzbiorach limfocytów T CD4 +, takich jak limfocyty T CD4 + pamięci. Integracja wirusa HIV wydaje się być nielosowa^1,2. W kilku badaniach wykryto szereg gorących punktów genomowych z rekurencyjnie zintegrowanym prowirusowym DNA poprzez sekwencjonowanie miejsc integracji u osób zakażonych ostro i przewlekle^2,3,

Protokół

1. Strategia celowania w inżynierii genomu i projektowanie wektora celującego (tv)

UWAGA: Pierwszy krok inżynierii genomu obejmuje wybór i wytworzenie narzędzi niezbędnych do celowania za pomocą systemu CRISPR-Cas9. Wybór miejsca integracji genomowej, dobór typu komórek do modyfikacji oraz zaprojektowanie reportera pochodzącego z HIV do integracji powinny poprzedzać ten etap. Niniejszy protokół opisuje celowanie minimalnego reporteru HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA w komórkach docelowych Jurkat. Schemat blokowy procesu celowania opartego na CRISPR-Cas9, generowania, przesiewania i weryfikacji linii klonalnych przedstawiono na

Wyniki

W tym reprezentatywnym eksperymencie zdecydowaliśmy się na skierowanie minimalnego reportera pochodnego od HIV-1, składającego się z LTR, sekwencji kodującej tdTomato oraz sekwencji sygnału polyA, do dwóch loci w intronie 5 genu BACH2¹⁷. Loci do targetowania wybrano na podstawie bliskości do opublikowanych powtarzalnych miejsc integracji zidentyfikowanych w różnych badaniach nad pierwotnymi limfocytami T od pacjentów zakażonych HIV^2,

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokół generowania modeli reporterowych Jurkat pochodzących z HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa przy użyciu inżynierii genomu opartej na CRISPR-Cas9.

Kilka punktów protokołu wymaga szczególnej uwagi na etapie planowania. Po pierwsze, locus, który ma być docelowy, powinien być starannie wybrany, ponieważ niektóre loci mogą być łatwiejsze do namierzenia niż inne (np. w zależności od statusu chromatyny regionu i samej sekwencji docelowej). Powtarz.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9	Addgene	42230	wektor do ekspresji SpCas9 i gRNA
pMK	GeneArt		ekspresyjny ssaków do klonowania
cDNA3.1	Wektor ekspresji ssaków	Invitrogen	V79020
BbsI	New England Biolabs	Enzym restrykcyjny	R0539S
NEBuilder Hifi DNA Zestaw do klonowania montażowego	New England Biolabs	E5520S	Zestaw do klonowania montażowego używany do generowania wektorów docelowych
TaqPlus Precision PCR System	Agilent Technologies	600210	Polimeraza DNA z aktywnością korekcyjną stosowana do amplifikacji ramion homologicznych (krok 1.2.2.2), weryfikacji miejsca integracji i sekwencji reporterowej (kroki 3.3.3 i 3.3.5), generowania sondy genomowej dla Southern blot (krok 3.4.1.5) i analizy zdarzeń niedocelowych (krok 3.5.4)
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej (okrągłodenna)	TPP	92097	do rozcieńczania
Polimeraza DNA Phusion High-Fidelity	New England Biolabs	M0530 L	Polimeraza DNA stosowana do wykrywania zdarzeń docelowych (krok 2.4.2) i generowania sondy specyficznej dla reportera dla Southern blot (krok 3.4.1.4)
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D9170	dimetylosulfotlenek jako PCR dodatek
Chlorek magnezu (MgCl2) Roztwór	New England Biolabs	B9021S	MgCl2 jako dodatek do PCR
Roztwór deoksynukleotydu (dNTP) Mieszanina New	England Biolabs	N0447S	dNTP z 10 mM każdego nt do reakcji PCR
5PRIME HotMasterMix	5PRIME	2200400	gotowa do użycia mieszanina PCR używana do przesiewowego PCR (krok 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kit	Qiagen	51106	Zestaw do izolacji i oczyszczania DNA
QIAquick PCR Zestaw do oczyszczania	Qiagen	28106	PCR Zestaw do oczyszczania
RPMI 1640 bez glutaminy	Pożywka do hodowli komórkowych	Lonza	BE12-167F
Surowica bydlęca płodu Republika Południowej Afryki Opłata	PAN Biotech	P123002	suplement pożywki
do hodowli komórkowychL-glutamina	Biochrom	K 0282	pożywka do hodowli komórkowych
suplement Penicylina/Streptomycyna 10.000 U/mL/ 10.000 &mikro; g/mL	Biochrom	A 2212	suplement pożywki do hodowli komórkowych
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media	Thermo Fisher Scientific	31985062	o obniżonym stężeniu w surowicy zoptymalizowana pod kątem transfekcji
TransIT-Jurkat	Mirus Bio	MIR2125	odczynnik do transfekcji
12-mirysianianu 13-octan	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	odczynnik
Jonomycyna	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	odczynnik do hodowli komórkowych
Jednostka filtrująca napędzana strzykawką, membrana PES, 0,22 i mikro; m	Millex	SLGP033RB	do filtracji sterylnej
Inkubator Heracell 150i	Termo Fisher Naukowy		inkubator kultur tkankowych
51026280 Amershan Hybond-N+	GE Healthcare	RPN1520B	dodatnio naładowana membrana nylonowa do blottingu DNA i RNA
Stratalinker 1800	Stratagene	400072	UV Crosslinker
High Prime	Zestaw Roche	11585592001	do znakowania DNA radioaktywnym dCTP przy użyciu losowych oligonukleotydów jako starterów ilustruje
Mikrokolumny ProbeQuant G-50	GE Healthcare	28-9034-08	chromatograficzne kolumny spinowe do oczyszczania znakowanego DNA

wektor do klonowania Płytki do hodowli tkankowych Pożywka do hodowli komórkowych Jednostka filtrująca