Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) integruje swoje prowirusowe DNA nielosowo z genomem komórki gospodarza w powtarzających się miejscach i gorących punktach genomu. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół generowania nowych modeli in vitro zakażenia wirusem HIV z wybranymi miejscami integracji genomowej z wykorzystaniem technologii inżynierii genomu opartej na CRISPR-Cas9. Dzięki tej metodzie wybrana sekwencja reporterowa może zostać zintegrowana z docelowym, wybranym locus genomowym, odzwierciedlającym klinicznie istotne miejsca integracji.
W protokole opisany jest projekt reportera pochodzącego od HIV oraz wybór miejsca docelowego i sekwencji gRNA. Wektor celujący z ramionami homologicznymi jest konstruowany i transfekowany do limfocytów T Jurkat. Sekwencja reporterowa jest ukierunkowana na wybrane miejsce genomowe za pomocą rekombinacji homologicznej, ułatwionej przez pęknięcie podwójnej nici za pośrednictwem Cas9 w miejscu docelowym. Klony pojedynczych komórek są generowane i badane pod kątem zdarzeń docelowych za pomocą cytometrii przepływowej i PCR. Wybrane klony są następnie namnażane, a prawidłowe celowanie jest weryfikowane za pomocą PCR, sekwencjonowania i Southern blot. Analizowane są potencjalne zdarzenia niezgodne z celem inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas9.
Korzystając z tego protokołu, można wygenerować nowe systemy hodowli komórkowych, które modelują zakażenie wirusem HIV w klinicznie istotnych miejscach integracji. Chociaż generowanie klonów jednokomórkowych i weryfikacja prawidłowej integracji sekwencji reporterowej jest czasochłonne, uzyskane linie klonalne są potężnymi narzędziami do funkcjonalnej analizy wyboru miejsca integracji prowirusa.