Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58572

⸱

14 listopada 2018

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Department of Anesthesiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 3German Center for Infection Research (DZIF)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy proces inżynierii genomu do generowania nowych modeli in vitro dla zakażenia HIV-1, które podsumowują integrację prowirusową w wybranych miejscach genomu. Ukierunkowanie na osoby zgłaszające pochodzące od wirusa HIV jest ułatwione dzięki manipulacji genomem specyficznej dla danego miejsca za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Dostępne są szczegółowe protokoły generowania klonów pojedynczych komórek, badań przesiewowych i weryfikacji prawidłowego celowania.

Streszczenie

Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) integruje swoje prowirusowe DNA nielosowo z genomem komórki gospodarza w powtarzających się miejscach i gorących punktach genomu. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół generowania nowych modeli in vitro zakażenia wirusem HIV z wybranymi miejscami integracji genomowej z wykorzystaniem technologii inżynierii genomu opartej na CRISPR-Cas9. Dzięki tej metodzie wybrana sekwencja reporterowa może zostać zintegrowana z docelowym, wybranym locus genomowym, odzwierciedlającym klinicznie istotne miejsca integracji.

W protokole opisany jest projekt reportera pochodzącego od HIV oraz wybór miejsca docelowego i sekwencji gRNA. Wektor celujący z ramionami homologicznymi jest konstruowany i transfekowany do limfocytów T Jurkat. Sekwencja reporterowa jest ukierunkowana na wybrane miejsce genomowe za pomocą rekombinacji homologicznej, ułatwionej przez pęknięcie podwójnej nici za pośrednictwem Cas9 w miejscu docelowym. Klony pojedynczych komórek są generowane i badane pod kątem zdarzeń docelowych za pomocą cytometrii przepływowej i PCR. Wybrane klony są następnie namnażane, a prawidłowe celowanie jest weryfikowane za pomocą PCR, sekwencjonowania i Southern blot. Analizowane są potencjalne zdarzenia niezgodne z celem inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas9.

Korzystając z tego protokołu, można wygenerować nowe systemy hodowli komórkowych, które modelują zakażenie wirusem HIV w klinicznie istotnych miejscach integracji. Chociaż generowanie klonów jednokomórkowych i weryfikacja prawidłowej integracji sekwencji reporterowej jest czasochłonne, uzyskane linie klonalne są potężnymi narzędziami do funkcjonalnej analizy wyboru miejsca integracji prowirusa.

Wprowadzenie

Integracja DNA prowirusa z genomem gospodarza po zakażeniu jest kluczowym krokiem w cyklu życia ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Po integracji HIV utrzymuje się poprzez ustanowienie opóźnienia w długożyciowych podzbiorach limfocytów T CD4 +, takich jak limfocyty T CD4 + pamięci. Integracja wirusa HIV wydaje się być nielosowa1,2. W kilku badaniach wykryto szereg gorących punktów genomowych z rekurencyjnie zintegrowanym prowirusowym DNA poprzez sekwencjonowanie miejsc integracji u osób zakażonych ostro i przewlekle2,3,4,5,6,7,8. Co ciekawe, w niektórych z tych miejsc integracji ten sam locus wykryto w dużej części zainfekowanych komórek, co prowadzi do wniosku, że integracja w nawracających miejscach może pozytywnie wpłynąć na ekspansję klonalną1.

Aby poszerzyć nasze zrozumienie znaczenia powtarzających się miejsc integracji, należy rozważyć wybór miejsca integracji prowirusowej. Jednak kilka aspektów technicznych utrudnia badanie wyboru miejsca integracji HIV i jego konsekwencji. Szeroko stosowane modele hodowli komórkowych dla latencji HIV, takie jak linie komórkowe JLat, nie odzwierciedlają klinicznie istotnych nawracających miejsc integracji9. Badania nad pierwotnymi komórkami pochodzącymi od pacjentów z jednej strony umożliwiają opisanie krajobrazu miejsc integracji za pomocą sekwencjonowania, ale nie pozwalają na analizy funkcjonalne. Zgodnie z naszą wiedzą, nie jest dostępny odpowiedni model eksperymentalny do funkcjonalnej analizy wybranych klinicznie istotnych miejsc integracji.

Tutaj prezentujemy szczegółowy proces generowania nowych modeli infekcji HIV przy użyciu technologii inżynierii genomu opartej na CRISPR-Cas9. Opisany tutaj przepływ pracy może być wykorzystany do wygenerowania linii komórek reporterowych pochodzących z limfocytów T, które modelują zakażenie wirusem HIV, przenosząc genomicznie zintegrowany reporter prowirusowy w wybranym miejscu integracji. Służą one zatem jako nowe narzędzia do badania, w jaki sposób miejsce integracji prowirusa może wpływać na biologię HIV i jak prowirus reaguje na różne strategie leczenia (np. indukowalność przez czynniki odwracające utajenie). Nasza metoda wykorzystuje zalety inżynierii genomowej opartej na CRISPR-Cas9, w której integracja sekwencji reporterowej przez rekombinację homologiczną jest ułatwiona przez wywołane nukleazą Cas9 pęknięcie podwójnej nici w miejscu docelowym. Miejsca docelowe do integracji są wybierane w zależności od odległości opisanych miejsc nawracającej integracji z badań na osobach zakażonych wirusem HIV oraz obecności odpowiednich motywów PAM dla inżynierii genomu za pośrednictwem Cas9.

W naszych przykładowych wynikach skupiliśmy się na locus genu BACH2, który koduje regulator transkrypcji BTB And CNC Homology 2. U osób przewlekle zakażonych wirusem HIV poddawanych terapii antyretrowirusowej, BACH2 jest jednym z loci wykazujących wzbogacenie zintegrowanych sekwencji HIV-13,6,7,8,10. Wybraliśmy minimalny reporter pochodzący od HIV składający się z długiego powtórzenia końcowego pochodzącego z HIV-1 (LTR), sekwencji kodującej tdTomato i sygnału poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) (PA), który skierowaliśmy do dwóch określonych miejsc w intronie 5 BACH2. Przedstawiony protokół jest zoptymalizowany pod kątem komórek Jurkat, ludzkiej linii komórek zawiesinowych pochodzących z limfocytów T CD4 +, ale można zastosować inne linie komórkowe i odpowiednio dostosować protokół. Przedstawiamy szczegółowy proces wyboru miejsca docelowego, budowy wektora docelowego z ramionami homologicznymi, celowania reportera w wybrane miejsce genomowe za pośrednictwem CRISPR-Cas9, generowania i selekcji linii klonalnych oraz kompleksowej weryfikacji nowo wygenerowanych, docelowych linii komórek reporterowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Strategia celowania w inżynierii genomu i projektowanie wektora celującego (tv)

UWAGA: Pierwszy krok inżynierii genomu obejmuje wybór i wytworzenie narzędzi niezbędnych do celowania za pomocą systemu CRISPR-Cas9. Wybór miejsca integracji genomowej, dobór typu komórek do modyfikacji oraz zaprojektowanie reportera pochodzącego z HIV do integracji powinny poprzedzać ten etap. Niniejszy protokół opisuje celowanie minimalnego reporteru HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA w komórkach docelowych Jurkat. Schemat blokowy procesu celowania opartego na CRISPR-Cas9, generowania, przesiewania i weryfikacji linii klonalnych przedstawiono na Rysunku 1. Opisana strategia celowania wykorzystuje Cas9 z S. pyogenes (SpCas9) do generowania indukowanych przez gRNA pęknięć dsDNA w wybranym miejscu integracji. Następnie reporter jest kierowany do wybranego locus genomowego poprzez rekombinację homologiczną dzięki dostarczeniu nielinearyzowanego wektora celującego (tv), który zawiera sekwencję reportera flankowaną przez tak zwane 5’ i 3’ ramiona homologii (HA)11.

  1. Wybór docelowego locus, gRNA oraz projektowanie wektora celującego
    1. Wybierz locus genomiczne do celowania w zależności od konkretnego pytania badawczego. Skorzystaj z opublikowanych list powtarzających się miejsc integracji HIV zidentyfikowanych u pacjentów w różnych badaniach.2,3,4,5,6,7,8 jako wytyczne. In silico wyekstrahować sekwencję genomiczną pożądanego locus genomicznego, który ma zostać objęty celowaniem (sekwencję pełnego genu lub co najmniej 5 kb sekwencji genomicznej), korzystając z przeglądarki genomu UCSC (http://genome.ucsc.edu).
    2. Wybierz 20-nt przewodnie RNA (gRNA) do celowania w wybrany locus genomiczny, korzystając z narzędzia internetowego E-CRISP (http://www.e-crisp.org).
      1. Wybierz „Homo sapiens GRCh38” jako organizm. Wprowadź 2 000 bp sekwencji genomicznej obejmującej pożądany locus genomiczny wyodrębniony w kroku 1.1.1.
      2. Rozpocznij wyszukiwanie gRNA, korzystając z ustawień aplikacji „medium” (dowolny PAM, dowolna zasada 5’, dopuszczalne niedopasowania w celach poza docelowymi, wykluczone introny/wyspy CpG). Pojawi się lista z możliwymi projektami gRNA, uszeregowana od najwyższych do niższych wyników pod kątem specyficzności i wydajności.
      3. Należy wybrać gRNA, który najlepiej charakteryzuje się wysokim wynikiem specyficzności i wydajności oraz znajduje się jak najbliżej pożądanego locus genomowego, który ma zostać poddany celowaniu.
        UWAGA: Należy znaleźć kompromis pomiędzy bliskością pożądanego locus genomowego a zaprojektowaniem specyficznego i wydajnego gRNA.
    3. Przeprowadź analizę BLAST wybranej sekwencji gRNA w odniesieniu do genomu referencyjnego, korzystając z przeglądarki NCBI blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov), aby sprawdzić unikalność miejsca wiązania gRNA.
      1. Wybierz „human” jako genom. Wprowadź sekwencję gRNA jako sekwencję zapytania. Jako program wybierz „highly similar sequences” (megablast). Upewnij się, że sekwencja gRNA jest unikalna. Jeśli nie, wybierz inne gRNA z kroku 1.1.2.3 i ponownie przeprowadź analizę blast.
    4. Po wybraniu sekwencji gRNA, należy wybrać in silico 1 000 pz powyżej (upstream) i poniżej (downstream) sekwencji gRNA z sekwencji genomowej wyekstrahowanej w kroku 1.1.1, odpowiednio jako HA 5' i 3'.
      UWAGA: gRNA powinny być homologiczne do wybranego locus miejsca integracji genomowej i zlokalizowane sąsiadująco z motywem PAM (protospacer adjacent motif; np., NGG dla SpCas9) (Rycina 2a). Wektor transferowy zawiera sekwencję reporterową, która jest flankowana z obu stron (5' i 3') ramionami homologii (HAs). Ramiona homologii obejmują 1000 bp powyżej i poniżej sekwencji gRNA.11Pełna sekwencja gRNA nie powinna być zawarta w HA. Dopuszczalne jest nakładanie się do 5 nt (Rycina 2a).
  2. Generowanie gRNA i wektorów celujących
    UWAGA: W celu zapoznania się ze schematami wektorów, należy przejrzeć Rycina 2b.
    1. Aby wygenerować wektor do ekspresji SpCas9 i gRNA, należy zastosować pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 jako szkielet, z którego mogą być jednocześnie eksprymowane zarówno SpCas9, jak i pojedyncze przewodzące RNA (sgRNA). W celu sklonowania sekwencji gRNA do szkieletu należy wykorzystać miejsca restrykcyjne BbsI.12.
    2. Aby wygenerować tv, należy wybrać plazmid o wysokiej liczbie kopii jako szkielet (np., pMK lub cDNA3.1).
      1. W pierwszej kolejności należy wprowadzić reporter (w niniejszym protokole: LTR_tdTomato_BGH-PA) do szkieletu konstruktu za pomocą klonowania metodą Gibson Assembly.13 używając komercyjnego zestawu do klonowania metodą assembly, oraz wprowadzając flankujące miejsca restrykcyjne 5' i 3' (np., 5’ PacI i 3’ SmaI) do późniejszego klonowania HAs z wykorzystaniem trawienia restrykcyjnego.
      2. Należy przeprowadzić amplifikację 1000 bp fragmentów HA wybranych w kroku 1.1.4 z DNA genomicznego (gDNA) typu komórek docelowych (w niniejszym protokole: komórek Jurkat), wykorzystując polimerazę DNA o aktywności korekcyjnej (patrz Tabela 1 i 2 (dla składników PCR i warunków cykli). Następnie wprowadź flankujące reportery miejsca restrykcyjne na końcach 5' i 3' każdego HA (PacI na końcu 5' HA po obu stronach, SmaI na końcu 3' HA po obu stronach).
      3. Sekwencyjnie sklonuj HA do szkieletu konstruktu zawierającego już reporter (wygenerowanego w kroku 1.2.2.1) metodą klonowania z użyciem enzymów restrykcyjnych14,15W pierwszej kolejności należy sklonować 5’-HA przy użyciu miejsc restrykcyjnych PacI, a następnie sklonować 3’-HA przy użyciu miejsc restrykcyjnych SmaI.
        UWAGA: Jeśli szkielet tv zawiera dodatkowy reporter fluorescencyjny, niepożądaną integrację szkieletu można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej (patrz kroki 3.2.2 i 3.2.3). Jeśli szkielet tv nie zawiera reportera fluorescencyjnego, integrację szkieletu należy ocenić za pomocą PCR (patrz krok 3.2.8).

figure-protocol-1
Rycina 1: Schemat celowania za pomocą CRISPR-Cas9, generowania i selekcji klonalnych linii raportujących z określonym miejscem integracji. (A) Przygotowanie wektora celującego i transdukcja komórek T Jurkat wektorem celującym oraz plazmidem ekspresyjnym Cas9/gRNA. (B) Wzbogacanie transfekowanych komórek 72 h po transfekcji metodą FACS. (C) Hodowla komórek przez 10 do 14 dni i potwierdzenie wystąpienia zdarzeń celowania za pomocą PCR i cytometrii przepływowej. (D) Generowanie klonów jednokomórkowych poprzez rozcieńczanie ograniczające i hodowla klonów przez 3 tygodnie. (E) Przesiewanie klonów w celu weryfikacji prawidłowego celowania za pomocą PCR i cytometrii przepływowej w formacie 96-dołkowym. Ekspansja wybranych klonów. (F) Weryfikacja prawidłowego celowania w wybranych klonach za pomocą Southern blot, PCR i sekwencjonowania, a także analiza zdarzeń poza docelowych (off-target) aktywności endonukleazy Cas9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Strategia celowania i konstrukcja wektora. (a) gRNA i wybór ramion homologii. gRNA o długości 20 nt jest homologiczne do wybranego miejsca docelowego w genomie i znajduje się w sąsiedztwie sekwencji PAM. Ramiona homologii są komplementarne do 1 000 bp powyżej i poniżej gRNA i nie powinny zawierać sekwencji gRNA. (b) Schematy wektora celującego oraz wektora gRNA/Cas9. Wektor celujący składa się z wybranej sekwencji reporterowej, która jest flankowana z obu stron (5' i 3') przez ramiona homologii. Wektor gRNA/Cas9 oparty jest na szkielecie pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9. (c) Schemat celowania poprzez rekombinację homologiczną. Wektor celujący oraz wektor guideRNA/Cas9 są transfekowane do komórek Jurkat. Cas9 pośredniczy w pęknięciu obu nici w miejscu docelowym w genomie (oznaczonym symbolem *) i ułatwia rekombinację homologiczną oraz integrację sekwencji reporterowej w docelowym locus genomicznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

2. Celowanie w komórki Jurkat z wykorzystaniem systemu CRISPR-Cas9

  1. Transfekcja komórek Jurkat
    1. Na 24 h przed transfekcją wysiać 1,25 x 106 komórki T Jurkat w 2,5 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej o 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 4 mM L-glutaminy [oznaczanej jako „RPMI bez antybiotyków (AB)”] na każdą studnię 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Dla pojedynczego eksperymentu celowanego należy przygotować jedną pełną płytkę 6-dołkową (tj., 6 dołków, w każdym po 2,5 ml zawiesiny komórkowej).
    2. Następnego dnia przeprowadź kotransfekcję komórek wektorami kołowymi tv oraz pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA, wykorzystując odczynnik do transfekcji przeznaczony dla komórek Jurkat.
      1. Dodaj 2 µg z okrężnej telewizji i 2 µg pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA na studzienkę do 250 µL komercyjnego medium RPMI z obniżonym stężeniem surowicy, zoptymalizowanego do transfekcji (RPMI z 50% redukcją surowicy), w probówce reakcyjnej i dokładnie wymieszać.
      2. Dodaj 12 µL powoli odczyn transfekcyjny do DNA/medium, nie dotykając ścianki probówki, i wymieszaj przez delikatne obracanie. Inkubuj mieszaninę przez 15 min, a następnie dodaj kroplowo do jednej studni z komórkami. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22.
        UWAGA: Przygotowanie reakcji transfekcji można skalować. Po transfekcji nie jest wymagana wymiana medium.
  2. Wzbogacanie populacji komórek transfektowanych za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)
    1. 72 h po transfekcji połącz transfected cells, policz je i przygotuj do wzbogacenia metodą FACS. Zbierz komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, odwiruj przy 300 x g i w temperaturze pokojowej (RT) przez 4 min, przemyć komórki raz w PBS, ponownie odwirować, a następnie zawiesić osad w odpowiedniej ilości buforu FACS (PBS uzupełniony o 1% FCS + 1 mM EDTA) w stężeniu 1 x 107 komórek/ml, a następnie przenieść do probówki do FACS.
    2. Poddać komórki analizie FACS i wyselekcjonować te, które wykazują ekspresję fluorescencyjnego reportera tv (np., (w niniejszym protokole tdTomato). Komórki należy zebrać w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FCS, 4 mM L-glutaminy oraz 50 J/ml penicyliny i streptomycyny (określanej jako „RPMI w/ AB”).
    3. Po sortowaniu metodą FACS przemyć komórki raz, dodając 20 ml pożywki RPMI z AB do posortowanych komórek, a następnie odwirować przy 300 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej. Osad komórkowy resuspender w odpowiedniej ilości pożywki RPMI z dodatkiem antybiotyków (AB), a następnie wysiać komórki do jednej studni płytki hodowlanej, stosując odpowiednią objętość w zależności od liczby komórek po FACS.
      UWAGA: Sortuj komórki w małej objętości pofrakcyjnej (np., (24-dołkowej), ponieważ w pierwszym tygodniu po ukierunkowaniu zaobserwowano znaczny poziom śmierci komórek (do 80–90%).
    4. Namnóż mieszaną populację docelowych komórek do gęstości 1 x 106 komórek/ml w naczyniu o powierzchni 75 cm²² kolba do hodowli komórkowej. Proces ten potrwa około 10–14 dni po sortowaniu FACS.
  3. Potwierdzenie zdarzeń targetowania metodą cytometrii przepływowej w mieszanej populacji komórek targetowanych
    1. Po 10–14 dniach ekspansji (gdy komórki osiągną gęstość 1 x 106 komórek/ml w naczyniu 75 cm²2 kolbę do hodowli komórkowych), wysiać do dwóch studni 1 x 106 komórki mieszanej docelowej populacji komórek w 1 ml pożywki RPMI z antybiotykami w 12-dołkowej płytce hodowlanej.
    2. Indukować LTR HIV reportera (generowanie tv opisano w kroku 1.2.2.1.) w jednym z dołków poprzez dodanie 50 ng/mL mirystynianu 12-myristate 13-acetate (PMA) oraz 1 µM Ionomycyna (oznaczona jako PMA-Iono). Komórki w drugiej studzience należy wykorzystać jako nieindukowaną próbę kontrolną. Zarówno komórki indukowane, jak i nieindukowane należy hodować przez 24 h.
    3. Należy pobrać po 0,5 ml zawiesiny komórek nieindukowanych i indukowanych, przepłukać je raz w PBS, a następnie każdą z nich zawiesić w 200 µL buforu do FACS.
    4. Przeanalizuj 100 000 komórek metodą cytometrii przepływowej. Wyznacz bramkę dla żywych pojedynczych komórek na podstawie wielkości w rozproszeniu przednim i bocznym, a następnie przeanalizuj ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego.
      UWAGA: Na tym etapie (10–14 dni po sortowaniu FACS) przejściowa ekspresja fluorescencyjnego reportera indukowana transfekcją nie powinna być już wykrywalna. Ekspresja fluorescencyjna w tym punkcie czasowym wskazuje na integrację genomową sekwencji reporterowej.
  4. Wykrywanie zdarzeń celowania metodą PCR w DNA genomicznym zmieszanej populacji komórek poddanych celowaniu
    UWAGA: Aby wykryć zdarzenia celowania za pomocą PCR, należy zaprojektować dwie pary starterów specyficznych dla 5’ złącza integracyjnego (int.) oraz 3’ złącza int. W przypadku PCR dla 5’ złącza int., starter forward powinien wiązać się powyżej (upstream) 5’ HA, a starter reverse w LTR reportera (startery P1 i P2 w Rycina 3a). Para starterów do PCR dla złącza 3' int. powinna obejmować obszar od PA reportera do 100–200 bp poniżej 3' HA (startery P3 i P4 w Rysunek 3a). Primery P1 i P4 posłużą również do amplifikacji allelu nietarczowego w mieszanej populacji z allelem tarczowym. Schemat przedstawiono w Rysunek 3a.
    1. Przygotuj gDNA z 2 ml zawiesiny komórkowej zmieszanej populacji komórek docelowych z kroku 2.2.4. Użyj zestawu do ekstrakcji gDNA zgodnie z protokołem producenta. Następnie przygotuj gDNA z komórek niedocelowych jako kontrolę.
    2. Przeprowadź reakcje PCR dla złączy integracyjnych (odpowiednio startery P1/P2 i P3/P4 dla złączy 5’ i 3’) oraz PCR dla allelu nietargetowego (startery P1/P4), wykorzystując polimerazę DNA o wysokiej wierności (patrz Tabela 3 i 4 (w odniesieniu do składników PCR i warunków cyklicznych). Analizować 5 µL produktów PCR w żelu agarozowym 1,5% w buforze TAE.
      UWAGA: Jeśli zmieszana populacja docelowa zawiera komórki poddane inżynierii genomu, powinien być widoczny specyficzny produkt PCR, który nie jest wykrywalny w gDNA komórek niedocelowych (kontrola negatywna). W przypadku PCR allelu niedocelowego powinien być widoczny produkt tej samej wielkości zarówno dla komórek docelowych, jak i niedocelowych (kontrola pozytywna dla genomowych starterów P1 i P4). Jeśli nie zaobserwowano prążków, należy rozważyć zmianę warunków cyklu PCR poprzez zwiększenie liczby cykli lub zmianę buforu PCR (na przykład poprzez dodanie DMSO lub zwiększenie ilości Mg)2+), lub poprzez zmianę polimerazy.

3. Generowanie linii klonalnych i przesiewanie pod kątem prawidłowego targetowania

UWAGA: Po potwierdzeniu zdarzeń celowania w mieszanej populacji komórek celowanych za pomocą cytometrii przepływowej i PCR (sekcje 2.2–2.4), należy wygenerować klony jednokomórkowe (czas trwania: od 28 do 35 dni) i przeprowadzić przesiew w celu potwierdzenia prawidłowej integracji sekwencji reporterowej.

  1. Generowanie klonów jednokomórkowych poprzez metodę siewu z rozcieńczeń
    1. Przygotuj wcześniej medium kondycjonowane komórkami Jurkat: pobierz medium RPMI z AB od zdrowych, niepoddanych traktowaniu komórek T Jurkat wyhodowanych do zagęszczenia 1 x 106 komórek/ml, wirować przez 5 min przy 300 x gi przefiltrować nadsącz za pomocą 0.22 µm jednostka filtrująca do strzykawki.
      UWAGA: Przechowywać medium warunkujące w temperaturze 4°C °C do krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze -20°C °C do przechowywania przez okres dłuższy niż 1 tydzień. Przed wysiewaniem metodą rozcieńczeń przygotować od 20 do 30 ml medium kondycjonowanego.
    2. Policz komórki docelowe z kroku 2.2.4 po 10–14 dniach ekspansji i rozcieńcz je w RPMI z AB do stężenia 1 x 105 komórek/ml. Pobrać 100 µL 1 x 105 roztworu o stężeniu [X] komórek/ml i rozcieńczyć 9,9 ml pożywki, aby uzyskać stężenie 1000 komórek/ml. Odmierzyć 1 ml roztworu o stężeniu 1000 komórek/ml i rozcieńczyć 9 ml pożywki, aby uzyskać stężenie 100 komórek/ml.
    3. Napełnij płytki 96-dołkowe tak, aby w każdym dołku znajdowała się jedna komórka lub dwie komórki. W przypadku jednej komórki na dołek, pobierz 1 ml roztworu o stężeniu 100 komórek/ml i delikatnie wymieszaj z 5 ml medium warunkowego oraz 4 ml świeżego medium w sterylnym dozowniku do odczynników.
    4. Aby uzyskać 2 komórki na dołek, należy pobrać 2 ml roztworu o stężeniu 100 komórek/ml i delikatnie wymieszać z 5 ml medium warunkowanego oraz 3 ml świeżego medium. Płytki 96-dołkowe z okrągłym dnem należy wysiać za pomocą 100 µL odpowiedniego rozcieńczenia komórek na każdą studzienkę przy użyciu pipety wielokanałowej.
      UWAGA: Do uzyskania klonów do przesiewania wystarczy od 5 do 10 płytek 96-dołkowych na każdy konstrukt celujący.
    5. Ułożyć płytki 96-dołkowe w stosy, przykryć każdy stos płytką 6-dołkową zawierającą 3 ml PBS w każdym dołku i inkubować płytki w temperaturze 37°C °C w inkubatorze do hodowli komórkowych z nawilżaniem i 5% CO22 przez 3 tygodnie.
      UWAGA: W tym czasie nie należy wymieniać pożywki do hodowli komórkowej. Inkubator należy otwierać nie częściej niż raz lub dwa razy w tygodniu. Najlepsze wyniki uzyskuje się w inkubatorach z otwartym zbiornikiem wodnym.
    6. Po 3 tygodniach inkubacji należy wizualnie potwierdzić obecność wyrośniętych kolonii za pomocą mikroskopii świetlnej (powiększenie 4X) i oznaczyć studzienki z wyrośniętymi koloniami w taki sposób, aby były one widoczne jako punkty na dnie studzienek.
    7. Przygotować jedną płytkę 96-dołkową z dnem okrągłym z 100 µL RPMI z AB na studzienkę. Delikatnie resuspenduj komórki w oznaczonej studzience za pomocą pipetowania. Przenieś 100 µL zawiesiny komórkowej do jednego dołka nowej płytki 96-dołkowej, w której znajduje się już 100 µL pożywki RPMI z AB, a następnie delikatnie wymieszać, pipetując. Przenieść 100 µL tej zawiesiny komórkowej do drugiej pustej płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem w celu zduplikowania płytki.
    8. Kontynuuj pracę ze wszystkimi zaznaczonymi dołkami, w których wyrosły kolonie. Wszystkie puste dołki wypełnij 200 µL pożywki RPMI z AB. Inkubować płytki w 37° C oraz 5% CO22.
      UWAGA: Jedna z tych płytek posłuży do namnażania pojedynczych klonów komórkowych („płytka zapasowa”), a druga jako „płytka dubletowa” do skriningu.
  2. Screening klonów pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej i PCR
    UWAGA: Podczas namnażania pojedynczych klonów komórkowych, należy wykorzystać płytkę dubletową z kroku 3.1.8 do przesiewania klonów pod kątem obecności sekwencji reporterowej za pomocą PCR (kroki 3.2.4–3.2.12) oraz ekspresji fluorescencyjnego reportera za pomocą cytometrii przepływowej (kroki 3.2.2–3.2.3) (Rycina 3c).
    1. Inkubować płytkę dubletową przez 24 do 48 h, a następnie ponownie powtórzyć płytkę. W tym celu należy dodać 100 µL RPMI z AB do każdego dołka, wymieszać delikatnie poprzez pipetowanie, a następnie przenieść 100 µL do nowej płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym za pomocą pipety wielokanałowej. Jedną płytkę należy wykorzystać do przesiewu metodą cytometrii przepływowej, a drugą do przesiewu metodą PCR.
    2. W celu przeprowadzenia przesiewu metodą cytometrii przepływowej, należy stymulować komórki za pomocą PMA-Iono. Przygotuj mastermix zawierający 0.1 µL ionomycyny (stężenie zapasowe 1 mM), 0.1 µL PMA (50 µg/µL roztwór zapasowy), oraz 4.8 µL RPMI z AB zgodnie z liczbą dołków, a następnie dodać 5 µL mastermixu na dołek.
      UWAGA: Indukcja jest niezbędna do skutecznej identyfikacji klonów, w których LTR może być transkrypcyjnie nieaktywny, a w konsekwencji reporter fluorescencyjny nie jest ekspresowany.
    3. Inkubować komórki przez 24 h, a następnie przygotować je do cytometrii przepływowej zgodnie z opisem w punkcie 2.3.3. Wyznaczyć bramkę dla żywych pojedynczych komórek na podstawie wielkości w rozproszeniu przednim i bocznym, a następnie przeanalizować ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego za pomocą cytometrii przepływowej (przykładowe wyniki patrz w Rycina 3c). Jeśli szkielet wektora zawiera drugi reporter fluorescencyjny z promotorem (np., GFP), należy również przesiewać wszelkie klony pod kątem ekspresji reportera szkieletowego (wyjaśnienie znajduje się w kroku 1.2.2 oraz w poniższej uwadze).
      UWAGA: Ekspresja reportera szkieletu wskazuje na niepożądaną integrację sekwencji szkieletowych.
    4. Gdy klony na drugiej płytce duplikacyjnej urosną w stopniu wystarczającym (zazwyczaj od 24 do 48 h po duplikacji płytki 96-dołkowej), należy przygotować lizaty komórkowe zawierające gDNA do przesiewu metodą PCR. Płytkę wiruj przez 10 min przy 300 x g w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odpipetować nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego.
      UWAGA: Wszystkie etapy przygotowania lizatów oraz reakcji PCR można przeprowadzić przy użyciu pipet wielokanałowych.
    5. Przemyć komórki za pomocą 100 µL buforu PBS poprzez delikatne pipetowanie i odwirywanie płytki przez 5 min przy 300 x g w temperaturze pokojowej. Odpiąć PBS i dodać 200 µL buforu do lizy [200 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8-8,5, 5 mM EDTA, 0,1% SDS; następnie dodać 250–1,000 µg/mL proteinazy K (liofilizowany proszek, odważyć bezpośrednio przed użyciem)] na każdą studzienkę. Delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie, a następnie przenieść zawiesinę do nowej płytki PCR.
    6. Uszczelnij płytkę folią parafinową i inkubuj przez 1 h w temperaturze 55°C. °C w termocyklerze. Wirować z maksymalną prędkością przez 10 min (3 000 x g) w celu odwirowania resztek komórkowych, a następnie przenieść nadsącz do nowej płytki PCR.
      UWAGA: Lizaty komórkowe w płytkach można na tym etapie przechowywać w temperaturze 4°C °C do czasu dalszego użycia.
    7. Przygotuj 96-dołkową płytkę PCR zawierającą 110 µL z dH2O i dodaj 10 µL lizatu komórkowego (rozcieńczenie 1:12). Lizaty komórkowe mogą być lepkie i trudne do pipetowania. Należy użyć co najmniej 20-µL końcówki do pipet
    8. Inaktywować proteinazę K poprzez inkubację przez 10 min w temperaturze 99°C °C w termocyklerze. Następnie użyć inaktywowanych i rozcieńczonych lizatów komórkowych do przesiewu PCR.
    9. Zaprojektować startery do PCR przesiewowego (P5 i P6) na podstawie wybranej sekwencji reporterowej, aby amplifikować fragment sekwencji reporterowej o długości 500–800 bp. Do PCR kontrolnego dodatniego należy użyć starterów P7 i P8, które amplifikują fragment o długości 630 bp z loci genomowego typu dzikiego, niepoddanego celowaniu (NUP188 gen) (Rysunek 3c i Tabela 5). Zaprojektuj trzecią parę starterów, która amplifikuje 500–600 bp szkieletu tv w celu kontroli nieswoistej integracji sekwencji szkieletu tv (PCR szkieletu).
    10. Do reakcji PCR przesiewowych, kontrolnych oraz PCR szkieletu (backbone PCR) należy użyć komercyjnego mastermixu do PCR (patrz Tabela 6 i 7 (dotyczy składników PCR i warunków cyklicznych). Należy użyć 2 µL rozcieńczonego i inaktywowanego lizatu przygotowanego w kroku 3.2.8 jako matrycy i przeprowadź PCR przez 38 do 40 cykli amplifikacji w formacie 96-dołkowym.
    11. Analizuj 5 µL produktów PCR w 1,5% żelu agarozowym w buforze TAE.
      UWAGA: W przypadku kontrolnej reakcji PCR dla każdej próbki powinno być widoczne specyficzne pasmo o wielkości 630 bp, co potwierdza, że jakość lizatów komórkowych jest odpowiednia do przeprowadzenia PCR. Specyficzne pasmo w PCR przesiewowym (500–800 bp w zależności od projektu starterów) wskazuje na integrację sekwencji reporterowej. Specyficzne pasmo w PCR szkieletowym (500–600 bp w zależności od projektu starterów) wskazuje na niepożądaną integrację sekwencji szkieletowych tv (przykładowe wyniki zob. Rysunek 3c).
    12. Połącz wyniki cytometrii przepływowej (krok 3.2.3) i przesiewu metodą PCR (krok 3.2.12). Wybierz klony, które wykazują prawidłową wielkość produktów w przesiewowym PCR i PCR kontroli pozytywnej oraz ekspresję fluorescencyjnego reportera po indukcji PMA-Iono w cytometrii przepływowej. Wyklucz klony, które wykazują jakikolwiek produkt PCR w PCR szkieletu (backbone PCR) lub ekspresję białka fluorescencyjnego kodowanego przez szkielet tv, co wskazywałoby na niespecyficzną integrację sekwencji szkieletu tv.
    13. Stopniowo przenosić wybrane klony z płyty zapasowej 96-dołkowej do formatów z większymi dołkami (48/24/12/6-dołkowych), aż do uzyskania formatu kolby hodowlanej T75, dodając świeże pożywkę co 2 do 3 dni. Utrzymywać gęstość komórek w zakresie od 1 x 105 oraz 1 x 106 komórek/ml
    14. Należy pamiętać o przygotowaniu banków komórek klonów podczas ekspansji: należy policzyć komórki, odwirować je przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, odlać nadsącz i delikatnie zawiesić komórki w FCS + 10% DMSO w stężeniu 5 x 106 komórek/ml. Rozdzielić do probówek kriogenicznych i użyć pojemnika do zamrażania kriogenicznego, aby zamrozić komórki w temperaturze -80 °C w 1 °C/min. W celu długoterminowego przechowywania przenieść je do ciekłego N22.
      UWAGA: Zaleca się zachowanie kolby do hodowli komórkowej T75 (t. j., około 1 x 107 komórki) podczas namnażania w celu przygotowania gDNA do weryfikacji celowania za pomocą Southern blottingu (patrz sekcja 3.4).
  3. Weryfikacja miejsc integracji za pomocą PCR/sekwencjonowania w wybranych klonach
    UWAGA: Złącza wewnętrzne 5’ i 3’ wybranych klonów poddaje się amplifikacji metodą PCR, a następnie sekwencjonowaniu metodą Sangera w celu weryfikacji prawidłowego celowania na poziomie sekwencji DNA.
    1. Wyizoluj gDNA z wybranych klonów oraz komórek Jurkat typu dzikiego, korzystając z komercyjnego zestawu do ekstrakcji gDNA.
    2. Do wyznaczenia 5' połączenia integracyjnego (startery P1 i P2) należy użyć par starterów wiążących się z końcem 5' reportera oraz powyżej 5' HA, a do 3' połączenia integracyjnego (startery P3 i P4) – z końcem 3' reportera oraz poniżej 3' HA, zgodnie z opisem w kroku 2.4. W celu amplifikacji docelowego miejsca integracji w allelu bez insertu reporterowego należy użyć starterów P1 i P4 (Rycina 4a).
    3. Przygotować reakcje PCR z użyciem 100–200 ng gDNA w charakterze matrycy i przeprowadzić PCR, stosując polimerazę o aktywności korekcyjnej (patrz Tabele 1 i 2 (dotyczących składników reakcji PCR oraz warunków cykliczności).
      UWAGA: Jeśli nie zaobserwowano żadnych prążków, należy rozważyć zmianę warunków cyklizacji PCR poprzez zwiększenie liczby cykli lub zmianę buforu PCR (na przykład poprzez dodanie DMSO lub zwiększenie ilości Mg).2+), lub poprzez zmianę polimerazy.
    4. Analizuj 5 µL produktów PCR na żelu agarozowym 1,5% w buforze TAE. Po zaobserwowaniu prążków o prawidłowych wielkościach należy oczyścić pozostały produkt PCR przy użyciu zestawu komercyjnego i poddać go sekwencjonowaniu metodą Sangera. Należy zweryfikować sekwencje połączenia 5’, połączenia 3’ oraz docelowego miejsca allelu bez integrytu reportera poprzez ich dopasowanie do sekwencji oczekiwanych.
      UWAGA: Allel homologiczny, w którym reporter nie został zintegrowany, prawdopodobnie wykaże zmiany w miejscu docelowym zapośredniczone przez Cas9, takie jak insercje lub delecje nukleotydów (Rysunek 4a).
    5. W przypadku klonów wykazujących prawidłowe sekwencje połączeń wewnętrznych po wyrównaniu, należy przeprowadzić reakcję PCR w celu amplifikacji całego docelowego reportera, a następnie poddać go sekwencjonowaniu metodą Sangera, aby zweryfikować poprawność sekwencji integrantu.
  4. Analiza Southern blot w celu weryfikacji celowania w wybranych klonach
    UWAGA: Wymagana jest analiza Southern blot wybranych klonów w celu weryfikacji prawidłowego celowania oraz wykluczenia zdarzeń rekombinacji zapośredniczonej przez Cas9, które mogły wystąpić w docelowym miejscu integracji.
    1. Opracuj strategię odpowiedniego trawienia gDNA oraz projekt sondy przed rozpoczęciem eksperymentu.
      1. Wybierz enzym restrykcyjny do trawienia gDNA, który w docelowym miejscu generuje odpowiednie fragmenty o długości od 2 do 10 kb. Niektóre enzymy restrykcyjne, takie jak Asp718, BamCześć, BglJa, BgLII, EkologiaRV, HindIII, NcoJa, PstJa, PvuIII, ScaJa, StuJa i SstZostał on z powodzeniem zastosowany do trawienia gDNA o wysokiej masie cząsteczkowej.
      2. Zaprojektuj dwie różne sondy do analizy Southern: sondę specyficzną dla reportera oraz sondę genomiczną. Sonda specyficzna dla reportera hybrydyzuje z sekwencją w obrębie reportera (tj., sonda specyficzna dla tdTomato). Sonda genomiczna hybrydyzuje z regionem genomicznym położonym blisko (ale nie nakładającym się na) jedną z kopii HA.
      3. Wybierz sondę genomiczną w taki sposób, aby fragment powstały w wyniku trawienia gDNA, który zostanie wykryty poprzez wiązanie sondy genomicznej, różnił się długością (o więcej niż 2 kb) od alleli docelowych i niedocelowych (Rycina 4bZaleca się, aby długość sondy wynosiła od 400 do 1000 pz.
      4. Zaprojektuj primery PCR do amplifikacji dwóch wymaganych sond. Amplifikuj sondę specyficzną dla reportera z matrycy tv, używając wysokowiernej polimerazy DNA (patrz Tabele 3 i 4 (w celu określenia składników PCR oraz warunków cyklicznych).
      5. Przeprowadź amplifikację sondy genomicznej z gDNA typu dzikiego linii Jurkat, przygotowanego za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji gDNA, wykorzystując polimerazę DNA o aktywności korektorskiej (patrz Tabela 1 i 2 (w odniesieniu do składników PCR i warunków cyklu). Produkty PCR należy oczyścić na żelu agarozowym/TAE, a fragmenty wyodrębnić za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji z żelu zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Wyizoluj gDNA o wysokiej masie cząsteczkowej z 1 x 107 komórki linii Jurkat typu dzikiego oraz wybrane klony z kroku 3.2.14.
      1. Odwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, przemyć raz roztworem PBS i zawiesić osad w 4 ml buforu lizującego [200 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8, 5 mM EDTA, 0,1% SDS]; następnie dodać 250–1,000 µg/mL proteinaza K (proszek liofilizowany, odważyć bezpośrednio przed użyciem)]. Inkubować przez noc w temperaturze 55 °C, wstrząsając z prędkością 350 obr./min w termomikserze stołowym.
      2. Dodać 4 ml izopropanolu i wymieszać, odwracając probówkę 10–20 razy. gDNA powinien stać się widoczny w postaci białego osadu. Wyłowić osad gDNA za pomocą cienkiej końcówki pipety szklanej, a następnie przemyć, zanurzając w 750 µL 70% EtOH i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (od 5 do 10 min).
      3. Przenieś osad do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µL buforu TE 1x (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) i pozostawić do rozpuszczenia przez noc w temperaturze 4°C °Cprzy wstrząsaniu z prędkością 350 obr./min. Wszelkie pipetowanie gDNA na tym etapie należy przeprowadzać przy użyciu końcówek o szerokim otworze, aby uniknąć fragmentacji materiału.
        UWAGA: Przygotowanie wysokocząsteczkowego gDNA jest niezbędne do analizy Southern blot, a dostępne komercyjnie zestawy do izolacji gDNA nie są do tego celu odpowiednie.
    3. Trawienie (dwukrotnie) 15 µg gDNA wybranych klonów oraz komórek Jurkat typu dzikiego za pomocą wybranych enzymów restrykcyjnych (patrz krok 3.4.1.1) w 60 µL reakcja z 6 µL enzymu (20 j./µL): najpierw dodać DNA, bufor do trawienia oraz ddH2O2O, inkubować przez noc w temperaturze 37°C °Cnastępnie należy dodać enzym i inkubować przez noc w temperaturze trawienia specyficznej dla danego enzymu. Na każdą sondę Southern wymagane jest 15 $\mu$g strawionego gDNA.
    4. Zastosowanie 7 µL z / od / do 60 µL trawienie restrykcyjne do analitycznej elektroforezy żelowej na żelu agarozy 1% w buforze TAE. Rozmycie (smear) wskazuje na całkowite trawienie i dobrą jakość DNA do analizy metodą Southern blot.
    5. Wytrącić pozostałość produktu trawienia restrykcyjnego poprzez dodanie octanu sodu 3 M w proporcji 1:10 oraz 2 objętości 100% EtOH, a następnie inkubować przez 1 h w temperaturze -80°C. °C i wiruj przez 30 min przy 15 600 x g g przy 4 °C.
    6. Odrzuć supernatant i przemyj osad 70% EtOH. Odwiruj przez 15 min przy 15 600 x g przy 4 °C, odwirować i usunąć nadsącz, pozwolić osadowi krótko wyschnąć w temperaturze pokojowej, a następnie rozpuścić w 20 µL z ddH2O2O.
    7. Przeprowadź elektroforezę na żelu do transferu (blottingu) z 1% agarozy w buforze TAE, nakładając 20 $\mu$L strawionego gDNA na każdą studzienkę. Elektroforezę prowadź przez 2 h przy napięciu 60 V i natężeniu 400 mA.
      UWAGA: Procentowy udział agarozy w żelu oraz czas i napięcie elektroforezy można dostosować do przewidywanej wielkości fragmentu do detekcji metodą Southern blot, obliczonej w kroku 3.4.1.1. Kolejne etapy analizy Southern blot zostały szczegółowo opisane w protokole uzupełniającym (kroki od 1 do 18). Kroki te obejmują: przemywanie żelu do transferu, transfer na membranę nylonową, przygotowanie sondy radioaktywnej, hybrydyzację sondy oraz wywoływanie filmu autoradiograficznego. Porównaj uzyskany wzór prążków po wywołaniu autoradiografu w kroku 18 (protokół uzupełniający) z wzorem oczekiwanym zgodnie ze strategią Southern blot (przykładowe wyniki patrz w Rycina 4b).
  5. Analiza zdarzeń off-target
    UWAGA: Ponieważ inżynieria genomu za pomocą systemu CRISPR-Cas9 może powodować efekty poza docelowe, należy przeprowadzić amplifikację PCR dziesięciu najwyżej sklasyfikowanych in silico–przewidywane miejsca poza celowe w wybranych klonach i poddać je sekwencjonowaniu metodą Sangera.
    1. Korzystanie z CCTop16 (http://crispr.cos.uni-heidelberg.de), aby wygenerować listę dziesięciu najwyżej ocenianych in silico przewidywane sekwencje off-target.
      1. Wprowadź sekwencję gRNA wraz z PAM użytą do targetowania jako sekwencję zapytania. Wybierz „NGG” jako PAM oraz „Human genome” jako referencję do przewidywania efektów off-target.
      2. Ustaw maksymalną całkowitą liczbę niedopasowań (maximal total mismatches) na „4”, a długość sekwencji docelowej (target site length) na długość gRNA bez sekwencji PAM. Plik wyjściowy dostarczy uszeregowaną listę genomowych miejsc off-target dla odpowiedniego gRNA.
    2. In silico wyodrębnij sekwencję genomową o długości 500 bp powyżej (upstream) i poniżej (downstream) każdego z dziesięciu najwyżej ocenionych trafień poza celami (off-target), korzystając z przeglądarki genomu UCSC (http://genome.edu.ucsc.edu) oraz pozycji trafienia off-target z listy wyników programu CCTop.
    3. Dla każdego z analizowanych miejsc pozacelowych należy zaprojektować parę starterów PCR, która amplifikuje fragment o długości od 600 do 700 pz, obejmujący przewidywane miejsce pozacelowe.
    4. Wyodrębnij gDNA z wybranych klonów oraz komórek Jurkat typu dzikiego, używając komercyjnego zestawu do ekstrakcji gDNA. Dla każdego miejsca poza docelowego przeprowadź reakcję PCR, wykorzystując polimerazę DNA o aktywności korekcyjnej (patrz Tabela 1 i 2 (dotyczące składników PCR i warunków cykliczności) na gDNA typu dzikiego oraz gDNA pochodzącego z odpowiedniego klonu.
    5. Analizuj 5 µL produktów PCR w żelu agarozowym 1,5% w buforze TAE. Po stwierdzeniu obecności prążków o prawidłowej wielkości, pozostałą część produktu PCR należy oczyścić za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania produktów PCR, a następnie poddać sekwencjonowaniu metodą Sangera. Porównaj sekwencje miejsc poza docelowych w komórkach Jurkat oraz w klonach docelowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym reprezentatywnym eksperymencie zdecydowaliśmy się na skierowanie minimalnego reportera pochodnego od HIV-1, składającego się z LTR, sekwencji kodującej tdTomato oraz sekwencji sygnału polyA, do dwóch loci w intronie 5 genu BACH217. Loci do targetowania wybrano na podstawie bliskości do opublikowanych powtarzalnych miejsc integracji zidentyfikowanych w różnych badaniach nad pierwotnymi limfocytami T od pacjentów zakażonych HIV2,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokół generowania modeli reporterowych Jurkat pochodzących z HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa przy użyciu inżynierii genomu opartej na CRISPR-Cas9.

Kilka punktów protokołu wymaga szczególnej uwagi na etapie planowania. Po pierwsze, locus, który ma być docelowy, powinien być starannie wybrany, ponieważ niektóre loci mogą być łatwiejsze do namierzenia niż inne (np. w zależności od statusu chromatyny regionu i samej sekwencji docelowej). Powtarz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Britta Weseloh i Bettina Abel za pomoc techniczną. Dziękujemy również Arne Düsedau i Janie Hennesen (platforma technologiczna cytometrii przepływowej, Heinrich Pette Institut) za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9Addgene42230wektor do ekspresji SpCas9 i gRNA
pMKGeneArtekspresyjny ssaków do klonowania
cDNA3.1Wektor ekspresji ssakówInvitrogenV79020
BbsINew England BiolabsEnzym restrykcyjnyR0539S
NEBuilder Hifi DNA Zestaw do klonowania montażowegoNew England BiolabsE5520SZestaw do klonowania montażowego używany do generowania wektorów docelowych
TaqPlus Precision PCR SystemAgilent Technologies600210Polimeraza DNA z aktywnością korekcyjną stosowana do amplifikacji ramion homologicznych (krok 1.2.2.2), weryfikacji miejsca integracji i sekwencji reporterowej (kroki 3.3.3 i 3.3.5), generowania sondy genomowej dla Southern blot (krok 3.4.1.5) i analizy zdarzeń niedocelowych (krok 3.5.4)
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej (okrągłodenna)TPP92097do rozcieńczania
Polimeraza DNA Phusion High-FidelityNew England BiolabsM0530 LPolimeraza DNA stosowana do wykrywania zdarzeń docelowych (krok 2.4.2) i generowania sondy specyficznej dla reportera dla Southern blot (krok 3.4.1.4)
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD9170dimetylosulfotlenek jako PCR dodatek
Chlorek magnezu (MgCl2) RoztwórNew England BiolabsB9021SMgCl2 jako dodatek do PCR
Roztwór deoksynukleotydu (dNTP) Mieszanina NewEngland BiolabsN0447SdNTP z 10 mM każdego nt do reakcji PCR
5PRIME HotMasterMix5PRIME2200400gotowa do użycia mieszanina PCR używana do przesiewowego PCR (krok 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kitQiagen51106Zestaw do izolacji i oczyszczania DNA
QIAquick PCR Zestaw do oczyszczaniaQiagen28106PCR Zestaw do oczyszczania
RPMI 1640 bez glutaminyPożywka do hodowli komórkowychLonzaBE12-167F
Surowica bydlęca płodu Republika Południowej Afryki OpłataPAN BiotechP123002suplement pożywki
do hodowli komórkowychL-glutaminaBiochromK 0282pożywka do hodowli komórkowych
suplement Penicylina/Streptomycyna 10.000 U/mL/ 10.000 &mikro; g/mLBiochromA 2212suplement pożywki do hodowli komórkowych
Gibco Opti-MEM Reduced Serum MediaThermo Fisher Scientific31985062o obniżonym stężeniu w surowicy zoptymalizowana pod kątem transfekcji
TransIT-JurkatMirus BioMIR2125odczynnik do transfekcji
12-mirysianianu 13-octanSigma-AldrichP8139-1MG odczynnik
JonomycynaSigma-AldrichI0634-1MGodczynnik do hodowli komórkowych
Jednostka filtrująca napędzana strzykawką, membrana PES, 0,22 i mikro; mMillexSLGP033RBdo filtracji sterylnej
Inkubator Heracell 150iTermo Fisher Naukowyinkubator kultur tkankowych
51026280 Amershan Hybond-N+GE HealthcareRPN1520Bdodatnio naładowana membrana nylonowa do blottingu DNA i RNA
Stratalinker 1800Stratagene400072UV Crosslinker
High PrimeZestaw Roche11585592001do znakowania DNA radioaktywnym dCTP przy użyciu losowych oligonukleotydów jako starterów ilustruje
Mikrokolumny ProbeQuant G-50GE Healthcare28-9034-08chromatograficzne kolumny spinowe do oczyszczania znakowanego DNA
wektor do klonowania Płytki do hodowli tkankowych Pożywka do hodowli komórkowych Jednostka filtrująca

Bibliografia

  1. Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
  2. Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
  3. Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells. Nature Communications. 8 (1), 498(2017).
  4. Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection. Cell. 160 (3), 420-432 (2015).
  5. Han, Y., Lassen, K., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  6. Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).
  7. Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345 (6196), 570-573 (2014).
  8. Maldarelli, F., Wu, X., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  9. Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro. The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).
  10. Mack, K. D., Jin, X., et al. HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).
  11. Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).
  12. ZhangLab. CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf (2013).
  13. Moser, F. Addgene. Gibson Assembly Protocol. Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/ (2009).
  14. Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ (2014).
  15. Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ (2013).
  16. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool. Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).
  17. Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection. Virus Research. 249, (2018).
  18. Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems. PloS ONE. 11 (6), e0158294(2016).
  19. Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).
  20. Jensen, K. T., Fløe, L., et al. Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency. FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).
  21. Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).
  22. Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. Position effects influence HIV latency reversal. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

In ynieria genomu CRISPR Cas9miejsca integracji HIV 1rekombinacja homologicznaprzesiew cytometrii przep ywowejklonowanie pojedynczych kom rekweryfikacja metod Southern blotprojektowanie przewodz cego RNAkonstrukcja wektora celuj cegointegracja reportera prowirusowego
Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.