Artykuł metodologiczny

Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC)

DOI:

10.3791/58580

⸱

19 października 2018

 ,  ,  , 
1College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center, Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono szczegółowy protokół stosowania strategii CARIC (ang. click chemistry-assisted RNA-interactome capture) do identyfikacji białek wiążących się zarówno z kodującymi, jak i niekodującymi RNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleksowa identyfikacja białek wiążących RNA (RBP) jest kluczem do zrozumienia potranskrypcyjnej sieci regulacyjnej w komórkach. Szeroko stosowana strategia wychwytywania RBP wykorzystuje poliadenylację [poli(A)] docelowych RNA, która występuje głównie na eukariotycznych dojrzałych mRNA, pozostawiając większość białek wiążących RNA innych niż poli(A) niezidentyfikowanych. W tym miejscu opisujemy szczegółowe procedury niedawno opisanej metody zwanej wychwytywaniem interaktomu RNA wspomaganego chemią kliknięcia (CARIC), która umożliwia wychwytywanie RBP poli(A), jak i nie-poli(A) w całym transkryptomie poprzez połączenie znakowania metabolicznego RNA, sieciowania UV in vivo i znakowania bioortogonalnego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki genom jest transkrybowany na różne typy kodujących i niekodujących RNA (ncRNA), w tym mRNA, rRNA, tRNA, małe jądrowe RNA (snRNA), małe jądrowe RNA (snoRNA) i długie niekodujące RNA (lncRNAs)1. Większość z tych RNA posiada ubranie RBP i funkcjonuje jako cząsteczki rybonukleoproteiny (RNP)2. Dlatego kompleksowa identyfikacja RBP jest warunkiem wstępnym zrozumienia sieci regulacyjnej między RNA a RBP, która jest związana z różnymi chorobami człowieka3,4,5.

W ciągu ostatnich kilku lat byliśmy świadkami ogromnego wzrostu liczby RBP odkrytych w różnych systemach eukariotycznych2,6, w tym human7,8,9,10,11, mouse12,13,14, drożdże9,15,16, danio pręgowany17, Drosophila melanogaster18,19, Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22oraz ludzkie pasożyty23,24,25. Postępy te zostały ułatwione dzięki strategii wychwytywania RBP opracowanej przez Castello i wsp.7 oraz Baltz et al.8 w 2012 roku, który łączy sieciowanie in vivo UV RNA i jego oddziałujących białek, wychwytywanie oligo(dT) poli(A) RNA oraz profilowanie proteomiczne oparte na spektrometrii mas (MS). Jednak biorąc pod uwagę fakt, że poli(A) występuje głównie na dojrzałych mRNA, które stanowią tylko ~3% - 5% transkryptomu eukariotycznego26, ta szeroko stosowana strategia nie jest w stanie wychwycić RBP oddziałujących z RNA innymi niż poli(A), w tym większość ncRNA i pre-mRNA.

Tutaj przedstawiamy szczegółowe procedury niedawno opracowanej strategii przechwytywania w całym transkryptomie zarówno poli(A), jak i niepoli(A) RBPs27. Strategia ta, określana jako CARIC, łączy sieciowanie UV in vivo i znakowanie metaboliczne RNA za pomocą fotoaktywowanych i "klikalnych" analogów nukleozydów (które zawierają bioortogonalną grupę funkcyjną, która może uczestniczyć w reakcji kliknięcia), 4-tiourydyny (4SU) i 5-etynylurydyny (UE). Kroki, które są kluczowe dla uzyskania idealnych wyników dzięki strategii CARIC, to skuteczne znakowanie metaboliczne, sieciowanie UV i reakcja kliknięcia oraz utrzymanie integralności RNA. Ponieważ Cu(I) stosowany jako katalizator w reakcji kliknięcia może powodować fragmentację RNA, niezbędny jest ligand Cu(I), który może zmniejszyć fragmentację RNA. Opisujemy, jak przeprowadzać skuteczne reakcje klikania w lizatach komórkowych bez powodowania poważnej degradacji RNA.

Chociaż przechwytywanie i identyfikacja RBP tylko w komórkach HeLa jest opisana w tym protokole, strategia CARIC może być stosowana do różnych typów komórek i ewentualnie do organizmów żywych. Oprócz wychwytywania RBP, protokół ten zapewnia również usprawnione procedury krok po kroku dotyczące przygotowania próbki SM oraz identyfikacji i kwantyfikacji białek, co może być pomocne dla tych, którzy nie są zaznajomieni z eksperymentami proteomicznymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Jeśli to możliwe, używane odczynniki powinny być zakupione w formie wolnych od RNaz lub rozpuszczonych w rozpuszczalnikach wolnych od RNaz (w większości przypadków, w wodzie uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC)). Podczas pracy z próbkami RNA i odczynnikami wolnymi od RNaz należy zawsze nosić rękawiczki i maski oraz często je zmieniać, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą.

1. Przygotowanie lizatu komórek znakowanych metabolicznie i usieciowanych UV

  1. Inkorporacja metaboliczna EU i 4SU
    1. Hodowla komórek HeLa w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Hodowla ~4 x 107 komórek HeLa (w dwóch 15-centymetrowych szalkach) do przygotowania jednej próbki doświadczalnej lub kontrolnej dla jednego standardowego przebiegu stwardnienia rozsianego.
    2. Gdy wyhodowane komórki HeLa osiągną ~80% konfluencji, usuń pożywkę hodowlaną i dodaj 15 ml podgrzanej świeżej pożywki na 15-centymetrowe naczynie.
    3. Dodać 15 μl na naczynie 100 mM EU (rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)) do końcowego stężenia 1 mM i 7,5 μl na naczynie 100 mM 4SU (rozpuszczonego w PBS) do końcowego stężenia 0,5 mM dla próbek eksperymentalnych i kontrolnych bez UV. Dodać 15 μl na naczynie 100 mM EU (rozpuszczonego w PBS) do końcowego stężenia 1 mM dla próbek kontrolnych no4SU.
      UWAGA: 4SU jest aktywowany fotograficznie; w związku z tym wymagana jest ochrona przed światłem po dodaniu 4SU.
    4. Przykryj naczynia folią i hoduj komórki przez 16 godzin. Dodać połowę ilości EU i 4SU lub tylko EU z kroku 1.1.3 odpowiednio do próbek eksperymentalnych, kontrolnych noUV i no4SU i kontynuuj hodowlę przez kolejne 2 godziny.
  2. Sieciowanie UV in vivo
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną, umyć komórki 3x 5 ml PBS na naczynie i usunąć resztki PBS tak bardzo, jak to możliwe.
      UWAGA: Pozostałości cieczy znacznie zmniejszą wydajność sieciowania.
    2. W przypadku próbek eksperymentalnych i kontrolnych no4SU należy umieścić szalki na lodzie ze zdjętą pokrywką i napromieniować komórki światłem UV o długości fali 365 nm o sile 2 J/cm2 za pomocą środka sieciującego UV.
    3. W przypadku próbek bezkontrolnych UV umieść naczynia na lodzie i chroń je przed światłem.
      UWAGA: Wszystkie poniższe czynności dla próbek kontrolnych bez promieniowania UV należy wykonywać w zaciemnionym pomieszczeniu.
  3. Liza i homogenizacja komórek
    1. Dodaj 1 ml na miskę buforu do wstępnej lizy (10 mM Tris∙HCl, pH 7,5, 50 mM LiCl, 0,02% Nonidet P-40 i koktajl inhibitorów proteazy bez kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)) do komórek. Zeskrobać komórki za pomocą gumowego podnośnika do komórek i zebrać zawiesinę do lizy wstępnej do probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Ten krok przerwie błonę komórkową i uwolni rozpuszczalne białka cytoplazmatyczne i RNA. NIE WOLNO odwirowywać probówki i usuwać supernatant.
    2. W przypadku zawiesiny z dwóch 15-centymetrowych naczyń należy dostosować objętość do 6 ml, dodając bufor do lizy wstępnej. Dodać do zawiesiny przed lizą równą objętość buforu R-lizy (200 mM Tris∙HCl, pH 7,5, 500 mM LiCl, 2% dodecylosiarczanu litu [LDS]).
    3. Homogenizować lizat komórkowy, przepuszczając go kilkakrotnie przez strzykawkę z wąską igłą (27-G), aż lizat będzie klarowny i jednorodny. Inkubować lizat w temperaturze 4 °C z delikatnymi obrotami (~15 obr./min) przez 1 h.
      UWAGA: Ten ostatni krok pozwoli na całkowitą denaturację białek. Lizat można bezpiecznie przechowywać w temperaturze -70 °C przez okres do jednego miesiąca.
  4. Przygotowanie do reakcji na kliknięcie
    1. Rozcieńczyć lizat, dodając 20 objętości buforu rozcieńczającego (50 mM Tris∙HCl, pH 7,5) i podzielić go na 15 ml frakcji.
      UWAGA: Roztwory zawierające wysokie stężenie soli i detergentu będą miały negatywny wpływ na skuteczność reakcji kliknięcia katalizowanej przez Cu(I); W związku z tym należy zmienić bufor lizatu.
    2. Zagęścić każdą frakcję za pomocą rurki ultrafiltracyjnej o pojemności 15 ml (z granicą masy cząsteczkowej 10 kDa), aż objętość będzie mniejsza niż 1 ml. Za pomocą wirnika z wahliwym kubełkiem obracać rurkę ultrafiltracyjną o sile 4 000 x g w temperaturze 4 °C przez ~15 min.
    3. Dodać 14 ml buforu rozcieńczającego do zagęszczonej frakcji lizatu i powtórzyć krok 1.4.2. Połączyć frakcje i zagęścić je do objętości 6 ml za pomocą ultrafiltracji (4 000 x g w temperaturze 4 °C przez ~15 min).
      UWAGA: Większość soli i LDS zostanie teraz usunięta, więc lizat jest gotowy na reakcję kliknięcia. Lizat można przechowywać w temperaturze -70 °C przez okres do jednego tygodnia. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ spowodują one znaczną degradację RNA. Podwielokrotnić lizat, jeśli wymagane są charakterystyki na małą skalę.

2. Przygotowanie próbek do wychwytu RNA-interaktomu

  1. Wstępne oczyszczanie lizatu
    1. Dodaj 100 μl kulek magnetycznych streptawidyny na 6 ml lizatu i delikatnie obracaj (~15 obr./min) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby wyeliminować naturalnie biotynylowane białka.
    2. Granulki obrabiać za pomocą magnesu (przez ~20 min w temperaturze 4 °C) i przenieść wstępnie oczyszczony lizat do nowej probówki.
  2. Wydajność reakcji na kliknięcie
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną: 6,5 μl biotyny (100 mM biotyny azydkowo-biotynowej rozpuszczonej w dimetylosulfotlenku [DMSO] o końcowym stężeniu 100 μM), 3,25 μl bulionu miedziowego (uczynić go świeżym; 1 M CuSO4 rozpuszczony w wodzie o końcowym stężeniu 500 μM), 65 μL zapasu liganda (200 mM THPTA rozpuszczonego w wodzie o końcowym stężeniu 2 mM), i 262,75 μLH2O.
      UWAGA: THPTA oznacza Tris[(1-hydroksypropylo-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]aminę.
    2. Dodaj mieszaninę reakcyjną do 6 ml wstępnie oczyszczonego lizatu i dobrze wymieszaj. Następnie dodać 162,5 μl odczynnika redukującego (świeży; 40 mg/ml askorbinianu sodu o końcowym stężeniu 5 mM) do lizatu i dobrze wymieszać. Ostateczna objętość powinna wynosić 6,5 ml.
    3. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej (800 obr./min). Dodać 5 mM EDTA do mieszaniny reakcyjnej i inkubować ją przez 5 minut w celu wygaszenia reakcji.
  3. Charakteryzacja na małą skalę
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną jak w kroku 2.2.1 z zapasem biotyny zastąpionym barwnikiem (np. 100 mM azydek-Cy5 rozpuszczony w DMSO).
      UWAGA: Ilość odczynnika należy dostosować do objętości lizatu. Zazwyczaj 20 μl podwielokrotności lizatu wystarcza do charakteryzacji, takich jak analiza fluorescencji w żelu.
    2. Dodać mieszaninę reakcyjną do lizatu i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie dodać jedną trzecią objętości buforu próbki LDS (4x), denaturować go w temperaturze 55 °C przez 5 minut i rozpuścić próbkę na 10% żelu bis-Tris.
      UWAGA: Aby potwierdzić, że sygnał fluorescencji jest prezentowany na RNA, dołącz kontrole z trawieniem RNazy A po reakcji kliknięcia.
  4. Oczyszczanie mieszaniny reakcyjnej
    1. Dodać osiem objętości wstępnie schłodzonego metanolu (100%) do wygaszonej mieszaniny reakcyjnej i inkubować ją przez 30 minut w temperaturze -30 °C w celu wytrącenia. Przeprowadzić wytrącanie w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Jeśli całkowita objętość jest większa niż 50 ml, podziel mieszaninę reakcyjną na dwie stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml.
    2. Przygotować bufor do rozpuszczenia: połączyć jedną objętość buforu A (4% dodecylosiarczanu sodu [SDS] i 10 mM EDTA) z ośmioma objętościami buforu B (1% Brij-97, 150 mM NaCl i 50 mM trietanoloaminy, pH 7,4).
    3. Wirować przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Dodaj ~1 - 2 ml wstępnie schłodzonego metanolu do granulatu. Pipetuj w górę iw dół, aby rozbić osad i upewnij się, że pastylka jest całkowicie zawieszona bez widocznych kawałków. Napełnij probówkę wstępnie schłodzonym metanolem. Powtórz ten krok 2 razy.
    4. Wirować przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Włożyć probówki z powrotem i ponownie odwirować przy 4 000 x g przez 5 minut. Ostrożnie wyciągnij resztki metanolu tak bardzo, jak to możliwe, nie naruszając osadu.
    5. Dodać 10 ml buforu do rozpuszczenia do osadu. Pipetować w górę i w dół, aby rozpuścić osad. Wirować przy 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Przenieść supernatant do nowej probówki. Pobrać 20 μl próbki do kontroli jakości (patrz sekcja 4).
      UWAGA: Teraz próbka jest gotowa do wychwycenia RNA-interaktomu. Zrekonstytuowaną próbkę można przechowywać w temperaturze -70 °C przez okres do jednego tygodnia.

3. Wychwyt RNA-interaktomu

  1. Przygotowanie kulek streptawidyny-agarozy
    1. Pobrać 1 600 μl zawiesiny streptawidyny i agarozy (800 μl osadzonych kulek) na 10 ml odtworzonej próbki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    2. Wirować kulki w odległości 4000 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadzonych kulek.
    3. Umyj kulki 10 ml 50 mM Tris∙HCl (pH 7,5). Odwirować kulki (4 000 x g przez 5 min) i usunąć supernatant. Powtórz ten krok 2 razy.
  2. Rozwijanie powinowactwa
    1. Przenieść oczyszczoną i odtworzoną próbkę z etapu 2.4.6 do kulek streptawidyny i agarozy (patrz etap 3.1). Inkubować przez noc z delikatnym obracaniem w temperaturze 4 °C.
  3. Mycie kulek streptawidyny
    1. Odwirować kulki (4 000 x g przez 5 minut) i przenieść supernatant do nowej probówki. Zebrać 20 μl próbki do kontroli jakości.
    2. Przemyć kulki 10 ml buforu do przemywania A (2% SDS w PBS, pH 7,4). Inkubować przez 10 minut z delikatnymi obrotami (~12 obr./min) w temperaturze pokojowej. Odwirować kulki (4 000 x g przez 5 min) i usunąć supernatant. Powtórz 1x.
    3. Powtórzyć krok 3.3.2 z buforem do przemywania B (8 M mocznika i 250 mM NH4HCO3 rozpuszczone w wodzie). Powtórzyć krok 3.3.2 z buforem przemywania C (2,5 M NaCl w PBS, pH 7.4). Następnie umyj kulki 10 ml 50 mM Tris∙HCl (pH 7,5). Odwirować kulki (4 000 x g przez 5 min) i usunąć supernatant.
    4. Podziel kulki równomiernie i przenieś je do dwóch probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  4. Elucja wychwyconych RNP
    1. Przygotować bufor elucyjny biotyny: 12,5 mM biotyny, 75 mM NaCl, 7,5 mM Tris∙HCl (pH 7,5), 1,5 mM EDTA, 0,15% SDS, 0,075% sarkozylu i 0,02% deoksycholanu sodu.
      UWAGA: Bufor należy przechowywać w temperaturze pokojowej, ponieważ biotyna może wytrącać się w temperaturze 4 °C.
    2. Do 400 μl przemytych osiadłych kulek dodać 400 μl buforu elucyjnego biotyny.
    3. Inkubować je na wytrząsarce orbitalnej (1 500 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie inkubować na wytrząsarce orbitalnej z blokiem grzewczym (1 500 obr./min, 65 °C) przez 10 minut. Odwiruj kulki (7 800 x g przez 1 min) i zbierz eluowany RNP.
    4. Do kulek dodać 400 μl świeżego buforu elucyjnego do elucji biotyny i powtórzyć krok 3.4.3. Połącz dwie eluty w jednej probówce o pojemności 15 ml.
  5. Trawienie RNaz
    1. Dodać trzy objętości buforu rozcieńczającego do eluowanego RNP w celu zmniejszenia stężenia SDS. Zagęścić rozcieńczoną próbkę za pomocą 0,5 ml rurki ultrafiltracyjnej (o granicy masy cząsteczkowej 10 kDa; wirować przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez ~30 min) do ~40 μl.
    2. Dodać 0,5 μg/μl RNazy A i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w celu uwolnienia RBP z usieciowanych RNA. Zebrać 2 μl RBP w celu kontroli jakości (patrz sekcja 4).

4. Kontrola jakości

  1. Kontrola skuteczności rozwijania powinowactwa
    1. Pobrać 10 μl próbki "przed pobraniem" z kroku 2.4.6 i 10 μl próbki "po pobraniu" z kroku 3.3.1.
    2. Próbki należy analizować przy użyciu standardowych procedur western blot (10% żel bis-Tris).
    3. Wybarwić membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) koniugatem streptawidyny-HRP w celu monitorowania sygnałów pozostałości biotyny próbki "po pobraniu".
      UWAGA: Jeśli sygnał biotyny w próbce "po pobraniu" jest większy niż jedna piąta sygnału próbki "przed pobraniem", należy zwiększyć ilość kulek streptawidyny-agarozy użytych w kroku 3.1.1.
  2. Kontrola całkowitej skuteczności wychwytywania
    1. Pobrać 2 μl uwolnionej próbki RBP z kroku 3.5.2 i 0,5 μl próbki "przed pobraniem" (jako 0,1% danych wejściowych) z kroku 2.4.6.
    2. Próbki należy przeanalizować przy użyciu standardowych procedur barwienia srebrem.
      1. Utrwalić żel buforem utrwalającym (40% etanol, 10% kwas octowy) przez 20 minut, a następnie uczulić (13 mM Na2S2O3, 83 mM octan sodu, 30% etanolu) przez 30 minut.
      2. Żel myć 3x wodą przez 5 min, a następnie barwić go roztworem 15 mM AgNO3 przez 20 min. Żel myć 2x wodą przez 1 min, rozprowadzić go w 0,24 M Na2CO3 i 0,012% formaldehydu, a na koniec 45 mM EDTA, gdy barwienie jest wystarczające.
        UWAGA: Intensywność barwienia srebrem wychwyconych RBP powinna być podobna do intensywności wsadu 0,1%.

5. Przygotowanie próbek do MS

  1. Trawienie trypsyny w żelu wychwyconych RBP28
    1. Dodaj jedną czwartą objętości bufora próbki SDS (5x) do zwolnionych próbek RBP z kroku 3.5.2. denaturacja próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
    2. Rozpuścić RBP na 1,5-milimetrowym żelu poliakryloamidowym o stężeniu 10%.
    3. Zabarwić żel srebrem, postępując zgodnie ze standardowymi protokołami.
    4. Wyciąć tor próbki eksperymentalnej lub próbki kontrolnej za pomocą żelu do układania w stos i usunąć główne pasmo RNazy A (~15 kDa).
    5. Pokrój wycięty pas na małe kawałki (~1 - 1,5 mm x ~1 - 1,5 mm).
      UWAGA: Najkrótsza krawędź kawałka żelu nie powinna być krótsza niż 1 mm, aby zapobiec zatykaniu się końcówek pipet.
    6. Przenieść kawałki żelu do probówki mikrowirówkowej i odbarwić buforem odbarwiającym (mieszanina o równych objętościach 100 mM Na2S2O3 i 30 mM K3 [Fe(CN)6]).
    7. Umyj kawałki żelu 200 mM wodorowęglanem amonu (ABC), aż kawałki żelu staną się całkowicie bezbarwne.
    8. Odwodnić kawałki żelu w 1 ml czystego acetonitrylu (ACN). Ponownie nawodnić za pomocą 200 μl 10 mM ditiotreitolu (rozpuszczonego w 50 mM ABC) i inkubować w temperaturze 56 °C przez 45 min.
      UWAGA: Całkowicie odwodnione kawałki żelu powinny być bardzo twarde i nieprzezroczyste. Jeśli kawałki żelu są nadal miękkie po odwodnieniu, usuń ACN i dodaj 1 ml czystego ACN, aby ponownie się odwodnić.
    9. Kawałki żelu schłodzić do temperatury pokojowej. Dodać 200 μl 58 mM jodoacetamidu (rozpuszczonego w 50 mM ABC) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut w ciemności.
    10. Po krótkim umyciu wodą, odwodnić kawałki żelu w 1 ml czystego ACN.
      UWAGA: Kawałki żelu muszą być całkowicie odwodnione.
    11. Ponownie uwodnić kawałki żelu odpowiednią ilością 10 ng/μl trypsyny (rozpuszczonej w 50 mM ABC) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 - 16 h.
      UWAGA: Kawałki żelu powinny być całkowicie nawodnione, bez nieprzezroczystych rdzeni. Usuń nadmiar płynu.
  2. Znakowanie dimetylowe stabilnych izotopów trawionych peptydów29
    1. Wyekstrahować strawione peptydy z kawałków żelu, dodając 200 μl buforu ekstrakcyjnego (5% kwasu mrówkowego i 50% ACN w wodzie) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut z wirowaniem (przy 1 200 obr./min).
    2. Powtórz krok 5.2.1 2x. Połącz ekstrakty w jednej probówce do mikrowirówki.
    3. Wysuszyć wyekstrahowane peptydy przez wirowanie próżniowe.
    4. Rozpuść peptydy w 200 μl 100 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB, pH 8,5).
      UWAGA: Kroki 5.2.4 - 5.2.6 należy wykonywać na lodzie w dygestorium.
    5. Dodać 8 μl 4%CH2O i 8 μL 4% 13CD2O odpowiednio do próbek doświadczalnych i kontrolnych.
      UWAGA: Aby kontrolować odchylenie znakowania stabilnego izotopu, zamień stabilny izotop na próbki eksperymentalne i kontrolne innej biologicznie niezależnej kontrpróby.
    6. Dodaj 8 μl 0,6 M NaBH3CN (spraw, aby było świeże) i dobrze wymieszaj.
    7. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z wirowaniem.
    8. Ostudzić próbki na lodzie. Ugasić reakcję, dodając 32 μl 1% wodnego roztworu amoniaku. Następnie należy dalej wygaszać reakcję, dodając 16 μl kwasu mrówkowego.
    9. Połączyć próbkę doświadczalną z odpowiednią próbką kontrolną w jednej probówce do mikrowirówki. Wysuszyć próbki przez odwirowanie próżniowe.
  3. Frakcjonowanie peptydów znakowanych dimetylu
    1. Przygotuj końcówki do ekstrakcji typu stop-and-go-seed (StageTips)30.
      1. Włóż membranę C18 do przedłużonej końcówki o pojemności 10 μl.
      2. Dodaj 300 μg kulek C18 o wysokim pH zawieszonych w ACN do końcówki.
      3. Umieść końcówkę pionowo w probówce do mikrowirówki z domowym stojakiem, który może ustabilizować końcówkę i podnieść końcówkę z dna.
      4. Obracaj końcówką o masie 1 400 x g przez 2 minuty. Wyrzuć przepływ.
      5. Umyj końcówkę 50 μl 80% ACN w 10 mM ABC (pH 10,0). Powtórz 1x.
        UWAGA: Dostosuj pH 10 mM roztworu ABC, dodając 28% wodorotlenku amonu.
      6. Umyj końcówkę 50 μl 50% ACN w 10 mM ABC (pH 10,0). Powtórz 1x.
      7. Umyj końcówkę 50 μl 10 mM ABC (pH 10,0). Powtórz 1x.
    2. Rozpuść peptydy w 50 μl 10 mM ABC (pH 10,0).
    3. Dodać odtworzoną próbkę do przygotowanej końcówki. Ponownie załaduj przepływ do końcówki, aby zapewnić skuteczne wiązanie peptydów.
    4. Umyj końcówkę 50 μl 10 mM ABC (pH 10,0). Powtórz 1x.
    5. Eluuj peptyd stopniowo przez 12 frakcji za pomocą 50 μl 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80% i 6% ACN w 10 mM ABC (pH 10,0).
    6. Połącz dwie frakcje w równym przedziale (ułamek 1 z 7, 2 z 8 i tak dalej), aby uzyskać sześć połączonych ułamków.
    7. Wysuszyć próbki przez odwirowanie próżniowe. Wysuszone peptydy można przechowywać w temperaturze -30 °C.

6. Wydajność MS i analiza danych

  1. Analiza peptydów metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w tandemie
    1. Rozpuść wysuszone frakcje peptydowe z kroku 5.3.7 w 15 μl wody zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego. Sprawdź pH rozpuszczonych peptydów, narysowując 1 μl roztworu na pasku pH (pH powinno być poniżej 3).
    2. Odtworzoną próbkę wstrzyknąć do kolumny do chromatografii cieczowej (LC). Zastosować odpowiedni gradient rozpuszczalnika (rozpuszczalnik A to woda zawierająca 0,1% kwasu mrówkowego, rozpuszczalnik B to ACN zawierający 0,1% kwasu mrówkowego) w wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Typowy gradient rozpuszczalnika B jest następujący: 5% - 35% w 40 minut; 35% - 70% w 4 min; i utrzymywany na poziomie 75% przez 10 min.
    3. Zjonizuj eluowane peptydy za pomocą elektrorozpylania i uruchom spektrometr masowy w trybie zależnym od danych. Wybierz 15 najliczniej występujących jonów (wielokrotnie naładowanych: 2+, 3+ lub więcej) w początkowym skanowaniu MS do skanowania za pomocą tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) (dysocjacja wywołana zderzeniem, CID). Ustaw rozmiar wykluczenia dynamicznego na 500 z maksymalnym czasem trwania 25 s.
  2. Identyfikacja i kwantyfikacja białek przy użyciu MaxQuant31
    1. Ustaw współczynnik fałszywych odkryć (FDR) identyfikacji białek na 0,01 i ustaw liczbę unikalnych peptydów na 2, aby zwiększyć dokładność i niezawodność.
    2. Ustaw minimalny wymagany stosunek liczb (unikatowy + brzytwa) dla kwantyfikacji białka na 2 i włącz funkcje Ponownie kwantyfikuj i Dopasuj między przebiegami.
  3. Ocena istotności wzbogacenia przy użyciu pakietu R/Bioconductor limma32
    1. Wykonaj moderowany test t zaimplementowany w limma, aby przetestować zmianę Log2-krotności w stosunku do zera z co najmniej trzech kontrprób biologicznych. Użyj funkcji read.table, aby odczytać tabelę danych. Następnie użyj funkcji lmFit i eBayes do dopasowania danych. Użyj funkcji topTable, aby wyeksportować wyniki obliczeń (w tym uśrednioną zmianę Log2-krotność i wartości P).
    2. Skoryguj wartości P za pomocą metody Benjaminiego-Hochberga do sterowania FDR.
    3. Zastosuj FDR równy 0,01, aby wygenerować listę białek znacznie wzbogaconych w próbkach eksperymentalnych. Ustaw granicę dwu- lub trzykrotnej zmiany, aby jeszcze bardziej kontrolować wyniki fałszywie dodatnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowane są reprezentatywne wyniki etapów kontroli jakości. Wyniki obejmują dane liczbowe z analizy fluorescencji w żelu opisanej w kroku 2.3.2 (Rysunek 1), analizy western blot opisanej w kroku 4.1.3 (Rysunek 2A) oraz analizy barwienia srebrem opisanej w kroku 4.2.2 (Rysunek 2B). Etapy kontroli jakości mają kluczowe znaczenie dla optymalizacji protokołów CARIC. Przygotowanie eksperymentów identyfikacyjnych RBP na dużą skalę ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrzymanie prawidłowej integralności RNA jest jednym z kluczy do udanych eksperymentów CARIC. Przy odpowiednich ligandach Cu(I) i ostrożnej pracy degradacja RNA może być znacznie zmniejszona, chociaż zaobserwowano częściową degradację. Współczynniki substytucji EU i 4SU w próbkach eksperymentalnych wynoszą odpowiednio 1,18% i 0,46% (dane nie pokazane). W przypadku nienaruszonych RNA o długości 2,000 nt, ~90% RNA zawiera co najmniej jeden EU i jeden 4SU. W przypadku częściowo zdegradowanych RNA o długości 1,000 nt, ~70% R...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin Granty 91753206, 21425204 i 21521003 oraz przez Narodowy Kluczowy Projekt Badawczo-Rozwojowy 2016YFA0501500.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HeLaATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Thermo Fisher Scientific11995065
FBS (Surowica bydlęca płodu)Thermo Fisher Scientific10099141
Penicylina i StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122
UE (5-etynylourydyna)Wuhu Huaren Co.CAS: 69075-42-9
4SU (4-tiourydyna)Sigma AldrichT4509
10 i razy; PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Thermo Fisher ScientificAM9625
Sieciownik UVPCL-1000Wyposażony w lampę UV 365 nm
DEPC (pirowęglan dietylu)Sigma AldrichD5758Do uzdatniania wody. Wysoce toksyczny!
Trójkąt i kropka środkowa; HCl, pH 7,5Thermo Fisher Scientific15567027
LiClSigma Aldrich62476
Nonidet P-40Biodee74385
Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTAThermo Fisher Scientific88265Jedna tabletka na 50 ml buforu do lizy.
LDS (dodecylosiarczan litu)Sigma AldrichL9781
15-mL rurka ultrafiltracyjna (odcięcie 10 kDa)MiliporeUFC901024
0,5-mL ultrafiltracyjna rurka (odcięcie 10 kDa)MilliporeUFC501096
Streptawidyna Kulki magnetyczneThermo Fisher Scientific88816
DMSO (dimetylosulfotlenek)Sigma Aldrich41639
Azide-biotynaClick Narzędzia chemiczneAZ104
Siarczan miedzi(II)Sigma AldrichC1297
THPTA [Tris(3-hydroksypropylotriazolylo)amina]Sigma Aldrich762342
Askorbinian soduSigma Aldrich11140
Azide-Cy5Kliknij Narzędzia chemiczneAZ118
Bufor próbek LDS (4& razy;)Thermo Fisher ScientificNP0008
10% żel bis-TrisThermo Fisher ScientificNP0301BOX
EDTAThermo Fisher ScientificAM9260G
RNaza ASigma AldrichR6513
SDS (dodecylosiarczan sodu)Thermo Fisher Scientific15525017
NaClSigma AldrichS3014
Brij-97 [Polioksyetyleno(20) eter oleilowy]J& K315442
TrietanoloaminaSigma AldrichV900257
Streptawidyna agarozaThermo Fisher Scientific20353
MocznikSigma AldrichU5378
Sarkosyl (N-Lauroilsarkozyna sól sodowa)Sigma Aldrich61743
BiotynaSigma AldrichB4501
Deoksycholan soduSigma Aldrich30970
MaxQuantWersja: 1.5.5.1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128(2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068(2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNA binding ProteinsClick ChemistryRNA interactome CaptureMetabolic LabelingUV Cross linkingBioorthogonal TaggingStreptavidin Agarose BeadsMass SpectrometryWestern Blot AnalysisIn gel Fluorescence

Powiązane artykuły