Tutaj opisujemy metodę oczyszczania nienaruszonych chloroplastów z liści Arabidopsis i ich trzech głównych podkomór (otoczka, zrąb i tylakoidy), używając kombinacji wirowania różnicowego, ciągłych gradientów Percoll i nieciągłych gradientów sacharozy. Metoda ta jest cenna dla subplastydialnej i subkomórkowej lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu i proteomiki.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie podkompartmentów chloroplastowych z Arabidopsis do analizy lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu lub proteomiki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chloroplasty są głównymi składnikami komórek roślinnych. Takie plastydy spełniają wiele kluczowych funkcji, takich jak asymilacja węgla, siarki i azotu, a także synteza niezbędnych metabolitów. Te organelle składają się z następujących trzech kluczowych podprzedziałów. Otoczka, charakteryzująca się dwiema błonami, otacza organelle i kontroluje komunikację plastydu z innymi przedziałami komórkowymi. Zrąb jest rozpuszczalną fazą chloroplastu i głównym miejscem, w którym dwutlenek węgla jest przekształcany w węglowodany. Błona tylakoidowa to wewnętrzna sieć błonowa składająca się z grana (płaskich skompresowanych woreczków) i blaszek (mniej gęstych struktur), w której zachodzi fotosynteza tlenowa. Niniejszy protokół opisuje krok po kroku procedury wymagane do oczyszczania, przy użyciu wirowania różnicowego i gradientów Percollu, nienaruszonych chloroplastów z Arabidopsis i ich frakcjonowania, przy użyciu gradientów sacharozy, w trzech podkompartmentach (tj. Otoczce, zrębie i tylakoidach). Protokół ten zawiera również instrukcje, jak ocenić czystość tych frakcji za pomocą markerów związanych z różnymi podkompartmentami chloroplastów. Opisana tutaj metoda jest cenna dla subplastydowej lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu, ale także dla proteomiki subkomórkowej i subplastydialnej oraz innych badań.
Wprowadzenie
Chloroplasty są głównymi składnikami komórek roślinnych. Pochodzą od przodka sinic, który przeszedł endosymbiozę i ostatecznie wyewoluował jako organella podczas ewolucji1,2. Takie organelle zawierają trzy główne przedziały (Ryc. 1). System otoczki składa się z wewnętrznej i zewnętrznej membrany otaczającej organelle. Ten system podwójnej błony zawiera różne enzymy biorące udział w metabolizmie lipidów i pigmentów i jest głównie poświęcony kontroli komunikacji między plastydami a cytozolem. Zawiera różne systemy transportowe, które umożliwiają import białek kodowanych jądrowo oraz wymianę jonów i metabolitów między cytozolem a chloroplastem, regulując w ten sposób podstawowe funkcje metaboliczne komórki roślinnej3,4. Zrąb, rozpuszczalna faza chloroplastu, zawiera enzymy cyklu Calvina (asymilacja CO2), syntezę różnych metabolitów, w tym aminokwasów i witamin, oraz mechanizmy transkrypcji i translacji plastydu. Błona tylakoidowa jest szeroko zorganizowaną wewnętrzną siecią błonową, w której zachodzi lekka faza fotosyntezy. W związku z tym chloroplasty są miejscem, w którym zachodzą niezbędne szlaki metaboliczne5.
Aby rozszyfrować nowe mechanizmy regulacyjne kontrolujące dynamikę i fizjologię chloroplastów, zdefiniowanie subplastydowej lokalizacji białek chloroplastowych jest zatem niezbędne do wsparcia ukierunkowanych badań mających na celu lepsze zrozumienie funkcji białek w organizmach modelowych6. Aby uzyskać dostęp do prawdziwej subplastydialnej lokalizacji tych białek, konieczne jest zatem rozpoczęcie od wysoce czystych frakcji subplastydowych (błony otoczkowe, zrąb i tylakoidy). W tym kontekście, celem niniejszego protokołu jest oczyszczenie nienaruszonych chloroplastów z liści Arabidopsis za pomocą wirowania różnicowego i ciągłych gradientów Percollu oraz frakcjonowanie ich przy użyciu nieciągłych gradientów sacharozy, w trzech podprzedziałach (tj. otoczce, zrębie i tylakoidach). Opisana tutaj metoda zawiera również instrukcje dotyczące oceny czystości oczyszczonych frakcji podorganellarnych przy użyciu markerów związanych z różnymi podkompartmentami chloroplastów. Protokół ten jest cenny dla subplastydialnej lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu oraz dla dalszej analizy oczyszczonych frakcji przy użyciu badań proteomicznych opartych na spektrometrii mas (MS).
Protokół
1. Przygotowanie, roztworów podstawowych i gradientów
- Przygotować następujące roztwory podstawowe, które mogą być przechowywane do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.
- Przygotować 1 l buforu trycyny (1 M, pH 8,4) i buforu trycyny (1 M, pH 7,6). Dostosuj pH, dodając granulki KOH.
- Przygotować 1 l kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 0,5 M, pH 8) i buforu kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS) (1 M, pH 7,8). Dostosuj pH, dodając granulki NaOH.
- Przygotować 50 ml MgCl2 (1 M).
- Przygotować 50 ml roztworów inhibitorów proteazy: fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF w izopropanolu, 100 mM), hydratu chlorowodorku benzamidyny (100 mM) i kwasu ε-aminokapronowego (50 mM).
UWAGA: Podczas gdy PMSF i kwas aminokapronowy są stabilne w roztworze przez miesiące w temperaturze 4 °C, roztwór benzamidyny należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Na dzień przed eksperymentem przygotować następujące roztwory i przechowywać wszystkie roztwory w temperaturze 4 °C.
- Przygotować 4 l podłoża mielącego o pH 8,4 zawierającego Tricine-KOH (20 mM, pH 8,4), sorbitol (0,4 M), EDTA (10 mM, pH 8) i NaHCO3 (10 mM). Dostosuj pH, dodając granulki NaOH. Dodać albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 0,1% (w/v) tuż przed użyciem i dobrze wymieszać.
- Przygotować 500 ml pożywki myjącej (2 x) o pH 7,6 zawierającej Tricine-KOH (20 mM, pH 7,6), sorbitol (0,8 M), MgCl2 (5 mM) i EDTA (2,5 mM). Dostosuj pH, dodając granulki NaOH. Rozcieńczyć taki roztwór po przygotowaniu gradientowego roztworu Percollu w celu uzyskania pożywki myjącej (1 x).
- Przygotować 200 ml gradientowego roztworu Percoll do oczyszczania chloroplastów, mieszając Percoll z medium myjącym (2 x) o równej objętości, aby uzyskać końcowy roztwór o stężeniu 50% (v/v) Percoll / 0,4 M sorbitolu.
- Przygotować 50 ml roztworów sacharozy do frakcjonowania chloroplastów, mieszając MOPS (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM) i różne stężenia sacharozy (0,3 M, 0,6 M i 0,93 M).
- Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj następujące gradienty i.
- Przygotować sześć probówek gradientów Percoll (każda zawierająca 30 ml 50% Percollu / 0,4 M sorbitolu) przez odwirowanie przy 38 700 x g przez 55 minut w temperaturze 4 °C. Trzymać hamulec wyłączony, aby zapobiec mieszaniu się gradientów. Po odwirowaniu probówki zawierające wstępnie uformowane gradienty należy przechowywać w chłodnym pomieszczeniu do czasu użycia.
- Przygotuj cztery probówki z gradientami sacharozy, z których każda składa się z trzech następujących warstw sacharozy: 3 ml 0,93 M, 2,5 ml 0,6 M i 2 ml 0,3 M sacharozy. Ostrożnie nałóż każdą warstwę za pomocą pompy perystaltycznej, zaczynając od 0,93 m na dole, a kończąc na 0,3 m na górze.
- Przygotować 50 ml pożywki hipotonicznej do lizy chloroplastów zawierającej MOPS (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM), PMSF (1 mM, w roztworze izopropanolu), hydrat chlorowodorku benzamidyny (1 mM) i kwas ε-aminowo-kapronowy (0,5 mM). Przechowywać bufor na lodzie do czasu użycia.
- Przygotować 50 ml buforu do płukania membrany zawierającego MOPS (10 mM, pH 7,8), PMSF (1 mM), hydrat chlorowodorku benzamidyny (1 mM) i kwas ε-aminokapronowy (0,5 mM). Przechowywać bufor na lodzie do czasu użycia.
2. Wzrost i zbiór liści Arabidopsis
- Do wzrostu roślin Arabidopsis przygotuj 4 duże plastikowe patelnie (o łącznej powierzchni od 0,5 do 1 m2) roślin Arabidopsis, wysiewając 30 mg nasion na każdej patelni. Uprawiaj rośliny Arabidopsis przez 5 tygodni w 12-godzinnym cyklu świetlnym w temperaturze 23 °C (dzień) / 18 °C (noc) przy natężeniu światła 150 μM m-2 s-1.
- Inkubować rośliny w ciemnym i chłodnym pomieszczeniu (4 °C) przez noc przed eksperymentem (w celu zmniejszenia ilości granulek skrobi w chloroplastach).
- Zważ wstępnie zlewkę o pojemności 1 l, a następnie umieść ją na lodzie przed rozpoczęciem zbioru materiału liściowego.
- Zbieraj liście Arabidopsis, unikając gleby (kompostu). Ponownie zważyć zlewkę i zanotować masę tkanki.
UWAGA: Oczekuje się, że z czterech patelni pojawi się od 400 do 500 g materiału liściowego. - Homogenizować liście w chłodnym pomieszczeniu z 2 litrami bufora do mielenia (dodać BSA przed użyciem) trzy razy/2 s za każdym razem, w blenderze na wysokich obrotach.
- Przefiltruj homogenat w chłodni za pomocą 4 warstw muślinu i jednej warstwy nylonu blutex. Delikatnie ściśnij liście homogenatu wewnątrz muślinu/nylonu blutex, aby wydobyć cały płyn.
- Odzyskaj pozostałą tkankę w kubku blendera do drugiej ekstrakcji. Powtórz kroki 2,5 i 2,6, używając 2 litrów środka do mielenia i nowych 4-5 warstw muślinu (w chłodnym pomieszczeniu).
3. Oczyszczanie surowych chloroplastów za pomocą wirowania różnicowego
- Równomiernie rozprowadzić surowy ekstrakt komórkowy do sześciu butelek o pojemności 500 ml i umieścić butelki na lodzie przed odwirowaniem. Wirować przez 2 minuty, gdy tylko zostanie osiągnięta maksymalna prędkość (2 070 x g) (maksymalne przyspieszenie i hamowanie włączone, 4 °C).
- Delikatnie odrzucić supernatant.
- Odessać pozostały supernatant za pomocą pompy wodnej i przechowywać granulki zawierające skoncentrowane surowe chloroplasty na lodzie.
- Delikatnie zawiesić granulki, dodając minimalną objętość pożywki myjącej (1 x) (końcowa objętość połączonych zawiesin chloroplastowych = 36 ml) za pomocą pędzla lub zakrzywionej plastikowej szpatułki. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml dodaj 3 ml środka myjącego do każdej butelki.
UWAGA: Nie należy używać pipet z bardzo cienkimi końcówkami, aby uniknąć pękania chloroplastów. Możesz też przeciąć niebieską końcówkę pipety żyletką, aby uzyskać większy otwór. - Zebrać zawieszone chloroplasty w jednej probówce za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę, aby uzyskać jednorodną zawiesinę przed załadowaniem na gradienty Percoll.
4. Oczyszczanie nienaruszonych chloroplastów na ciągłym gradiencie perkolu
- Powoli załaduj 6 ml zawiesiny chloroplastów na wierzch każdego z sześciu gradientów Percollu za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aby uniknąć pęknięcia chloroplastów.
- Wirować pochyłości przez 10 minut przy 13 300 x g, 4 °C za pomocą wirnika z wahliwym kubełkiem.
UWAGA: Przyspieszenie powinno być powolne, a hamulec powinien być odłączony (hamulec wyłączony lub powolne zwalnianie), aby zapobiec mieszaniu się gradientów Percoll. - Odessać górną fazę, która zawiera uszkodzone chloroplasty i nienaruszone mitochondria za pomocą pompy wodnej, a następnie pobrać nienaruszone chloroplasty obecne w dolnej fazie (szeroki ciemnozielony pasek) za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Uważaj, aby nie zasysać jąder i szczątków komórkowych (znajdujących się na dnie probówki) z nienaruszonymi chloroplastami (Rysunek 2A).
- Rozcieńczyć 3-4-krotnie nienaruszoną zawiesinę chloroplastów buforem płuczącym (1 x). Wirować przez 2 minuty, gdy tylko zostanie osiągnięta maksymalna prędkość (2 070 x g, 4 °C) (maksymalne przyspieszenie i hamowanie włączone).
- Ostrożnie wyrzucić supernatant.
- Całkowicie odessać pozostały supernatant za pomocą pompy wodnej i utrzymać osad skoncentrowanych nienaruszonych chloroplastów na lodzie.
- Przed lizą chloroplastów należy przechowywać podwielokrotność nienaruszonej frakcji chloroplastowej w około 1 ml pożywki myjącej (1 x) do dalszych analiz przy użyciu elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i western blot. Zachować małą porcję tych nienaruszonych chloroplastów w celu oznaczenia stężenia białka. Przechowuj nienaruszoną frakcję chloroplastową w ciekłym azocie do dalszych eksperymentów.
5. Liza nienaruszonych chloroplastów za pomocą hipotonicznego buforu i oczyszczanie podkompartmentów chloroplastów na nieciągłych gradientach sacharozy
- Oczyszczone nienaruszone chloroplasty poddać lizie przez ponowne zawieszenie osadu w pożywce hipotonicznej zawierającej inhibitory proteazy (ostateczna objętość nie powinna przekraczać 12 ml).
UWAGA: Od tego etapu możliwe jest użycie pipety z cienkimi końcówkami (niebieskie końcówki), ponieważ nienaruszoność chloroplastów nie jest już istotna (pipetowanie chloroplastów w górę iw dół, o ile granulki nie zostaną całkowicie ponownie zawieszone). Chloroplasty Arabidopsis są bardzo delikatne (na przykład w porównaniu z chloroplastami grochu), a ich liza następuje prawie natychmiast po inkubacji w pożywce hipotonicznej. - Powoli załaduj 3 ml lizowanych chloroplastów na wierzch każdego wstępnie uformowanego gradientu sacharozy za pomocą pompy perystaltycznej.
- Ultraodwirować gradienty przez 1 godzinę w temperaturze (70 000 x g, 4 °C). Zrównoważyć pary probówek za pomocą hipotonicznego buforu pożywki przed odwirowaniem.
- Ostrożnie odzyskaj rozpuszczalne białka zrębu, pipetując górną fazę gradientu (3 ml z każdego gradientu) (Rysunek 2B). Weź podwielokrotność do oznaczania stężenia białka7. Przechowuj zrąb w ciekłym azocie do dalszych eksperymentów.
- Zassać pozostałą górną fazę każdego gradientu aż do żółtego pasma za pomocą pompy wodnej.
- Pobrać żółtą obrączkę (kopertę) za pomocą pipety (około 1 ml z każdego gradientu). Zbierz koperty w jednej tubie.
- Usuń pozostałą fazę każdego gradientu aż do osadu tylakoidów za pomocą pompy wodnej.
6. Mycie i zagęszczanie tylakoidów i systemów membranowych
- Zawiesić granulki tylakoidów (zielone granulki) w minimalnej objętości (2 ml) buforu do przemywania błon (1 x) (z inhibitorami proteazy).
- Rozcieńczyć otoczkę i zawiesiny tylakoidów 3-4-krotnie w membranowym podłożu myjącym (dostosować objętość do 10 ml) i ultrawirować przez 1 godzinę w temperaturze (110 000 x g, 4 °C). Zrównoważyć pary probówek za pomocą bufora do płukania membrany przed odwirowaniem.
- Ostrożnie zassać supernatanty za pomocą pompy wodnej.
- Dodać około 100 μl buforu do przemywania błony (z inhibitorami proteazy) do osadu otoczki. Weź podwielokrotność do oznaczania stężenia białka7. Oczyszczony preparat membranowy otoczki należy przechowywać w ciekłym azocie.
- Zawiesić osad tylakoidów w 3 ml buforu do płukania błon (z inhibitorami proteazy). Weź podwielokrotność do oznaczania stężenia białka7. Przechowuj frakcję błony tylakoidowej w ciekłym azocie.
Wyniki
Kolejne etapy procedury prowadzącej do oczyszczenia chloroplastów oraz ich podfrakcji przedstawiono na Rysunku 2. Gradient Percollu (Rysunek 2A) pozwala na odróżnienie nienaruszonych chloroplastów od chloroplastów uszkodzonych i mitochondriów (góra gradientu) lub jąder komórkowych i szczątków komórkowych (dół gradientu). Po rozbiciu organelli oczyszczonych za pomocą Percollu poprzez szok osmotyczny, otrzymane frakcje są rozdzielane w gradiencie sacharozy (Rysunek 2B). Stroma (rozpuszczalna część chloroplastu) unosi się na powierzchni gradientu sacharozy. Pęcherzyki lekkiej błony otoczkowej są odzyskiwane jako oddzielny żółty pas na interfejsie sacharozy 0,6/0,93 M. Najcięższe pęcherzyki błon tylakoidów koncentrują się na dnie probówki. Po odzyskaniu, przemyciu i zagęszczeniu dwóch frakcji błonowych, białka są ilościowo oznaczane, a skład wszystkich czterech frakcji analizowany za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 2C). Do linii nakładana jest równa ilość białka (20 µg każdej oczyszczonej frakcji). Wiedząc, że chloroplasty zawierają tylko 1% białek otoczki i 50% białek stromy lub tylakoidów, podejście to ma tendencję do zawyżania stopnia zanieczyszczenia krzyżowego oczyszczonych preparatów otoczki innymi podfrakcjami chloroplastów. Jednak metoda ta pozwala na wykrycie śladowych ilości białek zanieczyszczających frakcję otoczki. Markery z każdego przedziału (t.j. białka obfite) są bardzo pomocne w ocenie zanieczyszczenia krzyżowego frakcji. Rzeczywiście, oczekuje się, że frakcje błon tylakoidów i otoczki będą zawierały bardzo niskie ilości dużej podjednostki RuBisCO (RBCL), najliczniejszego białka stromy (50 kDa). Uszkodzone chloroplasty można łatwo odróżnić od nienaruszonych ze względu na utratę tego białka stromowego8. Białka kompleksu zbierającego światło (LHCP) to obfite komponenty tylakoidów o masie 25 kDa, które powinny zanieczyszczać błony otoczki w niewielkim stopniu (mniej niż 3%)9. Wreszcie, translokator fosforan-triozofosforanowy (TPT) jest białkiem o masie 30 kDa, które jest widoczne tylko w oczyszczonej frakcji otoczki ze względu na jej silne wzbogacenie (t.j. 50- do 10-krotne) w porównaniu z ekstraktami z całych chloroplastów. Stosując opisaną tutaj metodę, podfrakcje chloroplastów są zazwyczaj słabo zanieczyszczone krzyżowo, co potwierdzono za pomocą analiz western-blot (Rysunek 2D) z wykorzystaniem przeciwciał skierowanych przeciwko znanym markerom wszystkich trzech podfrakcji: rozpuszczalnej ketolakwasowej reduktoizomerazie (KARI) ze stromy, miedziowej ATPase otoczki chloroplastów (HMA1) oraz białkom kompleksu zbierającego światło (LHCP) z błon tylakoidów. Zanieczyszczenie krzyżowe trzech podfrakcji można ilościowo ocenić za pomocą immunoblottingu oraz analizy spektrometrią mas9. Podczas gdy stroma zazwyczaj nie jest zanieczyszczona frakcjami otoczki lub tylakoidów, oczyszczone frakcje otoczki zawierają 3% białek tylakoidów i do 10% białek stromy. Białka stromy w niewielkim stopniu zanieczyszczają błony tylakoidów (mniej niż 1%), ale tylakoidy zawierają do 3% białek błony otoczki. Niniejsza metoda, poza kluczową rolą w identyfikacji rzeczywistej lokalizacji subplastydycznej białek chloroplastowych, ogranicza również błędne wnioski dotyczące lokalizacji subplastydycznej białek wynikające zanieczyszczeń krzyżowych.
Rycina 1: Reprezentatywny schemat podprzedziałów chloroplastu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Oczyszczanie nienaruszonych chloroplastów i trzech ich głównych podprzedziałów z wykorzystaniem gradientów Percollu i sacharozy. A. Gradient Percolla umożliwiający oddzielenie uszkodzonych i nienaruszonych chloroplastów. BGradient sacharozy umożliwiający rozdzielenie frakcji stromy, osłonki i tylakoidów. CReprezentatywny obraz SDS-PAGE białek z nienaruszonych chloroplastów oraz ich trzech głównych podcompartmentów, umożliwiający wizualizację licznych markerów z każdego podcompartmentu. Każda ścieżka zawiera 10 µg białek. Markery masy cząsteczkowej: RBCL, duża podjednostka RuBisCO (marker stromy); TPT, translokator fosforanu/triozofosforanu (marker osłonki); LHCP, białka kompleksu zbierającego światło (marker tylakoidu). Deksperymenty Western-blot pozwalające na wykrycie specyficznych markerów (przy użyciu specyficznych przeciwciał) z każdego podprzegrody: miedziowa ATP-aza HMA1 otoczki chloroplastu10, białka kompleksu zbierającego światło LHCP z błon tylakoidów11or ketol-kwasową reduktazy izomerazy KARI ze stromy9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Niniejszy artykuł ma na celu szczegółowe omówienie krok po kroku protokołu stosowanego do oczyszczania chloroplastów (i ich podkompartmentów) z Arabidopsis thaliana. Od czasu udostępnienia pełnej sekwencji genomu prawie dwie dekady temu i dużych kolekcji mutantów insercyjnych udostępnionych społeczności, rzodkiewnik jest obecnie powszechnie akceptowany jako roślina modelowa. Jednak, podczas gdy roślina ta była doskonale przystosowana do podejść genetycznych, naukowcy zajmujący się roślinami musieli dostosować narzędzia biochemiczne i fizjologiczne do tego wyłaniającego się modelu. W związku z tym konieczne było dostosowanie protokołów pozwalających na oczyszczanie fotosyntetycznie aktywnych chloroplastów z liści o ugruntowanych modelach biochemicznych, takich jak szpinak12 czy groch13. Pierwsza metoda opisująca oczyszczanie chloroplastów rzodkiewnika została opublikowana w 1998roku14, tuż przed opublikowaniem sekwencji genomu rzodkiewnika. Kilka lat później udostępniono proste metody izolowania chloroplastów rzodkiewnika (Arabidopsis) zgodne z badaniami mającymi na celu analizę importu in vitro białek w oczyszczonych organellach15,16. Metody te nie pozwoliły jednak na połączenie wysokiego poziomu czystości z zachowaniem aktywności fotosyntetycznej oczyszczonych chloroplastów. Niedawno17 opracowano szybką metodę, która opiera się na wykorzystaniu gradientów Percollu i pozwala zachować prawie 90% szybkości fotosyntezy mierzonej w wyjściowych liściach Arabidopsis.
Opisany tutaj protokół pozwala na oczyszczenie chloroplastów Arabidopsis na doskonałym poziomie czystości. Rzeczywiście, immunologiczne wykrywanie zanieczyszczeń z innych przedziałów komórkowych wykazało, że oczyszczone organelle są pozbawione markerów błony mitochondrialnej i plazmatycznej 9,10. Protokół ten był również skuteczny w oczyszczaniu chloroplastów z kilku ekotypów Arabidopsis 18, takich jak Columbia (Col) lub Wassilewskija (WS), tj. ekotypów, które były używane do projektów sekwencjonowania genomu lub ekspresji znaczników sekwencji (EST), ale także do generowania mutantów insercyjnych T-DNA u Arabidopsis. Innymi słowy, gdy konieczne jest przeprowadzenie badań proteomicznych, obecny protokół jest zgodny z tymi dwoma referencyjnymi ekotypami z Arabidopsis. Wreszcie, wydajność chloroplastów przy użyciu obecnego protokołu jest podobna do tej uzyskanej przy rozpoczynaniu z liści szpinaku lub grochu (tj. 3%, mierzona na podstawie zawartości chlorofilu w chloroplastach oczyszczonych percollem w porównaniu z całkowitą ilością chlorofilu obecnego w liściach wyjściowych). Jeśli chodzi o białka, plon jest bliski 50 mg białek chloroplastowych, gdy organelle są oczyszczane z 500 g 5-tygodniowych liści Arabidopsis.
Aby osiągnąć tak dobrą wydajność (i integralność chloroplastów), należy jednak zwrócić szczególną uwagę na kilka kroków podczas korzystania z niniejszego protokołu. Chloroplast Arabidopsis jest niezwykle delikatną strukturą (nie dotyczy to na przykład chloroplastów grochu). W związku z tym należy zwrócić szczególną uwagę, aby uniknąć pęknięcia organelli na dużą skalę podczas oczyszczania. Liczba i wielkość granulek skrobi obecnych w chloroplastach ma kluczowe znaczenie dla przygotowania nienaruszonych chloroplastów. Rzeczywiście, chloroplasty zawierające duże ziarno skrobi będą na ogół rozbijane podczas początkowych etapów wirowania różnicowego mających na celu zagęszczenie surowych frakcji chloroplastów12. Dlatego rośliny powinny być przechowywane przez noc w ciemnym i chłodnym pomieszczeniu (4 °C) przed eksperymentem, aby zmniejszyć ilość skrobi.
Nowi użytkownicy obecnego protokołu mogą pokusić się o rozpoczęcie od większych ilości materiału liściowego (ogromnych rozet ze starych roślin Arabidopsis o większych liściach), próbując zwiększyć odzysk oczyszczonych chloroplastów. Jednak w naszych rękach rozpoczęcie od młodych liści (5-tygodniowych) jest najlepszym kompromisem, aby połączyć plon, czystość i integralność oczyszczonych organelli. Rzeczywiście, zbyt stare liście są silnie wzbogacone w związki fenolowe, które, jak wykazano, mają negatywny wpływ na integralność chloroplastów19.
Wreszcie, początkowy etap ekstrakcji (mielenie tkanki) jest kolejnym krytycznym krokiem. Proces miksowania musi być ograniczony do kilku sekund. Jak wspomniano powyżej, nowi użytkownicy mogą pokusić się o dłuższe mieszanie, spodziewając się w ten sposób znacznej poprawy wydajności oczyszczonych organelli. Jeśli jednak dłuższe mieszanie skutecznie uwalnia więcej materiału z liści, wydaje się, że proporcja uszkodzonych chloroplastów gwałtownie wzrasta w surowym ekstrakcie komórkowym. Ze względu na ten wysoki stosunek rozbitych do nienaruszonych chloroplastów w pożywce, dalsze etapy oczyszczania (separacja na gradientach Percoll) są silnie ograniczone, a wydajność oczyszczania jest nieoczekiwanie niższa.
Dostępność specjalnych protokołów oczyszczania organelli pozwoliła na przeprowadzenie serii wysokoprzepustowych eksperymentów opartych na proteomice na próbkach chloroplastów. Dane te zostały udostępnione w kilku publicznych bazach danych6, zapewniając w ten sposób biologom w terenie dokładną subkomórkową (i subplastydialną) lokalizację wielu białek chloroplastowych. Było to szczególnie prawdziwe w przypadku białek otoczkowych, których tożsamość i lokalizacja pozostawały w większości nieznane przed tymi analizami, ponieważ błony otoczki stanowią niewielki składnik chloroplastów (1-2% białek chloroplastowych), odgrywając jednocześnie kluczową rolę w metabolizmie i biogenezie chloroplastów 5,20. Korzystając z opisanego tutaj protokołu, niedawno przeanalizowaliśmy skład trzech głównych przedziałów chloroplastowych Arabidopsis (tj. zrębu, tylakoidów i systemu błony otoczki)9. Opierając się na półilościowym podejściu proteomicznym (zliczanie spektralne), byliśmy w stanie ocenić partycjonowanie setek białek w tych trzech przedziałach chloroplastów.
Podczas gdy obecny protokół pozwala na oczyszczenie trzech głównych kompartmentów chloroplastu z Arabidopsis, możliwe jest również wyodrębnienie dodatkowych podkompartmentów w chloroplastach. Rzeczywiście, system membran otoczki składa się z wewnętrznych i zewnętrznych błon otoczki (ryc. 1). Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, metoda oczyszczania wewnętrznych i zewnętrznych błon otoczki z chloroplastów Arabidopsis nie została jeszcze ustalona. Wewnętrzne i zewnętrzne błony otoczki można oczyścić z chloroplastów szpinaku21 lub grochu22 . Główne ograniczenie rzodkiewnika wynika głównie z ograniczonych ilości materiału wyjściowego. Już od 500 g liści rzodkiewnika (który wymaga już 1m2 powierzchni w komorze wzrostowej) pozwala na oczyszczenie tylko 100 μg białek otoczki. Z drugiej strony łatwo jest zacząć od 5-10 kg liści szpinaku z rynku, oczyścić dużą ilość chloroplastów8 i skończyć na wydajności od 3 do 10 mg białek otoczki z tego materiału.
To samo dotyczy podkompartmentów tylakoidów. Rzeczywiście, tylakoidy są zbudowane z lekkich pęcherzyków błonowych (blaszek) i gęstych struktur (grana) (ryc. 1). Dostępne są specyficzne protokoły pozwalające na rozróżnienie tych dwóch przedziałów u Arabidopsis23,24. Ponownie, w oparciu o ilościową analizę proteomiczną, niedawno zinwentaryzowaliśmy białka obecne w tych dwóch podprzedziałach24. Podejścia te, wraz z dogłębnym badaniem literatury, pozwoliły na walidację lub zaproponowanie hipotez dotyczących subplastydowej lokalizacji setek białek tylakoidów. Należy jednak zauważyć, że na zakrzywionych brzegach tylakoidów obecne są dodatkowe mikrodomeny błonowe. Te podkompartmenty lipoprotein lub plastoglobule są trwale sprzężone z błonami tylakoidów i zawierają określony zestaw białek25. Korzystając z obecnego protokołu, nie jest możliwe odróżnienie tych specyficznych białek od innych składników tylakoidów.
Na listach wykrytych białek nadal brakuje niektórych prawdziwych (dobrze znanych) składników otoczki, zrębu lub tylakoidów. Wraz z ukierunkowanymi analizami biochemicznymi i immunologicznymi, ciągła poprawa czułości SM będzie bardzo pomocna w ponownym przyjrzeniu się zawartości chloroplastów w kierunku pełnego repertuaru składu różnych podkompartmentów.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez wspólne stypendium doktoranckie dla IB z Wydziału Biologii i Hodowli Roślin INRA oraz z Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01). Chcielibyśmy również podziękować projektowi ANR ANR-15-IDEX-02, dr Olivierowi Vallonowi (IBPC Paris) za przeciwciała przeciwko LHCP oraz dr Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) za przeciwciała przeciwko KARI.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Percoll | GE Healthcare | 17089101 | |
| Tricine | Roth | 6977.2 | |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Promega | H5032 | |
| NaHCO3 | Roth | 8551.1 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Roth | 8076.5 | |
| MgCl2 | Roth | 2189.1 | |
| Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzamidyna | Sigma | B6506 | |
| ε-aminokapronowy kwas | Fluka | 21530 | |
| Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS) | Roth | 6979.3 | |
| Sacharoza | Roth | 9286.2 | |
| Zapas akrylamidu: 30% (w/v) akrylamid, 0,8% (w/v) bisakryloamid | Roth | 3029.1 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 | |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Roth | 1057.1 | |
| Tetrametyloetylenodiamina (TEMED) | Sigma | T-8133 | |
| Nadsiarczan amonu (APS) | Roth | 9592.1 | |
| Glicerol | Roth | 3783.1 | |
| Błękit bromofenolowy | USB | US12370 | |
| Glicyna | Roth | 3908.3 | |
| Medium do barwienia w | żelu Clini-sciences | GEN-QC-STAIN | |
| Etanol | CARLO ERBA | 528151 | |
| NaCl | Euromedex | 1112-A | |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| Beztłuszczowe mleko w proszku | Ré gilait | ||
| HCl | Fisher | H/1150/PB15 | |
| Granulki KOH | Sigma | 1.05012 | |
| Granulki NaOH | CARLO ERBA | 480507 | |
| Przeciwciało | Seigneurin-Berny et al, 2006 | Stosowany w rozcieńczeniu 1:1000 | |
| Przeciwciało | Ferro et al, 2010 | Stosowany w rozcieńczeniu 1:1000 | |
| Przeciwciało anty-LHCP | Vallon et al, 1991 | Stosowane w rozcieńczeniu 1:25 000 | |
| Sigma | D5879 | ||
| Duże (30 cm i razy 45 cm) plastikowe pudełka | Puteaux | Nasiona | |
| A. thaliana | Około 30 mg nasion na całą skrzynkę | ||
| 12-godzinny cykl świetlny, ustawiony na 23& C (dzień) / 18° C (noc) o natężeniu światła 150 μ mol/m2/s. | |||
| Muślin lub gaza | Raffin | 70116 | 80 cm |
| duży Nylon blutex 50 μ m apertura | Tripette et Renaud, Sailly Saillisel | 50 μ m apertura | |
| Mieszalnik napędzany silnikiem, trzy prędkości, pojemność 1 galon (4 l) | Waring Blender | ||
| Wirniki o stałym kącie JLA-10.500 (6 & razy; 500-mL plastikowe butelki) | Beckman Coulter | ||
| Beckman JA-20 rotor | Beckman Coulter | ||
| JA-20 (6 & razy; 50 ml probówki polipropylenowe) | Instrumenty | ||
| SorvallRotor z łyżką wahliwą JS-13.1 (6 & razy; probówki z poliwęglanu 50 ml) | Rotor Beckman Coulter | ||
| SW 41 Ti (6 & razy; 13,2 ml ultraprzezroczyste probówki) | Probówki rotora Beckman Coulter | ||
| SW 41 Ti (13,2 ml ultraprzezroczyste probówki) | Beckman Coulter | ||
| (Beckman L7) | Beckman Coulter | ||
| (Beckman JSE-06D18) | Mikrowirówka Beckman Coulter | ||
| Eppendorf 5415D lub równoważna | |||
| Pompa wodna podłączona do pipety Pasteura za pomocą plastikowej rurki. | |||
| Membrany nitrocelulozowe | BA85, Schleicher i Schuell | ||
| Bibuła filtracyjna | 3MM, Whatman, Maidstone | ||
| Ciekły azot | |||
| Pompa perystaltyczna | Gilson | ||
| Gel aparatura do elektroforezy z różnymi akcesoriami potrzebnymi do separacji białek za pomocą elektroforezy (grzebienie, płytki i aparatura odlewnicza). | Bio-Rad Protean 3 lub równoważny | ||
| System do transferu białek do błon nitrocelulozowych | Bio-Rad Protean 3 lub równoważny |
Bibliografia
- Zimorski, V., Ku, C., Martin, W. F., Gould, S. B. Endosymbiotic theory for organelle origins. Current Opinion in Microbiology. 22, 38-48 (2014).
- Gould, S. B., Waller, R. F., McFadden, G. I. Plastid evolution. Annual Review of Plant Biology. 59, 491-517 (2008).
- Linka, N., Weber, A. P. Intracellular metabolite transporters in plants. Molecular Plant. 3 (1), 21-53 (2010).
- Block, M. A., Douce, R., Joyard, J., Rolland, N. Chloroplast envelope membranes: a dynamic interface between plastids and the cytosol. Photosynthesis Research. 92 (2), 225-244 (2007).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Agrawal, G. K., et al. Plant organelle proteomics: collaborating for optimal cell function. Mass Spectrometry Reviews. 30 (5), 772-853 (2011).
- Chua, N. -H. [40] Electrophoretic analysis of chloroplast proteins. Methods in Enzymology. 69, 434-446 (1980).
- Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Joyard, J., Rolland, N. Purification of intact chloroplasts from Arabidopsis and spinach leaves by isopycnic centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 30 (2008).
- Ferro, M., et al. AT_CHLORO, a comprehensive chloroplast proteome database with subplastidial localization and curated information on envelope proteins. Molecular & Cell Proteomics. 9 (6), 1063-1084 (2010).
- Seigneurin-Berny, D., et al. HMA1, a new Cu-ATPase of the chloroplast envelope, is essential for growth under adverse light conditions. Journal of Biological Chemistry. 281 (5), 2882-2892 (2006).
- Vallon, O., et al. Lateral redistribution of cytochrome b6/f complexes along thylakoid membranes upon state transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8262-8266 (1991).
- Douce, R. J. J. Purification of the chloroplast. Methods in Chloroplast Molecular Biology. Edelman, M., Hallick, R. B., Chua, N. -H. , Elsevier Science Publishers BV. Amsterdam. 239-256 (1982).
- Cerovic, Z. G., Plesnicar, M. An improved procedure for the isolation of intact chloroplasts of high photosynthetic capacity. Biochemical Journal. 223 (2), 543-545 (1984).
- Kunst, L. Preparation of physiologically active chloroplasts from Arabidopsis. Methods in Molecular Biology. 82, 43-48 (1998).
- Aronsson, H., Jarvis, P. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).
- Ling, Q., Jarvis, P. Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Dorne, A. J., Joyard, J., Rolland, N. Percoll-purified and photosynthetically active chloroplasts from Arabidopsis thaliana leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 46 (11), 951-955 (2008).
- Salvi, D., Rolland, N., Joyard, J., Ferro, M. Purification and proteomic analysis of chloroplasts and their sub-organellar compartments. Methods in Molecular Biology. 432, 19-36 (2008).
- Walker, D. The use of the oxygen electrode and fluorescence probes in simple measurements of photosynthesis. , Oxygraphics Ltd, University of Sheffield. South Yorkshire, UK. (1990).
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Block, M. A., Dorne, A. J., Joyard, J., Douce, R. Preparation and characterization of membrane fractions enriched in outer and inner envelope membranes from spinach chloroplasts. II. Biochemical characterization. Journal of Biological Chemistry. 258 (21), 13281-13286 (1983).
- Soll, J. Phosphoproteins and protein-kinase activity in isolated envelopes of pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 166 (3), 394-400 (1985).
- Moyet, L., Salvi, D., Tomizioli, M., Seigneurin-Berny, D., Rolland, N. Preparation of Membrane Fractions (Envelope, Thylakoids, Grana, and Stroma Lamellae) from Arabidopsis Chloroplasts for Quantitative Proteomic Investigations and Other Studies. Methods in Molecular Biology. 1696, 117-136 (2018).
- Tomizioli, M., et al. Deciphering thylakoid sub-compartments using a mass spectrometry-based approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2147-2167 (2014).
- Spicher, L., Kessler, F. Unexpected roles of plastoglobules (plastid lipid droplets) in vitamin K1 and E metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 25, 123-129 (2015).
Przedruki i uprawnienia
