Method Article

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

DOI:

10.3791/58585

⸱

November 8th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Center for Brain Science, Harvard University, 3Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University, 4Institute of Science and Technology Austria

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weryfikacja zmian chorobowych i lokalizacji elektrod odbywa się tradycyjnie poprzez badanie histologiczne barwionych wycinków mózgu, co jest czasochłonną procedurą, która wymaga ręcznego oszacowania. W tym miejscu opisujemy prostą, nieskomplikowaną metodę ilościowego określania zmian chorobowych i lokalizowania elektrod w mózgu, która jest mniej pracochłonna i daje bardziej szczegółowe wyniki. Całe mózgi są barwione tetratlenkiem osmu, zatopione w żywicy i obrazowane za pomocą mikrotomografu komputerowego. Wynikiem skanów są cyfrowe objętości 3D mózgów z rozdzielczościami i wirtualnymi grubościami przekrojów zależnymi od wielkości próbki (12-15 i 5-6 μm na woksel odpowiednio dla mózgów szczurów i zeberek). Można scharakteryzować zmiany powierzchniowe i głębokie, a także lokalizować pojedyncze tetrody, układy tetrodowe, zmiany elektrolityczne i sondy krzemowe. Darmowe i zastrzeżone oprogramowanie pozwala eksperymentatorom badać objętość próbki z dowolnej płaszczyzny i segmentować objętość ręcznie lub automatycznie. Ponieważ metoda ta generuje całą objętość mózgu, zmiany chorobowe i elektrody mogą być oznaczane ilościowo w znacznie wyższym stopniu niż w przypadku obecnych metod, co pomoże ustandaryzować porównania w ramach badań i między nimi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurobiolodzy od dawna polegają na zmianach chorobowych, aby zrozumieć związek między funkcją a lokalizacją w mózgu. Na przykład, nasze rozumienie hipokampa jako niezbędnego do uczenia się i zapamiętywania oraz kory przedczołowej jako kluczowej dla kontroli impulsów było wynikiem przypadkowych zmian u ludzi1,2. Wykorzystanie modeli zwierzęcych pozwoliło jednak neurobiologom okiełznać moc zmian chorobowych, wychodząc poza przypadkowy zbieg okoliczności, a funkcja niezliczonych obszarów mózgu została wyjaśniona dzięki systematycznym badaniom relacji struktura-funkcja poprzez lesions3,4.

Aby poprawnie przypisać funkcję strukturze, badania zmian wymagają precyzyjnych procedur kwantyfikacji, czego do tej pory brakowało. Obecnym złotym standardem w ilościowym określaniu zmian chorobowych jest cięcie, montowanie i obrazowanie mózgu za pomocą mikroskopu świetlnego. Zobrazowane wycinki są następnie dopasowywane do najbliższych sekcji atlasu, a przybliżone współrzędne zmian chorobowych u badanych są raportowane pośrednio, często za pomocą obrazów camera lucida lub przykładowych wycinków histologicznych3,4,5,6,7,8,9,10.

Poza niedokładnością obecnych procedur kwantyfikacji zmian, techniki te są czasochłonne i podatne na niepowodzenia. Niewielkie zmiany w sztywności mózgu, ostrości ostrza i temperaturze mogą prowadzić do spartaczonych, wypaczonych lub rozdartych sekcji. Sekcje mogą również plamić się nierównomiernie i być nieprawidłowo obrazowane z powodu pęcherzyków powietrza w medium montażowym. Co ważne, po przeprowadzeniu sekcji trójwymiarowy kontekst lokalizacji zmiany w mózgu zostaje utracony, co sprawia, że precyzyjna rekonstrukcja 3D zmiany w mózgu jest trudna.

Innym powszechnym zastosowaniem zmian było określenie lokalizacji zapisów pojedynczych i wielokrotnych elektrod w mózgu. Pod koniec końcowej sesji nagraniowej naukowcy indukują małe zmiany elektrolityczne na końcówce elektrody i przetwarzają mózg histologicznie, tak jak w konwencjonalnym eksperymencie z uszkodzeniem11. Technika ta ma te same wady, które opisano powyżej, a dodatkowym problemem jest to, że zmiany elektrolityczne są zwykle większe niż elektrody użyte do ich wykonania, ale zwykle są na tyle małe, że trudno je znaleźć histologicznie. W przypadku wprowadzenia wielu elektrod, jak w przypadku matrycy tetrodowej, weryfikacja przez uszkodzenia elektrolityczne jest jeszcze trudniejsza. Alternatywą dla zmian elektrolitycznych jest użycie barwnika na elektrodzie w celu późniejszej weryfikacji histologicznej12, ale ta technika ma te same wady, które mają konwencjonalną histologię.

Tutaj szczegółowo opisujemy niedawno opisaną metodę13 opartą na technikach barwienia w mikroskopii elektronowej (EM) i rentgenowskiej tomografii komputerowej (micro-CT), która określa ilościowo zmiany chorobowe i lokalizuje elektrody w mózgach małych zwierząt lepiej niż obecne metody. Mikro-CT to technika obrazowania, w której promienie rentgenowskie są wystrzeliwane na próbkę, która jest obracana o 360°, podczas gdy scyntylator zbiera promienie rentgenowskie, które nie są odchylane przez próbkę. Rezultatem jest cyfrowa rekonstrukcja 3D próbki w wysokiej rozdzielczości, którą można wizualizować w dowolnej orientacji i precyzyjnie określić ilościowo. Wiele instytucji akademickich posiada mikrotomografy komputerowe, które są również dostępne na rynku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie metody opieki i eksperymentalne manipulacje na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Harvard Institutional Animal Care and Use Committee. Opisana tutaj perfuzja jest specyficzna dla szczurów, ale procedura ma zastosowanie do wszystkich zwierząt z mniejszymi lub podobnymi rozmiarami mózgów.

1. Perfuzja

  1. Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Dla szczura (wiek: 0,5–1,5 roku, waga: 250–600 g) powinno wystarczyć 800–1000 ml. Użyj 400 ml do perfuzji zwierzęcia i dodatkowych 400 ml do rozcieńczenia utrwalacza
    2. .
  2. Przygotować utrwalacz składający się z 2% (w/v) paraformaldehydu (PFA) i 2,5% (w/v) aldehydu glutarowego (GA) w 1x PBS. Dla szczura wystarczy 400 ml. Zachowaj 50 ml w stożkowej probówce o pojemności 50 ml do utrwalenia mózgu po perfuzji.
  3. Znieczulać szczura 4–5% izofluranem gazowym (o stężeniu 0,8 l/minO2 przy 1,0 barze w temperaturze 21 °C) przez 15 minut.
  4. Wstrzyknąć dootrzewnowo śmiertelną dawkę pentobarbitalu sodu (180 mg/kg).
  5. Przetestuj utratę odruchów u zwierzęcia, przeprowadzając badanie odruchu szczypania palców u stóp. Poczekaj z rozpoczęciem perfuzji, aż zwierzę straci odruchową reakcję.
  6. Postępuj zgodnie z wcześniej opisanym protokołem perfuzji wewnątrzsercowej i ekstrakcji mózgu14 z następującymi roztworami: przeprowadź perfuzję zwierzęcia za pomocą 400 ml 1x PBS przy 125 mm Hg, aby usunąć krew. Po usunięciu całej krwi i zastąpieniu ją 1x PBS, rozpocznij perfuzję z 400 ml roztworu 2% PFA i 2,5% GA rozpuszczonego w 1x PBS przy 125 mm Hg.
    UWAGA: Jeśli zabieg przeprowadzany jest na zwierzęciu, które nie jest szczurem, jedynymi ważnymi elementami procedury perfuzji jest użycie 1x PBS i 2% PFA, 2,5% GA w 1x PBS. Objętość roztworu i ciśnienie perfuzji można regulować w zależności od gatunku.

2. Po fiksacji

  1. Umieść wyekstrahowany mózg w 2% PFA, 2,5% GA w 1x roztworze PBS (ten sam roztwór, który wcześniej był używany do perfuzji zwierzęcia). Upewnij się, że objętość roztworu jest co najmniej 10 razy większa niż objętość mózgu. W przypadku szczurów umieść mózg w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 50 ml roztworu. Przechowywać próbkę w miejscu po utrwaleniu przez 2–3 dni, lekko wstrząsając w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Jeśli próbka znajduje się w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, umieszczenie jej poziomo na wytrząsarce orbitalnej zapewni najlepsze wyniki.
  2. Po wystarczająco długim utrwaleniu próbki należy ją przemyć w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O), wodzie dejonizowanej (diH2O) lub wodzie ultraczystej (patrz tabela materiałów) cztery razy przez następujące czasy: 1, 1, 1 i 15 min.
    UWAGA: W przypadku tego protokołu ddH2O, diH2O lub woda ultraczysta powinny być wymienne. Dla uproszczenia ddH2O będzie odtąd używane w odniesieniu do wody oczyszczonej.

3. Barwienie

UWAGA: Na tym etapie wszystkie przygotowania roztworu przeprowadzaj pod kapturem, używając rękawiczek.

  1. Przygotuj co najmniej 10-krotność objętości roztworu barwiącego do mózgu. W przypadku mózgów szczurów należy przygotować 50 ml 2% (w/v) tetratlenku osmu (OsO4) w ddH2O, łącząc 25 ml podstawowego 4% roztworu OsO4 i 25 ml ddH2O.
    UWAGA: Tetratlenek osmu jest lotny i może powodować tymczasową ślepotę i problemy z oddychaniem, jeśli nie jest odpowiednio traktowany. Wyrzuć wszystkie materiały, które mają kontakt z tetratlenkiem osmu, w odpowiednim pojemniku na zagrożenia chemiczne w pojemniku wtórnym.
  2. Umieść mózg w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj roztwór OsO4. Mózg powinien zacząć brązowieć, gdy OsO4 reaguje z lipidami w tkance.
  3. Zamknij probówkę i dokładnie uszczelnij ją folią parafinową (patrz Tabela materiałów), aby upewnić się, że nie przecieka podczas inkubacji.
    UWAGA: Osm jest lotny i będzie łagodnie reagował z plastikiem rurki, dlatego prawidłowe uszczelnienie rurki jest bardzo ważne. Tuba może być owinięta folią aluminiową dla dodatkowej ochrony.
  4. Szczelnie zamkniętą probówkę przechowywać w temperaturze 4 °C, lekko wstrząsając na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min przez 2 tygodnie. Umieść rurkę poziomo, aby zapewnić najlepsze mieszanie. Upewnij się, że próbka jest całkowicie zanurzona w roztworze podczas wstrząsania.
    UWAGA: Jeśli osm nie może krążyć w sposób ciągły, może nie przeniknąć w pełni do próbki, dlatego bardzo ważne jest poziome umieszczenie na wytrząsarce.

4. Osadzanie

  1. Po inkubacji próbki w OsO4 przez 2 tygodnie, przemyć ją ddH2O 5 razy w temperaturze pokojowej (RT) przez następujące czasy: 1, 1, 1, 15 i 60 minut w celu usunięcia całego niezwiązanego OsO4 z próbki.
    UWAGA: Wielokrotna wymiana, w tym ostatnia 60-minutowa wymiana, jest konieczna, aby umożliwić dyfuzję całego osmu w układzie krążenia.
  2. Przemywać próbkę za pomocą ddH2O przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Osm może nadal dyfundować z próbki, ale jego ilość powinna być znacznie zmniejszona w porównaniu z poprzednim etapem.
  3. Odwodnić próbkę etanolem, aby ostatecznie przeniknąć do niej żywicą. W celu odwodnienia należy zastąpić ddH2O 10–20 ml następujących rozcieńczeń etanolu (po 30 minut w temperaturze 4 °C): 20% (v/v) etanolu i 80% (v/v)ddH2O; 50% (v/v) etanolu i 50% (v/v) ddH2O; 70% (v/v) etanolu i 30% (v/v)ddH2O; 90% (v/v) etanolu i 10% (v/v)ddH2O; 100% etanolu.
  4. Przygotować rozcieńczenia acetonu/żywicy w następujący sposób.
    1. Przygotuj 100 ml żywicy do zatopienia (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Aby przygotować 33% (v/v) roztwór żywicy i 67% acetonu, wlej 15 ml żywicy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 30 ml 100% acetonu destylowanego ze szkła.
    3. Aby uzyskać 50% (v/v) żywicy-50% acetonu, wlej 22,5 ml żywicy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 22,5 ml 100% acetonu destylowanego ze szkła.
    4. Aby przygotować 67% (v/v) roztwór żywicy i 33% acetonu, wlej 30 ml żywicy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 15 ml 100% acetonu destylowanego ze szkła.
    5. Użyj pozostałych 32,5 ml żywicy jako pierwszego roztworu 100% żywicy poniżej.
  5. Proces infiltracji żywicy należy rozpocząć od przepuszczenia próbki przez 10-20 ml następujących roztworów acetonu i acetonu/żywicy: 100% aceton przez 30 minut w temperaturze 4 °C; 100% aceton przez 30 minut w temperaturze 4 °C i 100% aceton przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Pozostała część procesu infiltracji będzie miała miejsce w RT.
  6. Zanurz próbkę w 33% (v/v) żywicy 67% acetonie przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, następnie w 50% (v/v) acetonie i 50% acetonie przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, 67% (v/v) żywicy 33% przez 3 godziny w temperaturze pokojowej i 100% żywicy przez 12 godzin w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotuj świeżą partię żywicy o pojemności 50 ml, postępując zgodnie z instrukcjami na butelce. Przenieść próbkę do pojemnika, w którym będzie ona utwardzana (np. jednorazowe formy opisane w Tabeli Materiałów). Nasycić próbkę świeżą 100% żywicą przez 4 godziny w temperaturze RT.
    UWAGA: Jeśli świeża żywica nie zostanie użyta, żywica wyprodukowana poprzedniego dnia zacznie przedwcześnie twardnieć, a próbka będzie trudna do manipulowania.
  8. Odgazować próbkę w piecu próżniowym przez 15 minut w temperaturze 45 °C.
    UWAGA: Ten krok pomoże usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza w próbce, ale nie jest niezbędny i nie wpłynie na jakość danych.
  9. Na koniec utwardzić próbkę w piecu przez 48 godzin w temperaturze 60 °C.

5. mikro-tomografia komputerowa

  1. Po utwardzeniu próbki zdejmij jednorazową formę i zeskanuj ją za pomocą mikrotomografu komputerowego.
    UWAGA: W zależności od używanej maszyny ustawienia będą się różnić. Dla skanera używanego przez autorów wymienionych w Tabeli Materiałów zalecane ustawienia to 130 kV, 135 μA z filtrem miedzianym 0,1 mm i źródłem molibdenu, 1-sekundowa ekspozycja i średnio 4 klatki na projekcję. Eksperymentatorzy powinni jednak kalibrować skaner indywidualnie, ponieważ wiele czynników będzie miało wpływ na optymalne ustawienia podczas danej sesji.
  2. Po zakończeniu skanowania zrekonstruuj próbkę z zalecanymi parametrami dla kombinacji skaner/oprogramowanie eksperymentatora na komputerze z oprogramowaniem skanera.
  3. Na koniec zwizualizuj i przeanalizuj zrekonstruowaną wolumin cyfrowy za pomocą wybranego przez eksperymentatora oprogramowania (przykłady znajdują się w Tabeli Materiałów).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjnie, mózgi są dzielone i barwione w celu ilościowego określenia zmian i zlokalizowania elektrod, ale ta metoda jest podatna na błędy, pracochłonna i zazwyczaj wymaga oszacowania wyników. Przygotowanie całych mózgów do obrazowania mikro-tomografii komputerowej znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo uszkodzenia próbek, interesujące cechy mogą być analizowane w kontekście całego mózgu, a metoda nadaje się do równoległego przetwarzania wielu próbek, co znacznie przyspiesza przygotowani...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujące kroki są krytycznymi krokami protokołu: po pierwsze, zastosowanie kombinacji PFA i GA do perfuzji zwierzęcia, a następnie po utrwaleniu mózgu, miało kluczowe znaczenie dla osiągnięcia konsekwentnej, pełnej penetracji tkanki przez osm. Chociaż nie testowaliśmy tego wyraźnie, prawdopodobnym wyjaśnieniem jest to, że fiksacja PFA jest odwracalna15, podczas gdy fiksacja GA nie jest odwracalna16,17. Ponieważ do pełnej infiltracji tka...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Gregowi Linowi i Arthurowi McClellandowi za ich ekspertyzę w zakresie mikro-tomografii komputerowej, Davidowi Richmondowi i Hunterowi Elliottowi z Image and Data Analysis Core (IDAC) w Harvard Medical School za ich porady dotyczące przetwarzania obrazów, oraz Williamowi Libertiemu z Boston University za łaskawe dostarczenie mózgu zeberki. Prace te zostały częściowo wykonane w Center for Nanoscale Systems (CNS), będącym członkiem National Nanotechnology Coordinated Infrastructure Network (NNCI), która jest wspierana przez National Science Foundation w ramach nagrody NSF nr 1541959. CNS jest częścią Uniwersytetu Harvarda. Prace te były wspierane przez Fundację Rodziny Richarda i Susan Smithów oraz IARPA (kontrakt #D16PC00002). S.B.E.W. był wspierany przez stypendia z Human Frontier Science Program (HFSP; LT000514/2014) oraz Europejskiej Organizacji Biologii Molekularnej (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. był wspierany przez National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa (EMS)157102% (w/v/) in 1X
PBS Aldehyd glutarowy (GA)EMS162202,5% (w/v) GA w 1x PBS
OsO4EMS19190Praca pod wyciągiem
EtanolDecon LabsKoptec140, 190, 200 proof
AcetonEMS10015Destylowana w szkle
żywica Durcupan ACMSigma-Aldrich44610Składniki A, B, C i D, żywica do zatapiania
Formy jednorazoweTed Pella27114Sugerowana
woda milliQ (woda ultraczysta)Millipore SigmaQGARD00R1 (lub pokrewny oczyszczacz)Sugerowany
Parafilm (folia parafinowa)Millipore SigmaP7793Sugerowana folia parafinowa
Skaner mikrotomograficznyNikon Metrology Ltd., Tring, Wielka BrytaniaX-Tek HMS ST 225Używany przez autorów
Oprogramowanie do wizualizacji i analizy skanów mikro-CT:
Volume GraphicsVG Studio MaxUżywane przez autorów
FEI / Thermo ScientificAvizoUżywane przez autorów
FEI / Thermo ScientificAmiraPodobne do Avizo
Mark Sutton & Russell GarwoodSpiersza darmo, http://spiers-software.org/
Pixmeo SarlOsirix Liteza darmo, https://www.osirix-viewer.com/
Open SourceFIJIFree, https://fiji.sc/
AdobePhotoshopDobry do analizowania jednego wycinka na raz

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
  2. Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
  3. Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
  4. Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
  5. Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
  6. Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
  7. Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
  8. Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
  9. Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
  10. Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
  11. Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
  12. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
  13. Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184(2018).
  14. Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564(2012).
  15. Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
  16. Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
  17. Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
  18. Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
  19. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  20. Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
  21. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
  22. Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
  23. Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
  24. Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974(2015).
  25. Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
  26. Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833(2016).
  27. Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  28. Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
  29. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
  30. Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
  31. Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
  32. Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
  33. Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
  34. Fu, T. -M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micro CT ImagingLesion CharacterizationElectrode LocalizationOsmium Tetroxide StainingBrain Tissue Preparation3D Volume AnalysisVirtual SectioningSmall Animal BrainsResin EmbeddingTissue Dehydration

Related Articles