Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Weryfikacja zmian chorobowych i lokalizacji elektrod odbywa się tradycyjnie poprzez badanie histologiczne barwionych wycinków mózgu, co jest czasochłonną procedurą, która wymaga ręcznego oszacowania. W tym miejscu opisujemy prostą, nieskomplikowaną metodę ilościowego określania zmian chorobowych i lokalizowania elektrod w mózgu, która jest mniej pracochłonna i daje bardziej szczegółowe wyniki. Całe mózgi są barwione tetratlenkiem osmu, zatopione w żywicy i obrazowane za pomocą mikrotomografu komputerowego. Wynikiem skanów są cyfrowe objętości 3D mózgów z rozdzielczościami i wirtualnymi grubościami przekrojów zależnymi od wielkości próbki (12-15 i 5-6 μm na woksel odpowiednio dla mózgów szczurów i zeberek). Można scharakteryzować zmiany powierzchniowe i głębokie, a także lokalizować pojedyncze tetrody, układy tetrodowe, zmiany elektrolityczne i sondy krzemowe. Darmowe i zastrzeżone oprogramowanie pozwala eksperymentatorom badać objętość próbki z dowolnej płaszczyzny i segmentować objętość ręcznie lub automatycznie. Ponieważ metoda ta generuje całą objętość mózgu, zmiany chorobowe i elektrody mogą być oznaczane ilościowo w znacznie wyższym stopniu niż w przypadku obecnych metod, co pomoże ustandaryzować porównania w ramach badań i między nimi.
Wprowadzenie
Neurobiolodzy od dawna polegają na zmianach chorobowych, aby zrozumieć związek między funkcją a lokalizacją w mózgu. Na przykład, nasze rozumienie hipokampa jako niezbędnego do uczenia się i zapamiętywania oraz kory przedczołowej jako kluczowej dla kontroli impulsów było wynikiem przypadkowych zmian u ludzi1,2. Wykorzystanie modeli zwierzęcych pozwoliło jednak neurobiologom okiełznać moc zmian chorobowych, wychodząc poza przypadkowy zbieg okoliczności, a funkcja niezliczonych obszarów mózgu została wyjaśniona dzięki systematycznym badaniom relacji struktura-funkcja poprzez lesions3....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie metody opieki i eksperymentalne manipulacje na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Harvard Institutional Animal Care and Use Committee. Opisana tutaj perfuzja jest specyficzna dla szczurów, ale procedura ma zastosowanie do wszystkich zwierząt z mniejszymi lub podobnymi rozmiarami mózgów.
1. Perfuzja
- Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Dla szczura (wiek: 0,5–1,5 roku, waga: 250–600 g) powinno wystarczyć 800–1000 ml. Użyj 400 ml do perfuzji zwierzęcia i dodatkowych 400 ml do rozcieńczenia utrwalacza .
- Przygotować utrwalacz składający się z 2% (w/v) paraformaldehydu (PFA....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Tradycyjnie mózgi są przecinane i barwione w celu ilościowego określenia zmian chorobowych oraz lokalizacji elektrod, jednak metoda ta jest podatna na błędy, pracochłonna i zazwyczaj wymaga szacowania wyników. Dzięki przygotowaniu całych mózgów do obrazowania mikro-CT znacznie zmniejsza się prawdopodobieństwo uszkodzenia próbek, analizowane cechy mogą być badane w kontekście całego mózgu, a metoda ta pozwala na równoległe przetwarzanie wielu próbek, co znacznie przyspiesza ich przygotowan.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Następujące kroki są krytycznymi krokami protokołu: po pierwsze, zastosowanie kombinacji PFA i GA do perfuzji zwierzęcia, a następnie po utrwaleniu mózgu, miało kluczowe znaczenie dla osiągnięcia konsekwentnej, pełnej penetracji tkanki przez osm. Chociaż nie testowaliśmy tego wyraźnie, prawdopodobnym wyjaśnieniem jest to, że fiksacja PFA jest odwracalna15, podczas gdy fiksacja GA nie jest odwracalna16,17. Ponieważ do pełnej infiltracji tka.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Gregowi Linowi i Arthurowi McClellandowi za ich ekspertyzę w zakresie mikro-tomografii komputerowej, Davidowi Richmondowi i Hunterowi Elliottowi z Image and Data Analysis Core (IDAC) w Harvard Medical School za ich porady dotyczące przetwarzania obrazów, oraz Williamowi Libertiemu z Boston University za łaskawe dostarczenie mózgu zeberki. Prace te zostały częściowo wykonane w Center for Nanoscale Systems (CNS), będącym członkiem National Nanotechnology Coordinated Infrastructure Network (NNCI), która jest wspierana przez National Science Foundation w ramach nagrody NSF nr 1541959. CNS jest częścią Uniwersytetu Harvarda. Prace te były wspierane przez F....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyd (PFA) | Mikroskopia elektronowa (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X |
| PBS Aldehyd glutarowy (GA) | EMS | 16220 | 2,5% (w/v) GA w 1x PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Praca pod wyciągiem |
| Etanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Aceton | EMS | 10015 | Destylowana w szkle |
| żywica Durcupan ACM | Sigma-Aldrich | 44610 | Składniki A, B, C i D, żywica do zatapiania |
| Formy jednorazowe | Ted Pella | 27114 | Sugerowana |
| woda milliQ (woda ultraczysta) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (lub pokrewny oczyszczacz) | Sugerowany |
| Parafilm (folia parafinowa) | Millipore Sigma | P7793 | Sugerowana folia parafinowa |
| Skaner mikrotomograficzny | Nikon Metrology Ltd., Tring, Wielka Brytania | X-Tek HMS ST 225 | Używany przez autorów |
| Oprogramowanie do wizualizacji i analizy skanów mikro-CT: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Używane przez autorów | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Używane przez autorów | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Podobne do Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | za darmo, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | za darmo, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Dobry do analizowania jednego wycinka na raz |
Bibliografia
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994)....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
