Artykuł metodologiczny

Nowatorskie rozpoznawanie obiektów i testy behawioralne lokalizacji obiektów u myszy przy ograniczonym budżecie

61.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58593

⸱

20 listopada 2018

 ,  , 
1Department of Psychology, Ohio State University, 2Department of Neuroscience, Ohio State University, 3Center for Chronic Brain Injury, Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj udostępniamy protokół, który zawiera obszerne instrukcje dotyczące ekonomicznego ustanawiania lokalizacji obiektów mysich i nowatorskich testów behawioralnych rozpoznawania obiektów, w tym projektowania, kosztu i budowy wymaganego sprzętu, a także wykonywania testów behawioralnych, zbierania danych i analizy.

Streszczenie

Etologicznie istotne testy behawioralne są kluczowym elementem każdego badania, które wykorzystuje modele mysie do badania poznawczych skutków różnych zmian fizjologicznych lub patologicznych. Zadanie lokalizacji obiektu (OLT) i zadanie rozpoznawania nowych obiektów (NORT) to dwa skuteczne zadania behawioralne powszechnie używane do ujawnienia funkcji i względnego zdrowia określonych regionów mózgu zaangażowanych w pamięć. Podczas gdy oba te testy wykorzystują wrodzoną preferencję myszy do nowości, aby ujawnić pamięć dla wcześniej napotkanych obiektów, OLT przede wszystkim ocenia uczenie się przestrzenne, które w dużej mierze opiera się na aktywności hipokampa. Z kolei NORT ocenia nieprzestrzenne uczenie się tożsamości obiektu, które opiera się na wielu regionach mózgu. Oba zadania wymagają areny testowej na otwartym polu, obiektów o wartości wewnętrznej równoważnej myszom, odpowiednich wskazówek środowiskowych oraz sprzętu do nagrywania wideo i oprogramowania. Dostępne na rynku systemy, choć wygodne, mogą być kosztowne. Ten manuskrypt szczegółowo opisuje prostą, opłacalną metodę budowy aren i ustawiania sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia OLT i NORT. Ponadto manuskrypt opisuje skuteczny protokół testowy, który obejmuje zarówno OLT, jak i NORT i zapewnia typowe metody pozyskiwania i analizy danych, a także reprezentatywne wyniki. Pomyślne zakończenie tych testów może dostarczyć cennych informacji na temat funkcji pamięci różnych systemów modeli myszy i ocenić podstawowe regiony neuronalne, które wspierają te funkcje.

Wprowadzenie

Skuteczne testy kognitywne izolują i oceniają funkcje neuronalne określonych obszarów mózgu, badając zachowanie w kontrolowanym środowisku1. U ludzi zaprojektowano specjalne zadania mające na celu ocenę wydajności docelowych regionów mózgu, takie jak zadanie sortowania kart w Wisconsin pod kątem funkcji przedczołowej lub test uczenia się sparowanych współpracowników w Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB) dla funkcji hipokampa2,3. Testy te mają na celu badanie funkcji określonych regionów mózgu u ludzi poprzez ocenę zachowań, które wynikają z aktywności neuronalnej tych regionów. Ostatecznym celem większości badań biomedycznych jest poprawa zdrowia ludzkiego; Jednak wiele badań nad funkcjonowaniem mózgu w zdrowiu lub chorobie nie może być etycznie przeprowadzonych z udziałem ludzi. W przypadku badań, w których nie można uczestniczyć w ludziach, często wybieranym modelem są małe gryzonie, takie jak myszy. Wykorzystanie modeli mysich pozwala na bezpośrednią kontrolę nad eksperymentalnymi manipulacjami, w tym zmianą ekspresji genów, indukcją urazu, a nawet modulacją aktywności obwodu za pomocą technik optogenetycznych. Testy behawioralne myszy, podobne do testów na ludziach, mają na celu ocenę wpływu zmiennych eksperymentalnych na funkcjonowanie mózgu poprzez pomiar zachowań, które opierają się na określonych regionach.

Hipokamp jest niezbędną strukturą do tworzenia pamięci u ludzi i gryzoni4. Mówiąc dokładniej, hipokamp odgrywa kluczową rolę w pamięci deklaratywnej obejmującej reprezentacje relacyjne, ale nie pamięć proceduralną, która opiera się na ośrodkach motorycznych mózgu4. Funkcja pamięci hipokampa jest przedmiotem badań w wielu dziedzinach neurobiologii, ponieważ jest wyjątkowo wrażliwa na zakłócenia. Negatywne zaburzenia, począwszy od długotrwałego stresu i starzenia się, a skończywszy na drgawkach i udarze, są związane z uszkodzeniem hipokampa5. Natomiast pozytywne interwencje, takie jak interakcje społeczne, fizyczne wzbogacanie środowiska lub ćwiczenia, poprawiają funkcję hipokampa6,7,8. Badania na gryzoniach z odpowiednim testowaniem pamięci hipokampa mogą ujawnić wgląd w komórkowe i molekularne mediatory pamięci, a także wpływ różnych interwencji środowiskowych na funkcję hipokampa.

U gryzoni opracowano kilka testów do badania uczenia się i pamięci zależnej od hipokampa9,10,11. Można je ogólnie podzielić na zadania, które wymagają bodźca o wartości emocjonalnej, aby wywołać zmianę w zachowaniu, oraz zadania, które czerpią z preferencji gryzoni do badania nowych bodźców11. Na przykład kontekstowe warunkowanie strachu łączy nieprzyjemny bodziec (wstrząs stopą) z kontekstem środowiskowym, a następnie testuje pamięć pod kątem tego kontekstu, mierząc zachowanie związane z zamrożeniem wywołane strachem9,11. Labirynt wodny Morris i jego suchy odpowiednik, labirynt Barnesa, wykorzystują ujemne wzmocnienie zewnętrzne, aby promować uczenie się przestrzenne4,11. W każdym przypadku gryzonie szukają ucieczki z awersyjnej sytuacji, zanurzając się odpowiednio w zimnej wodzie lub wystawiając na działanie na jasno oświetlonej platformie. Z kolei labirynt z ramieniem promieniowym opiera się na pozytywnym wzmocnieniu, ponieważ zwierzęta wykorzystują naturalne zachowania związane z żerowaniem w połączeniu z pamięcią przestrzenną, aby odzyskać małe nagrody w postaci jedzenia4,11. Zadania te są szeroko stosowane i przyniosły podstawową wiedzę na temat pamięci hipokampa. Jednak negatywne i pozytywne wzmocnienia zewnętrzne lub bodźce wywołujące strach, takie jak szok, dodają komponent emocjonalny do tych testów behawioralnych, co w niektórych przypadkach może być niepożądane. Na przykład hipokamp grzbietowy i brzuszny są związane z różnymi funkcjami, odpowiednio pamięcią przestrzenną i regulacją emocjonalną12. Testy, które opierają się na emocjonalnej reakcji na bodźce, mogą nie odzwierciedlać dokładnie upośledzonej pamięci przestrzennej, jeśli wpływa to również na funkcje regulacji emocjonalnej brzusznego hipokampa.

OLT to prosty i skuteczny test, który dostarcza miary pamięci przestrzennej zależnej od hipokampa13. Zadanie opiera się na wewnętrznej preferencji zwierzęcia do nowości bez dodatkowego zewnętrznego wzmocnienia i dlatego zazwyczaj pozwala uniknąć komplikacji związanych z różnymi reakcjami emocjonalnymi13. Obecny protokół OLT jest przedstawiony dla myszy, ale jest również skuteczny u szczurów, jeśli wymiary sprzętu są odpowiednio skalowane. Protokół polega na aklimatyzacji myszy do areny testowej na otwartym polu, a następnie umożliwieniu jej zbadania 2 obiektów w odniesieniu do przestrzennych wskazówek środowiskowych. Mysz jest następnie usuwana z areny, a podczas opóźnienia (interwału między próbami lub ITI) jeden z obiektów jest przesuwany. Po ITI mysz zostaje ponownie wprowadzona na arenę i może swobodnie eksplorować. Ogólnie rzecz biorąc, myszy preferują nowości, a jeśli pamiętają lokalizację obiektów z ich początkowej ekspozycji, spędzą więcej czasu na badaniu poruszanego obiektu. Zwierzęta z uszkodzeniami w hipokampie mają upośledzone przestrzenne uczenie się kontekstowe i w związku z tym nie wykazują preferencji dla obiektów w nowej lokalizacji14,15.

OLT może być używany niezależnie lub w połączeniu z dodatkowym testem pamięci, który wykorzystuje aktywność neuronalną z wielu obszarów mózgu, nowym zadaniem rozpoznawania obiektów (NORT). NORT jest identyczny z OLT do fazy testowej, kiedy jeden z obiektów jest zastępowany nowym obiektem, zamiast być przenoszony w nowe miejsce. Podobnie jak w przypadku OLT, myszy z dobrą pamięcią do obiektów spontanicznie wolą badać nowy obiekt. W przeciwieństwie do pamięci lokalizacji obiektów, która w dużej mierze opiera się na substratach hipokampa, pamięć rozpoznawania obiektów wydaje się polegać na różnych regionach mózgu, a zaangażowanie hipokampa jest niepewne. Wiele badań donosi, że uszkodzenia lub inaktywacja hipokampa nie wpływają na preferencję nowego obiektu10,13,16,17, podczas gdy inni uważają, że jest odwrotnie18,19. Jednak nadal jest to powszechnie stosowane zadanie do oceny funkcji pamięci ogólnej u gryzoni.

Protokół przedstawiony tutaj określa kroki związane z inicjacją i realizacją OLT i NORT, które korzystają z areny testowania na otwartym polu. Dostępny na rynku sprzęt do testów behawioralnych może być zbyt kosztowny, szczególnie dla mniejszych laboratoriów. Protokół ten obejmuje projekt i proste kroki do budowy aren we własnym zakresie przy minimalnych kosztach i bez specjalistycznych narzędzi. Co więcej, protokół ten szczegółowo opisuje idealny obszar testów behawioralnych, w tym rozmieszczenie aren, wskazówki kontekstowe i system nagrywania wideo, który przygotowuje grunt pod wdrożenie protokołów OLT i NORT. Przedstawiono reprezentatywne wyniki zarówno dla udanych, jak i wadliwych badań, podkreślając znaczenie optymalizacji wszystkich materiałów i procedur dla każdego badania.

opisopcjailość
Część A: Arkusz akrylowy - nieprzezroczysty biały (0,635 cm x 40 cm x 40,64 cm)Trasowane krawędziecyfra arabska
Część B: Arkusz akrylowy - nieprzezroczysty biały (0,635 cm x 40 cm x 41,91 cm)Trasowane krawędziecyfra arabska
Część C: Arkusz akrylowy - nieprzezroczysty biały (0,635 cm x 41,91 cm x 41,91 cm)Trasowane krawędzie1
Cement akrylowy (1 pkt.)nie1
16-stopniowy aplikator hiponie1
Kwadrat kombinowanynie1
Kamera internetowa HDnie1
Oprogramowanie do przechwytywania wideonie1
Przedłużacz USB 2.0nie1
Kanał kablowynie1

Tabela 1: Szczegółowa lista materiałów i sprzętu wymaganych do testów behawioralnych.

Protokół

Poniższy protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie stanowym Ohio (OSU).

1. Budowa aren

  1. Zamów materiały wymienione w Tabeli 1: pięć arkuszy akrylu, cement akrylowy oraz aplikator hipodermiczny 16 G.
  2. Stosuj odpowiedni sprzęt ochronny zgodnie z instrukcjami producenta, co może obejmować ochronę oczu, skóry oraz inne rodzaje zabezpieczeń.
  3. Usuń ochronną papierową powłokę z arkuszy akrylowych.
  4. Wykonaj próbne dopasowanie wszystkich elementów, aby potwierdzić poprawność wymiarów (Rysunek 1A).
  5. Zmontuj strzykawkę i napełnij ją cementem akrylowym.
  6. Wyrównaj długą krawędź zewnętrznej ścianki (część B) z górną krawędzią podstawy (część C) i upewnij się, że są one względem siebie prostopadłe, używając kątownika warsztatowego.
  7. Za pomocą strzykawki nanieś małą, równomierną warstwę cementu bezpośrednio w narożnik dwóch łączonych elementów.
  8. Przytrzymaj oba elementy (części B i C) na miejscu, aż wstępnie stężeją (około 5 min).
    UWAGA: Zazwyczaj utwardzają się w 80% w ciągu 24 h, jednak montaż można kontynuować po 5 min.
  9. Powtórz kroki 1.5–1.7 z drugą zewnętrzną ścianką (część B) i tą samą podstawą.
  10. Przymocuj dwie wewnętrzne ścianki (część A), jedną po drugiej, do podstawy, stosując kroki 1.5–1.7.
  11. Dodatkowo użyj strzykawki, aby nanieść małą, równomierną warstwę cementu bezpośrednio w narożniku tworzonym obecnie przez ściankę zewnętrzną (część B) i ściankę wewnętrzną (część A).
  12. Przytrzymaj te elementy na miejscu przez 5 min.
  13. Po 24–48 h przystąp do przygotowania środowiska do testów behawioralnych.

2. Przygotowanie środowiska i sprzętu do testów behawioralnych

  1. Umieść wskazówki środowiskowe (opisane w sekcji dyskusji) naprzeciwko siebie, skierowane w stronę aren w obszarze testowym (Rysunek 1B).
  2. Ustaw cztery areny testowe w układzie 2x2 na podłodze lub stabilnym stole, w odpowiednich odległościach od wskazówek i kamery, aby zmaksymalizować bodźce wizualne dla myszy (Rysunek 1B).
  3. Zweryfikuj linię widoczności, opierając przymiar od dna każdej areny o jej ścianę w stronę wskazówek, aby potwierdzić, że odległości między arenami a wskazówkami są odpowiednie.
  4. Wyznacz optymalną długość drogi optycznej, która umożliwi dokumentację wideo wszystkich czterech aren, regulując wysokość kamery lub wysokość stołu (Rysunek 1B).
  5. Podłącz kamerę do przedłużacza USB.
  6. Za pomocą korytek kablowych poprowadź kabel wzdłuż sufitu i w dół ściany do komputera z uruchomionym oprogramowaniem do przechwytywania wideo.
  7. Ukryj komputer za zasłoną, która oddzieli myszy w obszarze testowym od badacza (Rysunek 1C).
  8. Przygotuj po 4 egzemplarze co najmniej 3 różnych obiektów o długości i szerokości około 2–5 cm oraz wysokości do 10 cm do wykorzystania w testach (Rysunek 1D).

Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, ustawienie eksperymentu, wymiary, kalibracja ekranu, marionetka z linijką.
Rycina 1: Przygotowanie do testów behawioralnych. (A) Montaż areny do testu otwartego pola (open-field test), gdzie część A odpowiada ścianie wewnętrznej, część B ścianie zewnętrznej, a część C podstawie. Gotowa arena będzie posiadać dwie ściany zewnętrzne (części B), które biegną wzdłuż całej krawędzi podstawy, oraz dwie ściany wewnętrzne (części A), które mieszczą się między ścianami zewnętrznymi na sąsiednich krawędziach podstawy (część C). Wszystkie ściany opierają się na podstawie. (B) Reprezentatywny układ aren na stole o wysokości 0,62 m, sygnały środowiskowe o wymiarach 60 x 90 cm, oświetlenie oraz kamera dla obszaru testowego, co pozwala na jednoczesną rejestrację wszystkich czterech aren. (C) Kurtyna oddzielająca eksperymentatora i system komputerowy od myszy podczas prób. Oświetlenie górne jest włączone na potrzeby wykonania tej fotografii, jednak podczas testów zapalone są jedynie lampy podłogowe. Ponadto, na potrzeby zdjęcia obszaru testowego usunięto jeden z sygnałów środowiskowych, lecz podczas testów przed arenami znajduje się czwarty sygnał, naprzeciwko całkowicie czarnego sygnału za stołem. (D) Reprezentatywny obiekt (oraz linijka dla skali) odpowiedni do testów OLT lub NORT z udziałem myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przeprowadź walidację tych obiektów.
    1. Pozyskaj minimum 8 myszy typu dzikiego w płci, szczepie i grupie wiekowej reprezentatywnej dla myszy eksperymentalnych, które będą użyte (np. samice i samce myszy C57Bl/6 w wieku od 6 do 9 tygodni).
    2. Przez okres od 3 do 5 dni przed testowaniem codziennie manipuluj myszami przez 1 min.
    3. Podziel myszy na grupy po 4 i, jeśli nie są jeszcze kwaterowane pojedynczo, przenieś je do indywidualnych, czystych klatek utrzymaniowych.
    4. Przenieś je do pomieszczenia testowego i pozwól im na aklimatyzację przez co najmniej 30 min.
      UWAGA: Obecność eksperymentatora w pomieszczeniu przez te 30 min zredukuje stres u myszy podczas zadania, szczególnie jeśli eksperymentator jest mężczyzną20.
    5. Po zakończeniu aklimatyzacji i przygotowaniu eksperymentatora do rozpoczęcia pracy, zacznij nagrywać wideo.
    6. Umieść każdą mysz przodem do ścian w jednym z narożników areny (zwanym narożnikiem startowym) (Rycina 2A).
    7. Pozwól myszom swobodnie eksplorować areny przez 10 min.
    8. Zatrzymaj nagrywanie wideo.
    9. Zwróć myszy do ich czystych klatek utrzymaniowych na okres 20 min.
    10. Oczyść wszystkie areny metodami rekomendowanymi przez zespół ds. zwierząt, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować wskazówki olfaktoryczne przed kolejnym użyciem.
    11. Używając dwustronnej taśmy, przymocuj 2 różne obiekty w pobliżu 2 narożników niebędących narożnikami startowymi w taki sposób, aby obiekty w arenie były zrównoważone, w odległości 6 x 6 cm2 od każdej ze ścian danego narożnika (Rycina 2B).
    12. Zacznij nagrywać wideo.
    13. Umieść każdą mysz przodem do ścian w narożniku startowym.
    14. Pozwól myszom swobodnie badać arenę i obiekty przez 10 min.
    15. Zatrzymaj nagrywanie wideo.
    16. Umieść myszy z powrotem w ich czystych klatkach utrzymaniowych na okres 20 min.
    17. Oczyść wszystkie areny i obiekty metodami rekomendowanymi przez zespół ds. zwierząt, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować wskazówki olfaktoryczne.
    18. Powtarzaj próby treningowe z 2 nowymi obiektami przymocowanymi w tych samych lokalizacjach, aż wszystkie obiekty (co najmniej trzy różne obiekty w przypadku przeprowadzania zarówno OLT, jak i NORT) zostaną przetestowane u każdej myszy.
    19. Wyklucz obiekty, na których myszy mogą usiąść.
    20. Przeanalizuj czas badania każdego obiektu przez każdą mysz zgodnie z krokiem 4.
    21. Wyklucz obiekty o ujemnej lub dodatniej wartości wewnętrznej.

3. Przeprowadzenie testu behawioralnego

  1. Tydzień przed testowaniem: zapoznanie osób przeprowadzających testy behawioralne
    1. Codziennie przez 1 min w ciągu 3–5 dni przed testowaniem należy obchodzić się z dorosłymi samicami i samcami myszy C57Bl/6 w wieku od 6 do 9 tygodni.
  2. Dzień 1: sesje habituacji
    1. Podzielić myszy na grupy po 4 osobniki i, jeśli nie są one jeszcze utrzymywane pojedynczo, przenieść je do indywidualnych, czystych klatek tymczasowych.
    2. Przenieść je do pomieszczenia testowego i pozwolić im na aklimatyzację w tym pomieszczeniu przez co najmniej 30 min.
      UWAGA: Obecność eksperymentatora w pomieszczeniu przez te 30 min zredukuje stres u myszy podczas zadania, zwłaszcza jeśli eksperymentator jest mężczyzną20.
  3. Po zakończeniu aklimatyzacji i gdy eksperymentator będzie gotowy do rozpoczęcia, należy włączyć nagrywanie wideo.
  4. Umieścić każdą mysz w arenie (jedna mysz na arenę) twarzą do ścian w narożniku wypuszczania (Rycina 2A).
  5. Pozwolić myszom na swobodną eksplorację aren przez 6 min.
  6. Zatrzymać nagrywanie wideo.
  7. Przenieść myszy z powrotem do czystych klatek tymczasowych w odstępie między próbami (ITI).
  8. Wyczyścić wszystkie areny zalecanymi w jednostce doświadczalnej metodami czyszczenia, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały zapachowe.
  9. Powtórzyć kroki 3.3–3.9 jeszcze dwa razy, aby przeprowadzić łącznie 3 sesje habituacji dla każdej myszy.
  10. Przenieść wszystkie myszy z powrotem do ich klatek macierzystych.
  11. Wyczyścić wszystkie areny zalecanymi w jednostce doświadczalnej metodami czyszczenia, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały zapachowe przed użyciem następnego dnia.
  12. Dzień 2: próba treningowa, OLT, NORT
    UWAGA: NORT jest testem opcjonalnym.
    1. Po 24 h przenieść tę samą grupę myszy do pomieszczenia testowego i pozwolić im na aklimatyzację w tym pomieszczeniu przez co najmniej 30 min, analogicznie do procedury przed sesjami habituacji w dniu poprzednim.
    2. Przeprowadzić próbę treningową z wykorzystaniem 2 obiektów umieszczonych w arenie (Rycina 2B).
      1. Używając dwustronnej taśmy, przymocować obiekty w odległości 6 x 6 cm2 od 2 narożników innych niż narożnik wypuszczania, tak aby były one rozmieszczone w arenie w sposób zrównoważony.
      2. Włączyć nagrywanie wideo.
      3. Umieścić każdą mysz twarzą do ścian w narożniku wypuszczania, tak jak podczas sesji habituacji.
      4. Pozwolić myszom na swobodną eksplorację areny i obiektów przez 10 min.
      5. Zatrzymać nagrywanie wideo.
      6. Umieścić myszy z powrotem w czystych klatkach tymczasowych na ITI trwający 20 min.
      7. Wyczyścić wszystkie areny i obiekty zalecanymi w jednostce doświadczalnej metodami czyszczenia, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały zapachowe.
    3. Przeprowadzić OLT.
      1. Przenieść jeden z obiektów użytych w próbie treningowej do nowego narożnika innego niż narożnik wypuszczania i przymocować obiekt dwustronną taśmą w odległości 6 cm od każdej ze ścian tego narożnika (Rycina 2C).
        UWAGA: Drugi obiekt powinien pozostać w miejscu, w którym znajdował się podczas próby treningowej.
      2. Włączyć nagrywanie wideo.
      3. Umieścić każdą mysz twarzą do ścian w narożniku wypuszczania.
      4. Pozwolić myszom na badanie obiektów przez 10 min.
      5. Zatrzymać nagrywanie wideo.
      6. Umieścić myszy z powrotem w czystych klatkach tymczasowych na ITI trwający 20 min.
      7. Wyczyścić wszystkie areny i obiekty zalecanymi w jednostce doświadczalnej metodami czyszczenia, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały zapachowe.
    4. Przeprowadzić NORT.
      1. Zastąpić obiekt, który nie został przesunięty podczas OLT, nowym obiektem i przymocować nowy obiekt dwustronną taśmą w odległości 6 cm od dwóch ścian narożnika (Rycina 2D).
      2. Włączyć nagrywanie wideo.
      3. Umieścić każdą mysz twarzą do ścian w narożniku wypuszczania.
      4. Pozwolić myszom na badanie obiektów przez 10 min.
      5. Zatrzymać nagrywanie wideo.
      6. Przenieść myszy z powrotem do ich klatek macierzystych.
      7. Wyczyścić wszystkie areny i obiekty zalecanymi w jednostce doświadczalnej metodami czyszczenia, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały zapachowe przed kolejnym użyciem.

Analiza zachowania myszy w boksie; układ eksperymentalny z kolorowymi obiektami, cztery etapy schematu A-D.
Rysunek 2: Konfiguracja areny dla prób. (A) Arena do testu otwartego pola bez obiektów do sesji habituacji. Czarna strzałka wskazuje róg wypuszczenia. Róg ten powinien znajdować się w tej samej lokalizacji względnej w każdej arenie i być spójny dla każdej badanej myszy oraz dla każdej próby. (B) W próbie treningowej dwa różne obiekty są przymocowane do otwartego pola w odległości 6 x 6 cm od odpowiadających im ścian. (C) W teście OLT jeden obiekt zostaje przeniesiony w nowe miejsce, również w odległości 6 x 6 cm od ścian i z dala od rogu wypuszczenia. (D) W teście NORT obiekt, który był stacjonarny w OLT, zostaje zastąpiony nowym obiektem, podczas gdy obiekt przeniesiony w OLT staje się teraz obiektem znanym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Analiza danych z testów behawioralnych

UWAGA: Analiza wideo powinna zostać w idealnym przypadku przeprowadzona przez co najmniej dwóch niezależnych, zaślepionych eksperymentatorów.

  1. Otwórz plik wideo.
  2. Na ekranie nałóż przezroczyste koła zapewniające obramowanie o szerokości 2 cm wokół każdego obiektu, aby ułatwić określenie aktywnej eksploracji. W celu kalibracji tej siatki należy użyć klatki z pliku wideo, na której w arenie umieszczono linijkę.
  3. Obserwuj zachowanie myszy i rejestruj czas, w którym mysz aktywnie eksploruje obiekt; uznaje się to za eksplorację, gdy nos myszy jest skierowany w stronę obiektu w odległości nieprzekraczającej 2 cm od tego obiektu.
    1. Zapisz znacznik czasu rozpoczęcia eksploracji obiektu przez mysz oraz znacznik czasu zakończenia tej eksploracji.
    2. Powtórz tę procedurę dla obu obiektów w arenie przez cały czas trwania próby.
    3. Oblicz skumulowany czas eksploracji każdego obiektu przez mysz, odejmując czas rozpoczęcia od czasu zakończenia dla każdego przypadku eksploracji obiektu, a następnie sumując wszystkie te wartości.
  4. Oblicz procent całkowitego czasu eksploracji lub indeks dyskryminacji za pomocą następujących wzorów:
    1. Oblicz procent całkowitego czasu eksploracji =
      Wzór indeksu preferencji nowości; równanie ilustrujące stosunek interakcji z obiektem nowym i znanym.
      UWAGA: Wartość powyżej 50% wskazuje na intensywniejszą eksplorację nowej lokalizacji lub obiektu.
    2. Oblicz indeks dyskryminacji =
      Wzór indeksu neofobii; schemat statystyczny; mierzy czas trwania odpowiedzi na nowość.
      UWAGA: Wartość dodatnia wskazuje na dłuższy czas eksploracji nowego obiektu. Indeks dyskryminacji równy zero oznacza poświęcenie równego amountu czasu obydwu obiektom.
  5. Przedstaw wyniki graficznie i przeprowadź analizy statystyczne przy użyciu testu t lub analizy ANOVA, w zależności od liczby porównywanych grup.

Wyniki

Rysunek 3 przedstawia przykłady typowych wyników pozytywnych i negatywnych uzyskanych u dorosłych samców i samic myszy C57Bl/6 z zastosowaniem tego protokołu6. Interpretacja danych z testów OLT i NORT zawsze odnosi się do zagregowanych danych grupy (patrz dyskusja poniżej). Czas eksploracji pojedynczej myszy nie może być interpretowany jako obecność lub brak pamięci. Jednakże wyniki grupy myszy (t.j. wielu osobników) można porównać z innymi grupami lub z ustalonym poziomem przypadku, stosując testy statystyczne. Podczas typowej próby treningowej grupy myszy nie wykazują średnio istotnej preferencji do któregoś z obiektów, ponieważ oba są w równym stopniu nowe i nie posiadają żadnej wewnętrznie negatywnej ani pozytywnej wartości dla myszy (Rysunek 3A i 3B). Jeśli zagregowane dane grupy myszy wykazują istotną preferencję jednego obiektu nad drugim podczas treningu, obiekty te nie powinny być stosowane, ponieważ taka wrodzona preferencja/awersja zakłóci wyniki w kolejnych próbach. Ponadto całkowity czas eksploracji wszystkich myszy musi spełniać minimalny standard (tradycyjnie ustalony na 20 sekund21) i powinien zostać porównany, aby upewnić się, że nie występują różnice bazowe w eksploracji, które mogłyby wpłynąć na późniejsze testy pamięci.

Podczas OLT pamięć dotyczącą lokalizacji obiektu przejawia się tym, że myszy spędzają średnio znacznie więcej niż 50% całkowitego czasu eksploracji z obiektem przesuniętym (Rycina 3A). Jeśli całkowity czas eksploracji u poszczególnych myszy znacznie się różni, wyniki lepiej przedstawić w formie indeksu dyskryminacji obiektów (Rycina 3B). Znaczący wzrost średniego indeksu dyskryminacji na Rycynie 3B wskazuje, że myszy spędziły więcej czasu z obiektem po jego przesunięciu. Niezależnie od tego, czy mierzy się to wzrostem procentowego czasu, czy indeksem dyskryminacji, zwiększona eksploracja obiektu po jego przesunięciu sugeruje, że myszy pamiętają miejsce, w którym obiekt znajdował się podczas treningu.

Ostatnia próba w tym protokole ocenia pamięć rozpoznawania obiektów. Reprezentatywny przykład z jedną grupą myszy wykazuje wyższy średni procent czasu eksploracji (Rycina 3C), a także dodatni indeks dyskryminacji (Rycina 3D) w porównaniu do stałych wartości kontrolnych wynoszących odpowiednio 50% i 0. Podobnie jak w przypadku danych OLT, jeśli między poszczególnymi myszami występuje znacząca zmienność całkowitego czasu eksploracji, indeks dyskryminacji jest prawdopodobnie lepszą metodą wizualizacji tych danych. Rycina 3E przedstawia przykład porównania dwóch grup w teście NORT oraz niektóre komplikacje statystyczne, które mogą wystąpić w tych badaniach (patrz sekcja dyskusja). Choć test t dla jednej próby dla grupy B wykazuje eksplorację istotnie powyżej 50%, ten sam test dla grupy A tego nie potwierdza. Wynik ten nie oznacza, że grupa A i B różnią się od siebie. Aby określić różnice między grupami, należy przeprowadzić oddzielny nieparametryczny test Manna-Whitneya dla dwóch prób, porównujący grupę B z grupą A. Nieparametryczny test Manna-Whitneya dla dwóch prób przeprowadzony na tych reprezentatywnych danych grupowych nie wykazuje istotnej różnicy (p = 0,66) między dwiema grupami w procencie czasu eksploracji nowego obiektu.

Zarówno test OLT, jak i NORT są bardzo wrażliwe na wartość immanentną obiektów, dlatego niezbędne jest dokładne przetestowanie równoważności obiektów, aby upewnić się, że nie występuje wrodzona preferencja, która mogłaby zakłócić wyniki. Rysunek 3F i 3G przedstawiają przykład niewłaściwego doboru obiektów. W teście pilotażowym na grupie 4 myszy zaobserwowano tendencję do spędzania mniej niż 50% czasu eksploracji z obiektem A w parze z obiektem B (Rysunek 3F). Gdy obiekty te zostały następnie wykorzystane w teście NORT, w którym obiekt A był obiektem nowym, a wielkość próby wynosiła 16, myszy spędzały istotnie mniej niż 50% czasu eksploracji z obiektem A (Rysunek 3G). Taka awersja do nowego obiektu jest tutaj łatwo rozpoznawalna jako błąd techniczny w eksperymencie i obrazuje, dlaczego testy pilotażowe obiektów pod kątem wrodzonej preferencji lub awersji są niezbędne.

Wykresy analizy behawioralnej; % czasu badania vs indeks dyskryminacji; test rozpoznawania obiektów.
Rycina 3: Dane z testów behawioralnych przeprowadzonych na dorosłych myszach szczepu C57Bl/6 typu dzikiego. (A) Porównanie procentowego całkowitego czasu badania przesuniętego obiektu podczas próby treningowej w stosunku do OLT wykazuje istotny wzrost badania po przesunięciu obiektu. ****p < 0.0001, test t dla prób zależnych. (B) Reprezentatywne wyniki badania przesuniętego obiektu podczas prób treningowych i OLT, przedstawione jako indeks dyskryminacji, analogicznie wykazują istotny wzrost badania obiektu po jego przesunięciu. ****p < 0.0001, test t dla prób zależnych. (C) Procent całkowitego czasu badania nowego obiektu w NORT wykazuje istotną preferencję badania nowego obiektu. **p = 0.0024, test t dla jednej próby vs. 50%. (D) Reprezentatywne wyniki badania nowego obiektu w NORT, przedstawione jako indeks dyskryminacji, analogicznie wykazują preferencję badania nowego obiektu. **p = 0.0024, test t dla jednej próby vs 0. (E) Reprezentatywne wyniki analizy NORT z udziałem dwóch różnych grup myszy. Grupa B różni się istotnie od 50% w teście t dla jednej próby (**p = 0.0024), ale grupa A nie wykazuje takiej różnicy (p = 0.5837). W oddzielnej analizie, w celu porównania grup, zastosowano test U Manna-Whitneya ze względu na nierówną liczebność grup; nie stwierdzono istotnej różnicy w badaniu (p = 0.66, ns). (F) Procent czasu spędzonego z obiektem podczas prób walidacyjnych przy małej liczebności próby wskazuje na tendencję do unikania obiektu. p = 0.2159, test t dla jednej próby. (G) Przy większej liczebności próby i wykorzystaniu obiektu z (F) jako nowego obiektu w NORT, stwierdzono istotne unikanie obiektu, mimo że był on obiektem nowym. *p = 0.0270, test t dla jednej próby. Jest to przykład błędu technicznego przy wyborze obiektu. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Dane z paneli C-E zostały zaadaptowane z wcześniejszej publikacji6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia opłacalną metodę przeprowadzania testów behawioralnych lokalizacji obiektów i rozpoznawania nowatorskich obiektów u myszy. Testy te umożliwiają ocenę funkcji hipokampa, a także funkcji innych obszarów kory mózgowej, takich jak kora przedczołowa, zaangażowanych w rozpoznawanie obiektów10. OLT i NORT mają tę zaletę, że unikają bodźców o silnej wartościowości emocjonalnej, które są wymagane w labiryncie wodnym Morrisa, kontekstowym warunkowaniu strachu, labiryncie Barnesa lub labiryncie ramion promieniowych. Unikają również konieczności pozbawiania się pożywienia, co jest wymagane w labiryncie ramienia promieniowego. Ponadto protokół ten opisuje prostą dwudniową procedurę testową, która nie wymaga rozbudowanego ani skomplikowanego sprzętu do wykonania lub analizy. Jedną z wad tych zadań jest to, że nie pozwalają one na pomiary uczenia się lub przyswajania. Różnica w badaniu nowości może wynikać z gorszego uczenia się o obiektach podczas treningu, gorszej pamięci tego, czego się nauczyliśmy, lub obu. Całkowity czas spędzony na badaniu obiektów jest ważną miarą pozwalającą wykluczyć wszelkie wrodzone różnice w popędzie do eksploracji, ale nie jest miarą uczenia się. Jeśli miary uczenia się są ważne dla pytania eksperymentalnego, labirynt wodny, labirynt Barnesa lub labirynt z ramieniem promieniowym byłby prawdopodobnie preferowany.

Budowanie niestandardowych aren behawioralnych ma potencjał, aby zaoszczędzić setki dolarów i sprawić, że testowanie obiektów znajdzie się w zasięgu finansowym szerokiej gamy laboratoriów. Protokół ten eliminuje wiele przeszkód i usprawnia proces produkcji, aby budowa aren we własnym zakresie była bardziej dostępna dla naukowców bez specjalistycznego szkolenia w zakresie akryli. Ważne jest, aby pamiętać, że zakup kolorowych arkuszy akrylowych, które będą kontrastować z myszami, takich jak biały akryl dla czarnych myszy i akryl dla białych myszy, ułatwi pozyskiwanie i analizę danych, zwłaszcza w przypadku korzystania z dostępnego na rynku oprogramowania analitycznego. Zamawianie arkuszy ciętych na wymiar z "frezowanymi krawędziami" eliminuje konieczność stosowania piły stołowej (tabela 1), a zastosowanie cementu akrylowego eliminuje konieczność wiercenia i pogłębiania otworów prowadzących. Wkręcanie łączników, wiercenie i cięcie akrylu często powoduje jego pękanie, odpryskiwanie i pękanie ze względu na jego kruchość. Ponieważ cement jest rozpuszczalnikiem, spłynie do łączonego obszaru, rozpuszczając i zmiękczając napotkany akryl. Dlatego nie należy go nakładać na każdy kawałek z osobna, tak jakby był to tradycyjny klej. W przeciwieństwie do kleju cement nie wypełnia ujemnych przestrzeni ani nie przylega do powierzchni. Jest to główny powód, dla którego warto zamawiać "frezowane krawędzie", ponieważ zapewni to gładką i płaską krawędź, tworząc znacznie lepsze połączenie. Kiedy cement wyschnie, stopi dwa arkusze akrylowe w jeden kawałek w procesie zwanym "spawaniem rozpuszczalnikowym". Podobnie jak w przypadku spawania metali, gotowy produkt jest pojedynczym elementem, ale spawany obszar zawsze pozostanie najsłabszym miejscem. W związku z tym, gdy areny są już w użyciu, należy zachować ostrożność, aby uniknąć bezpośredniego uderzenia lub ekstremalnego stresu w tych momentach.

Protokół ten pokazuje również, jak skonfigurować 4 areny do jednoczesnego testowania do 4 myszy (rysunek 1 i rysunek 2). Nieprzezroczyste ściany aren uniemożliwiają myszom zobaczenie się nawzajem podczas testów, ale nadal istnieje możliwość, że obecność innych myszy w pomieszczeniu powoduje rozpraszanie zapachu lub hałasu, co może utrudnić testowanie. Próby habituacji, jak opisano tutaj, mogą pomóc złagodzić ten problem, ponieważ myszy są narażone na warunki w pomieszczeniu z wieloma zwierzętami przed testami behawioralnymi. Jeśli jednak rozproszenie uwagi od innych myszy lub hałas eksperymentatora związany z obchodzeniem się z innymi myszami jest poważnym problemem, można również użyć jednej areny z jedną myszą, chociaż wydłuży to czas potrzebny do ukończenia OLT i NORT z wieloma myszami. Teoretycznie można również użyć więcej niż 4 aren, ale większość kamer nie ma wystarczająco szerokiego pola widzenia, aby pokazać tyle aren w dobrej rozdzielczości.

Podane tutaj wymiary i odległości są ogólnymi wskazówkami dotyczącymi testowania zachowania myszy w typowym pomieszczeniu testowym o wymiarach 16 x 16 x 16m3 (Rysunek 1B i 1C). Ustawienie odpowiednich sygnałów środowiskowych, aren i sprzętu do nagrywania wideo musi być zoptymalizowane dla każdego środowiska. Wskazówki mogą składać się z dużych kształtów lub wzorów (zwykle w kolorze czarnym i białym), które umożliwiają myszom orientację przestrzenną podczas OLT. Zamiast umieszczać wskazówki w różnych miejscach naprzeciwko siebie, można je również zamontować na ścianach obszaru testowego. Protokół ten zaleca podzielenie pokoju testowego zasłoną, aby ukryć badacza i komputer podczas testów behawioralnych. Podczas wszystkich przyzwyczajeń, interwałów między próbami i aktywnych prób badacze powinni zasunąć kurtynę, aby oddzielić się od obszaru testowego. Jeśli nie jest to praktyczne, komputer może pozostać w polu widzenia myszy, ale badacz musi zejść z pola widzenia podczas wykonywania zadania. Jeśli badacz jest obecny, myszy mogą próbować polegać na nim jako na wskazówce przestrzennej.

Wszystkie testy behawioralne powinny być przeprowadzane w środowisku o kontrolowanej temperaturze i wilgotności ze słabym, ale równomiernym oświetleniem o natężeniu około 310 luksów i minimalnym zewnętrznym dźwiękiem lub silnymi sygnałami zapachowymi otoczenia, takimi jak perfumy dla eksperymentatorów. Pomiędzy każdym dniem próbnym i testowym wszystkie areny i obiekty powinny być czyszczone metodami sterylizacji zalecanymi przez zwierzęta, takimi jak przecieranie 70% etanolem lub bezzapachowymi chusteczkami wybielającymi, aby zminimalizować sygnały węchowe. Jeśli stosowane są chemiczne środki dezynfekujące, zaleca się końcowe spłukanie 70% etanolem, ponieważ wiele chemicznych środków dezynfekujących może działać drażniąco na stopy zwierząt. Jak w przypadku każdego zadania behawioralnego, Obchodzenie się z myszami przez kilka dni przed badaniem jest konieczne, aby zapoznać je z osobami, które będą wykonywać OLT i NORT oraz zmniejszyć stres podczas testowania20,22. Ponieważ myszy mogą doświadczać ostrego stresu z powodu nieznanych osób znajdujących się w pobliżu obszaru testowego, zaleca się również, aby wszystkie testy behawioralne były wykonywane przez tę samą osobę (osoby). Parametry i warunki testowe wyszczególnione w tym protokole zostały zoptymalizowane dla dorosłych myszy C57Bl / 6 w wieku od 6 do 9 tygodni i byłyby najbardziej przydatne w ujawnieniu zaburzeń pamięci spowodowanych urazem w tej grupie wiekowej lub zaburzeń pamięci spowodowanych wiekiem u starszych myszy. Jeśli celem jest przetestowanie poprawy pamięci u młodych myszy, dłuższy ITI wynoszący od 1 godziny do 1 dnia byłby bardziej odpowiedni, aby uniknąć wpływu na wydajność w łatwiejszej 20-minutowej wersji ITI. Rzeczywiście, ITI mogą trwać od 5 minut (w celu natychmiastowego przypomnienia) do kilku godzin lub dni (w przypadku pamięci zdalnej), w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentu oraz szczepów i wieku myszy. Co ważne, niezależnie od długości, wszystkie ZIT powinny być spójne między sesjami w eksperymencie. Ponieważ różne szczepy i wiek myszy wykazują różnice w zachowaniu i uczeniu się, czas każdej próby i interwału, układ obszaru testowego i używane obiekty mogą być modyfikowane w zależności od konkretnego szczepu myszy, ich wieku i konkretnego modelu urazu / choroby / interwencji, który jest testowany 9,21,23,25.

Podczas gdy zależność hipokampa funkcji pamięci przestrzennej testowanych w OLT jest dobrze ugruntowana, NORT może, ale nie musi, polegać na hipokampie. Interpretacja danych z NORT powinna uwzględniać to zastrzeżenie. Zmienne decydujące o tym, czy hipokamp jest zaangażowany, w pamięć rozpoznawania obiektów, nie są jeszcze uzgodnione, ale mogą obejmować długość ITI lub istotność wskazówek przestrzennych18. Warto zauważyć, że prezentowany protokół wykorzystuje przestrzenny OLT przed NORT, co może skłaniać myszy do korzystania z procesów hipokampa w NORT. Dlatego ważne jest, aby pamiętać, że kolejność może być odwrócona lub każde zadanie może być uruchamiane niezależnie, w zależności od pytań i potrzeb eksperymentatorów.

Wybór obiektów jest krytycznym aspektem zarówno OLT, jak i NORT22,24. Idealne przedmioty są na tyle ciężkie, aby nie mogły być łatwo przemieszczone przez mysz i wykonane z materiału, takiego jak szkło lub metal, którego mysz nie może uszkodzić przez żucie lub drapanie. Przedmioty drewniane, piankowe lub z miękkiego tworzywa sztucznego nie są odpowiednie, ponieważ łatwo się odkształcają i trudno je utrzymać w stanie wolnym od zapachu. Co więcej, wszystkie przedmioty użyte w próbach powinny być stosunkowo podobne pod względem wielkości, tekstury, zapachu i materiału. Rysunek 1D przedstawia przykład odpowiedniego obiektu, który można wykorzystać. Ta pomarańczowa plastikowa figurka pisklęcia jest wypełniona piaskiem, aby nadać jej odpowiednią wagę i uszczelniona, aby zapobiec wyciekom odczynników czyszczących lub innych środków powodujących nieprzyjemny zapach. Ze względu na kształt wierzchołka, myszy nie są w stanie wspiąć się na niego ani na nim usiąść. W przypadku OLT lub NORT obiekt ten najlepiej łączy się z innym obiektem o podobnym rozmiarze, wadze, materiale, kolorze i złożoności, takim jak podobna plastikowa figurka królika. Aby upewnić się, że badanie obiektów rzeczywiście odzwierciedla preferencję dla nowości, wszystkie obiekty muszą zostać zweryfikowane pod kątem równoważnej wartości wewnętrznej na co najmniej 8 myszach w tym samym szczepie, płci i wieku grupy eksperymentalnej, jak opisano w sekcji 2.9 protokołu. Dodatkowo, obiekty powinny być losowo wybrane pod względem tego, który obiekt jest nowym lub przeniesionym obiektem między myszami w tym samym badaniu, aby dodatkowo upewnić się, że nieodłączne cechy obiektów nie wpływają na preferencje. Rozmieszczenie obiektów może również mieć duży wpływ na powodzenie lub porażkę OLT i NORT. Obiekty muszą być zrównoważone na arenach i nie mogą znajdować się zbyt blisko ścian. Kącik zatłoczony przez przedmiot jest atrakcyjnym miejscem do ukrycia się dla myszy, co zakłóci pomiary badawcze.

Ważnym warunkiem wstępnym do zbierania danych jest zdefiniowanie "aktywnego śledztwa", które ma miejsce, gdy mysz atakuje obiekt z nosem skierowanym na obiekt w odległości nie większej niż 2 cm. Mysz poruszająca się nad obiektem lub patrząca poza obiekt nie kwalifikuje się jako aktywne badanie. Ponadto, ponieważ OLT i NORT zależą od tego, czy mysz zapamiętuje albo położenie przestrzenne, albo rzeczywiste cechy obiektu, podczas prób treningowych musi być przeprowadzone wystarczające badanie. W związku z tym badacz musi określić minimalny czas badania i wykluczyć wszystkie osoby, które nie spełniają tego podstawowego poziomu badania, tradycyjnie ustalonego na 20 sekund21.

Kwantyfikacja czasu badania obiektu może być realizowana na różne sposoby, zarówno za pomocą drogiego oprogramowania analitycznego, jak i bez niego. Jeśli używane jest ręczne ocenianie, jak opisano tutaj, najbardziej kompleksowe zbieranie danych można osiągnąć, rejestrując znaczniki czasu na wideo, gdy mysz bada obiekt. Rejestrowanie czasów rozpoczęcia i zakończenia badania obiektu podczas trzech indywidualnych prób tworzy stały dziennik bezstronnych znaczników czasu i ułatwia dokładne ręczne obliczanie danych w przeciwieństwie do alternatywnych metod, takich jak użycie stopera do addytywnego rejestrowania całkowitego czasu, w którym mysz bada każdy obiekt.

Dostępne są również komercyjne pakiety oprogramowania do badania obiektów scoringowych. Dostępne na rynku oprogramowanie może dostarczyć wielu danych wykraczających poza opisane tutaj dane dotyczące punktacji rozdań, w tym całkowity przebyty dystans, ilość czasu spędzonego w określonych obszarach areny i prędkość ruchu16,23. Oprogramowanie, po prawidłowym skalibrowaniu i potwierdzeniu, że niezawodnie wykrywa badanie obiektu, może również generować dane znacznie szybciej niż ręczna ocena. Ta szybsza wydajność danych może w dłuższej perspektywie przynieść oszczędności netto w porównaniu z roboczogodzinami wymaganymi do ręcznego oceniania. Jednak większość pakietów oprogramowania do analizy behawioralnej wiąże się z wysokimi kosztami początkowymi, które mogą być zaporowe dla wielu laboratoriów, a ręczna ocena może być często wykonywana przez studentów-badaczy, dzięki czemu koszty godzinowe oceny behawioralnej są minimalne. Oprogramowanie komercyjne często wiąże się również z ograniczeniami dotyczącymi liczby użytkowników, którzy mogą jednocześnie uzyskiwać dostęp do oprogramowania, co ogranicza przepustowość danych i oszczędność czasu. Chociaż te pakiety oprogramowania mają wiele zalet, nie są one konieczne do zbierania niezbędnych informacji o czasie badania obiektów z OLT i NORT. Możliwość ręcznego pozyskiwania tych danych sprawia, że nowatorskie zadania obiektowe są bardziej dostępne finansowo dla szerszego grona badaczy.

Dodatkową cechą tego protokołu jest to, że pierwsza sesja habituacji jest zasadniczo próbą na otwartym polu, która może dostarczyć danych na temat aktywności i poziomu lęku. Poziomy aktywności można określić ilościowo za pomocą całkowitego przebytego dystansu lub średniej prędkości, jeśli dostępne jest oprogramowanie śledzące. Podobnie, w przypadku oprogramowania śledzącego, miary lęku można uzyskać na podstawie czasu spędzonego w centrum areny lub odległości przebytej w centrum. Dane te można również pozyskać ręcznie, nakładając na obraz wideo z areny siatkę i określając ilościowo skrzyżowania. Te dane z otwartego pola mogą pomóc wykluczyć duże deficyty motoryczne lub nadmierny niepokój, które mogą przeszkadzać w późniejszym badaniu obiektów.

Testy statystyczne stosowane w tym protokole są reprezentatywne dla tradycyjnych metod analizy. Porównując 2 grupy myszy, zaleca się dwupróbowy, dwustronny test t w celu zbadania znaczenia różnicy w procentowym czasie badania przeniesionego lub nowego obiektu między grupami. Jeśli wielkość próby jest nierówna, ma wyjątkowo wysoką zmienność lub wykazuje nierównomierną zmienność między grupami, zamiast tego zaleca się test nieparametryczny, ponieważ w tych warunkach zostanie naruszonych wiele podstawowych założeń testu t. Porównując 3 lub więcej grup myszy, zaleca się ANOVA w celu sprawdzenia, czy grupa ma znaczący wpływ na procentowy czas badania przeniesionego lub nowego obiektu. Testy post-hoc z korekcją błędów, takie jak test Tukeya lub porównania parami z korekcją Bonferroniego, można następnie zastosować do zbadania różnicy w procentowym czasie badania między każdą parą grup. W przypadku OLT dodatkowym sposobem analizowania danych jest testowanie znaczącej zmiany w procentowym czasie badania przeniesionego obiektu z prób szkoleniowych do OLT. Z tylko jedną grupą myszy, test ten przyjąłby formę sparowanego, dwustronnego testu t, testującego znaczące zmiany w procentowym czasie z poruszanym obiektem od treningu do OLT u każdej myszy (pamiętając, że są to analizy sparowane, a nie niezależne pomiary, ponieważ każda mysz daje dwa punkty danych). W przypadku dwóch grup myszy zastosowano dwukierunkową ANOVA z powtarzanymi pomiarami, przy czym powtarzanym pomiarem byłaby próba (trening kontra OLT), a drugim czynnikiem byłoby przypisanie do grupy. Testy post-hoc dotyczące różnic między grupami leczenia powinny porównywać grupy ze sobą w ramach badań.

Alternatywnie, jeśli testowane jest tylko dowód pamięci w OLT lub NOR, można użyć testu t dla jednej próby, w którym procentowo badany jest obiekt w porównaniu z ustaloną wartością 50%. Procent czasu znacznie wyższy niż 50% sugeruje pamięć dla obiektu. Odsetek czasu znacznie poniżej 50% sugeruje niechęć (z jakiegoś powodu), a wybory obiektów powinny zostać ponownie ocenione. Test t dla jednej próby nie może jednak ujawnić, czy dwie lub więcej grup różni się od siebie. Na przykład w eksperymencie z dwiema grupami myszy, jeśli grupa A spędziła 60% czasu z nowym obiektem dla p = 0,049 przez porównanie testu t dla jednej próby z 50%, a grupa B spędziła tylko 59% czasu z nowym obiektem dla p = 0,051, grupa A znacznie różni się od 50% (a grupa B nie). Błędne jest jednak wnioskowanie, że te dwie grupy znacznie się od siebie różnią. Test t dla dwóch prób porównujący A i B może łatwo ujawnić, że te dwie grupy są statystycznie nie do odróżnienia. Jeśli celem końcowym jest porównanie wydajności pamięci dwóch lub więcej grup, grupy te muszą być statystycznie porównane ze sobą, a nie tylko porównane z zewnętrznym standardem. Podobna wytyczna dotyczy porównania czasu spędzonego z ruchomym obiektem między treningiem a OLT. W tym przypadku znalezienie istotnej różnicy w procentowym czasie z poruszanym obiektem między treningiem a OLT w jednej grupie, a nie w innej, NIE pokazuje, że grupy te różnią się statystycznie. Grupy muszą być porównywane post hoc ze sobą w ramach każdego badania, a nie tylko między badaniami w grupie.

Ważne jest, aby pamiętać, że czas badania pojedynczej myszy nie może być wykorzystany jako dowód za lub przeciw pamięci. Pamięć o lokalizacji lub tożsamości obiektu w tych zadaniach może być raczej zakończona tylko na podstawie danych zagregowanych, które są statystycznie porównywane albo z zagregowanymi danymi innej grupy, albo z ustalonymi poziomami szansy (50% dla czasu, 0 dla współczynnika dyskryminacji). Potrzebna wielkość próby będzie w dużym stopniu zależała od wielkości efektu konkretnej manipulacji i zmienności zachowania, które z kolei będą zależeć od użytych myszy. Wiek, płeć i manipulacje wpływają na zmienność. W przykładowych danych przedstawionych na rysunkach 3A i 3B użyto n = 14 osób, co dało wielkość efektu 0,68 i moc 0,65 dla sparowanego testu t przy α = 0,05. Gdyby do tego porównania pożądana była potęga 0,8, wymagana byłaby próba o wielkości 18.

Dyskusja ta skupia się na wartościach p i punktach odcięcia istotności, ponieważ są to miary i analizy najczęściej zgłaszane dla danych OLT i NORT, a zatem prawdopodobnie są znane zarówno eksperymentatorom, jak i recenzentom. To poleganie na wartościach p było ostro krytykowane jako statystycznie niepoprawne26. Jednakże, chociaż istnieją alternatywne metody analizy i są one zatwierdzone w niektórych czasopismach27, żadna z nich nie została szeroko przyjęta przez dziedziny behawioralne i biomedyczne jako standard26.

Podsumowując, protokół ten skutecznie testuje pamięć u myszy przy minimalnych kosztach. Dołączono zalecenia dotyczące odpowiednich modyfikacji protokołu, aby zapewnić pomyślne wdrożenie z każdym modelem małego gryzonia. Zastosowanie tego protokołu do konkretnych modeli urazów lub interwencji terapeutycznych może ujawnić cenne znaczenie funkcjonalne, które uzupełnia badane mechanizmy komórkowe i molekularne.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez R00 NS089938 z NIH oraz fundusze zalążkowe z Chronic Brain Injury and Discovery Themes na Uniwersytecie Stanowym Ohio dla EDK.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Znak Biały - 9% Półprzezroczysty i nieprzezroczysty kolorowy odlew akrylowy (Chemcast)TAP PlasticsNA1/4 "x 15.75" x 15,75 " z frezowanymi krawędziami
Znak Biały - 9% Półprzezroczysty i nieprzezroczysty kolorowy odlew akrylowy (Chemcast)TAP PlasticsNA1/4 "x 15,75" x 16,5 " z frezowanymi krawędziami
Znak biały - 9% Przezroczysty i nieprzezroczysty kolorowy odlew akrylowy (Chemcast)TAP PlasticsNA1/4" x 16,5" x 16,5" z frezowanymi krawędziami
TAP Cement akrylowy (1 pkt.)TAP PlasticsNA
16 G Aplikator hipoTAP PlasticsNA
Debiutanckie oprogramowanie do przechwytywania wideo Pro EditionOprogramowanie NCHNA
Stanely SAE/metryczny grzebień kwadratowyGrainger6R171
Logitech Pro Stream Webcam C922xCDW4429927
Belkin 16' Aktywny przedłużacz USB 2.0CDW
Panduit Pan-Way LD Bieżnia powierzchniowa (8')CDW 300902
Wskazówki przestrzenne/środowiskoweZmiennaNA
Obiekty do testowaniaZmiennaNA
70%etanolu ZmiennaNA
Taśma dwustronnaZmiennaNA
570691

Bibliografia

  1. Krakauer, J. W., Ghazanfar, A. A., Gomez-Marin, A., Maclver, M. A., Poeppel, D. Neuroscience Needs Behavior: Correcting a Reductionist Bias. Neuron. 93 (3), 480-490 (2017).
  2. Lange, F., Seer, C., Kopp, B. Cognitive flexibility in neurological disorders: Cognitive components and event-related potentials. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 83, 496-507 (2017).
  3. Barnett, J. H., Blackwell, A. D., Sahakian, B. J., Robbins, T. W. The Paired Associates Learning (PAL) Test: 30 Years of CANTAB Translational Neuroscience from Laboratory to Bedside in Dementia Research. Current Topics in Behavioral Neuroscience. 28, 449-474 (2016).
  4. Eichenbaum, H., Otto, T., Cohen, N. J. The hippocampus-what does it do? Behavioral and Neural Biology. 57 (1), 2-36 (1992).
  5. Bartsch, T., Wulff, P. The hippocampus in aging and disease: From plasticity to vulnerability. Neuroscience. 19 (309), 1-16 (2015).
  6. Smith, B. M., Yao, X., Chen, K. S., Kirby, E. D. A Larger Social Network Enhances Novel Object Location Memory and Reduces Hippocampal Microgliosis in Aged Mice. Frontiers in Aging Neuroscience. 10 (142), 1-16 (2018).
  7. Chieffi, S., et al. Exercise Influence on Hippocampal Function: Possible Involvement of Orexin-A. Frontiers in Physiology. 14 (8), 85(2017).
  8. Garth, A., Roeder, I., Kempermann, G. Mice in an enriched environment learn more flexibly because of adult hippocampal neurogenesis. Hippocampus. 26 (2), 261-271 (2016).
  9. Brown, R. E., Stanford, L., Schellinck, H. M. Developing standardized behavioral tests for knockout and mutant mice. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (3), 163-174 (2000).
  10. Barker, G. R., Warburton, E. C. When is the hippocampus involved in recognition memory? Journal of Neuroscience. 31 (29), 10721-10731 (2011).
  11. Savage, S., Ma, D. Animal behavior testing: memory. British Journal of Anaesthesia. 113 (1), 6-9 (2015).
  12. Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures? Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
  13. Vogel-Ciernia, A., Wood, M. A. Examining object location and object recognition memory in mice. Current Protocols in Neuroscience. 69, 1-17 (2014).
  14. Ammassari-Teule, M., Passino, E. The dorsal hippocampus is selectively involved in the processing of spatial information even in mice with a genetic hippocampal dysfunction. Psychobiology. 25 (2), 118-125 (1997).
  15. Le Merrer, J., Rezai, X., Scherrer, G., Becker, J. A., Kieffer, B. L. Impaired hippocampus-dependent and facilitated striatum-dependent behaviors in mice lacking the delta opioid receptor. Neuropsychopharmacology. 38 (6), 1050-1059 (2013).
  16. Hattiangady, B., et al. Object location and object recognition memory impairments, motivation deficits and depression in a model of Gulf War illness. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 78(2014).
  17. Oliveira, A. M., Hawk, J. D., Abel, T., Havekes, R. Post-training reversible inactivation of the hippocampus enhances novel object recognition memory. Learning and Memory. 17 (3), 155-160 (2010).
  18. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Jr Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. Behavioral Brain Research. 285, 105-117 (2014).
  19. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
  20. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  21. Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behavioral Brain Research. 31 (1), 47-49 (1988).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  23. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. Public Library of Science ONE. 11 (1), e0147733(2016).
  24. Ennaceur, A. One-trial object recognition in rats and mice: methodological and theoretical issues. Behavioural Brain Research. 215, 244-254 (2010).
  25. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718(2017).
  26. Wasserstein, R. L., Lazar, N. A. The ASA's Statement on p-Values: Context, Process, and Purpose. The American Statistician. 70 (2), 129-133 (2016).
  27. Ranstam, J. Why the P-value culture is bad and confidence intervals a better alternative. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (8), 805-808 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zadanie rozpoznawania obiekt wtesty behawioralne myszykonstrukcja arenyrejestracja wideobadanie obiekt wtesty pami cimetoda niskobud etowasesja habituacjianaliza danych
Nowatorskie rozpoznawanie obiektów i testy behawioralne lokalizacji obiektów u myszy przy ograniczonym budżecie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.