Nowatorskie rozpoznawanie obiektów i testy behawioralne lokalizacji obiektów u myszy przy ograniczonym budżecie

Summary

Tutaj udostępniamy protokół, który zawiera obszerne instrukcje dotyczące ekonomicznego ustanawiania lokalizacji obiektów mysich i nowatorskich testów behawioralnych rozpoznawania obiektów, w tym projektowania, kosztu i budowy wymaganego sprzętu, a także wykonywania testów behawioralnych, zbierania danych i analizy.

Abstract

Etologicznie istotne testy behawioralne są kluczowym elementem każdego badania, które wykorzystuje modele mysie do badania poznawczych skutków różnych zmian fizjologicznych lub patologicznych. Zadanie lokalizacji obiektu (OLT) i zadanie rozpoznawania nowych obiektów (NORT) to dwa skuteczne zadania behawioralne powszechnie używane do ujawnienia funkcji i względnego zdrowia określonych regionów mózgu zaangażowanych w pamięć. Podczas gdy oba te testy wykorzystują wrodzoną preferencję myszy do nowości, aby ujawnić pamięć dla wcześniej napotkanych obiektów, OLT przede wszystkim ocenia uczenie się przestrzenne, które w dużej mierze opiera się na aktywności hipokampa. Z kolei NORT ocenia nieprzestrzenne uczenie się tożsamości obiektu, które opiera się na wielu regionach mózgu. Oba zadania wymagają areny testowej na otwartym polu, obiektów o wartości wewnętrznej równoważnej myszom, odpowiednich wskazówek środowiskowych oraz sprzętu do nagrywania wideo i oprogramowania. Dostępne na rynku systemy, choć wygodne, mogą być kosztowne. Ten manuskrypt szczegółowo opisuje prostą, opłacalną metodę budowy aren i ustawiania sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia OLT i NORT. Ponadto manuskrypt opisuje skuteczny protokół testowy, który obejmuje zarówno OLT, jak i NORT i zapewnia typowe metody pozyskiwania i analizy danych, a także reprezentatywne wyniki. Pomyślne zakończenie tych testów może dostarczyć cennych informacji na temat funkcji pamięci różnych systemów modeli myszy i ocenić podstawowe regiony neuronalne, które wspierają te funkcje.

Introduction

Skuteczne testy kognitywne izolują i oceniają funkcje neuronalne określonych obszarów mózgu, badając zachowanie w kontrolowanym środowisku¹. U ludzi zaprojektowano specjalne zadania mające na celu ocenę wydajności docelowych regionów mózgu, takie jak zadanie sortowania kart w Wisconsin pod kątem funkcji przedczołowej lub test uczenia się sparowanych współpracowników w Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB) dla funkcji hipokampa^2,3. Testy te mają na celu badanie funkcji określonych regionów mózgu u ludzi poprzez ocenę zachowań, które wynikają z aktywności neuronalnej tych regionów. Ostatecznym celem większości badań biomedycznych jest poprawa zdrowia ludzkiego; Jednak wiele badań nad funkcjonowaniem mózgu w zdrowiu lub chorobie nie może być etycznie przeprowadzonych z udziałem ludzi. W przypadku badań, w których nie można uczestniczyć w ludziach, często wybieranym modelem są małe gryzonie, takie jak myszy. Wykorzystanie modeli mysich pozwala na bezpośrednią kontrolę nad eksperymentalnymi manipulacjami, w tym zmianą ekspresji genów, indukcją urazu, a nawet modulacją aktywności obwodu za pomocą technik optogenetycznych. Testy behawioralne myszy, podobne do testów na ludziach, mają na celu ocenę wpływu zmiennych eksperymentalnych na funkcjonowanie mózgu poprzez pomiar zachowań, które opierają się na określonych regionach.

Hipokamp jest niezbędną strukturą do tworzenia pamięci u ludzi i gryzoni⁴. Mówiąc dokładniej, hipokamp odgrywa kluczową rolę w pamięci deklaratywnej obejmującej reprezentacje relacyjne, ale nie pamięć proceduralną, która opiera się na ośrodkach motorycznych mózgu⁴. Funkcja pamięci hipokampa jest przedmiotem badań w wielu dziedzinach neurobiologii, ponieważ jest wyjątkowo wrażliwa na zakłócenia. Negatywne zaburzenia, począwszy od długotrwałego stresu i starzenia się, a skończywszy na drgawkach i udarze, są związane z uszkodzeniem hipokampa⁵. Natomiast pozytywne interwencje, takie jak interakcje społeczne, fizyczne wzbogacanie środowiska lub ćwiczenia, poprawiają funkcję hipokampa^6,7,8. Badania na gryzoniach z odpowiednim testowaniem pamięci hipokampa mogą ujawnić wgląd w komórkowe i molekularne mediatory pamięci, a także wpływ różnych interwencji środowiskowych na funkcję hipokampa.

U gryzoni opracowano kilka testów do badania uczenia się i pamięci zależnej od hipokampa^9,10,11. Można je ogólnie podzielić na zadania, które wymagają bodźca o wartości emocjonalnej, aby wywołać zmianę w zachowaniu, oraz zadania, które czerpią z preferencji gryzoni do badania nowych bodźców¹¹. Na przykład kontekstowe warunkowanie strachu łączy nieprzyjemny bodziec (wstrząs stopą) z kontekstem środowiskowym, a następnie testuje pamięć pod kątem tego kontekstu, mierząc zachowanie związane z zamrożeniem wywołane strachem^9,11. Labirynt wodny Morris i jego suchy odpowiednik, labirynt Barnesa, wykorzystują ujemne wzmocnienie zewnętrzne, aby promować uczenie się przestrzenne^4,11. W każdym przypadku gryzonie szukają ucieczki z awersyjnej sytuacji, zanurzając się odpowiednio w zimnej wodzie lub wystawiając na działanie na jasno oświetlonej platformie. Z kolei labirynt z ramieniem promieniowym opiera się na pozytywnym wzmocnieniu, ponieważ zwierzęta wykorzystują naturalne zachowania związane z żerowaniem w połączeniu z pamięcią przestrzenną, aby odzyskać małe nagrody w postaci jedzenia^4,11. Zadania te są szeroko stosowane i przyniosły podstawową wiedzę na temat pamięci hipokampa. Jednak negatywne i pozytywne wzmocnienia zewnętrzne lub bodźce wywołujące strach, takie jak szok, dodają komponent emocjonalny do tych testów behawioralnych, co w niektórych przypadkach może być niepożądane. Na przykład hipokamp grzbietowy i brzuszny są związane z różnymi funkcjami, odpowiednio pamięcią przestrzenną i regulacją emocjonalną¹². Testy, które opierają się na emocjonalnej reakcji na bodźce, mogą nie odzwierciedlać dokładnie upośledzonej pamięci przestrzennej, jeśli wpływa to również na funkcje regulacji emocjonalnej brzusznego hipokampa.

OLT to prosty i skuteczny test, który dostarcza miary pamięci przestrzennej zależnej od hipokampa¹³. Zadanie opiera się na wewnętrznej preferencji zwierzęcia do nowości bez dodatkowego zewnętrznego wzmocnienia i dlatego zazwyczaj pozwala uniknąć komplikacji związanych z różnymi reakcjami emocjonalnymi¹³. Obecny protokół OLT jest przedstawiony dla myszy, ale jest również skuteczny u szczurów, jeśli wymiary sprzętu są odpowiednio skalowane. Protokół polega na aklimatyzacji myszy do areny testowej na otwartym polu, a następnie umożliwieniu jej zbadania 2 obiektów w odniesieniu do przestrzennych wskazówek środowiskowych. Mysz jest następnie usuwana z areny, a podczas opóźnienia (interwału między próbami lub ITI) jeden z obiektów jest przesuwany. Po ITI mysz zostaje ponownie wprowadzona na arenę i może swobodnie eksplorować. Ogólnie rzecz biorąc, myszy preferują nowości, a jeśli pamiętają lokalizację obiektów z ich początkowej ekspozycji, spędzą więcej czasu na badaniu poruszanego obiektu. Zwierzęta z uszkodzeniami w hipokampie mają upośledzone przestrzenne uczenie się kontekstowe i w związku z tym nie wykazują preferencji dla obiektów w nowej lokalizacji^14,15.

OLT może być używany niezależnie lub w połączeniu z dodatkowym testem pamięci, który wykorzystuje aktywność neuronalną z wielu obszarów mózgu, nowym zadaniem rozpoznawania obiektów (NORT). NORT jest identyczny z OLT do fazy testowej, kiedy jeden z obiektów jest zastępowany nowym obiektem, zamiast być przenoszony w nowe miejsce. Podobnie jak w przypadku OLT, myszy z dobrą pamięcią do obiektów spontanicznie wolą badać nowy obiekt. W przeciwieństwie do pamięci lokalizacji obiektów, która w dużej mierze opiera się na substratach hipokampa, pamięć rozpoznawania obiektów wydaje się polegać na różnych regionach mózgu, a zaangażowanie hipokampa jest niepewne. Wiele badań donosi, że uszkodzenia lub inaktywacja hipokampa nie wpływają na preferencję nowego obiektu^10,13,16,17, podczas gdy inni uważają, że jest odwrotnie^18,19. Jednak nadal jest to powszechnie stosowane zadanie do oceny funkcji pamięci ogólnej u gryzoni.

Protokół przedstawiony tutaj określa kroki związane z inicjacją i realizacją OLT i NORT, które korzystają z areny testowania na otwartym polu. Dostępny na rynku sprzęt do testów behawioralnych może być zbyt kosztowny, szczególnie dla mniejszych laboratoriów. Protokół ten obejmuje projekt i proste kroki do budowy aren we własnym zakresie przy minimalnych kosztach i bez specjalistycznych narzędzi. Co więcej, protokół ten szczegółowo opisuje idealny obszar testów behawioralnych, w tym rozmieszczenie aren, wskazówki kontekstowe i system nagrywania wideo, który przygotowuje grunt pod wdrożenie protokołów OLT i NORT. Przedstawiono reprezentatywne wyniki zarówno dla udanych, jak i wadliwych badań, podkreślając znaczenie optymalizacji wszystkich materiałów i procedur dla każdego badania.

opis	opcja	ilość
Część A: Arkusz akrylowy - nieprzezroczysty biały (0,635 cm x 40 cm x 40,64 cm)	Trasowane krawędzie	cyfra arabska
Część B: Arkusz akrylowy - nieprzezroczysty biały (0,635 cm x 40 cm x 41,91 cm)	Trasowane krawędzie	cyfra arabska
Część C: Arkusz akrylowy - nieprzezroczysty biały (0,635 cm x 41,91 cm x 41,91 cm)	Trasowane krawędzie	1
Cement akrylowy (1 pkt.)	nie	1
16-stopniowy aplikator hipo	nie	1
Kwadrat kombinowany	nie	1
Kamera internetowa HD	nie	1
Oprogramowanie do przechwytywania wideo	nie	1
Przedłużacz USB 2.0	nie	1
Kanał kablowy	nie	1

Tabela 1: Szczegółowa lista materiałów i sprzętu wymaganych do testów behawioralnych.

Protocol

Następujący protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Ohio (OSU).

1. Budowa aren

1. Zamów materiały przedstawione w Tabeli 1: pięć arkuszy akrylu, cementu akrylowego i aplikator hipo o gramaturze 16 G.
2. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny zgodnie z instrukcjami producenta, który może obejmować ochronę oczu, skóry i inne rodzaje ochrony.
3. Usuń papierową powłokę ochronną z arkuszy akrylowych.
4. Dopasuj na sucho wszystkie materiały, aby potwierdzić, że rozmiary są prawidłowe (Rysunek 1A).
5. Zmontować i załadować strzykawkę cementem akrylowym.
6. Wyrównaj dłuższą krawędź ściany zewnętrznej (część B) z górną krawędzią podstawy (część C) i upewnij się, że są one prostopadłe do siebie za pomocą kwadratu kombinowanego lub kwadratu operatora.
7. Za pomocą strzykawki nałóż małą i stabilną kulkę cementu bezpośrednio na róg dwóch łączonych elementów.
8. Przytrzymaj dwie części (części B i C) na miejscu, aż zostaną wstępnie ustawione (około 5 min).
   UWAGA: Zazwyczaj są one utwardzone w 80% w ciągu 24 godzin, ale montaż można kontynuować po 5 minutach.
9. Powtórz kroki 1.5–1.7 z drugą ścianą zewnętrzną (część B) do tej samej podstawy.
10. Przymocuj dwie ściany wewnętrzne (część A), pojedynczo, do podstawy, wykonując czynności 1.5–1.7.
11. Dodatkowo za pomocą strzykawki nałóż małą i stabilną warstwę cementu bezpośrednio na narożnik tworzony teraz przez ścianę zewnętrzną (część B) i ścianę wewnętrzną (część A).
12. Przytrzymaj te elementy na miejscu przez 5 minut.
13. Po 24–48 godzinach przystąp do konfiguracji środowiska testów behawioralnych.

2. Konfiguracja środowiska i sprzętu do testowania behawioralnego

1. Umieść wskazówki środowiskowe (zgodnie z opisem w sekcji dyskusji) naprzeciwko siebie i zwrócone w stronę aren w obszarze testowym (Rysunek 1B).
2. Ustaw cztery areny testowe w sposób 2 na 2 na podłodze lub solidnym stole w odpowiednich odległościach od wskazówek i kamery, aby zmaksymalizować wizualny wkład dla myszy (Rysunek 1B).
3. Sprawdź linię wzroku za pomocą drążka metra podpartego z każdej podłogi areny nad ścianą w kierunku wskazówek, aby potwierdzić, że te odległości między arenami a wskazówkami są odpowiednie.
4. Określ optymalną długość ścieżki optycznej, która umożliwia dokumentację wideo wszystkich czterech aren, dostosowując wysokość kamery lub wysokość stołu. (Rysunek 1B).
5. Podłącz aparat do przedłużacza USB.
6. Korzystając z bieżni kablowych, poprowadź przez sufit i w dół ściany do komputera z oprogramowaniem do przechwytywania wideo.
7. Ukryj komputer za zasłoną, która oddzieli myszy w obszarze testowania od badacza (Rysunek 1C).
8. Zbierz po 4 z co najmniej 3 różnych obiektów o długości i szerokości około 2–5 cm oraz wysokości do 10 cm, aby użyć ich do testowania (Rysunek 1D).

Rysunek 1: Przygotowanie do testów behawioralnych. (A) Zespół areny do badań w otwartym polu, w którym część A odpowiada ścianie wewnętrznej, część B jest ścianą zewnętrzną, a część C jest podstawą. Gotowa arena będzie miała dwie ściany zewnętrzne (części B), które biegną przez całą krawędź podstawy i dwie ściany wewnętrzne (części A), które mieszczą się między ścianami zewnętrznymi na sąsiednich krawędziach podstawy (część C). Wszystkie ściany będą spoczywać na podstawie. (B) Reprezentatywne rozmieszczenie aren na stole o wysokości 0,62 m, wskazówki środowiskowe o wymiarach 60 x 90 cm, światła i kamera dla obszaru testowego, która umożliwia uchwycenie wszystkich czterech aren jednocześnie. (C) Kurtyna zasłania eksperymentatora i system komputerowy przed myszami podczas prób. Na potrzeby wykonania tego zdjęcia włączone są górne światła, ale podczas testów włączone są tylko lampy podłogowe. Na tym zdjęciu obszaru testowego usunięto również jedną ze wskazówek środowiskowych, ale podczas testów przed arenami znajduje się czwarta wskazówka, zwrócona w stronę całkowicie czarnej kina za stołem. (D) Reprezentatywny obiekt (i linijka do skali), który jest odpowiedni do testowania OLT lub NORT na myszach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

9. Zweryfikuj te obiekty.
   1. Uzyskaj co najmniej 8 myszy typu dzikiego w płci i grupie wiekowej reprezentatywnej dla myszy eksperymentalnych, które zostaną użyte (np. 6 do 9 tygodniowych samic i samców myszy C57Bl/6).
   2. Ze wszystkimi myszami należy obchodzić się codziennie przez 1 minutę w ciągu 3–5 dni przed badaniem.
   3. Podziel myszy na grupy po 4 sztuki i, jeśli nie są jeszcze trzymane pojedynczo, przenieś je do indywidualnych, czystych klatek.
   4. Przynieś je do pomieszczenia testowego i pozwól im się zaaklimatyzować przez co najmniej 30 minut.
      UWAGA: Obecność eksperymentatora w pomieszczeniu przez te 30 minut zmniejszy stres u myszy podczas zadania, szczególnie jeśli eksperymentator jest mężczyzną²⁰.
   5. Po zakończeniu aklimatyzacji i gotowości eksperymentatora do rozpoczęcia rozpocznij nagrywanie wideo.
   6. Umieść każdą mysz przodem do ścian jednego rogu areny (zwanego rogiem zwalniającym) (Rysunek 2A).
   7. Pozwól myszom swobodnie eksplorować areny przez 10 minut.
   8. Zatrzymaj nagrywanie wideo.
   9. Umieść myszy z powrotem w czystych klatkach na czas 20 minut.
   10. Wyczyść wszystkie areny za pomocą metod czyszczenia zalecanych przez zwierzęta, takich jak przecieranie 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały węchowe przed następnym użyciem.
   11. Za pomocą taśmy dwustronnej przymocuj 2 różne przedmioty w pobliżu 2 niezwalniających się narożników, tak aby obiekty były równoważone na arenie, oraz 6 x 6 cm² od każdej ściany tego rogu (Rysunek 2B).
   12. Rozpocznij nagrywanie wideo.
   13. Umieść każdą mysz przodem do ścian w rogu zwalniającym.
   14. Pozwól myszom swobodnie badać arenę i obiekty przez 10 minut.
   15. Zatrzymaj nagrywanie wideo.
   16. Umieść myszy z powrotem w ich czystych klatkach na czas 20 minut.
   17. Oczyść wszystkie areny i obiekty za pomocą metod czyszczenia zalecanych przez zwierzęta, takich jak przecieranie 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały węchowe.
   18. Powtarzaj próby treningowe z 2 nowymi obiektami umieszczonymi w tych samych miejscach, aż wszystkie obiekty (co najmniej trzy różne obiekty, jeśli przeprowadzasz zarówno OLT, jak i NORT) zostaną przetestowane za pomocą każdej myszy.
   19. Wyklucz obiekty, które pozwalają myszom siedzieć na obiekcie.
   20. Przeanalizuj czas badania każdej myszy z każdym obiektem zgodnie z krokiem 4.
   21. Wyklucz obiekty, które mają ujemną lub dodatnią wartość wewnętrzną.

3. Przeprowadzanie testu behawioralnego

1. Tydzień przed testem: zapoznanie się z osobami przeprowadzającymi testy behawioralne
   1. Z dorosłymi samicami i samcami myszy C57Bl/6 w wieku od 6 do 9 tygodni należy obchodzić się codziennie przez 1 minutę w ciągu 3–5 dni przed badaniem.
2. Dzień 1: sesje habituacyjne
   1. Podziel myszy na grupy po 4 sztuki i, jeśli nie są jeszcze trzymane pojedynczo, przenieś je do indywidualnych, czystych klatek.
   2. Przynieś je do pokoju testowego i pozwól im zaaklimatyzować się w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut.
      UWAGA: Obecność eksperymentatora w pomieszczeniu przez te 30 minut zmniejszy stres u myszy podczas zadania, szczególnie jeśli eksperymentator jest mężczyzną²⁰.
3. Po zakończeniu aklimatyzacji i gotowości eksperymentatora do rozpoczęcia rozpocznij nagrywanie wideo.
4. Umieść każdą mysz na arenie (po jednej myszy na arenę) przodem do ścian rogu zwalniającego (Rysunek 2A).
5. Pozwól myszom swobodnie eksplorować areny przez 6 minut.
6. Zatrzymaj nagrywanie wideo.
7. Umieść myszy z powrotem w ich czystych klatkach podczas przerwy między próbami (ITI).
8. Wyczyść wszystkie areny za pomocą metod czyszczenia zalecanych przez zwierzęta, takich jak wycieranie 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały węchowe.
9. Powtórz kroki 3.3–3.9 jeszcze dwa razy, co daje w sumie 3 sesje habituacyjne dla każdej myszy.
10. Wróć wszystkie myszy do ich klatek domowych.
11. Wyczyść wszystkie areny za pomocą metod czyszczenia zalecanych przez zwierzęta, takich jak przecieranie 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały węchowe przed użyciem następnego dnia.
12. Dzień 2: próba treningowa, OLT, NORT
    UWAGA: NORT jest testem opcjonalnym.
    1. Po 24 godzinach przyprowadź tę samą grupę myszy do pokoju testowego i pozwól im zaaklimatyzować się w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut, tak jak to miało miejsce przed sesjami habituacyjnymi poprzedniego dnia.
    2. Przeprowadź próbę treningową z użyciem 2 obiektów umieszczonych na arenie (Rysunek 2B).
       1. Za pomocą taśmy dwustronnej przymocuj przedmioty w odległości 6 x 6 cm² od 2 niezwalniających rogów, tak aby były przeciwwagi na arenie.
       2. Rozpocznij nagrywanie wideo.
       3. Umieść każdą mysz przodem do ścian rogu zwalniającego, tak jak to miało miejsce podczas sesji przyzwyczajania.
       4. Pozwól myszom swobodnie badać arenę i obiekty przez 10 minut.
       5. Zatrzymaj nagrywanie wideo.
       6. Umieść myszy z powrotem w ich czystych klatkach na 20 minut.
       7. Oczyść wszystkie areny i obiekty za pomocą metod czyszczenia zalecanych przez zwierzęta, takich jak przecieranie 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały węchowe.
    3. Wykonaj OLT.
       1. Przenieś jeden z obiektów użytych w próbie szkoleniowej do nowego narożnika bez zwalniania i przymocuj obiekt w odległości 6 cm od każdej ściany tego narożnika za pomocą taśmy dwustronnej (Rysunek 2C).
          UWAGA: Drugi obiekt powinien pozostać w miejscu, w którym znajdował się podczas próby treningowej.
       2. Rozpocznij nagrywanie wideo.
       3. Umieść każdą mysz przodem do ścian w rogu zwalniającym.
       4. Pozwól myszom badać obiekty przez 10 minut.
       5. Zatrzymaj nagrywanie wideo.
       6. Umieść myszy z powrotem w ich czystych klatkach na 20 minut.
       7. Oczyść wszystkie areny i obiekty za pomocą metod czyszczenia zalecanych przez zwierzęta, takich jak przecieranie 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały węchowe.
    4. Wykonaj NORT.
       1. Zastąp obiekt, który nie został przesunięty podczas OLT, nowym obiektem i przymocuj nowy obiekt 6 cm od dwóch ścian narożnika za pomocą taśmy dwustronnej (Rysunek 2D).
       2. Rozpocznij nagrywanie wideo.
       3. Umieść każdą mysz przodem do ścian w rogu zwalniającym.
       4. Pozwól myszom badać obiekty przez 10 minut.
       5. Zatrzymaj nagrywanie wideo.
       6. Umieść myszy z powrotem w ich domowych klatkach.
       7. Wyczyść wszystkie areny i obiekty za pomocą zalecanych metod czyszczenia dla zwierząt, takich jak przecieranie 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały węchowe przed następnym użyciem.

Rysunek 2: Konfiguracja areny na potrzeby prób. (A) Pole testowe na otwartym polu bez obiektów do sesji habituacyjnej. strzałka wskazuje narożnik zwalniający. Ten róg powinien znajdować się w tym samym względnym położeniu na każdej arenie i być spójny dla każdej testowanej myszy i dla każdej próby. (B) Na potrzeby próby treningowej dwa różne obiekty są mocowane do otwartego pola w odległości 6 x 6 cm od ich odpowiednich ścian. (C) W przypadku OLT jeden obiekt jest przenoszony w nowe miejsce, również w odległości 6 x 6 cm od ścian, a nie od narożnika zwalniającego. (D) W przypadku NORT obiekt, który był nieruchomy w OLT, jest zastępowany nowym obiektem, podczas gdy obiekt przeniesiony z OLT jest teraz obiektem znajomym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Analiza danych z testów behawioralnych

UWAGA: Analiza wideo powinna być najlepiej wykonana przez co najmniej dwóch niezależnych, zaślepionych eksperymentatorów.

1. Otwórz plik wideo.
2. Zastosuj przezroczyste kółko, które zapewnia obramowanie o szerokości 2 cm wokół każdego obiektu na ekranie, aby pomóc w określeniu aktywnego badania. Użyj obrazu pliku wideo z linijką umieszczoną na arenie, aby skalibrować tę siatkę.
3. Obserwuj zachowanie myszy i rejestruj czasy, w których mysz aktywnie bada obiekt, który składa się z nosa skierowanego na obiekt w maksymalnej odległości 2 cm od tego obiektu.
   1. Zapisz sygnaturę czasową, w której mysz zaczyna badać obiekt, oraz sygnaturę czasową, gdy przestaje badać ten obiekt.
   2. Powtórz to dla obu obiektów na arenie przez cały czas trwania próby.
   3. Oblicz łączny czas, w którym mysz badała każdy obiekt, odejmując czas rozpoczęcia od czasu zakończenia dla każdego wystąpienia badania obiektu i dodając wszystkie te wartości.
4. Oblicz procent całkowitego czasu dochodzenia lub wskaźnik dyskryminacji za pomocą następujących wzorów:
   1. Obliczać procent całkowitego czasu dochodzenia =
      
      UWAGA: Wartość powyżej 50% wskazuje na dokładniejsze zbadanie nowej lokalizacji lub obiektu.
   2. Obliczać wskaźnik dyskryminacji =
      
      UWAGA: Wartość dodatnia oznacza więcej czasu na zbadanie nowego obiektu. Wskaźnik dyskryminacji równy zero wskazuje równy czas spędzony z obydwoma obiektami.
5. Graficzne przedstawienie wyników i przeprowadzenie analiz statystycznych przy użyciu testu t lub ANOVA w zależności od liczby porównywanych grup.

Results

Rysunek 3 przedstawia przykłady typowych pozytywnych i negatywnych wyników uzyskanych na samcach i samicach dorosłych myszy C57Bl/6 przy użyciu tego protokołu⁶. Interpretacja danych OLT i NORT zawsze ma zastosowanie do zagregowanych danych grupy (patrz dyskusja poniżej). Czas badania dla pojedynczej myszy nie może być interpretowany jako pamięć lub brak pamięci. Jednak wydajność grupy myszy (tj. wielu próbek) można porównać z innymi grupami lub z ustalonymi poziomami szansy za pomocą testów statystycznych. Podczas typowej próby treningowej grupy myszy nie wykazują średnio znaczącej preferencji dla żadnego z obiektów, ponieważ oba są równie nowe i nie mają żadnej wewnętrznie negatywnej lub pozytywnej wartości dla myszy (Rysunek 3A i 3B). Jeśli zagregowane dane grupy myszy wykazują znaczącą preferencję dla jednego obiektu nad drugim podczas treningu, obiekty te nie powinny być używane, ponieważ ta wrodzona preferencja/niechęć zafałszuje wyniki w kolejnych próbach. Dodatkowo, całkowity czas badania wszystkich myszy musi spełniać minimalny standard (tradycyjnie ustalony na 20 sekund²¹) i powinien być porównywany, aby upewnić się, że nie ma różnicy w linii bazowej w badaniu, która może mieć wpływ na kolejne testy pamięci.

Podczas OLT, pamięć lokalizacji obiektu jest odzwierciedlana przez myszy spędzające średnio znacznie ponad 50% całkowitego czasu badania z przenoszonym obiektem (Rysunek 3A). Jeśli całkowity czas badania poszczególnych myszy znacznie się różni, wyniki są lepiej przedstawione jako wskaźnik dyskryminacji dla obiektów (Rysunek 3B). Znaczący wzrost średniego wskaźnika dyskryminacji w Rysunek 3B wskazuje, że myszy spędzały więcej czasu z obiektem po jego ruchu. Niezależnie od tego, czy mierzy się to wzrostem procentowym czasu, czy wskaźnikiem dyskryminacji, wzrost badania obiektu po jego przeniesieniu sugeruje, że myszy pamiętają, gdzie znajdował się obiekt podczas treningu.

Ostatnia próba tego protokołu ocenia pamięć rozpoznawania obiektów. Reprezentatywny przykład z jedną grupą myszy pokazuje wyższy średni procent czasu badania (Rysunek 3C), a także wskaźnik pozytywnej dyskryminacji (Rysunek 3D) w porównaniu ze stałymi wartościami kontrolnymi wynoszącymi odpowiednio 50% i 0. Podobnie jak w przypadku danych OLT, jeśli istnieje znaczna zmienność w całkowitym czasie badania między poszczególnymi myszami, wskaźnik dyskryminacji jest prawdopodobnie lepszą metodą wizualizacji tych danych. Rysunek 3E pokazuje przykład porównania 2 grup w NORT i niektóre z komplikacji statystycznych, które mogą wystąpić w tych testach (zobacz dyskusję). Podczas gdy test t dla jednej próby dla grupy B wykazuje badanie znacznie powyżej 50%, ten sam test dla grupy A tego nie robi. To stwierdzenie nie oznacza, że A i B różnią się od siebie. Aby określić różnice w grupach, należy przeprowadzić oddzielny nieparametryczny test Manna-Whitneya dla dwóch prób porównujący grupy B i A. Nieparametryczny test Manna-Whitneya dla dwóch prób tych reprezentatywnych danych grupowych nie wykazuje istotnej różnicy (p = 0,66) między obiema grupami pod względem procentu czasu badania nowego obiektu.

Zarówno OLT, jak i NORT są bardzo wrażliwe na wewnętrzną wartość obiektów, a dokładne testowanie równoważności obiektów jest konieczne, aby upewnić się, że nie ma wewnętrznych uprzedzeń, które mogłyby zafałszować wyniki. Rysunek 3F i 3G pokazuje przykład niewłaściwego wyboru obiektu. W teście pilotażowym z próbą o wielkości 4 myszy wykazywały tendencję do spędzania mniej niż 50% czasu badania z obiektem A w parze z obiektem B (Rysunek 3F). Kiedy obiekty te zostały następnie użyte w NORT z obiektem A jako nowym obiektem i większą próbą o wielkości 16, myszy spędziły znacznie mniej niż 50% czasu badania z obiektem A (Rysunek 3G). Ta niechęć do nowego obiektu jest tutaj łatwo rozpoznawalna jako wada techniczna eksperymentu i ilustruje, dlaczego pilotażowe testowanie obiektów pod kątem wrodzonych preferencji/awersji jest niezbędne.

Rysunek 3: Dane z testów behawioralnych na dorosłych myszach C57Bl/6 typu dzikiego. (A) Porównanie procentowego całkowitego czasu badania przemieszczonego obiektu podczas próby szkoleniowej z OLT pokazuje znaczny wzrost badania po przemieszczeniu obiektu. p < 0,0001, sparowany test t. (B) Reprezentatywne wyniki badania przemieszczanego obiektu podczas treningu i prób OLT przedstawione jako wskaźnik dyskryminacji podobnie pokazują znaczny wzrost badań obiektu po jego przeniesieniu. p < 0,0001, sparowany test t. (C) Procentowy całkowity czas badania nowego obiektu w NORT wskazuje na znaczną preferencję dla badania nowego obiektu. **p = 0,0024, test t dla jednej próby w porównaniu z testem t 50%. (D) Reprezentatywne wyniki badań nad nowym obiektem w NORT przedstawione jako wskaźnik dyskryminacji podobnie wskazują na preferencję dla badania nowego obiektu. **p = 0,0024, test t dla jednej próby w porównaniu z 0. (E) Reprezentatywne wyniki analizy NORT z udziałem dwóch różnych grup myszy. Grupa B różni się znacznie od 50% testem t dla jednej próby (**p = 0,0024), ale grupa A nie (p = 0,5837). W oddzielnej analizie, do porównania grup, stosuje się test Manna-Whitneya dla dwóch prób ze względu na nierówną wielkość grup i nie stwierdzono istotnej różnicy w badaniu (p = 0,66, ns). (F) Procentowy czas spędzony z obiektem podczas prób walidacyjnych w małej próbie pokazuje tendencję do niechęci do obiektu. p = 0,2159, test t dla jednej próby. (G) Przy większej liczebności próby i obiekcie z (F) używanym jako nowy obiekt w NORT, stwierdza się znaczną awersję do obiektu, mimo że jest to nowy obiekt. *p = 0,0270, test t dla jednej próby. Jest to przykład błędu technicznego w doborze obiektów. Dane są prezentowane jako średnia ± SEM. Dane z paneli C-E są zaadaptowane z poprzedniej publikacji⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Protokół ten zapewnia opłacalną metodę przeprowadzania testów behawioralnych lokalizacji obiektów i rozpoznawania nowatorskich obiektów u myszy. Testy te umożliwiają ocenę funkcji hipokampa, a także funkcji innych obszarów kory mózgowej, takich jak kora przedczołowa, zaangażowanych w rozpoznawanie obiektów¹⁰. OLT i NORT mają tę zaletę, że unikają bodźców o silnej wartościowości emocjonalnej, które są wymagane w labiryncie wodnym Morrisa, kontekstowym warunkowaniu strachu, labiryncie Barnesa lub labiryncie ramion promieniowych. Unikają również konieczności pozbawiania się pożywienia, co jest wymagane w labiryncie ramienia promieniowego. Ponadto protokół ten opisuje prostą dwudniową procedurę testową, która nie wymaga rozbudowanego ani skomplikowanego sprzętu do wykonania lub analizy. Jedną z wad tych zadań jest to, że nie pozwalają one na pomiary uczenia się lub przyswajania. Różnica w badaniu nowości może wynikać z gorszego uczenia się o obiektach podczas treningu, gorszej pamięci tego, czego się nauczyliśmy, lub obu. Całkowity czas spędzony na badaniu obiektów jest ważną miarą pozwalającą wykluczyć wszelkie wrodzone różnice w popędzie do eksploracji, ale nie jest miarą uczenia się. Jeśli miary uczenia się są ważne dla pytania eksperymentalnego, labirynt wodny, labirynt Barnesa lub labirynt z ramieniem promieniowym byłby prawdopodobnie preferowany.

Budowanie niestandardowych aren behawioralnych ma potencjał, aby zaoszczędzić setki dolarów i sprawić, że testowanie obiektów znajdzie się w zasięgu finansowym szerokiej gamy laboratoriów. Protokół ten eliminuje wiele przeszkód i usprawnia proces produkcji, aby budowa aren we własnym zakresie była bardziej dostępna dla naukowców bez specjalistycznego szkolenia w zakresie akryli. Ważne jest, aby pamiętać, że zakup kolorowych arkuszy akrylowych, które będą kontrastować z myszami, takich jak biały akryl dla czarnych myszy i akryl dla białych myszy, ułatwi pozyskiwanie i analizę danych, zwłaszcza w przypadku korzystania z dostępnego na rynku oprogramowania analitycznego. Zamawianie arkuszy ciętych na wymiar z "frezowanymi krawędziami" eliminuje konieczność stosowania piły stołowej (tabela 1), a zastosowanie cementu akrylowego eliminuje konieczność wiercenia i pogłębiania otworów prowadzących. Wkręcanie łączników, wiercenie i cięcie akrylu często powoduje jego pękanie, odpryskiwanie i pękanie ze względu na jego kruchość. Ponieważ cement jest rozpuszczalnikiem, spłynie do łączonego obszaru, rozpuszczając i zmiękczając napotkany akryl. Dlatego nie należy go nakładać na każdy kawałek z osobna, tak jakby był to tradycyjny klej. W przeciwieństwie do kleju cement nie wypełnia ujemnych przestrzeni ani nie przylega do powierzchni. Jest to główny powód, dla którego warto zamawiać "frezowane krawędzie", ponieważ zapewni to gładką i płaską krawędź, tworząc znacznie lepsze połączenie. Kiedy cement wyschnie, stopi dwa arkusze akrylowe w jeden kawałek w procesie zwanym "spawaniem rozpuszczalnikowym". Podobnie jak w przypadku spawania metali, gotowy produkt jest pojedynczym elementem, ale spawany obszar zawsze pozostanie najsłabszym miejscem. W związku z tym, gdy areny są już w użyciu, należy zachować ostrożność, aby uniknąć bezpośredniego uderzenia lub ekstremalnego stresu w tych momentach.

Protokół ten pokazuje również, jak skonfigurować 4 areny do jednoczesnego testowania do 4 myszy (rysunek 1 i rysunek 2). Nieprzezroczyste ściany aren uniemożliwiają myszom zobaczenie się nawzajem podczas testów, ale nadal istnieje możliwość, że obecność innych myszy w pomieszczeniu powoduje rozpraszanie zapachu lub hałasu, co może utrudnić testowanie. Próby habituacji, jak opisano tutaj, mogą pomóc złagodzić ten problem, ponieważ myszy są narażone na warunki w pomieszczeniu z wieloma zwierzętami przed testami behawioralnymi. Jeśli jednak rozproszenie uwagi od innych myszy lub hałas eksperymentatora związany z obchodzeniem się z innymi myszami jest poważnym problemem, można również użyć jednej areny z jedną myszą, chociaż wydłuży to czas potrzebny do ukończenia OLT i NORT z wieloma myszami. Teoretycznie można również użyć więcej niż 4 aren, ale większość kamer nie ma wystarczająco szerokiego pola widzenia, aby pokazać tyle aren w dobrej rozdzielczości.

Podane tutaj wymiary i odległości są ogólnymi wskazówkami dotyczącymi testowania zachowania myszy w typowym pomieszczeniu testowym o wymiarach 16 x 16 x 16^m3 (Rysunek 1B i 1C). Ustawienie odpowiednich sygnałów środowiskowych, aren i sprzętu do nagrywania wideo musi być zoptymalizowane dla każdego środowiska. Wskazówki mogą składać się z dużych kształtów lub wzorów (zwykle w kolorze czarnym i białym), które umożliwiają myszom orientację przestrzenną podczas OLT. Zamiast umieszczać wskazówki w różnych miejscach naprzeciwko siebie, można je również zamontować na ścianach obszaru testowego. Protokół ten zaleca podzielenie pokoju testowego zasłoną, aby ukryć badacza i komputer podczas testów behawioralnych. Podczas wszystkich przyzwyczajeń, interwałów między próbami i aktywnych prób badacze powinni zasunąć kurtynę, aby oddzielić się od obszaru testowego. Jeśli nie jest to praktyczne, komputer może pozostać w polu widzenia myszy, ale badacz musi zejść z pola widzenia podczas wykonywania zadania. Jeśli badacz jest obecny, myszy mogą próbować polegać na nim jako na wskazówce przestrzennej.

Wszystkie testy behawioralne powinny być przeprowadzane w środowisku o kontrolowanej temperaturze i wilgotności ze słabym, ale równomiernym oświetleniem o natężeniu około 310 luksów i minimalnym zewnętrznym dźwiękiem lub silnymi sygnałami zapachowymi otoczenia, takimi jak perfumy dla eksperymentatorów. Pomiędzy każdym dniem próbnym i testowym wszystkie areny i obiekty powinny być czyszczone metodami sterylizacji zalecanymi przez zwierzęta, takimi jak przecieranie 70% etanolem lub bezzapachowymi chusteczkami wybielającymi, aby zminimalizować sygnały węchowe. Jeśli stosowane są chemiczne środki dezynfekujące, zaleca się końcowe spłukanie 70% etanolem, ponieważ wiele chemicznych środków dezynfekujących może działać drażniąco na stopy zwierząt. Jak w przypadku każdego zadania behawioralnego, Obchodzenie się z myszami przez kilka dni przed badaniem jest konieczne, aby zapoznać je z osobami, które będą wykonywać OLT i NORT oraz zmniejszyć stres podczas testowania^20,22. Ponieważ myszy mogą doświadczać ostrego stresu z powodu nieznanych osób znajdujących się w pobliżu obszaru testowego, zaleca się również, aby wszystkie testy behawioralne były wykonywane przez tę samą osobę (osoby). Parametry i warunki testowe wyszczególnione w tym protokole zostały zoptymalizowane dla dorosłych myszy C57Bl / 6 w wieku od 6 do 9 tygodni i byłyby najbardziej przydatne w ujawnieniu zaburzeń pamięci spowodowanych urazem w tej grupie wiekowej lub zaburzeń pamięci spowodowanych wiekiem u starszych myszy. Jeśli celem jest przetestowanie poprawy pamięci u młodych myszy, dłuższy ITI wynoszący od 1 godziny do 1 dnia byłby bardziej odpowiedni, aby uniknąć wpływu na wydajność w łatwiejszej 20-minutowej wersji ITI. Rzeczywiście, ITI mogą trwać od 5 minut (w celu natychmiastowego przypomnienia) do kilku godzin lub dni (w przypadku pamięci zdalnej), w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentu oraz szczepów i wieku myszy. Co ważne, niezależnie od długości, wszystkie ZIT powinny być spójne między sesjami w eksperymencie. Ponieważ różne szczepy i wiek myszy wykazują różnice w zachowaniu i uczeniu się, czas każdej próby i interwału, układ obszaru testowego i używane obiekty mogą być modyfikowane w zależności od konkretnego szczepu myszy, ich wieku i konkretnego modelu urazu / choroby / interwencji, który jest testowany 9,21,23,25.

Podczas gdy zależność hipokampa funkcji pamięci przestrzennej testowanych w OLT jest dobrze ugruntowana, NORT może, ale nie musi, polegać na hipokampie. Interpretacja danych z NORT powinna uwzględniać to zastrzeżenie. Zmienne decydujące o tym, czy hipokamp jest zaangażowany, w pamięć rozpoznawania obiektów, nie są jeszcze uzgodnione, ale mogą obejmować długość ITI lub istotność wskazówek przestrzennych¹⁸. Warto zauważyć, że prezentowany protokół wykorzystuje przestrzenny OLT przed NORT, co może skłaniać myszy do korzystania z procesów hipokampa w NORT. Dlatego ważne jest, aby pamiętać, że kolejność może być odwrócona lub każde zadanie może być uruchamiane niezależnie, w zależności od pytań i potrzeb eksperymentatorów.

Wybór obiektów jest krytycznym aspektem zarówno OLT, jak i NORT^22,24. Idealne przedmioty są na tyle ciężkie, aby nie mogły być łatwo przemieszczone przez mysz i wykonane z materiału, takiego jak szkło lub metal, którego mysz nie może uszkodzić przez żucie lub drapanie. Przedmioty drewniane, piankowe lub z miękkiego tworzywa sztucznego nie są odpowiednie, ponieważ łatwo się odkształcają i trudno je utrzymać w stanie wolnym od zapachu. Co więcej, wszystkie przedmioty użyte w próbach powinny być stosunkowo podobne pod względem wielkości, tekstury, zapachu i materiału. Rysunek 1D przedstawia przykład odpowiedniego obiektu, który można wykorzystać. Ta pomarańczowa plastikowa figurka pisklęcia jest wypełniona piaskiem, aby nadać jej odpowiednią wagę i uszczelniona, aby zapobiec wyciekom odczynników czyszczących lub innych środków powodujących nieprzyjemny zapach. Ze względu na kształt wierzchołka, myszy nie są w stanie wspiąć się na niego ani na nim usiąść. W przypadku OLT lub NORT obiekt ten najlepiej łączy się z innym obiektem o podobnym rozmiarze, wadze, materiale, kolorze i złożoności, takim jak podobna plastikowa figurka królika. Aby upewnić się, że badanie obiektów rzeczywiście odzwierciedla preferencję dla nowości, wszystkie obiekty muszą zostać zweryfikowane pod kątem równoważnej wartości wewnętrznej na co najmniej 8 myszach w tym samym szczepie, płci i wieku grupy eksperymentalnej, jak opisano w sekcji 2.9 protokołu. Dodatkowo, obiekty powinny być losowo wybrane pod względem tego, który obiekt jest nowym lub przeniesionym obiektem między myszami w tym samym badaniu, aby dodatkowo upewnić się, że nieodłączne cechy obiektów nie wpływają na preferencje. Rozmieszczenie obiektów może również mieć duży wpływ na powodzenie lub porażkę OLT i NORT. Obiekty muszą być zrównoważone na arenach i nie mogą znajdować się zbyt blisko ścian. Kącik zatłoczony przez przedmiot jest atrakcyjnym miejscem do ukrycia się dla myszy, co zakłóci pomiary badawcze.

Ważnym warunkiem wstępnym do zbierania danych jest zdefiniowanie "aktywnego śledztwa", które ma miejsce, gdy mysz atakuje obiekt z nosem skierowanym na obiekt w odległości nie większej niż 2 cm. Mysz poruszająca się nad obiektem lub patrząca poza obiekt nie kwalifikuje się jako aktywne badanie. Ponadto, ponieważ OLT i NORT zależą od tego, czy mysz zapamiętuje albo położenie przestrzenne, albo rzeczywiste cechy obiektu, podczas prób treningowych musi być przeprowadzone wystarczające badanie. W związku z tym badacz musi określić minimalny czas badania i wykluczyć wszystkie osoby, które nie spełniają tego podstawowego poziomu badania, tradycyjnie ustalonego na 20 sekund²¹.

Kwantyfikacja czasu badania obiektu może być realizowana na różne sposoby, zarówno za pomocą drogiego oprogramowania analitycznego, jak i bez niego. Jeśli używane jest ręczne ocenianie, jak opisano tutaj, najbardziej kompleksowe zbieranie danych można osiągnąć, rejestrując znaczniki czasu na wideo, gdy mysz bada obiekt. Rejestrowanie czasów rozpoczęcia i zakończenia badania obiektu podczas trzech indywidualnych prób tworzy stały dziennik bezstronnych znaczników czasu i ułatwia dokładne ręczne obliczanie danych w przeciwieństwie do alternatywnych metod, takich jak użycie stopera do addytywnego rejestrowania całkowitego czasu, w którym mysz bada każdy obiekt.

Dostępne są również komercyjne pakiety oprogramowania do badania obiektów scoringowych. Dostępne na rynku oprogramowanie może dostarczyć wielu danych wykraczających poza opisane tutaj dane dotyczące punktacji rozdań, w tym całkowity przebyty dystans, ilość czasu spędzonego w określonych obszarach areny i prędkość ruchu^16,23. Oprogramowanie, po prawidłowym skalibrowaniu i potwierdzeniu, że niezawodnie wykrywa badanie obiektu, może również generować dane znacznie szybciej niż ręczna ocena. Ta szybsza wydajność danych może w dłuższej perspektywie przynieść oszczędności netto w porównaniu z roboczogodzinami wymaganymi do ręcznego oceniania. Jednak większość pakietów oprogramowania do analizy behawioralnej wiąże się z wysokimi kosztami początkowymi, które mogą być zaporowe dla wielu laboratoriów, a ręczna ocena może być często wykonywana przez studentów-badaczy, dzięki czemu koszty godzinowe oceny behawioralnej są minimalne. Oprogramowanie komercyjne często wiąże się również z ograniczeniami dotyczącymi liczby użytkowników, którzy mogą jednocześnie uzyskiwać dostęp do oprogramowania, co ogranicza przepustowość danych i oszczędność czasu. Chociaż te pakiety oprogramowania mają wiele zalet, nie są one konieczne do zbierania niezbędnych informacji o czasie badania obiektów z OLT i NORT. Możliwość ręcznego pozyskiwania tych danych sprawia, że nowatorskie zadania obiektowe są bardziej dostępne finansowo dla szerszego grona badaczy.

Dodatkową cechą tego protokołu jest to, że pierwsza sesja habituacji jest zasadniczo próbą na otwartym polu, która może dostarczyć danych na temat aktywności i poziomu lęku. Poziomy aktywności można określić ilościowo za pomocą całkowitego przebytego dystansu lub średniej prędkości, jeśli dostępne jest oprogramowanie śledzące. Podobnie, w przypadku oprogramowania śledzącego, miary lęku można uzyskać na podstawie czasu spędzonego w centrum areny lub odległości przebytej w centrum. Dane te można również pozyskać ręcznie, nakładając na obraz wideo z areny siatkę i określając ilościowo skrzyżowania. Te dane z otwartego pola mogą pomóc wykluczyć duże deficyty motoryczne lub nadmierny niepokój, które mogą przeszkadzać w późniejszym badaniu obiektów.

Testy statystyczne stosowane w tym protokole są reprezentatywne dla tradycyjnych metod analizy. Porównując 2 grupy myszy, zaleca się dwupróbowy, dwustronny test t w celu zbadania znaczenia różnicy w procentowym czasie badania przeniesionego lub nowego obiektu między grupami. Jeśli wielkość próby jest nierówna, ma wyjątkowo wysoką zmienność lub wykazuje nierównomierną zmienność między grupami, zamiast tego zaleca się test nieparametryczny, ponieważ w tych warunkach zostanie naruszonych wiele podstawowych założeń testu t. Porównując 3 lub więcej grup myszy, zaleca się ANOVA w celu sprawdzenia, czy grupa ma znaczący wpływ na procentowy czas badania przeniesionego lub nowego obiektu. Testy post-hoc z korekcją błędów, takie jak test Tukeya lub porównania parami z korekcją Bonferroniego, można następnie zastosować do zbadania różnicy w procentowym czasie badania między każdą parą grup. W przypadku OLT dodatkowym sposobem analizowania danych jest testowanie znaczącej zmiany w procentowym czasie badania przeniesionego obiektu z prób szkoleniowych do OLT. Z tylko jedną grupą myszy, test ten przyjąłby formę sparowanego, dwustronnego testu t, testującego znaczące zmiany w procentowym czasie z poruszanym obiektem od treningu do OLT u każdej myszy (pamiętając, że są to analizy sparowane, a nie niezależne pomiary, ponieważ każda mysz daje dwa punkty danych). W przypadku dwóch grup myszy zastosowano dwukierunkową ANOVA z powtarzanymi pomiarami, przy czym powtarzanym pomiarem byłaby próba (trening kontra OLT), a drugim czynnikiem byłoby przypisanie do grupy. Testy post-hoc dotyczące różnic między grupami leczenia powinny porównywać grupy ze sobą w ramach badań.

Alternatywnie, jeśli testowane jest tylko dowód pamięci w OLT lub NOR, można użyć testu t dla jednej próby, w którym procentowo badany jest obiekt w porównaniu z ustaloną wartością 50%. Procent czasu znacznie wyższy niż 50% sugeruje pamięć dla obiektu. Odsetek czasu znacznie poniżej 50% sugeruje niechęć (z jakiegoś powodu), a wybory obiektów powinny zostać ponownie ocenione. Test t dla jednej próby nie może jednak ujawnić, czy dwie lub więcej grup różni się od siebie. Na przykład w eksperymencie z dwiema grupami myszy, jeśli grupa A spędziła 60% czasu z nowym obiektem dla p = 0,049 przez porównanie testu t dla jednej próby z 50%, a grupa B spędziła tylko 59% czasu z nowym obiektem dla p = 0,051, grupa A znacznie różni się od 50% (a grupa B nie). Błędne jest jednak wnioskowanie, że te dwie grupy znacznie się od siebie różnią. Test t dla dwóch prób porównujący A i B może łatwo ujawnić, że te dwie grupy są statystycznie nie do odróżnienia. Jeśli celem końcowym jest porównanie wydajności pamięci dwóch lub więcej grup, grupy te muszą być statystycznie porównane ze sobą, a nie tylko porównane z zewnętrznym standardem. Podobna wytyczna dotyczy porównania czasu spędzonego z ruchomym obiektem między treningiem a OLT. W tym przypadku znalezienie istotnej różnicy w procentowym czasie z poruszanym obiektem między treningiem a OLT w jednej grupie, a nie w innej, NIE pokazuje, że grupy te różnią się statystycznie. Grupy muszą być porównywane post hoc ze sobą w ramach każdego badania, a nie tylko między badaniami w grupie.

Ważne jest, aby pamiętać, że czas badania pojedynczej myszy nie może być wykorzystany jako dowód za lub przeciw pamięci. Pamięć o lokalizacji lub tożsamości obiektu w tych zadaniach może być raczej zakończona tylko na podstawie danych zagregowanych, które są statystycznie porównywane albo z zagregowanymi danymi innej grupy, albo z ustalonymi poziomami szansy (50% dla czasu, 0 dla współczynnika dyskryminacji). Potrzebna wielkość próby będzie w dużym stopniu zależała od wielkości efektu konkretnej manipulacji i zmienności zachowania, które z kolei będą zależeć od użytych myszy. Wiek, płeć i manipulacje wpływają na zmienność. W przykładowych danych przedstawionych na rysunkach 3A i 3B użyto n = 14 osób, co dało wielkość efektu 0,68 i moc 0,65 dla sparowanego testu t przy α = 0,05. Gdyby do tego porównania pożądana była potęga 0,8, wymagana byłaby próba o wielkości 18.

Dyskusja ta skupia się na wartościach p i punktach odcięcia istotności, ponieważ są to miary i analizy najczęściej zgłaszane dla danych OLT i NORT, a zatem prawdopodobnie są znane zarówno eksperymentatorom, jak i recenzentom. To poleganie na wartościach p było ostro krytykowane jako statystycznie niepoprawne²⁶. Jednakże, chociaż istnieją alternatywne metody analizy i są one zatwierdzone w niektórych czasopismach²⁷, żadna z nich nie została szeroko przyjęta przez dziedziny behawioralne i biomedyczne jako standard²⁶.

Podsumowując, protokół ten skutecznie testuje pamięć u myszy przy minimalnych kosztach. Dołączono zalecenia dotyczące odpowiednich modyfikacji protokołu, aby zapewnić pomyślne wdrożenie z każdym modelem małego gryzonia. Zastosowanie tego protokołu do konkretnych modeli urazów lub interwencji terapeutycznych może ujawnić cenne znaczenie funkcjonalne, które uzupełnia badane mechanizmy komórkowe i molekularne.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Znak Biały - 9% Półprzezroczysty i nieprzezroczysty kolorowy odlew akrylowy (Chemcast)	TAP Plastics	NA	1/4 "x 15.75" x 15,75 " z frezowanymi krawędziami
Znak Biały - 9% Półprzezroczysty i nieprzezroczysty kolorowy odlew akrylowy (Chemcast)	TAP Plastics	NA	1/4 "x 15,75" x 16,5 " z frezowanymi krawędziami
Znak biały - 9% Przezroczysty i nieprzezroczysty kolorowy odlew akrylowy (Chemcast)	TAP Plastics	NA	1/4" x 16,5" x 16,5" z frezowanymi krawędziami
TAP Cement akrylowy (1 pkt.)	TAP Plastics	NA
16 G Aplikator hipo	TAP Plastics	NA
Debiutanckie oprogramowanie do przechwytywania wideo Pro Edition	Oprogramowanie NCH	NA
Stanely SAE/metryczny grzebień kwadratowy	Grainger	6R171
Logitech Pro Stream Webcam C922x	CDW	4429927
Belkin 16' Aktywny przedłużacz USB 2.0	CDW
Panduit Pan-Way LD Bieżnia powierzchniowa (8')		CDW 300902
Wskazówki przestrzenne/środowiskowe	Zmienna	NA
Obiekty do testowania	Zmienna	NA
70%	etanolu Zmienna	NA
Taśma dwustronna	Zmienna	NA