Method Article

Roztwór strukturalny białka fluorescencyjnego Cerulean za pomocą MeshAndCollect

DOI:

10.3791/58594

⸱

March 19th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Synchrotron Radiation Facility, Structural Biology Group, 2European Molecular Biology Laboratory, 3Univ. Grenoble Alpes, CNRS, CEA, IBS (Institut de Biologie Structurale)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy użycie protokołu MeshAndCollect do uzyskania kompletnego zestawu danych dyfrakcyjnych, do wykorzystania w późniejszym określaniu struktury, składającego się z częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych zebranych z wielu małych kryształów fluorescencyjnego białka Cerulean.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krystalografia rentgenowska jest główną techniką używaną do uzyskiwania informacji o wysokiej rozdzielczości dotyczących trójwymiarowych struktur makrocząsteczek biologicznych. Do niedawna głównym wymogiem była dostępność stosunkowo dużych, dobrze dyfrakujących kryształów, które często są trudne do uzyskania. Jednak pojawienie się krystalografii szeregowej i renesans metod gromadzenia danych wielokrystalicznych oznacza, że dostępność dużych kryształów nie musi już być czynnikiem ograniczającym. W tym miejscu ilustrujemy zastosowanie zautomatyzowanego protokołu MeshAndCollect, który najpierw identyfikuje pozycje wielu małych kryształów zamontowanych na tym samym uchwycie próbki, a następnie kieruje zbieraniem z kryształów serii zestawów danych dyfrakcji częściowej w celu późniejszego łączenia i wykorzystania w określaniu struktury. MeshAndCollect może być stosowany do każdego rodzaju mikrokryształów, nawet jeśli są słabo załamujące. Jako przykład przedstawiamy tutaj zastosowanie tej techniki do rozwiązania struktury krystalicznej cyjanowego białka fluorescencyjnego (CFP) Cerulean.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makromolekularna krystalografia rentgenowska (MX) jest zdecydowanie najczęściej używaną metodą uzyskiwania wglądu w rozdzielczość atomową w trójwymiarowe struktury makromolekuł biologicznych. Jednak głównym wąskim gardłem jest wymóg stosunkowo dużych, dobrze dyfrakcyjnych kryształów.

Często, a szczególnie podczas krystalizacji białek błonowych, można uzyskać tylko bardzo małe kryształy o wielkości kilku mikronów w największym wymiarze. Efekty uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem ograniczają rozdzielczość kompletnego zestawu danych dyfrakcyjnych, które można zebrać z pojedynczego mikrokryształu2, a bardzo często konieczne jest poprawienie stosunku sygnału do szumu, a co za tym idzie rozdzielczości zbioru danych, poprzez połączenie kilku częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych z różnych, ale izomorficznych kryształów. Wzrost gęstości strumienia wiązek promieniowania rentgenowskiego w źródłach synchrotronowych i w innych miejscach (np. lasery rentgenowskie na swobodnych elektronach (X-FEL)) oznacza, że użyteczne zestawy danych dyfrakcji cząstkowej można zebrać nawet z bardzo małych kryształów makrocząsteczek biologicznych. To z kolei doprowadziło do opracowania nowych technik gromadzenia i łączenia zbiorów danych dyfrakcji cząstkowej zebranych z wielu różnych kryształów w celu stworzenia kompletnego zestawu danych do rozwiązania strukturalnego. Takie techniki są powszechnie określane jako krystalografia szeregowa (SX)3,4,5,6,7,8. Prototypowym przykładem SX jest użycie urządzeń inżekcyjnych do wprowadzenia wąskiego strumienia krystalicznej zawiesiny do wiązki promieniowania rentgenowskiego3,4,5. Wzór dyfrakcyjny jest rejestrowany za każdym razem, gdy kryształ jest wystawiony na działanie promieni rentgenowskich, co prowadzi do zebrania, z wielu tysięcy pojedynczych kryształów, "nieruchomych" obrazów dyfrakcyjnych, informacji, które są następnie łączone w celu wytworzenia kompletnego zestawu danych. Jednak istotną wadą tego typu szeregowego zbierania danych jest to, że przetwarzanie nieruchomych obrazów może być problematyczne. Jakość danych ulega znacznej poprawie, jeśli kryształy mogą być obracane i/lub kilka obrazów dyfrakcyjnych jest zbieranych z tego samego kryształu podczas eksperymentów krystalografii seryjnej6.

MeshAndCollect1 został opracowany w celu połączenia SX ze "standardowym" zbieraniem danych o rotacji MX i pozwala, w sposób automatyczny, eksperymentatorom na zbieranie częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych z wielu kryształów tego samego celu makromolekularnego zamontowanych na tych samych lub różnych uchwytach na próbki. Kompletny zestaw danych dyfrakcyjnych uzyskuje się następnie przez połączenie najbardziej izomorficznego z zebranych częściowych zestawów danych. MeshAndCollect jest kompatybilny z każdą najnowocześniejszą synchrotronową linią rentgenowską do badania MX (najlepiej urządzeniem wprowadzającym ze stosunkowo małym (20 μm lub mniej) rozmiarem wiązki w miejscu próbki). Oprócz kompilacji kompletnych zestawów danych z serii małych, dobrze dyfrakcyjnych kryształów, metoda ta jest również bardzo przydatna do wstępnej eksperymentalnej oceny jakości dyfrakcyjnej mikrokryształów oraz do przetwarzania próbek nieprzezroczystych, np. w mikrokryształach białek błonowych hodowanych w mezo9.

Na początku eksperymentu MeshAndCollect, pozycje, w dwóch wymiarach, każdego z wielu kryształów zawartych w pojedynczym pojemniku na próbkę są określane za pomocą niskodawkowego skanu rentgenowskiego. Obrazy dyfrakcyjne zebrane podczas tego skanowania są automatycznie analizowane przez program DOZOR1, który sortuje pozycje kryształów na uchwycie próbki zgodnie z ich odpowiednią siłą dyfrakcji. Pozycje do zbierania częściowych zestawów danych są przypisywane automatycznie na podstawie punktu odcięcia siły dyfrakcji, a w ostatnim kroku z każdej wybranej pozycji zbierane są małe kliny danych dyfrakcyjnych, zwykle ±5° obrotu. Doświadczenie pokazuje, że ten zakres rotacji zapewnia wystarczającą ilość odbić na kryształ do celów częściowego skalowania zestawu danych, jednocześnie zmniejszając możliwe problemy z centrowaniem kryształów i szansę na odsłonięcie wielu kryształów w szczególnie zatłoczonym support1. Poszczególne kliny danych dyfrakcyjnych (częściowe zestawy danych) są następnie przetwarzane ręcznie lub za pomocą zautomatyzowanych potoków przetwarzania danych10,11,12,13. W celu określenia dalszej struktury konieczne jest znalezienie najlepszej kombinacji częściowych zestawów danych do scalenia14,15,16, po czym wynikowy kompletny zestaw danych może być traktowany w taki sam sposób, jak ten pochodzący z eksperymentu z pojedynczym kryształem.

Jako przykład MeshAndCollect w praktyce, prezentujemy tutaj rozwiązanie struktury krystalicznej cyjanu białka fluorescencyjnego (CFP) Cerulean, używając zestawu danych dyfrakcyjnych zbudowanego z kombinacji częściowych zestawów danych zebranych z serii mikrokryształów zamontowanych na tym samym nośniku próbki. Cerulean został opracowany z Białka Zielonej Fluorescencji (GFP) z meduzy Aequorea victoria17, której fluorescencyjny chromofor powstaje autokatalitycznie w wyniku cyklizacji trzech kolejnych reszt aminokwasowych. Cerulean otrzymuje się z GFP poprzez mutację pierwszej i drugiej reszty chromoforu, seryny i tyrozyny, odpowiednio do treoniny (S65T) i tryptofanu (Y66W) oraz adaptacji środowiska chromoforu do dalszych mutacji (Y145A, N146I, H148D, M153T i V163A) w celu wytworzenia znaczącego, ale nieoptymalnego poziomu fluorescencji QY = 0,4918,19,20. Zaproponowano, że nieoptymalne właściwości fluorescencyjne Cerulean są związane ze złożoną dynamiką białek obejmującą niedoskonałą stabilizację jednej z jedenastu nici β białka21 oraz z akomodacją dwóch różnych izomerów chromoforowych w zależności od pH i warunków napromieniowania22. Zdecydowaliśmy się na pracę z Cerulean jako białkiem modelowym ilustrującym zastosowanie protokołu MeshAndCollect ze względu na stosunkowo łatwą regulację wielkości kryształów w zależności od krystalizacji. Struktura Cerulean jest bardzo podobna do struktury jego macierzystego białka GFP, ponieważ składa się z β-beczki utworzonej z jedenastu β-nici otaczających α-helisę, na której znajduje się chromofor.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspresja i Oczyszczanie Cerulean

Uwaga: To jest oparte na protokole opublikowanym przez Lelimousin et al.21

  1. Ekspresję oznaczonego przez Hisa Cerulean w komórkach Escherichia coli BL21 hodowanych w temperaturze 37 °C w 4 litrach pożywki autoindukowanej 23 do OD600=1, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 27 °C.
  2. Zbierz komórki bakteryjne przy 5,000 x g i poddaj je lizie za pomocą sonikacji (40%, 5 min, 10 s puls, 10 s przerwy) w 200 ml buforu składającego się z 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl i 1x inhibitorów proteazy wolnych od EDTA.
  3. Załadować supernatant do kolumny Ni-NTA z pułapką Hisa i wymyć Cerulean 100 mM imidazolem w tych samych warunkach buforowych.
  4. Połącz jasnożółte frakcje. Białko jest wewnętrznie zabarwione, stąd frakcje zawierające cerulean są łatwe do odróżnienia.
  5. Oczyść białko (4 ml) w kolumnie S75 w 20 mM Tris pH 8,0.
  6. Zebrać jasnożółte frakcje i zagęścić roztwór białkowy do 15 mg/ml.

2. Krystalizacja

  1. Użyj techniki dyfuzji pary z wiszącą kroplą24 w temperaturze 20 °C w płytkach Linbro. Napełnij studzienki 1 ml roztworu strącającego składającego się ze 100 mM HEPES o pH 6,75, 12% PEG8000 i 100 mM MgCl2. W przypadku wiszących kropli zmieszać 1 μl białka skoncentrowanego w 15 mg/ml z 1 μl roztworu strącającego. Kryształy powinny pojawić się w ciągu 24 godzin.
  2. Zebrane kryształy należy zebrać i przenieść do 100 μl buforu wysiewającego składającego się z 0,1 M HEPES pH 6,75, 22% PEG 8000.
  3. Zmiel kryształy za pomocą młynka do tkanek o pojemności 0,1 ml i rozcieńcz w buforze wysiewającym (stosunek 1:100).
  4. Trawić podwielokrotność podstawowego roztworu białkowego (15 mg/ml) z trypsyną (0,5 mg/ml w tym samym buforze) przez 1 godzinę (1:10 (v/v)).
  5. Wymieszać strawiony roztwór białkowy z 10% buforem zawierającym nasiona (v/v).
  6. Hoduj kryształy (10*10*20 μm3) w 0,1 M HEPES pH 7, 14% PEG 8000, 0,1 MgCl2 w 1-1,5 μL wiszących kroplach metodą dyfuzji pary.

3. Montaż kryształu

  1. Użyj odpowiedniej pętli, np. pętli siatkowej z 700 kwadratowymi otworami po 25 μm każdy zamontowany na standardowym uchwycie na próbkę SPINE25. Przenieść kryształy z kropli krystalizacji (krok 2.6) do 1 μl roztworu krioprotektantu (roztwór strącający studzienkę zmieszany z glicerolem (20% v/v final)).
  2. Zamontuj zawiesinę kryształów białka na pętli siatkowej, przesuwając pętlę pod kryształami i podnosząc je z kropli. Idealnie byłoby, gdyby kryształy miały maksymalny wymiar od 5 μm do 30 μm, bez zachodzenia na siebie kryształów zamontowanych w pętli.
  3. Odkręć nadmiar płynu, szybko dotykając uchwytu bibułą filtracyjną. Osadź kryształy tak, aby znajdowały się w płaszczyźnie pętli otoczonej jak najmniejszą ilością płynu.
  4. Zanurz wierzchowiec w krążku pełnym ciekłego azotu. Przechowuj krążek w temperaturze 100 K w odpowiednim pojemniku do przechowywania, aż będzie dostępny czas wiązki.

4. Przygotowanie eksperymentu synchrotronowego w trybie offline

Uwaga: Poproś o czas wiązki synchrotronowej tak wcześnie, jak to możliwe i postępuj zgodnie z wytycznymi online dotyczącymi dostępnych typów dostępu i sposobu składania wniosku dla danego synchrotronu. Wytyczne ESRF można znaleźć na stronie http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. W przypadku członkostwa w Grupie Alokacji Bloków ESRF (BAG), wniosek dla każdego konkretnego projektu nie jest wymagany. W takim przypadku eksperymentatorzy powinni zwrócić się do swojego odpowiedzialnego BAG w sprawie zaplanowania czasu wiązki.

  1. Po zaakceptowaniu propozycji i otrzymaniu zaproszenia do udziału w eksperymencie, wszyscy uczestnicy powinni ukończyć szkolenie w zakresie bezpieczeństwa. Wypełnij "Formularz A" (za pośrednictwem portalu użytkownika ESRF, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) z wymaganymi informacjami dotyczącymi bezpieczeństwa próbek. Skontaktuj się z lokalną osobą kontaktową, aby omówić eksperyment. Po przesłaniu i zatwierdzeniu formularza A otrzymasz numer eksperymentu i hasło.
  2. Połącz się z rozszerzonym ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) i wybierz MX.
  3. Zaloguj się za pomocą numeru eksperymentu i hasła z formularza A.
  4. Wybierz pozycję Wysyłka | Dodaj Nowy i wypełnij wymagane informacje.
  5. Wybierz Dodaj paczkę i uzupełnij odpowiednie dane. Wybierz opcję Dodaj kontener, wybierz unipuck i wypełnij wymagane informacje, w tym pozycje posiadaczy próbek w krążku.

5. Załadunek próbki na linię badawczą

  1. W klatce doświadczalnej załaduj krążek do zmieniacza próbek (SC) dewara i zanotuj jego położenie.
  2. Zablokuj kabinę doświadczalną i wejdź do klatki kontrolnej.
  3. Zaloguj się do ISPyB (https://esrf.fr/). Wybierz opcję Przygotuj eksperyment, znajdź przesyłkę, wybierz pozycję Dalej i wskaż linię badawczą oraz pozycję krążka w SC.
  4. Zaloguj się do oprogramowania sterującego linią badawczą, tutaj MXCuBE227,28 z numerem eksperymentu i hasłem podanym na formularzu A.
    1. Naciśnij przycisk Sync, aby zsynchronizować oprogramowanie sterujące linią z bazą danych ISPyB.
  5. Za pomocą oprogramowania sterującego linią badawczą zamontuj uchwyt próbki na goniometrze. W MXCuBE2 kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję w obszarze zmieniacza próbek i wybierz opcję Zamontuj próbkę.
  6. Korzystając z goniometru MK3 mini-kappa29 zainstalowanego na większości linii badawczych ESRF MX, użyj przepływu pracy MXCuBE2 "wizualnego wyrównania" MXCuBE230, aby wyrównać płaszczyznę uchwytu próbki z osią obrotu goniometru.
    1. Wybierz przycisk Środek, a następnie kliknij 3 razy wyśrodkuj środek na środku krawędzi końcówki pętli. Zapisz pozycję wyśrodkowaną, wybierając opcję Zapisz.
    2. Kliknij ponownie przycisk Środek, a następnie kliknij 3 kliknięcia wyśrodkuj środek początku trzonu pętli. Zapisz również drugą pozycję, klikając Zapisz.
    3. Wybierz jedną z zapisanych pozycji wyśrodkowanych, klikając na nią.
    4. W obszarze Zaawansowane dodaj przepływ pracy Orientacja wizualna do kolejki zbierania danych MxCuBE2.
    5. Uruchom przepływ pracy, klikając opcję Zbierz kolejkę.
    6. Po tym, jak przepływ pracy wyrówna płaszczyznę uchwytu próbki z osią obrotu goniometru, ponownie wyśrodkuj uchwyt próbki, tym razem gdzieś w środku siatki.
  7. Ustaw uchwyt próbki tak, aby powierzchnia siatki była prostopadła do kierunku wiązki promieniowania rentgenowskiego, obracając oś omega za pomocą MXCuBE2.
  8. W MXCuBE2 wybierz rozmiar wiązki wymagany do skanowania uchwytu próbki (tylko dla linii badawczych o zmiennym rozmiarze wiązki).
    1. Kliknij w menu rozwijane przysłony w oprogramowaniu sterującym linią i wybierz wartość, np. 10 μm.
  9. Zdefiniuj siatkę dla skanowania siatki.
    1. Kliknij ikonę narzędzia siatki w MXCuBE2. Pojawi się okno narzędzia siatki.
    2. W przykładowym widoku MXCuBE2 narysuj siatkę, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając myszą nad obszarem zawierającym kryształy na uchwycie próbki.
    3. Aby zapisać siatkę, kliknij przycisk Plus w oknie narzędzia siatki (siatka zmieni kolor na zielony).

6. Przygotowanie i wykonanie przepływu pracy MeshAndCollect

  1. W polu Resolution (Rozdzielczość) MXCuBE2 wprowadź rozdzielczość (dmin), przy której mają być zbierane obrazy dyfrakcyjne, np. tutaj 1,8 A.
  2. Wybierz pozycję MeshAndCollect na karcie Zaawansowane zbieranie danych, dodaj ją do kolejki i kliknij przycisk Zbierz kolejkę.
  3. W wyświetlonym oknie parametrów użyj domyślnych parametrów zależnych od linii badawczej. W opisanym tutaj eksperymencie domyślne parametry to czas naświetlania 0,037 s na punkt skanowania siatki, 100% transmisja (prowadząca w tym przypadku do 4 x 1011 ph/s), oscylacja 1° na linię skanowania siatki.
  4. Kliknij przycisk C. ontinue. Skanowanie siatki przebiega, a obrazy dyfrakcyjne zebrane w każdym punkcie siatki są analizowane i klasyfikowane według siły dyfrakcji za pomocą oprogramowania DOZOR1. Ten proces przebiega w tle.
  5. Po analizie DOZOR generowana jest mapa cieplna, a kolejność kolejnych częściowych zbiorów danych jest przypisywana automatycznie na podstawie siły dyfrakcyjnej (patrz Rysunek 1).
    Uwaga: Wyniki tego kroku można również sprawdzić w ISPyB. Do zbierania częściowych zestawów danych wyskakuje nowa zakładka z ustawieniami w oprogramowaniu sterującym beamline, wybierz odpowiednie wartości dla zakresu obrotu (np. 0,1°), liczby obrazów (np. 100), czasu naświetlania, rozdzielczości, transmisji, wiązki odwrotnej itp. Idealnie byłoby, gdyby dawka dla każdego klina, który ma być zebrany, była poniżej limitu Garmana (30 MGy). Przybliżony czas naświetlania na obraz wynosi od 0,037 s do 0,1 s w opisanych warunkach eksperymentalnych.
  6. Kliknij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić częściowe zbieranie danych.

7. Przetwarzanie danych

Uwaga: Częściowe zestawy danych są zintegrowane z odpowiednim programem (XDS10). W tym celu zostanie użyty skrypt Pythona, który rozpoznaje każdy pojedynczy zestaw danych, integruje go i upewnia się, że indeksowanie między różnymi częściowymi zestawami danych jest spójne.

  1. Otwórz folder zawierający obrazy: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.
  2. Utwórz kopię bezpieczeństwa podfolderu procesu, która znajduje się w folderze, w którym zbierane są częściowe zestawy danych.
    1. W terminalu Linux użyj polecenia cp –r process process_backup.
  3. Przejdź do folderu procesu i uruchom skrypt przetwarzania.
    1. W terminalu Linux wpisz polecenie cd process i naciśnij Enter.
    2. Wpisz procMultiCrystalData i naciśnij enter.
      Uwaga: Skrypt poprosi o podanie parametrów grupy przestrzeni i komórki (te informacje są opcjonalne), wprowadź je zgodnie z instrukcjami. Po ostatnim potwierdzeniu przez użytkownika skrypt zostanie uruchomiony automatycznie.

8. Scalanie zbiorów danych

Uwaga: Po zintegrowaniu wszystkich częściowych zestawów danych, najlepsza ich kombinacja jest łączona, aby uzyskać końcowy zestaw danych do wykorzystania w określaniu i udoskonalaniu struktury. Różnymi celami tego procesu scalania mogą być uzyskanie pełnej kompletności (wysoce zalecane), wysokiej liczebności lub najlepszych statystyk danych (wysokie , niskie współczynniki R itp.). To ostatnie może czasami odbywać się kosztem kompletności i/lub wielości, dlatego tę opcję należy wybierać ostrożnie.

  1. Scal częściowe zestawy danych za pomocą programu ccCluster14. Wykorzystuje hierarchiczną analizę skupień (HCA) do określenia możliwych kombinacji izomorficznych częściowych zestawów danych ().
    1. Wpisz ccCluster w terminalu uniksowym, aby otworzyć jego graficzny interfejs użytkownika (GUI).
      Uwaga: W graficznym interfejsie użytkownika ccCluster rysowany jest dendrogram. Daje to sugestię, które częściowe zestawy danych można najlepiej scalić na podstawie izomorfizmu między nimi.
    2. Kliknij węzeł, który odpowiada wartości około 0,4 na osi pionowej. Ogólnie rzecz biorąc, wyższe wartości będą zawierać więcej częściowych zestawów danych, ale doprowadzą do gorszych statystyk scalania, ponieważ częściowe zestawy danych będą mniej izomorficzne.
    3. Kliknij SCAL DANE. Wybrany klaster zostanie przetworzony w tle, a szacowane statystyki scalania pojawią się w nowej karcie w graficznym interfejsie użytkownika. Ten krok można powtórzyć dla różnych kombinacji zestawów danych. Dla dobrej kombinacji częściowych zestawów danych kompletność powinna być bliska 100%, wartości wysokie (10 lub wyższe w powłoce o najniższej rozdzielczości), a wartości R-meas31 niskie (około 5% w powłoce o niskiej rozdzielczości).
  2. Dla każdej wybranej kombinacji użyj wygenerowanego skryptu wejściowego, aby scalić wybrane częściowe zestawy danych w jeden plik mtz (tj. pointless32).
  3. Ostatecznie przeskaluj i scal dane intensywności w tym pliku za pomocą programu do skalowania (tj. aimless32) i, podobnie jak w przypadku pliku pochodzącego ze zbioru danych pojedynczego kryształu, użyj danych wyjściowych do późniejszego fazowania i struktury rozwiązanie33.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MeshAndCollect, zaimplementowany w MXCuBE2 (zobacz Rysunek 1A), został użyty do zbierania częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych z małych kryształów Cerulean znajdujących się na tym samym uchwycie próbki, w którym identyfikacja wizualna kryształów była trudna. Aby przesiać uchwyt próbki, narysowaliśmy siatkę nad środkiem pętli siatkowej (patrz Rysunek 1B) i na podstawie mapy cieplnej wyników DOZOR (patrz rysunki 1C, 1D) automatycznie zebrano 85 zestawów danych częściowej dyfrakcji. Zostały one indywidualnie zintegrowane, a następnie połączone (patrz wyżej) w celu uzyskania zestawu danych o kompletności 99,8% przy dmin = 1,7A (patrz Tabela 1). Korelacja połówkowa zbioru (CC1/2)34 w powłoce o najwyższej rozdzielczości wyniosła 60% ( = 4,7). Zgodnie z oczekiwaniami, struktura krystaliczna Cerulean może być łatwo rozwiązana przez molekularne podstawienie33 przy użyciu wygenerowanego zestawu danych. Po doprecyzowaniu uzyskaliśmypracę R na poziomie 22,8% i Rwolną od 25,4%. Superpozycja z poprzednio ustaloną strukturą (wpis PDB 2WSO21) pokazuje globalny rmsd na pozycjach Cα 0,1 A.

pkt. pkt.
Statystyki scalonego zbioru danych
Próg klastrowania0,35
Liczba częściowych zbiorów danych25
Grupa kosmicznaP212121
Komórka elementarna (a, b, c)50,98, 62,76, 69,50
Zakres rozdzielczości46,58-1,70 (1,73-1,70)
Rmerge (wszystkie I+ i I-)0,133 (0,743)
Rmeas (wszystkie I+ i I-)0,142 (0,813)
Rpim (wszystkie I+ i I-)0,047 (0,318)
Obserwacje ogółem/niepowtarzalne220693/25129
Średnia((I)/sd(I))13,8 w stosunku do 4,7
Mn(I) korelacja połówkowa zbiorów CC(1/2)0,994 (0,602)
kompletność99,8 (99,5)
Liczebność8,8 (6,5)
Końcowy Rcryst22,8
Final Rza darmoRejon 25,4

Tabela 1: Statystyki połączonego zestawu danych wskazujące na wysoką jakość zebranych danych.

figure-results-1
Rysunek 1: Użycie MeshAndCollect do zebrania serii częściowych zestawów danych z serii małych kryształów zawartych w tym samym uchwycie na próbki. a) Interfejs użytkownika MXCuBE2. Zielony owal nad polem przeglądarki na osi wskazuje narzędzie siatki. B) Dzięki niemu siatka jest rysowana na obrazie uchwytu próbki w polu obrazu życia. C) Mapa cieplna wyników DOZOR. D) Przykład obrazu dyfrakcyjnego. E) Dendrogram po hierarchicznej analizie skupień. Do scalania użyto zestawów danych w kolorze czerwonym. F) Ogólna struktura Cerulean. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powodzenie eksperymentu MX zwykle zależy od istnienia stosunkowo dużych, dobrze dyfrakujących kryształów. W przypadku projektów, w których optymalizacja od małych pęków kryształów do większych kryształów nie powiedzie się, MeshAndCollect zapewnia możliwość uzyskania kompletnego zestawu danych dyfrakcyjnych dla rozwiązania struktury poprzez kombinację izomorficznych częściowych zestawów danych zebranych z serii małych kryształów. Metoda jest kompatybilna z synchrotronowymi liniami badawczymi dla MX, najlepiej o wysokim strumieniu fotonów i małej średnicy wiązki, wyposażonymi w najnowocześniejszy dyfraktometr i detektor o szybkim odczycie. Na takiej stacji końcowej zbieranie danych w takim eksperymencie zajmie około 20 minut, w zależności od liczby częściowych zestawów danych do zebrania i liczby posiadaczy próbek zawierających kryształy do analizy.

Najważniejszym warunkiem powodzenia eksperymentu MeshAndCollect jest istnienie wystarczającej liczby (najlepiej co najmniej 50, a najlepiej 100) pozycji dyfrakcyjnych na uchwycie próbki. Z doświadczenia wynika, że minimalny rozmiar kryształów do analizy powinien wynosić około 5 μm w najmniejszym wymiarze. Metoda jest kompatybilna z każdym rodzajem standardowych uchwytów na próbki kompatybilnych z chłodzeniem kriogenicznym, a najlepsze wyniki osiąga się przy użyciu sztywnych i prostych mocowań siatkowych.

W ESRF MeshAndCollect jest wdrażany w sposób przyjazny dla użytkownika w przepływie pracy Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en)30 dostępnym w oprogramowaniu sterującym linią badawczą MXCuBE2. Główną zaletą MeshAndCollect w porównaniu z innymi metodami SX jest to, że zebrane dane mogą być przetwarzane przez standardowe programy i zautomatyzowane potoki używane do monokryształu MX.

Jak pokazuje nasz przykład, MeshAndCollect jest bardzo łatwy do zastosowania i prowadzi do serii częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych, zwykle zbieranych z małych kryształów, które można połączyć w celu uzyskania kompletnego zestawu danych do wykorzystania w roztworze strukturalnym. Co więcej, MeshAndCollect ma potencjał, aby otworzyć przestrzeń próbkowania krystalografii białek, ponieważ zapewnia sposób na zbieranie użytecznych danych z prób krystalizacji, w których ostatni etap optymalizacji, czyli produkcja dużych kryształów, kończy się niepowodzeniem.

W świetle obecnych osiągnięć w kierunku jaśniejszych źródeł promieniowania rentgenowskiego (np. projekt Extremely Brilliant Source (EBS)/ESRF35) można przewidzieć, że ze względu na zwiększone uszkodzenia radiacyjne, rodzaj zbierania danych wielokrystalicznych ułatwiony przez MeshAndCollect stanie się standardową metodą zbierania danych, a nie wyjątkiem – jak ma to miejsce obecnie – na liniach badawczych MX opartych na synchrotronie.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy ESRF za udostępnienie czasu wiązki w ramach swojego wewnętrznego programu badawczego.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
KoncentratoryESRF ID 23-1
: Amicon Ultra-4 Ultracel -30KMerck MilliporeUFC803024
Płytki krystalizacyjne XDXm z uszczelniaczemHampton ResearchHR3-306
Inhibitory proteazy wolne od EDTARoche4,693,159,001
Escherichia coli BL21 (DE3)Life Technologies Thermo Fisher NaukoweC600003
glicerolVWR Chemicals Prolabo14388.29T
HEPESEuromedex10-110-C
His-trap HPGE healthcare17-5247-01
imidazolSigma-Aldrich56750-500G
MgCl2Sigma-Aldrich13452-1KG
MicroMeshes 700/25MiTeGenSKU:  M3-L18SP-25L
NaClFisher ChemicalS/3160/60
PEG8000Sigma-AldrichP5413-500G
Sonicator Vibra cell 75/15SONICS
Superdex 75 10/300 -GLGE healthcare17-5174-01
Tris baseEuromedex26-128-3094-B
TrypsynaSigma-AldrichT9201-1G
UnipuckWymiary molekularneMD7-601
NazwaFirmaNumer katalogowy>Komentarze
Programy
ISPyBESRFSolange Delageniè re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Sté phanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seá n M. McSweeney, Sté phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: system zarządzania informacją dla synchrotronowej krystalografii makromolekularnej, Bioinformatyka, tom 27, wydanie 22, 15 listopada 2011 r., strony 3186– 3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535lokalny
bezcelowyLaboratorium Biologii Molekularnej MRCEvans, P.R., Murshudov, G.N. Jak dobre są moje dane i jaka jest rozdzielczość? Acta Crystallographica Sekcja D Krystalografia biologiczna. 69 (7), 1204– 1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).
ccClusterESRFSantoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchiczne grupowanie dla eksperymentów z wielokryształową krystalografią makromolekularną: program ccCluster. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844– 1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017).Rozwój lokalny
DOZORESRFBourenkov i Popov, niepublikowanyrozwój lokalny
Przepływ pracy MeshAndCollectESRFZander, U. et al. MeshAndCollect: zautomatyzowany proces zbierania danych wielokrystalicznych dla synchrotronowych linii badawczych krystalografii makromolekularnej. Acta Crystallographica Sekcja D Krystalografia biologiczna. 71 (11), 2328– 2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015).Rozwój lokalny
MXCuBE2ESRFGabadinho, J. et al. MxCuBE: środowisko sterowania synchrotronową linią badawczą dostosowane do eksperymentów krystalografii makromolekularnej. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700– 707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24 i ndash; 226 (2014).Rozwój lokalny
XDSMax-Planck-Institut fü r Medizinische ForschungKabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Sekcja D Krystalografia biologiczna. 66 (2), 125– 132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)
rozwój

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).
  2. Henderson, R. Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  5. Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).
  6. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  7. Coquelle, N., et al. Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).
  8. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).
  9. Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G., Gordeliy, V. I. X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure. Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).
  10. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  11. Winter, G., et al. DIALS implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
  12. Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
  13. Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).
  14. Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).
  15. Zander, U., et al. Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).
  16. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  17. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).
  19. Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).
  20. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
  21. Lelimousin, M., et al. Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  22. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  23. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  24. Rhodes, G. Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam; Boston. (2006).
  25. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  26. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  27. Gabadinho, J., et al. MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).
  28. De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone. Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).
  29. Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. The use of a mini-κ goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).
  30. Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).
  31. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4, 269(1997).
  32. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  33. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  34. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  35. Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022). The orange book. , (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MeshAndCollectSerial CrystallographyX ray CrystallographyCrystal StructureCerulean ProteinPartial Data SetsMicro crystalsSynchrotron BeamlineMXCuBE SoftwareMolecular Replacement

Related Articles