Opracowanie i angiograficzne zastosowanie króliczego modelu VX2 w raku wątroby

Podsumowanie

Celem tego artykułu jest dostarczenie podstaw do rozwoju i wykorzystania modelu raka wątroby VX2 dla królika.

Streszczenie

Guz królika VX2 jest modelem zwierzęcym powszechnie wykorzystywanym do badań translacyjnych dotyczących raka wątrobowokomórkowego (HCC) w dziedzinie radiologii interwencyjnej. Model ten wykorzystuje anaplastycznego raka płaskonabłonkowego, który jest łatwo i niezawodnie rozmnażany w mięśniach szkieletowych królików-dawców w celu ostatecznego pobrania i wszczepienia alloprzeszczepu do wątroby naiwnych biorców. Ten przeszczep guza szybko rośnie w wątrobie królików biorców do identyfikowalnego angiograficznie guza charakteryzującego się martwiczym rdzeniem otoczonym żywotną torebką hipernaczyniową. Fizyczny rozmiar anatomii królika jest wystarczający, aby ułatwić oprzyrządowanie naczyniowe, co pozwala na zastosowanie i testowanie różnych technik interwencyjnych. Pomimo tych korzyści istnieje niedostatek zasobów technicznych, które mogłyby stanowić konkretny punkt odniesienia dla badaczy pracujących z modelem. W niniejszym artykule przedstawiamy kompleksowy zarys wizualny technicznych aspektów rozwoju, wzrostu, rozmnażania i angiograficznego wykorzystania modelu guza królika VX2 do użytku zarówno przez początkujących, jak i doświadczonych badaczy.

Wprowadzenie

Model guza królika VX2 odgrywa ważną rolę w onkologii eksperymentalnej od czasu jego opracowania w 1935 roku^1,2. Guz ten jest indukowanym przez wirusa anaplastycznym rakiem płaskonabłonkowym, charakteryzującym się hiperunaczynieniem, szybkim wzrostem i łatwym rozprzestrzenianiem się w mięśniach szkieletowych^3,4. Podczas gdy model guza królika VX2 został wykorzystany do zbadania wielu nowotworów^5,6,7,8; Tematem artykułu jest rak wątroby9.

Celem opisanej metody jest przedstawienie modelu pierwotnego raka wątroby lub raka wątrobowokomórkowego (HCC), który może być używany przez radiologów interwencyjnych do badań translacyjnych. Może być stosowany do badań farmakokinetycznych, badań terapeutycznych i testowania metodą ablacyjną^{10,11,12,13,14,15}.

Metoda opisana tutaj daje wiele zalet w porównaniu z innymi modelami z tej samej dziedziny, takimi jak modele gryzoni, takie jak szczury, myszy i świstaki, lub większe modele, takie jak naczelne¹⁶. Jedną z głównych korzyści jest szybki i niezawodny wzrost guza, który pozwala naukowcom ustalić aktywną linię guza w ciągu miesiąca od pierwszej propagacji kończyn tylnych¹⁷. Dodatkowo guz ten ma prostą widoczność ultrasonograficzną i peryferię przekrwienną, co pozwala zarówno na transtętnicze leczenie lokoregionalne, jak i terapie ablacyjne. Wreszcie, co najważniejsze, rozmiar układu naczyniowego królika pozwala na wykonalne i technicznie łatwe wykorzystanie oprzyrządowania naczyniowego¹⁸.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny ze wszystkimi wymaganiami i wytycznymi nałożonymi przez University of Illinois - Chicago. Został on sprawdzony i zatwierdzony przez lokalną Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania przed wykonaniem.

1. VX2 Rozwój guza kończyn tylnych

1. Zakup linii komórek nowotworowych VX2 z National Cancer Institute Division of Cancer Treatment Diagnosis and Treatment Tumor/Cell Line Repository.
   Uwaga: W tej chwili katalog zamówień można znaleźć pod następującym linkiem: https://dtp.cancer.gov/repositories/.
2. Aby przygotować zawiesinę komórek do wstrzykiwań, należy umieścić zamrożoną próbkę VX2 i pożywkę metylocelulozową w letniej wodzie do momentu rozmrożenia.
   1. Do strzykawki o pojemności 5 ml odessać 0,5\u20121 ml zawiesiny rozmrożonych komórek i równą objętość rozmrożonego podłoża metylocelulozowego.
      Uwaga: Pomocne może być użycie igły o masie 21 lub 22 G do zasysania zawiesiny komórek i igły o większej wielkości do zasysania podłoża metylocelulozowego. Umieścić strzykawki na lodzie.
3. Przygotować królika-dawcę guza kończyny tylnej do inokulacji zawiesiny komórek, rozpoczynając od sedacji przy użyciu 1 mg/kg acepromazyny i 0,02 mg/kg buprenorfiny podawanej domięśniowo. Ogolić miejsce inokulacji (kończyna tylna) maszynką do strzyżenia i ogolić ogolone za pomocą środka na bazie alkoholu lub jodu.
   Uwaga: Meloksykam może być podawany w dawce 0,2 mg/kg podskórnie w celu znieczulenia. Futro królika jest trudne do golenia. Zaleca się, aby badacz wykonał wiele przejść, najpierw skupiając się na usunięciu większości futra, a następnie dociskając maszynkę do strzyżenia do skóry i idąc pod włos.
4. Przymocować igłę 16 G do strzykawki o pojemności 5 ml zawierającej zawiesinę komórek i wstrzyknąć 1 ml zawiesiny w mięsień kończyny tylnej królika-dawcy na głębokość około 1 cm. Pamiętaj, aby chronić nerw kulszowy biegnący w wyczuwalnym rowku wzdłuż kości udowej.
   Uwaga: Fresh VX2 skutecznie zaszczepia 88% badanych, podczas gdy zamrożony i rozmrożony VX2 jest skuteczny tylko w 33% przypadków¹⁹.
   UWAGA: Guz VX2 będzie rósł szybko. Działania niepożądane, które można zauważyć w miarę postępu nowotworu, to: zwiększona częstość oddechów, letarg, zmniejszona czujność i/lub zmiany w zachowaniu (np. Niezwykła agresywność). W związku z tym zaleca się ścisłe monitorowanie zwierząt i planowanie pobrania guza w ciągu dwóch tygodni po zaszczepieniu.

2. VX2 Wzrost i zbiór guzów kończyn tylnych

Uwaga: Zakładając udaną inokulację, w ciągu 2 tygodni powinien pojawić się wyczuwalny (3\u20124 cm) guzek guza w miejscu wstrzyknięcia. Zwykle guzek ten będzie wyczuwalny palpacyjnie około 1 tygodnia; Jednak lepiej jest pozwolić guzowi rosnąć, aby umożliwić wystarczające pobranie tkanki. Zazwyczaj guzek ten będzie twardy, utwardzony i uniesiony ponad poziom mięśnia. Jeśli

1. Zbadaj palpacyjnie zaszczepiony obszar po 2 tygodniach od inokulacji. Jeśli po 2 tygodniach nie zostanie wykryty wzrost guza, ponownie wykonaj krok 1. Zobacz Rysunek 1.
   Uwaga: Obecność guza można również ocenić za pomocą ultradźwięków. Chociaż nie przeprowadzono badań oceniających różnicę w wskaźnikach wzrostu guza po rozmnażaniu z zamrożonego stada w porównaniu ze świeżym stadem, z naszego doświadczenia wynika, że zamrożony guz rośnie nieco wolniej i będzie wykrywalny po jego świeżej części zapasowej. Niezależnie od tego, każda metoda powinna dać guz nadający się do zbioru w ciągu 2 tygodni.
2. Przygotuj dawcę guza kończyny tylnej do pobrania guza. Znieczulić królika 45 mg/kg ketaminą i 5 mg/kg ksylazyną. Poddać eutanazji dożylną (IV) dawkę pentobarbitalu sodu przekraczającą 390 mg/kg.
3. Gdy królik zostanie poddany eutanazji, rozpocznij zbieranie guza, usuwając tkankę skórną i podskórną pokrywającą guzek guza za pomocą skalpela z ostrzem o dowolnym rozmiarze, który badacz uzna za stosowny. Zobacz Rysunek 2.
4. Po zidentyfikowaniu guzka nowotworowego w mięśniu kończyny tylnej należy usunąć guz en bloc za pomocą szerokich krzywoliniowych marginesów. W tym celu przetnij ścięgnane punkty przyczepu na bliższych i dalszych końcach mięśnia, a następnie prześledź ostrze skalpela wzdłuż leżącej poniżej kości. Przeciąć eksplantowaną próbkę na pół, odsłaniając torebkę nowotworową i martwiczy rdzeń. Zobacz Rysunek 3.
   Uwaga: Guz VX2 ma wysoce martwiczy rdzeń. Należy pamiętać o stosowaniu odpowiedniej ochrony oczu i innych środków ochrony osobistej podczas zbierania guza, ponieważ każde uszkodzenie torebki nowotworowej może spowodować wyrzucenie martwiczych szczątków pod wysokim ciśnieniem.
5. Delikatnie zeskrob martwiczy rdzeń przedmiotem (np. kleszczami, hemostatykami), aby oczyścić guz. Powinno to pozwolić na lepszą wizualizację torebki nowotworowej i punktu przejścia między torebką a otaczającym mięśniem. Zobacz Rysunek 4.
6. Z tej próbki zbierz kilka kawałków guza około 1\u20122 mm³ i natychmiast przechowuj je w kubku zawierającym sterylną sól fizjologiczną o temperaturze pokojowej.
   Uwaga: Te próbki guza zostaną wykorzystane do późniejszej implantacji wewnątrzwątrobowej.
7. Umieść pozostały guz na sterylnej szalce Petriego i wykąp go w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM). Jeśli próbka ta jest przechowywana w niskiej temperaturze na lodzie, można ją zachować do pracy do 2-3 godzin później.

3. Implantacja guza wątroby za pomocą laparotomii

1. Przygotuj królika biorcę do laparotomii. Znieczulić królika biorcę za pomocą 45 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny w celu indukcji, a następnie intubacji i leczenia podtrzymującego 1%-3% izofluranem w razie potrzeby. Gdy królik jest znieczulony, ogol miejsce operacji za pomocą maszynki do strzyżenia włosów. Oczyść obszar nacięcia, przemywając go trzykrotnie peelingiem betadynowym, 70% roztworem etanolu i roztworem betadyny, a następnie udrapuj brzuch w sterylny sposób chirurgiczny.
2. Używając ostrza #15, zainicjuj laparotomię, wykonując małe pionowe nacięcie linii środkowej w dół przez skórę królika, zaczynając od wyrostka mieczykowatego. Powinno to być łatwo wyczuwalne palpacyjnie i zwykle jest mniej więcej wielkości amerykańskiego pensa. Zobacz Rysunek 5.
3. Odbij skórę i zidentyfikuj kresę białą. Powinien to być odblaskowy biały pas tkanki przemieszczający się niżej w linii środkowej. Użyj rozwarstwienia, aby przejść przez linię białą i odsłonić otrzewną. Zobacz Rysunek 6.
   Uwaga: Otrzewną można łatwo zidentyfikować, ponieważ będzie ona bezpośrednio przylegać do jelita, które można zobaczyć poruszające się wraz z oddychaniem.
   UWAGA: Otrzewna ma tendencję do przylegania do leżącego poniżej jelita ze względu na napięcie powierzchniowe. Użycie urazu do wypreparowania kresy białej pomaga zmniejszyć ryzyko perforacji jelita leżącego pod spodem.
4. Po odsłonięciu otrzewnej ostrożnie ją przepreparuj, aby dostać się do jamy otrzewnej. Wątrobę można teraz zidentyfikować. Aby lepiej poruszać się po przestrzeni brzusznej, przedłuż nacięcie linii środkowej o 1–2 cm niżej przez skórę, mięśnie i otrzewną.
   Uwaga: Przedłużenie nacięcia w linii środkowej można łatwo i bezpiecznie wykonać, ostrożnie wprowadzając zakrzywiony hemostat do przestrzeni otrzewnej z zakrzywioną końcówką skierowaną powierzchownie w kierunku otrzewnej. Następnie lekko otwórz hemostat i użyj ostrza, aby przeciąć tkankę między dwoma ramionami hemostatu.
5. Zidentyfikuj lewy płat wątroby, aby wybrać miejsce do implantacji guza. Lewy płat jest dolno-boczny w stosunku do płata przyśrodkowego, który znajduje się w linii środkowej.
6. Przed próbą wyciągnięcia wątroby z przestrzeni otrzewnej umieść suchy kawałek gazy w dolnej części nacięcia.
   Uwaga: Gaza zapewni przylegającą powierzchnię, na której można położyć wątrobę, aby zapobiec jej cofaniu się do brzucha.
7. Za pomocą atraumatycznych kleszczy lub kawałka mokrej gazy na palcach ostrożnie wyciągnij lewy płat wątroby z jamy brzusznej przez nacięcie i połóż go na umieszczonej wcześniej suchej gazie. Zobacz Rysunek 7.
   UWAGA: Torebka wątroby jest wrażliwa i może łatwo pęknąć. Bardzo ważne jest, aby zachować ostrożność podczas obchodzenia się z tym narządem, aby zapobiec krwawieniu z torebki, siniakom wątroby i/lub ewentualnemu hemoperitoneum.
   Uwaga: Zwykle wątroba zgłasza się wizualnie po wejściu do przestrzeni otrzewnej; Jeśli jednak żołądek królika jest rozdęty, wątroba może zostać wypchnięta czaszkowo poza pole widzenia. W takim przypadku delikatnie unieś ścianę brzucha za pomocą sondy. W tym scenariuszu wątroba ma tendencję do przylegania do brzusznego aspektu przepony ze względu na napięcie powierzchniowe, więc ostrożnie oddziel wątrobę za pomocą sondy i powinna się odłączyć. Następnie użyj atraumatycznych kleszczy, aby wyciągnąć wątrobę.
8. W tym momencie przygotuj tkankę nowotworową do implantacji i umieść kawałek mokrej gazy na wątrobie, aby ją chronić.
9. Wybierz fragment tkanki nowotworowej o średnicy 1–³ mm, który został wygenerowany w kroku 2.6 do implantacji do wątroby. Zobacz Rysunek 8.
10. Za pomocą ostrza #11 nakłuj tkankę wątroby pod kątem 45°, tworząc kieszeń o głębokości 0,5 cm, uważając, aby nie przebić się przez grzbietową stronę torebki wątroby. Po wykonaniu nakłucia pozostaw ostrze na miejscu. Zobacz Rysunek 9.
11. Delikatnie unieś ostrze w kierunku brzusznym, aby utworzyć małą kieszeń w łożysku wątroby. Weź kawałek guza za pomocą kleszczy, umieść kawałek guza w tej kieszeni, a następnie wyjmij ostrze.
    Uwaga: Ostrze można usunąć przed włożeniem kawałka guza, jednak wątroba będzie krwawić, co może zasłaniać miejsce nakłucia, utrudniając jego identyfikację.
    UWAGA: Pamiętaj, aby zminimalizować kontakt guza z innymi strukturami, aby zapobiec niezamierzonemu wysiewowi guza. Można tego również uniknąć, odkładając na bok wszelkie narzędzia używane do pomocy przy implantacji po jej wszczepieniu.
12. W tym momencie umieść kawałek środka hemostatycznego, takiego jak pianka żelowa, na kieszonce guzowej, aby promować hemostazę i zapobiec wyrzuceniu kawałka guza
.
13. Wróć wątrobę do jamy brzusznej, po potwierdzeniu hemostazy.
14. Zamknąć ścianę brzucha szwem 3-0 polidioksanonu na igle stożkowej za pomocą prostego ściegu ciągłego i zamknąć skórę szwami 4-0 poliglaktyny 910 na igle tnącej za pomocą ciągłego ściegu podskórnego.
    UWAGA: Podczas zamykania ściany brzucha należy uważać, aby nie uszkodzić sieci lub innych struktur jelitowych podczas rzutu szwu.
    Uwaga: Chociaż guz ten potrzebuje co najmniej 2 tygodni, aby można go było ostatecznie zidentyfikować radiologicznie, osiąga on rozmiar 1,5-22 cm średnicy po 3 tygodniach wzrostu. Należy uważać, aby guz wątroby nie urósł dłużej niż 3,5–4 tygodnie, ponieważ guz utworzy masę egzofityczną i agresywnie rozprzestrzeni się lokalnie.

4. Przygotowanie zawiesiny guza VX2

1. Umieść sitko o wielkości 40 μm w otworze stożkowej probówki propylenowej o pojemności 50 ml. Używając guza z kroku 2.7, użyj ostrza #15, aby zeskrobać powierzchnię guza, aby zebrać żywy guz i umieścić te zeskrobiny w sitku.
2. Przemyć żywe zeskrobiny guza przez sitko za pomocą DMEM, a następnie odwirować probówkę propylenową z prędkością 1600 obr./min przez 8 minut.
3. Po zakończeniu wirówki usunąć supernatant i wyrzucić go. Następnie dodaj metylocelulozę do pozostałego bloku komórkowego w stosunku objętościowym 1:1.
4. Wstrzyknąć tę zawiesinę królikowi-dawcy kończyn tylnych, wykonując czynności 1.3\u20121.4. Pozostałą zawiesinę umieścić w podwielokrotnościach o objętości 1 ml w probówkach kriogenicznych i zamrozić w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania.

5. Angiograficzne wykorzystanie guza wątroby VX2

1. Przygotuj królika zgodnie z opisem w kroku 3.1.
2. Zbadaj palpacyjnie rowek udowy w pachwinie. Po zidentyfikowaniu rowka wykonaj liniowe nacięcie o długości 2\u20123 cm wzdłuż rowka. Zobacz Rysunek 10.
3. Za pomocą sekcji zlokalizuj i odizoluj pęczek kości udowej zawierający żyłę udową, tętnicę i nerw. Zobacz Rysunek 11.
4. Ponownie użyj sekcji, aby oddzielić tętnicę udową od reszty struktur w pęczku i odizoluj tętnicę na szczycie rękojeści skalpela. Zobacz Rysunek 12.
5. Z 3-francuskim zestawem wprowadzającym, wykorzystaj technikę Seldingera, aby uzyskać dostęp za pomocą igły. Włóż prowadnik i wyjmij igłę, aby wsunąć 3-francuską osłonę do naczynia. Zobacz Rysunek 13.
   UWAGA: Unikaj używania nadmiernej siły przy przesuwaniu pochewki 3-francuskiej, ponieważ może to spowodować przecięcie tętnicy udowej.
6. Pod kontrolą fluoroskopową i przy użyciu cewnika, prowadnika i środka kontrastowego johexolu wybierz pień trzewny - zwykle zlokalizowany na poziomie T12 - a następnie wsuń cewnik do lewej tętnicy wątrobowej przez wspólną wątrobową i prawidłową wątrobę.
7. W tym momencie podaj wybrany środek przez cewnik. Po podaniu środka należy usunąć cewnik.
8. Za pomocą szwu jedwabnego 3-0 podwiązać tętnicę udową proksymalnie i dystalnie do punktu wprowadzenia pochewki. Pamiętaj, aby zacisnąć węzeł proksymalnie do pochwy, gdy jest ona wycofywana, aby zapobiec krwawieniu.
9. Zamknij nacięcie pachwiny szwami 4-0 polyglactin 910 na igle tnącej za pomocą ściegu podskórnego.
10. Utrzymuj standardową opiekę pooperacyjną i monitoruj powrót zwierząt do zdrowia. W razie potrzeby przeprowadzić eutanazję i sekcję zwłok przy użyciu standardowych technik.

Wyniki

Patrząc na Rysunek 1, widać wyraźnie, że mięsień czworogłowy królika jest powiększony. Dodatkowo widocznych jest wiele małych, dyskretnych guzków, zwykle korelujących ze wzrostem guza przez powięź. W badaniu palpacyjnym kończyna, w którą wykonano wstrzyknięcie, powinna być bardziej widoczna niż kończyna, w którą nie wykonano iniekcji. Jeśli badacz wymaga bardziej ostatecznego zapewnienia o obecności guza, obrazowanie ultrasonograficzne może być wykorzystane d...

Dyskusja

Pierwszym krytycznym krokiem w metodologii leczenia guza VX2 jest pomyślne rozprzestrzenienie guza w tylnej kończynie królika-dawcy. Zapoznaj się z pierwszym akapitem w sekcji "Reprezentatywne wyniki", aby uzyskać więcej informacji na temat tego kroku.

Kolejnym krytycznym krokiem jest upewnienie się, że żywa torebka nowotworowa jest prawidłowo zidentyfikowana. Będzie to konieczne nie tylko do przygotowania zawiesiny guza, ale jest również ważne dla selekcji i generowania fragmentów guza do imp...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MethoCult (Metyloceluloza)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Linia komórkowa	NCI	VX-2
mL Strzykawka	BD	309646
16 G Igła	BD	305197
22 G Igła	BD	305155
Maszynka do strzyżenia włosów	Wahl	41870-0438
Pianka Pudełko izolowane	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazyna	Henry Schein	003845
Buprenorfina	Par	42023-179-05
Meloksykam	Henry Schein	049755
Wkładki alkoholowe	Covidien	5033
Ketamina	Henry Schein	056344
Ksylazyna	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Sterylna szalka Petriego	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-ostrzowy	Steris	02-050-015
Rękojeść skalpela x 2	Steris	22-2381
Zakrzywione kleszcze atraumatyczne
Gaza	Medline	NON21430LF
11-ostrzowa	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Stożek	Ethicon	Z305H
Vicryl / Etyka cięcia		J392H
40 μ m Filtr siatkowy	BD	352340
Rurka stożkowa 50 ml	Pipeta	339652
	Thomas Scientific	HS206371B
Wirówka	Sorvall	75004240
1,40 ml Probówki (gwint wewnętrzny)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Zestaw wprowadzający	Rozwiązania	naczynioweNa zamówienie (P15180391)
.018 Drut ślizgowy kątowy 45°	Terumo	RG*GA1818SA
Mikrocewnik Direxion w kształcie berna	Boston Scientific	M001195230
Omnipaque	GE	Y510