Pomiar i interpretacja wskaźników zużycia tlenu w całych segmentach głowy muchy

Podsumowanie

Pomiar zmian w tempie przemiany materii jest kluczowy dla zrozumienia postępu różnych chorób i starzenia się. W tym miejscu przedstawiamy nową technikę pomiaru zużycia tlenu w całej głowie, która bardziej przypomina stan fizjologiczny i może pomóc w ujawnieniu nowych leków modyfikujących aktywność mitochondriów.

Streszczenie

Regulowana aktywność metaboliczna jest niezbędna do normalnego funkcjonowania żywych komórek. Rzeczywiście, zmieniona aktywność metaboliczna jest przyczynowo związana z postępem raka, cukrzycą, neurodegeneracją i starzeniem się, żeby wymienić tylko kilka. Na przykład zmiany w aktywności mitochondriów, metabolicznej elektrowni komórki, zostały scharakteryzowane w wielu takich chorobach. Ogólnie rzecz biorąc, wskaźniki zużycia tlenu w mitochondriach uważano za wiarygodny odczyt aktywności mitochondriów, a pomiary w niektórych z tych badań opierały się na izolowanych mitochondriach lub komórkach. Jednak takie warunki mogą nie reprezentować złożoności całej tkanki. Niedawno opracowaliśmy nowatorską metodę, która umożliwia dynamiczny pomiar wskaźników zużycia tlenu z całych izolowanych głów much. Stosując tę metodę, odnotowaliśmy niższe wskaźniki zużycia tlenu w całym segmencie głowy u młodych i starszych muszek. Po drugie, odkryliśmy, że inhibitory deacetylazy lizyny szybko zmieniają zużycie tlenu w całej głowie. Nasza nowatorska technika może zatem pomóc w odkryciu nowych właściwości różnych leków, które mogą wpływać na tempo metabolizmu. Co więcej, nasza metoda może dać lepsze zrozumienie zachowań metabolicznych w konfiguracji eksperymentalnej, która bardziej przypomina stany fizjologiczne.

Wprowadzenie

Regulowana aktywność metaboliczna jest niezbędna dla przetrwania komórek i zdrowego funkcjonowania tkanki. Wykazano, że rozregulowana aktywność metaboliczna jest powiązana z początkiem i progresją różnych dolegliwości¹. Na przykład niższa aktywność metaboliczna została wcześniej opisana w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i związane z wiekiem upośledzenie pamięci^2,3. Ponadto uważa się, że dysfunkcja mitochondriów jest przyczynowo zaangażowana w proces starzenia^4,5. Z drugiej strony, wyższe tempo mitochondriów i metabolizmu opisano w komórkach nowotworowych⁶, gdzie zastosowanie inhibitorów mitochondriów zmniejszyło nowotworzenie ⁷.

Jednym z odczytów aktywności metabolicznej jest wskaźnik zużycia tlenu (OCR) w mitochondriach. Co ciekawe, tego typu odczyt uzyskuje się przede wszystkim z izolowanych mitochondriów lub komórek, stąd większość tego, co jest opisywane w literaturze, opiera się głównie na odczycie, który nie przypomina stanu fizjologicznego. Technika ta ma jednak kilka wad. Po pierwsze, protokół izolacji mitochondriów może potencjalnie uszkodzić jego integralność⁸, co może być istotnym artefaktem przy porównywaniu mitochondriów wyizolowanych z młodych i starszych tkanek⁹. Co więcej, proces izolacji jest długi i może skutkować utratą istotnych modyfikacji potranslacyjnych białek, które regulują funkcję mitochondriów^9,10,11. Co więcej, wykazano, że izolowane mitochondria nie reprezentują konsekwentnie tempa metabolizmu całych tkanek^12,13. Taka biologiczna złożoność komórkowa może być postrzegana jako "całość jest większa niż suma jej części", tj. mitochondria mogą wykazywać różne tempo metabolizmu wewnątrz złożonej komórki w porównaniu z ich tempem metabolizmu po izolacji.

Chociaż komórki mogą oferować lepszy odczyt OCR niż izolowane mitochondria, komunikacja między komórkami w kontekście całej tkanki może zostać utracona. Na przykład w mózgu aktywność metaboliczna neuronów jest w dużym stopniu zależna od aktywności metabolicznej sąsiednich komórek glejowych¹⁴. W związku z tym ustanowienie nowych technik badania OCR w całej tkance lub całych organizmach może okazać się bardziej wnikliwe w zakresie występowania i progresji różnych zaburzeń.

Ostatnio pojawiły się nowe techniki rozwiązywania tych problemów i umożliwiania pomiaru OCR z całej tkanki, segmentu lub żywych organizmów. Na przykład w niedawnej pracy opisano pomiar tlenu z mięśnia lotu chrząszcza przy użyciu podejścia z włókien przepuszczalnych z respirometrem¹⁵. Nowe aparaty do mikrorespirometrii pozwalają na pomiar OCR wysp trzustkowych^16,17. W związku z tym doniesiono, że technologia ta umożliwia pomiar OCR z całych robaków¹⁸ i Zebra fish¹⁹. Jednak obecność bariery trawiennej może stanowić wyzwanie dla testowania różnych leków w kontekście zmian OCR. Co ciekawe, ostatnie doniesienia Neville'a i współpracowników wykazały nową technikę pomiaru mózgu pojedynczej larwy marogona za pomocą płytki studziennej^20,21.

W tym badaniu użyliśmy podobnej konfiguracji, aby umożliwić pomiar całego OCR od cało- żywych i nieruchliwych Drosophila²². Technika ta oferuje również drugorzędną przewagę w mierzeniu wpływu różnych leków na aktywność metaboliczną w całym segmencie, bez konieczności przechodzenia przez barierę układu pokarmowego^13,22. Na przykład, wcześniej wykazano, że bezpośrednie wstrzyknięcie inhibitora deacetylazy lizyny (KDACi), leku, który uważa się za zmieniający mechanizm epigenetyczny w mózgu, spowodowało poprawę tworzenia wspomnień²³. Jednak dzięki zastosowaniu naszej nowatorskiej techniki odkryliśmy, że hamowanie KDAC spowodowało szybki wzrost OCR, który sam w sobie może być czynnikiem przyczyniającym się do aktywności neuronalnej. Nasz protokół zapewnia prostą i nowatorską metodę oceny wpływu różnych leków, manipulacji genetycznych czy stanów fizjologicznych (choroba, starzenie się) na OCR w kontekście całej głowy.

Protokół

1. Przygotowanie instrumentu

Uwaga: Do tego eksperymentu użyliśmy urządzenia Seahorse XF24 z "płytami wysepek". Działanie tej techniki wykorzystuje różne cykle mieszania, oczekiwania i pomiarów, a także możliwość dodawania substancji do komory pomiarowej.

1. Włącz maszynę na długo przed rozpoczęciem eksperymentu, aby było wystarczająco dużo czasu na osiągnięcie żądanej temperatury i pozostanie stabilne.
2. W ustawieniach oprogramowania (tryb administracyjny) wybierz długość kalibracji wkładu (tutaj wybrano 20 minut) i żądaną temperaturę.
   Uwaga: Podczas gdy pomiary mitochondriów lub tkanek ssaków są zwykle przeprowadzane w temperaturze 37 °C, temperatura otoczenia głowy muchy wynosi 25 °C, ale wyniki pomiarów w temperaturze 31 °C są publikowane. Użyliśmy 31 °C, ponieważ jest to najniższe ustawienie temperatury dla urządzenia w temperaturze pokojowej. Aby osiągnąć temperaturę 25 °C lub niższą, umieść maszynę w chłodniejszym pomieszczeniu lub w temperaturze 11 °C, jak ostatnio opublikowano²¹.
3. W oprogramowaniu należy zastosować następujący protokół: 3 min mieszanie – 2 min oczekiwanie – 2 min pomiaru. W zależności od projektu eksperymentalnego, dodaj etapy wtrysku z portów A-D po wybranym kroku pomiaru.
   1. W celu sprawdzenia jakości i określenia podstawowego OCR, należy odczekać co najmniej trzy cykle pomiarowe przed wstrzyknięciem pierwszego leku przez port A. Szczegółowy harmonogram protokołu można znaleźć w odnośniku Becker i wsp.¹³.

2. Przygotowanie wkładu

1. Wstępną kalibrację wkładu należy przeprowadzić dzień (lub co najmniej 4 godziny) przed badaniem. Dodać 1,0 ml Calibrant (pH 7,4) do każdego dołka i umieścić wkład czujnika na wierzchu płytki i przechowywać w temperaturze 37 °C bez CO₂ przez noc lub do 72 godzin. Zapobiegaj parowaniu wkładu z parafilmem, jeśli jest on uwodniony przez ponad 24 godziny.
2. Upewnij się, że eksperymentalne leki są dobrze rozpuszczone w pożywce (świeże podłoże + 2,5% glukozy) przed rozpoczęciem eksperymentu.
3. Zmierzyć i dostosować pH roztworu leku do pH nośnika w żądanej temperaturze, aby uniknąć jakiejkolwiek różnicy pH podczas wstrzykiwania leku.
4. Odpipetować roztwór leku do przydzielonego mu portu iniekcyjnego. Na przykład użyj 77 μl dla portu A, aby uzyskać rozcieńczenie 1:10 w roztworze o stężeniu 770 μl, a następnie 85 μl dla portu B.
5. Załaduj wkład do urządzenia i rozpocznij kalibrację.

3. Przygotowanie talerza

Uwaga: Zdecydowanie zaleca się, aby dwie osoby przygotowały talerz jednocześnie. Czas przygotowania jednej płytki na dwie osoby może wymagać ~45-60 minut.

1. Dostosuj świeżo przygotowane podłoże + 2,5% glukozy do pożądanego pH za pomocą 1 N HCl. Upewnij się, że zmiany temperatury nie mają wpływu na pH.
2. Przygotuj pojemnik na lód i połóż metalowy talerz na lodzie.
3. Otworzyć opakowanie płytki wysepek (płytki 24-dołkowej) i zanurzyć sieci na szalce Petriego (92 mm x 16 mm) z podłożem.
4. Zbierz jedną siatkę za pomocą podajnika (małego instrumentu, który mocno umieszcza siatkę w studzience) i niech podajnik stanie obok mikroskopu. Dodaj małą kroplę pożywki do siatki dołączonej do podajnika.
5. Znieczulenie much (używano tu tygodniowych lub 4-tygodniowych samców kantońskich), umieszczając muchy na lodowatej metalowej płytce.
6. Za pomocą kleszczy chwyć brzuch muchy i zanurz go w pożywce na szalce Petriego pod mikroskopem.
7. Za pomocą drugiej pary kleszczy delikatnie usuń głowę muchy. Umieść go na środku siatki przymocowanej do podajnika i sprawdź, czy głowica jest zanurzona w nośniku.
8. Wyśrodkuj głowy, gdy w siatce jest ich 16. Usuń zbędny płyn przed wyśrodkowaniem głowic, aby zapobiec utracie główek podczas umieszczania ich w studzience.
   Uwaga: Użyto 16 głowic muchowych, ponieważ liczba ta dawała wystarczające i stabilne dane w rozsądnym czasie przygotowania płytki podczas ustalania metody.
9. Za pomocą podajnika umieść siatkę w studni. Upewnij się, że głowice są uwięzione pod siatką. Powoli dodawaj 700 μl pożywki + 2,5% glukozy (Rysunek 1). Powtórz proces dla każdej ze studzienek.
   Uwaga: Zaleca się 20 dołków z próbkami głowic muchowych i 4 puste studzienki do kalibracji tła na płytkę. Upewnij się, że puste studzienki zawierają również siatkę z 700 μl buforu + 2,5% glukozy.
10. Sprawdź studzienki pod siatkami pod mikroskopem pod pęcherzykami powietrza. Delikatnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Trzymaj głowice wyśrodkowane, aby uzyskać wiarygodny odczyt OCR.
11. Dodaj płytkę do maszyny i rozpocznij pomiar.

4. Analiza pomiarów OCR

1. Na końcu protokołu wyjmij wkład.
2. W ramach kontroli jakości należy zwrócić uwagę na wszelkie widoczne resztki w wypełnieniach portu. Wyrzuć wkład i płytkę (opcja 1), jeśli głowice nie mają być używane do ekstrakcji białka, np. (patrz opcja 2).
3. Wyodrębnij pliki arkusza kalkulacyjnego i sprawdź jakość każdej studzienki pod kątem poziomu tlenu i pH. Upewnij się, że studzienki tła nie wykazują OCR i że poziom tlenu jest stabilny.
   1. Użyj algorytmu do analizy danych, z których część można wybrać w odpowiednim oprogramowaniu. Użyj algorytmu AKOS dla wartości OCR² jeśli zakres poziomów tlenu podczas całego pomiaru, między pierwszym a ostatnim wskazem (= podpomiar) jest podobny między dwiema próbkami biologicznymi, a poziom tlenu w ostatnich tyknięciach nie jest niższy niż 95 (mmHg) (OCR głowic jest wyraźnie niższy przy tym poziomie tlenu), (Rysunek 2).
   2. Niektóre warunki spowodują, że próbka wygeneruje szybki OCR i może wykazywać niższy poziom tlenu podczas 1^st tick i/lub w ostatnim ticku (anoxia) (Rysunek 3A). W takim scenariuszu należy użyć alternatywnej metody pomiaru, takiej jak algorytm FIXED. W przypadku anoksji OCR jest znacznie zmniejszony ze względu na niski poziom tlenu w roztworze. W związku z tym algorytm AKOS daje mylące odczyty.
      Uwaga: Nowsza maszyna nie ma algorytmu FIXED. Dlatego preferowane jest wyodrębnienie całkowitego poziomu tlenu i wykreślenie szybkości na czas dla pierwszych 3-5 tyknięć (Rysunek 3).

5. (Opcja 2) Analiza biochemiczna segmentu głowy

1. Aby zmierzyć właściwości biochemiczne (metabolity, proteom itp.) segmentu głowy, należy dostosować czas pracy do wymagań, jednak w każdej chwili możliwe jest przerwanie protokołu i usunięcie płytki.
2. Po wyjęciu płytki użyj niezaostrzonych kleszczy, aby zrobić otwór w siatce i usuń go, uwalniając w ten sposób głowice do pływania.
3. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml z odciętą końcówką przenieść główki do fiolki.
4. Szybko wyrzuć bufor i zatrzaskowo zamroź głowice w ciekłym azocie. Przechowuj głowice w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.

Wyniki

Możliwość rejestrowania wysokiej jakości pomiarów OCR opiera się na wyśrodkowaniu głowy w środku siatki (Rysunek 1). Jest to ważne w przypadku maszyny XF24, która ma raczej małą plamkę czujnika tlenu w porównaniu z nowszą maszyną XFe24, w której czujnik jest większy. Jak pokazano wcześniej, wyśrodkowanie głów wyświetla stały OCR przez co najmniej 20 kolejnych pomiarów u młodych much¹³.

Jednym z kluczowych aspektów korzystania z maszyn jest zastosowanie poprawnej analizy. Zaleca się sprawdzanie poziomu tlenu podczas eksperymentów. Każdy 2-minutowy pomiar jest podzielony na 10 podpomiarów (znaczników). Studnia z 16 zdrowymi głowami zwykle wykazuje ciśnienie parcjalne tlenu (pO₂) 140-170 (mmHg) dla pierwszego kleszcza. W pierwszym przykładzie porównaliśmy młode i średnie głowy muchowe (Rysunek 2A i 2B). Podczas gdy poziom tlenu spada szybciej w głowach w średnim wieku, obserwowana różnica jest niewielka (Ryc. 2A). Co więcej, zakres poziomów tlenu jest podobny w różnych warunkach, od 165 podczas pierwszego tykania do 120 podczas ostatniego tyknięcia. W takim przypadku lepiej jest użyć algorytmu AKOS do automatycznego wygenerowania OCR (pmol/min)², który niezawodnie odzwierciedla spadek poziomu tlenu między młodymi i średnimi głowami (Rysunek 2B). Warto zauważyć, że program analityczny przez maszynę automatycznie wybiera algorytm AKOS.

Jednakże, na podstawie naszych obserwacji, automatyczne użycie algorytmu AKOS może dać mylące, jeśli nie przeciwstawne wyniki dla prawidłowego OCR. Takie artefakty mogą być generowane w warunkach, w których próbka o dużym zużyciu osiąga anoksję^13,22. Na przykład dodanie maślanu sodu (SB), inhibitora KDAC, przejściowo zmienia dynamikę poziomu tlenu (Rysunek 3A). Podczas gdy elementy sterujące pojazdu pokazują stały poziom tlenu podczas pierwszego i ostatniego tyknięcia, dodanie SB powoduje znaczny i przejściowy spadek poziomu tlenu w tych tyknięciach (Rysunek 3A). SB sam w sobie nie zmienia poziomu tlenu w studzienkach tła, w których nie są dodawane żadne głowice (dane nie pokazane). Dane potwierdzają pogląd, że SB zwiększa zużycie tlenu. Ponieważ pobieranie pierwszego wskazu jest opóźnione (12 sekund do zarejestrowania pierwszego wskazu w fazie pomiaru), pierwszy punkt danych znajduje się już niżej w studzienkach poddanych działaniu SB. W związku z tym trudno jest uchwycić wczesne zmiany w zużyciu tlenu po dodaniu tego inhibitora HDAC. Ponadto poziomy tlenu w próbkach poddanych działaniu SB są obniżone do już niskiego poziomu (anoksja), na co wskazuje pobranie ostatnich kleszczy. W momencie niedotlenienia głowice spowalniają zużycie tlenu w ostatnich tyknięciach (Rysunek 3A). Ponieważ obliczenia AKOS uwzględniają wszystkie ticki i ignorują stan beztlenowy, generują wprowadzający w błąd OCR. Rzeczywiście, nieznormalizowane poziomy OCR oparte na AKOS wykazują niewielkie zmiany po wstrzyknięciu (linia przerywana) portu A (Veh/SB) (Rysunek 3B).

Normalizacja poziomów OCR do pomiaru przed wstrzyknięciem na podstawie AKOS ujawnia bardzo podobne poziomy OCR przed i po wstrzyknięciu portu A, który nie obsługuje zmian poziomu tlenu (Rysunek 3A). W tych okolicznościach zalecany jest algorytm FIXED, który bardziej modeluje/przypomina OCR i zmiany poziomu tlenu (Rysunek 3C). W związku z tym znormalizowany pomiar oparty na algorytmie FIXED ujawnia zwiększony OCR po leczeniu SB (Rysunek 3C).

Wadą nowej maszyny jest brak algorytmu FIXED. Dlatego w eksperymentach, w których stosuje się silnie zużywającą próbkę/zabieg, zaleca się ręczne obliczanie pomiarów OCR i obliczanie spadku poziomu tlenu w czasie dla pierwszych 3-5 tyknięć w każdym pomiarze.

Rysunek 1. Przykład studni zawierającej 16 jednotygodniowych głów samców much. Głowice są wyśrodkowane poniżej siatki i unoszą się w mediach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Reprezentatywny przykład porównania pomiaru OCR między jednotygodniowymi główkami muchowymi (młodymi) a czterotygodniowymi (w średnim wieku). (A) Poziomy tlenu są pokazane dla trzech oddzielnych pomiarów; Każdy 2-minutowy pomiar jest podzielony na dziesięć podpomiarów (znaczników). (B) Kwantyfikacja (A). Poziomy pierwszego i ostatniego tyknięcia są podobne, chociaż poziomy próbki w średnim wieku są nieco niższe. Kwantyfikacja nachylenia spadku poziomu tlenu służy do generowania poziomów OCR. Jak wcześniej opisano²², OCR much w średnim wieku jest o 10%-15% wyższy niż u młodych much. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Przykład zmiany OCR przez maślan sodu (SB) u młodych głów much. (A) Poziomy tlenu zarejestrowane w siedmiu pomiarach po dodaniu 15 mM SB. Linia przerywana oznacza wstrzyknięcie leku (lub pojazdu) z portu A. Warto zauważyć, że podczas gdy poziomy tlenu w kleszczach 1 i 10 pozostają stabilne w grupie kontrolnej (niebieski), poziomy tlenu podczas tych kleszczy są przejściowo (sześć pomiarów po wstrzyknięciu) zmniejszone w próbkach poddanych działaniu SB (pomarańczowy). Ponadto spadek poziomu tlenu jest znacznie zmniejszony podczas ostatnich tyknięć próbek poddanych działaniu SB. N=3 na grupę (B) [Po lewej] Nieznormalizowane poziomy OCR obliczone na podstawie algorytmu AKOS. Obliczenia nieprawidłowo pokazują podobne poziomy OCR przed i po wstrzyknięciu SB przez port A. [Po prawej] Normalizacja OCR do pomiaru przed wstrzyknięciem portu A. (C) [Po lewej] "Stałe" obliczanie algorytmu (A) pokazujące nieznormalizowany OCR. W tym przypadku OCR ściśle reprezentuje przejściowy wzrost zużycia tlenu przez głowice po leczeniu SB; [Po prawej] Normalizacja OCR do pomiaru przed wstrzyknięciem portu A. Słupki błędów wskazują S.E.M. na wszystkich wykresach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Nasza nowa technika oferuje nowatorskie podejście do badania zmian metabolicznych związanych ze starzeniem się i chorobami w kontekście całych segmentów głowy muchy²². Metoda może być również odpowiednia do badania wpływu maślanu sodu KDAC na zużycie tlenu. Jak wykazaliśmy, inhibitory deacetlyazy lizyny (HDAC/KDAC) powodują zmiany OCR. Zasadniczo, ponieważ cele takich inhibitorów zwykle nie są zlokalizowane w mitochondriach (inhibitory te nie wpływają na deacetylazy klasy III, sirtuiny)²⁴, takie leki można było testować tylko na poziomie co najmniej tkankowym. Rzeczywiście, różne leki są wstrzykiwane bezpośrednio do mózgu, omijając w ten sposób ewentualne przetwarzanie/modyfikację/inaktywację przez układ trawienny. W związku z tym nasza technika oferuje nowy wgląd w to, w jaki sposób takie leki bezpośrednio wpływają na segment głowy.

Istnieje kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, jak stwierdzono w protokole, zdecydowanie zalecamy przygotowanie talerza w ciągu jednej godziny, przy czym dwie pary rąk przygotowują talerz. Z naszego doświadczenia wynika, że jakość i stabilność pomiarów OCR jest lepsza, gdy są przygotowywane w odpowiednim czasie. Gdy trwa to zbyt długo, zwiększa się występowanie dołków o niskim OCR, a także krótszy czas trwania stabilnego OCR. Po drugie, ważne jest, aby przeprowadzić kontrolę jakości i upewnić się, że warunki eksperymentalne między różnymi próbkami są podobne (pH, poziom tlenu). Wreszcie, krytycznym krokiem jest wybór odpowiedniego algorytmu do analizy próbek. Jak wykazaliśmy, domyślny algorytm AKOS dawał mylące, a czasem przeciwstawne obliczenia w próbkach, które zużywały tlen w wysokim tempie¹³. W związku z tym podkreślamy znaczenie sprawdzania surowych danych pod kątem poziomu tlenu i porównywania wynikowych OCR.

Obecnie istnieje kilka ograniczeń związanych z tą techniką. W temperaturze pokojowej maszyna nagrzewa się do 31 °C (jest to minimalna temperatura pomiaru, gdy maszyna znajduje się w temperaturze pokojowej), co może stanowić stan naprężenia dla głowic muchowych²⁵. Można temu jednak zaradzić, umieszczając maszynę w chłodni, co umożliwi pomiary w temperaturze 25 °C, a tym samym bez ewentualnego naprężenia cieplnego głowic muchowych. Ostatnie doniesienia wykazały, że maszyna jest ustawiana w temperaturze 11 °C, co umożliwia rejestrację much w temperaturze OCR w temperaturze 25 °C²¹. Niemniej jednak separacja głowy muchy powinna być wykonywana w temperaturze pokojowej. Co więcej, wahania temperatury utrudniają kontrolowanie zmian pH, dlatego zdecydowanie zaleca się testowanie wpływu warunków fizjologicznych/leków na OCR przy użyciu podobnych konfiguracji eksperymentalnych. Ponadto nie ustalono jeszcze udziału zużycia tlenu w mechanizmach nieniezależnych od mitochondriów²⁶. Dzięki zastosowaniu różnych inhibitorów układu oddechowego, które są skuteczne w głowach much, możliwe byłoby ustalenie takich niemitochondrialnych wskaźników zużycia tlenu.

Warto zauważyć, że różne choroby ssaków charakteryzują się zmianami w metabolizmie energetycznym. Wśród nich są choroby, które charakteryzują się albo zmniejszeniem metabolizmu, takim jak choroba Alzheimera, albo przeprogramowaniem metabolicznym, takim jak rak. Co ciekawe, inhibitory KDAC są stosowane zarówno w chorobie Alzheimera, jak i w leczeniu raka²⁷. Podczas gdy dokładne mechanizmy, za pomocą których inhibitory KDAC osiągają aspekt terapeutyczny, pozostają niejasne, dane z naszej techniki wspierają nowatorski pogląd, że takie inhibitory mogą modulować metabolizm.

Podsumowując, metoda ta jest cenna do pomiaru ogólnych wskaźników zużycia tlenu in vivo i dokładniej pokazuje wpływ leku na ogólny metabolizm, który może zostać pominięty w izolowanych protokołach mitochondriów¹². Na przykład, wyniki uzyskane tą metodą, a nie poprzednimi technikami, pozwoliły na uzyskanie nowych informacji na temat związanej z wiekiem elastyczności metabolicznej podczas leczenia KDAC. Chociaż konieczne są dodatkowe prace w celu optymalizacji warunków eksperymentalnych dla głów much, połączenie naszej techniki i odpowiedniej analizy może prowadzić do dalszego wyjaśnienia aktywności mitochondriów w kontekście całych żywych tkanek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glukoza	Sigma-Aldrich	G8644	D-(+)-Roztwór glukozy 100 g/L w H2O, sterylnie filtrowany
test XF Podłoże	Agilent	103575-100	Seahorse XF DMEM Pożywka, pH 7,4
Maślan sodu	Merck	817500	Rozpuszczony w buforze do oznaczania XF
Analizator Seahorse XF24/e24	Agilent
	XF24/e24Agilent	100850-001	Kartridż
XF24/e24 Mikropłytki do przechwytywania wysepek	Agilent	101122-100	Narzędzie
do wstawiania ekranu przechwytywania konika morskiego	Agilent	101135-10	Wkładka
Petriego	Sarstedt	821,472	Petriego 92 x 16 mm