Artykuł metodologiczny

Fotowybielanie umożliwia obrazowanie pierścienia FtsZ w Cyanobacterium prochlorococcus w superrozdzielczości

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58603

⸱

6 listopada 2018

 ,  , 
1Department of Ocean Science, Hong Kong University of Science and Technology, 2Division of Life Science, Hong Kong University of Science and Technology, 3HKUST Shenzhen Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę fotowybielania w celu zmniejszenia autofluorescencji sinic. Po fotowybielaniu stosuje się stochastyczną mikroskopię rekonstrukcji optycznej w celu uzyskania trójwymiarowych obrazów pierścienia FtsZ cyjanobakterii o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Mikroskopia superrozdzielcza jest szeroko stosowana do badania interakcji białek i struktur subkomórkowych w wielu organizmach. Jednak w organizmach fotosyntetyzujących rozdzielczość boczna obrazowania w superrozdzielczości wynosi tylko ~100 nm. Niska rozdzielczość wynika głównie z wysokiego tła autofluorescencji komórek fotosyntetycznych spowodowanego przez lasery o wysokiej intensywności, które są wymagane do obrazowania w superrozdzielczości, takiego jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM). W tym miejscu opisujemy metodę STORM wspomaganą fotowybielaniem, która została niedawno opracowana do obrazowania morskich picocyanobacterium Prochlorococcus. Po fotowybielaniu autofluorescencja Prochlorococcus jest skutecznie redukowana, dzięki czemu STORM można wykonać z rozdzielczością boczną ~10 nm. Za pomocą tej metody uzyskujemy in vivo trójwymiarową (3-D) organizację białka FtsZ i charakteryzujemy cztery różne morfologie pierścieni FtsZ podczas cyklu komórkowego Prochlorococcus. Metoda, którą tutaj opisujemy, może zostać zastosowana do obrazowania w superrozdzielczości innych organizmów fotosyntetyzujących.

Wprowadzenie

Mikroskopie super-rozdzielcze mogą przekroczyć limit dyfrakcji światła i dostarczyć obrazy w rozdzielczościach subdyfrakcyjnych (< 200 nm). Są szeroko stosowane w wielu organizmach do badania lokalizacji białek i struktur subkomórkowych. Główne metody mikroskopii superrozdzielczej obejmują mikroskopię oświetlenia strukturalnego (SIM), mikroskopię zubożenia emisji wymuszonej (STED), STORM i mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotoaktywowaną (PALM). Mechanizmy i zastosowania tych mikroskopów o wysokiej rozdzielczości zostały omówione gdzie indziej1,2.

STORM może osiągnąć rozdzielczość tak wysoką jak 10 nm dzięki separacji przestrzennej3,4. W przypadku STORM tylko jedna cząsteczka w obszarze ograniczonym dyfrakcją jest aktywowana ("włączona"), a reszta cząsteczek jest utrzymywana w stanie nieaktywnym ("wyłączonym"). Poprzez akumulację szybkiego włączania i wyłączania pojedynczych cząsteczek można wygenerować obraz "nieograniczony dyfrakcyjnie"3. Tymczasem w STORM ma zastosowanie wiele rodzajów barwników organicznych i białek fluorescencyjnych, co pozwala na łatwą aktualizację ze zwykłej mikroskopii fluorescencyjnej do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości5,6.

STORM nie był szeroko stosowany w komórkach fotosyntetycznych, takich jak cyjanobakterie, glony i komórki roślinne z chloroplastami7,8, co wynika z faktu, że STORM wymaga dużej intensywności lasera do sterowania fotoprzełączaniem. Laser o wysokiej intensywności niekorzystnie wzbudza silne tło autofluorescencji w komórkach fotosyntetycznych i zakłóca lokalizację pojedynczej cząsteczki w obrazowaniu STORM. Aby wykorzystać STORM do zbadania struktur subkomórkowych lub interakcji białkowych w komórkach fotosyntetycznych, opracowaliśmy protokół fotowybielania w celu wygaszenia sygnałów autofluorescencji tła9. W rutynowej procedurze barwienia immunofluorescencyjnego próbki są wystawiane na działanie białego światła o dużym natężeniu podczas etapu blokowania, co obniża autofluorescencję komórek fotosyntetycznych, aby spełnić wymagania STORM. W związku z tym protokół ten umożliwia badanie organizmów barwnikowych za pomocą STORM.

Tutaj opisujemy protokół korzystania z STORM do obrazowania organizacji pierścienia FtsZ w jednokomórkowym picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ jest wysoce konserwatywnym białkiem cytoszkieletu podobnym do tubuliny, które polimeryzuje, tworząc strukturę pierścieniową (pierścień Z) wokół obwodu komórki10 i jest niezbędne do podziału komórki11. Zachowane komórki Prochlorococcus są najpierw fotowybielane w celu zmniejszenia tła autofluorescencyjnego i barwione immunologicznie pierwszorzędowym przeciwciałem anty-FtsZ, a następnie drugorzędowe przeciwciało anty-IgG królika (H+L) jest sprzężone z fluoroforem (np. Alexa Fluor 750). Ostatecznie STORM jest używany do obserwacji szczegółowych organizacji pierścieni FtsZ w Prochlorococcus na różnych etapach cyklu komórkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie i utrwalenie próbki

  1. Zaszczepić 1 ml aksenu Prochlorococcus MED4 do 5 ml Pro99 na bazie wody morskiej Pro99 pożywka12. Hodować kultury Prochlorococcus w temperaturze 23 °C pod światłem z intensywnością 35 μmol fotonów/m2s. Pięć dni później zbierz 1 ml kultury do probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Pięć dni po inokulacji Prochlorococcus MED4 osiągnie późną fazę logarytmiczną, z około 108 komórkami/ml, co jest odpowiednie do obrazowania STORM.
  2. Dodaj 100 μl formaldehydu świeżo przygotowanego z 25% paraformaldehydu (PFA) (w/v) i 2 μl 50% aldehydu glutarowego do probówki o pojemności 1,5 ml, aby utrwalić kulturę. Próbkę inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 min.
    UWAGA: Próbka była przechowywana w ciemności w celu utrwalenia, ponieważ aldehyd glutarowy jest wrażliwy na światło.
  3. Odwirować próbkę o masie 13 500 x g przez 1 minutę, następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl Pro99 medium12. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C do momentu barwienia immunologicznego.

2. Wstępne pokrycie szkiełka nakrywkowego kulkami polistyrenowymi

UWAGA: Koraliki polistyrenowe są uważane za znacznik odniesienia do korekcji dryfu.

  1. Zwiruj oryginalną fiolkę z kulkami polistyrenu i przygotuj rozcieńczenie 1:20 000 z 50% etanolem jako zawiesiną roboczą.
  2. Włącz płytę grzejną, ustaw temperaturę na 120 °C i umieść szkiełka nakrywkowe na płycie grzejnej.
  3. Załadować 100 μl zawiesiny roboczej na każde szkiełko nakrywkowe. Inkubować szkiełko nakrywkowe na płycie grzejnej przez 10 minut, a następnie ostrożnie przenieść szkiełka nakrywkowe na szalki Petriego w celu przechowywania w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Strona z przymocowanymi do niej koralikami powinna być skierowana do góry, a komórki powinny być przymocowane po tej samej stronie. Kulki są unieruchomione na szkiełkach nakrywkowych i wykorzystywane do korygowania dryfu próbki w czasie rzeczywistym podczas obrazowania STORM. Po unieruchomieniu koralików szkiełka nakrywkowe nie mogą zostać podpalone.

3. Powlekanie poli-L-lizyny na szkiełku nakrywkowym pokrytym koralikami

UWAGA: To jest zrobione w celu unieruchomienia komórek sinic

.
  1. Dodać 100 μl poli-L-lizyny (1 mg/ml) na środek szkiełka nakrywkowego stroną pokrytą kulkami skierowaną do góry. Pozostaw na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Za pomocą pipety ostrożnie zaaspiruj niepodłączoną poli-L-lizynę i przenieś ją do probówki o pojemności 1,5 ml. Zachowaj poli-L-lizynę w temperaturze 4 °C do ponownego użycia.
  3. Opłucz szkiełko nakrywkowe 10 ml ultrafiltrowanej wody na 60-milimetrowej szalce Petriego, a następnie krótko osusz szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym.
  4. Przechowywać szkiełko nakrywkowe na szalce Petriego (100 mm) do późniejszego wykorzystania. Aby zapobiec przyklejeniu się szkiełka nakrywkowego do naczynia, wyłóż szalkę Petriego warstwą parafilmu.
    UWAGA: Szkiełko nakrywkowe, wstępnie pokryte koralikami i poli-L-lizyną, może być przechowywane w temperaturze pokojowej przez co najmniej pół roku. Dlatego zdecydowanie zaleca się wcześniejsze przygotowanie partii szkiełek nakrywkowych.

4. Unieruchomienie komórek na szkiełku nakrywkowym

  1. Przenieść wstępnie powleczone szkiełko nakrywkowe na nową szalkę Petriego z parafilmem na dnie, która będzie odtąd nazywana naczyniem barwiącym. Załadować 100 μl utrwalonej próbki na szkiełko nakrywkowe i pozostawić na 30 minut, aby umożliwić przyłączenie komórek.
  2. Przenieś szkiełko nakrywkowe do dołka na 12-dołkowej płytce, która będzie odtąd nazywana naczyniem do mycia. Dodać 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl i 2,7 mM KCl, pH 7,4) do studzienki, aby przepłukać szkiełko nakrywkowe. Usuń bufor PBS i dodaj nowy bufor PBS, aby ponownie umyć szkiełko nakrywkowe.

5. Permeabilizacja komórek sinic

  1. Usuń bufor PBS za pomocą pipety. Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego buforu permeabilizacyjnego do studzienki naczynia do mycia, który zawiera 0,05% niejonowego detergentu-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8,0) i 0,2 mg/ml lizozymu.
  2. Inkubować naczynie do mycia w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie usuń bufor przepuszczalności.
  3. Dodać 1 ml buforu PBS i umieścić naczynie do mycia na shakerze, który delikatnie potrząsa naczyniem do mycia przez 5 minut. Usuń bufor PBS. Powtórz ten krok 3 razy, aby umyć szkiełko nakrywkowe.

6. Fotowybielanie pigmentów chlorofilu w etapie blokowania

  1. Przenieś szkiełko nakrywkowe do naczynia do barwienia. Dodać 50 μl buforu blokującego, który zawiera 0,2% (v/v) niejonowego detergentu-100 i 3% (v/v) koziej surowicy, na wierzch szkiełka nakrywkowego.
  2. Umieść całą płytkę barwiącą na lodzie i przenieś ją pod ksenonowym źródłem światła w celu fotowybielania przez co najmniej 60 minut, przy natężeniu światła 1 800 μmol fotonów/m2·s.
  3. Po fotowybielaniu i blokowaniu ostrożnie usuń bufor blokujący, adsorbując go krawędzią ręcznika papierowego.
    UWAGA: Intensywność światła ksenonowego jest tak duża, że do ochrony oczu potrzebna jest para odpowiednich okularów przeciwsłonecznych. W międzyczasie owiń źródło światła i płytkę folią aluminiową, aby uniknąć wycieku światła, które może spowodować uszkodzenie oczu. Sprawdzaj szkiełko nakrywkowe co 15 minut, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe pozostaje wilgotne. Jeśli szkiełko nakrywkowe jest suche, dodać 50 μl buforu blokującego.

7. Wiązanie przeciwciał

  1. Przeciwciało anty-Anabaena FtsZ rozpuścić w 200 μl wody zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Rozcieńczyć 1 μl przeciwciała anty-FtsZ w 99 μl buforu blokującego. Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  3. Przenieś szkiełko nakrywkowe do naczynia do mycia. Dodaj 1 ml buforu PBS i umieść naczynie do mycia na shake'u. Delikatnie potrząsaj naczyniem myjącym przez 5 minut. Powtórz ten krok 3 razy, aby umyć szkiełko nakrywkowe.
  4. Przenieś szkiełko nakrywkowe do naczynia do barwienia. Rozcieńczyć 1 μl przeciwciała drugorzędowego w 500 μl buforu blokującego. Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego na szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieś szkiełko nakrywkowe do naczynia do mycia. Przemyj go 1 ml buforu PBS na shakerze. Delikatnie potrząsaj naczyniem myjącym przez 5 minut. Owiń naczynie do mycia papierem aluminiowym, aby było odporne na światło. Powtórz ten krok 3 razy.
  6. Dodać 500 μl formaldehydu świeżo przygotowanego z 4% paraformaldehydu (PFA) (w/v) do studzienki. Inkubować szkiełko nakrywkowe przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  7. Usuń formaldehyd i powtórz krok prania 3x.
  8. Przechowywać szkiełko nakrywkowe w buforze PBS w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu wykonania obrazowania.

8. Przygotowanie bufora obrazowania STORM

  1. Przygotować 1 ml buforu obrazowego zgodnie z Tabelą 1, bezpośrednio przed obrazowaniem STORM.
    UWAGA: Ponieważ okres trwałości bufora do obrazowania wynosi około 2 godzin, należy przygotować go na świeżo, tuż przed użyciem. Unikać wirowania po dodaniu oksydazy glukozowej i katalazy.
    UWAGA: Wioligogen metylowy jest materiałem trującym. Prosimy obchodzić się z nim ze szczególną ostrożnością. Cyklooktatetraen jest klasyfikowany jako rakotwórczy kot. 1 substancja chemiczna. Należy unikać wdychania i kontaktu ze skórą, a roztwór podstawowy cyklooktatetraenu i bufor do obrazowania należy przygotować w kapturze chemicznym.

9. Akwizycja obrazu danych STORM

  1. Załaduj szkiełko nakrywkowe do komory załadowczej (Rysunek 1). Świeżo przygotowany bufor do obrazowania należy delikatnie załadować do komory, aby uniknąć zmycia komórek sinicowych. Umieść prostokątne szkiełko nakrywkowe na górze bufora obrazowania, aby zapobiec jego reakcji z tlenem w powietrzu. Unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym.
  2. Włącz kamerę, światło LED i laser. Otwórz oprogramowanie STORM do akwizycji obrazu, wyznaczania położenia środka ciężkości i korekcji dryfu próbki13.
  3. Dodaj pół kropli olejku immersyjnego na wierzch soczewki. Załaduj komorę i upewnij się, że soczewka obiektywu styka się ze szkiełkiem nakrywkowym.
  4. Zbadaj sygnał za pomocą lasera 750 nm.
    UWAGA: Zawsze dołączaj drugą kontrolę ujemną bez barwienia przeciwciała, aby upewnić się, że autofluorescencja jest zmniejszona.
  5. Zidentyfikuj obszar próbki, który zawiera zarówno komórki, jak i znaczniki odniesienia. Uruchom oprogramowanie do korekcji dryftu próbki.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, idealny obszar próbki zawiera od 10 do 30 komórek. W międzyczasie komórki powinny być dobrze oddzielone, aby uniknąć nakładania się komórek.
  6. Uzyskaj jeden obraz szerokokątny jako odniesienie, ze wzmocnieniem zwielokrotnienia elektronów (EM) kamery na poziomie 300 i czasem naświetlania 30 ms (Rysunek 2A).
  7. Zwiększ intensywność lasera wzbudzającego 750 nm do wyższej mocy, około 4.5 kW/cm2. Gdy fluorofory przejdą w rzadki wzór mrugania, uzyskaj jeden obraz o super rozdzielczości, zbierając 10 000 klatek przy 33 Hz (Rysunek 2B).
    UWAGA: Jeśli fluorofory nie są wyizolowane, odczekaj kilka minut, aż więcej fluoroforów zostanie przełączonych w stan ciemny, a wyizolowane pojedyncze cząsteczki zaczną sekwencyjnie migotać. Opisana tutaj liczba ramek jest odpowiednia dla naszej próbki i musi zostać zoptymalizowana pod kątem innych docelowych konstrukcji.

10. Rekonstrukcja obrazów o wysokiej rozdzielczości na podstawie surowych danych

  1. Użyj wtyczki o nazwie QuickPALM (Table of Materials)14 w ImageJ, aby zrekonstruować kolorowy obraz 3D o wysokiej rozdzielczości.
    UWAGA: Pojawi się wstępny obraz chromatyczny (Rysunek 2C) wraz z kolorowym paskiem skali (Rysunek 2C). Kolor reprezentuje głębokość na osi z.
  2. Aby zademonstrować strukturę 3D w filmie, skonstruuj stos obrazów o wysokiej rozdzielczości z osią z przekrojami co 10 nm za pomocą QuickPALM14. Dostosuj jasność stosów i zduplikuj stos jednej komórki docelowej. Użyj wtyczki o nazwie 3D Viewer (Table of Materials)15 w ImageJ, aby wygenerować obraz 3D komórki. Nagraj obrót struktury 3D w celach demonstracyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Technika STORM umożliwia obrazowanie w superrozdzielczości poprzez stochastyczną aktywację pojedynczych fluoroforów fotoprzełączalnych. Pozycja każdego fluoroforu jest rejestrowana, a następnie na podstawie tych lokalizacji konstruowany jest obraz w superrozdzielczości4. Z tego względu precyzja lokalizacji fluoroforu jest kluczowa dla rekonstrukcji obrazu w superrozdzielczości. Widma absorpcyjne Prochlorococcus osiągają maksimum przy 447 nm i 680 nm, a

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole opisaliśmy procedurę znacznego zmniejszenia autofluorescencji cyjanobakterii Prochlorococcus (ryc. 3C), a następnie barwienia immunologicznego białek w komórkach, co umożliwiło nam wykorzystanie STORM do badania morfologii pierścienia 3-D FtsZ w Prochlorococcus (ryc. 4). Protokół ten może zostać przyjęty do obrazowania w superrozdzielczości u innych organizmów fotosyntetycznych.

Wcześniejsze badania n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Daiying Xu za pomoc techniczną i komentarze do manuskryptu. Badania te są wspierane przez granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (numer projektu 41476147) oraz Rady ds. Grantów Badawczych Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkongu w Chinach (numery projektów 689813 i 16103414).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cząstki polistyrenuSpherotechPP-20-102,0-2,4 &mikro;
m Szkiełko nakrywkoweMarienfeld011158018 mm &puste;, Grubość nr 1
EtanolScharlauET00021000
Bromowodorek poli-L-lizynySigma-AldrichP9155mol wt 70 000-150 000
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
Roztwór aldehydu glutarowego, 50%Sigma-Aldrich340855
PBSSigmaP3813
Triton X-100SigmaT8787
EDTA Sól disodowa, 2-hydratZłoto biotechnologiaE-210-500
Baza TrizmaSigmaT1503
LizozymSigmaL6876
Surowica koziaSigmaG9023
anty- Anabaena Przeciwciało FtsZAgriseraAS07217
Kozia anty-królicza IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciałowtórne Life TechnologiesA-21039sprzężone z Alexa Fluor 750
D-glukoza bezwodnaFisher ScientificD16-1
Kwas L-askorbinowySigma-AldrichA5960
Viologen metylowySigma-Aldrich
CyklooktatetraenSigma-Aldrich138924
tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP)Sigma-Aldrich646547
Oksydaza glukozowaSigma-AldrichG2133
KatalazaSigma-AldrichC9322
XD-300 Mikroskop ksenonowy250 W
STORMNBISRiS
RohdeaNBISRiS 3.0oprogramowanie do akwizycji obrazowania
LunaNBISRiS 3.0oprogramowanie do korekcji dryfu
QuickPALMhttps://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewerhttp://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home
856177 Mikroskop

Bibliografia

  1. Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
  2. Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  4. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  5. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
  6. Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  7. Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
  8. Schubert, V. Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531(2017).
  9. Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657(2017).
  10. Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
  11. Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
  12. Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
  13. Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879(2015).
  14. Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
  15. Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).
  16. Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
  17. Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
  18. Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
  19. Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
  20. Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
  21. Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser? Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
  22. Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
  23. Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

STORM wspomagany fotoblakowaniemmorfologia pier cienia FtsZProchlorococcus MED4redukcja autofluorescencjiobrazowanie 3D STORMlokalizacja bia ekdynamika cyklu kom rkowegoorganizmy fotosyntetyzuj cewzbudzanie laserowe

Powiązane artykuły