Chłonne pobieranie próbek mikrobiopsji i ekstrakcja RNA do minimalnie inwazyjnej, jednoczesnej analizy krwi i skóry

Podsumowanie

W tym artykule pokazujemy, jak przeprowadzana jest technika mikrobiopsji absorpcyjnej i jak próbka może być wykorzystana do ekstrakcji RNA w celu prostego i jednoczesnego pobierania próbek skóry i krwi w minimalnie inwazyjny sposób.

Streszczenie

Konwencjonalna biopsja skóry ogranicza badania kliniczne, które obejmują obszary wrażliwe kosmetycznie lub zastosowania pediatryczne, ze względu na swoją inwazyjność. W tym miejscu opisujemy protokół stosowania chłonnego urządzenia na bazie mikroigł, mikrobiopsji chłonnej, do minimalnie inwazyjnego pobierania próbek mieszanki skóry i krwi. Naszym celem jest ułatwienie szybkiego postępu w badaniach klinicznych, ustanowienie biomarkerów chorób skóry i zmniejszenie ryzyka dla uczestników badań klinicznych. W przeciwieństwie do konwencjonalnych technik biopsji skóry, mikrobiopsję chłonną można wykonać w ciągu kilku sekund i nie wymaga intensywnego szkolenia ze względu na prostą konstrukcję. W niniejszym raporcie opisujemy zastosowanie mikrobiopsji chłonnej, w tym ładowanie i aplikację, na ochotniku. Następnie pokazujemy, jak wyizolować RNA z wchłoniętej próbki. Na koniec pokazujemy zastosowanie ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) do ilościowego określenia poziomów ekspresji mRNA zarówno we krwi (CD3E i CD19), jak i skórze (KRT14 i TYR). Metody, które opisujemy, wykorzystują gotowe zestawy i odczynniki. Protokół ten oferuje minimalnie inwazyjne podejście do jednoczesnego pobierania próbek skóry i krwi w tej samej chłonnej matrycy mikrobiopsji. Odkryliśmy, że komisje bioetyczne, klinicyści i wolontariusze popierają to podejście do badań dermatologicznych.

Wprowadzenie

Biopsja skóry jest jedną z najważniejszych technik w dermatologii do pobierania próbek skóry i późniejszej diagnozy chorób skóry poprzez ocenę histopatologiczną. Technika biopsji polega na tym, że lekarz używa biopsji ostrza lub stempla w celu usunięcia podejrzanej zmiany na skórze pacjenta do badania¹. Chociaż technika ta jest skuteczna, jest wysoce inwazyjna i ogranicza badania kliniczne, ponieważ punkt końcowy zwykle obejmuje techniki biologii molekularnej^2,3. Analiza molekularna chorób skóry może dostarczyć bardzo specyficznych informacji biologicznych, których nie może dostarczyć analiza histopatologiczna, ułatwiając w ten sposób odkrywanie leków i diagnozowanie chorób^4,5. Poza tym zapotrzebowanie na próbki w większości technik molekularnych jest stosunkowo niewielkie i może prowadzić do zmniejszenia wykorzystania zwierząt i pozwolić na większą liczbę powtórzeń. W związku z tym istnieje wyraźna potrzeba opracowania alternatywnej techniki, która umożliwi analizę molekularną w badaniach klinicznych i obniży ryzyko dla uczestników.

Aby zaspokoić taką potrzebę w terenie, nasza grupa opracowała nowatorską platformę diagnostyczną opartą na mikroigłach, mikrobiopsję absorpcyjną, która umożliwia pobranie niewielkiej ilości skóry zmieszanej z krwią w prosty i minimalnie inwazyjny sposób⁶. Celem niniejszej publikacji jest opisanie mikrobiopsji chłonnej jako narzędzia do pobierania próbek ułatwiającego analizę molekularną poprzez ekstrakcję RNA w badaniach klinicznych.

Poprzednio opisaliśmy pierwszą wersję mikrobiopsji, mikrobiopsji skóry, która składa się z mikroigły wykonanej z trójwarstwowej stalowej płytki do ekstrakcji maleńkich fragmentów tkanek skóry⁷. Nowatorstwo tego urządzenia polega na wielu punktach styku z mikroigłą, które umożliwiają wydajną ekstrakcję tkanek³. W przeciwieństwie do tego, okrągła biopsja dziurkowania skóry zapewnia tylko jeden punkt kontaktu i w niektórych przypadkach po prostu rozrywa skórę, nie pobierając żadnej próbki. Opierając się na mikrobiopsji skóry, opracowaliśmy niedawno mikrobiopsję chłonną, która umożliwia pobieranie próbek zarówno krwi, jak i skóry. W niedawnym badaniu epidemiologicznym wykazano, że urządzenie jest możliwe do użytku na obszarach ubogich w zasoby⁶.

Ze względu na swoją prostą konstrukcję, mikrobiopsja chłonna może być wykonana w ciągu kilku sekund i nie wymaga intensywnego szkolenia. Dodatkowo nie jest potrzebne znieczulenie miejscowe, a miejsce aplikacji nie powoduje bliznowacenia. Niniejszy protokół umożliwia badaczom lub pracownikom służby zdrowia nieposiadającym odpowiedniego przeszkolenia w zakresie pobierania próbek uzyskanie docelowych danych dotyczących skóry do analizy molekularnej. Spodziewamy się, że w przyszłości urządzenia do mikropobierania próbek staną się rutyną w badaniach nad skórą.

Chociaż mikrobiopsja została opisana w innych badaniach chorób skóry, które obejmowały molekularne techniki diagnostyczne^6,8,9^,10, takich jak wykrywanie DNA wirusa brodawczaka ludzkiego, ten protokół jest pierwszym, który demonstruje szczegóły technik ekstrakcji i przetwarzania próbek dla mikrobiopsji chłonnej. Co więcej, jest to pierwszy raport opisujący względne profilowanie ekspresji genów komórek skóry i krwi w próbkach z mikrobiopsji.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Naukowych Metro South i Komitet Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Queensland (HREC-13-QPAH-551 i UQ2013001551) oraz Komitet Etyki Człowieka Uniwersytetu Południowej Australii (200607).

1. Produkcja mikrobiopsji chłonnej

1. Laserowo wycinane części mikroigłowe z blachy ze stali nierdzewnej klasy medycznej 50 μm i warstwy chłonnej (bibuła filtracyjna) odpowiednio ( Rysunek 1).
   Uwaga: Inne części, w tym tłok i obudowa, urządzenia są wytwarzane przy użyciu technik szybkiego prototypowania, takich jak druk 3D.
2. Namocz wszystkie części, z wyjątkiem warstwy chłonnej, w 70% etanolu (EtOH) przez 5 minut, a następnie wysusz je na powietrzu przez 30 minut.
3. Zamontuj trójwarstwową mikroigłę, z warstwą chłonną pośrodku (Rysunek 1a).
4. Włóż zmontowaną mikroigłę do szczeliny tłoka.
5. Załóż sprężynę i włóż tłok do koperty (Rysunek 1c). Unikaj dotykania czegokolwiek przez mikroigłę podczas montażu, aby zapewnić jakość igły.
6. Przed użyciem należy zapieczętować zmontowaną mikrobiopsję chłonną w opakowaniu w celu sterylizacji γ promieniowaniem.

2. Pobieranie próbek za pomocą mikrobiopsji chłonnej

1. Noś jednorazowe rękawiczki i spryskaj ręce i narzędzia, takie jak kleszcze, 70% EtOH.
2. Zdezynfekuj miejsce aplikacji chusteczką nasączoną alkoholem.
3. Wyjmij mikrobiopsję z opakowania wysterylizowanego promieniowaniem γ, nie dotykając przy tym mikroigły.
4. Załaduj urządzenie, pociągając za tłok, aby ścisnąć sprężynę, aż usłyszysz dźwięk "kliknięcia" i tłok zablokuje się na swoim miejscu.
5. Skierować urządzenie na skórę, od której ma zostać pobrane próbki, upewniając się, że obszar pobierania próbek znajduje się w ustalonym położeniu.
6. Upewnij się, że urządzenie jest w przybliżeniu prostopadłe do skóry, a następnie przyłóż ≥1 kg siły do urządzenia na skórę.
   Uwaga: Wymagane jest przyłożenie siły w dół do skóry, aby zapewnić wystarczającą penetrację mikroigły.
7. Naciśnij spust i przytrzymaj urządzenie w miejscu przez co najmniej 10 sekund, aby próbka krwi została wchłonięta.
   Uwaga: Jeśli urządzenie zostanie zwolnione przed upływem 10 sekund, pobrana próbka zostanie pobrana mniej.

3. Ekstrakcja RNA

Uwaga: Procedury ekstrakcji RNA zostały zmodyfikowane w stosunku do protokołu producenta w celu optymalnej izolacji RNA z próbki poddanej mikrobiopsji. Wszystkie odczynniki i kolumna używane do ekstrakcji RNA znajdują się w zestawie, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Delikatnie wyciągnąć tłok i chłonną mikroigłę z etui rękami. Upewnij się, że końcówka mikroigły nie styka się z niczym podczas usuwania.
2. Wyjąć chłonną mikroigłę z tłoka. Przytrzymaj dwa otwory w mikroigle za pomocą sterylnych kleszczyków i wyciągnij je.
3. Umieścić nienaruszoną mikroigłę w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml (nie z zestawu do izolacji RNA; patrz Tabela materiałów) wstępnie wypełnionej 50 μl buforu ekstrakcyjnego, stroną z igłą skierowaną w dół w kierunku dołu. Aby zminimalizować utratę próbki, pozostaw probówkę na suchym lodzie na 5 minut przed przetworzeniem próbki.
Krótko przeprowadź
4. wirowanie (3 - 5 s), aby usunąć część pobranych materiałów z końcówki.
5. Inkubować mikroigłę w probówce na kołysku przez 30 minut w temperaturze 42 °C.
   Uwaga: Roztwór buforowy zostanie natychmiast wchłonięty przez warstwę chłonną.
6. Umieść górną część mikroigły (po przeciwnej stronie niż igła) poziomo z górną krawędzią probówki do mikrofug o pojemności 2 ml za pomocą sterylnych kleszczyków.
7. Zamknij pokrywę probówki tak, aby górna część mikroigły była utrzymywana na miejscu między nasadką a rurką.
8. Obracaj probówkę z prędkością 16 000 x g lub z maksymalną prędkością przez 30 s, aby usunąć pobrane próbki z warstwy chłonnej urządzenia.
9. Ostrożnie usunąć mikroigłę kleszczami, nie zanurzając jej z powrotem w roztworze buforowym. Zachowaj probówkę i wyrzuć mikroigłę.
10. Odwirować próbki o masie 3 000 x g przez 2 minuty. Ostrożnie odpipetować supernatant zawierający wyekstrahowany RNA do nowej probówki do mikrowirówki.
11. Dodać 250 μl buforu kondycjonującego na membranę filtracyjną kolumny oczyszczającej i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
12. Odwirować kolumnę w probówce zbiorczej przy 16 000 x g lub przy maksymalnej prędkości przez 1 min.
13. Dodać 50 μl 70% EtOH do pobranej próbki z kroku 3.9. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół.
14. Przenieść mieszaninę (~100 μl) do wstępnie kondycjonowanej kolumny oczyszczającej.
15. Natychmiast odwirować przez 2 minuty przy 100 x g, a następnie odwirować przy 16 000 x g przez 30 s w celu usunięcia przepływu.
16. Dodać 100 μl buforu płuczącego 1 (W1) do kolumny oczyszczającej i wirować przez 1 minutę przy 8 000 x g.
17. Przygotować roztwór DNazy, dodając 5 μl roztworu podstawowego DNazy I do 35 μl buforu RDD w oddzielnej probówce mikrowirówkowej dla każdej próbki. Mieszać delikatnie odwracając.
    Uwaga: Obróbkę DNazy należy przeprowadzić na kolumnie oczyszczającej, a nie na płytce PCR, ze względu na ilość próbki.
18. Dodać 40 μl mieszanki inkubacyjnej DNazy bezpośrednio do membrany kolumny oczyszczającej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
19. Dodać 40 μl W1 do membrany kolumny oczyszczającej. Wirować przy 8 000 x g przez 15 s.
20. Odpipetować 100 μl buforu płuczącego 2 (W2) do kolumny oczyszczającej po obróbce DNazą i odwirować przez 1 minutę przy 8 000 x g.
21. Dodać kolejne 100 μl W2 do kolumny oczyszczającej i wirować przez 2 minuty przy 16 000 x g. Sprawdzić, czy w kolumnie oczyszczającej nie ma pozostałości buforu do płukania. Ponownie odwirować przy 16 000 x g przez 1 minutę, jeśli pozostał jakikolwiek bufor do płukania.
22. Przenieś kolumnę oczyszczającą do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml dostarczonej w zestawie.
23. Odpipetować 11 μl wody wolnej od RNaz (brak w zestawie do izolacji RNA), zamiast buforu elucyjnego (EB), bezpośrednio na membranę kolumny oczyszczającej. Delikatnie przyłóż końcówkę pipety do powierzchni membrany podczas dozowania wody wolnej od RNaz, aby zapewnić maksymalne wchłanianie wody wolnej od RNaz do membrany. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
24. Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 1 000 x g, aby rozprowadzić wodę wolną od RNaz w kolumnie, a następnie odwirować przez 16 000 x g po 1 minutzie, aby wymyć RNA.
    Uwaga: Kwantyfikacja RNA nie jest zalecana ze względu na małą ilość próbki.
25. Punkt zatrzymania #1: Przechowuj całą próbkę RNA w temperaturze -80 °C, jeśli synteza cDNA nie zostanie przeprowadzona natychmiast.
    Uwaga: Unikaj zamrażania, jeśli nie jest to konieczne, ze względu na niskie stężenie próbki RNA.

4. Synteza cDNA

1. Rozmrozić zamrożoną próbkę na lodzie (od etapu 3.25).
2. Zsyntetyzuj cDNA z całkowitego RNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z poniższą procedurą.
3. Przygotować mieszaninę reakcyjną: 11 μl całkowitego RNA, 4 μl 5x buforu TransAmp, 1 μl odwrotnej transkryptazy, 4 μl wody wolnej od DNaz/RNaz. Delikatnie wymieszać, pipetując.
4. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję na termocyklerze: 25 °C przez 10 minut, 42 °C przez 15 minut, a następnie końcowy etap inaktywacji odwrotnej transkryptazy w temperaturze 85 °C przez 5 minut.
5. Punkt zatrzymania #2: Przechowuj odwróconą transkrybowaną próbkę w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

5. Reakcja qPCR i analiza danych

Uwaga: Startery do reakcji qPCR zostały zaprojektowane tak, aby przekraczać granice intronów, aby uniknąć amplifikacji genomowego DNA za pomocą NCBI Primer BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Gen referencyjny wykorzystany w tym badaniu to RPLP0 (więcej informacji można znaleźć w sekcji Dyskusja).

1. Rozmrozić zamrożoną próbkę na lodzie (od kroku 4.5).
2. Wykonaj qPCR za pomocą zestawu qPCR master mix kit zgodnie z poniższą procedurą.
3. Przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą następujące składniki na reakcję: 5 μl mieszaniny reakcyjnej 2x qPCR, 0,4 μl 10 μM startera do przodu, 0,4 μl 10 μM startera odwrotnego, 2,2 μl wody wolnej od DNaz. Delikatnie wymieszać, pipetując. Ustaw próbki w trzech egzemplarzach.
4. Najpierw odpipetować 8 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka na 384-dołkowej płytce PCR, a następnie 2 μl cDNA z każdej próbki (łącznie 10 μl na studzienkę).
   Uwaga: Brak kontroli matrycowej (NTC) i kontroli odwrotnej transkryptazy (-RT) nie są uwzględnione jako kontrole ujemne.
5. Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i krótko odwiruj.
6. Uruchom reakcję amplifikacji na termocyklerze czasu rzeczywistego: 95 °C przez 2 minuty (aktywacja polimerazy), a następnie 40 cykli po 95 °C przez 5 s (denaturacja), 60 °C przez 10 s (wyżarzanie) i 72 °C przez 10 s (przedłużenie).
7. Obliczyć stężenie RNA w próbkach przez interpolację z krzywej wzorcowej przygotowanej z matryc o znanych stężeniach.
   1. Utwórz nowy eksperyment w oprogramowaniu.
   2. Kliknij przycisk Definiuj i konfiguruj standardy, aby skonfigurować seryjne rozcieńczanie płyt.
   3. Wybierz i ułóż dołki dla wzorców i próbek. Kliknij przycisk Zastosuj.
   4. Kliknij przycisk Analizuj na karcie Wynik, aby ocenić krzywą standardową. Upewnij się, że nachylenie, wartość R², wydajność amplifikacji i błąd spełniają kryteria eksperymentalne.
   5. Sprawdź wizualnie ilości nieznanych próbek na krzywej wzorcowej na podstawie ich wartości Ct.
      Uwaga: Konstrukcja krzywej standardowej, w tym wybór współczynnika rozcieńczenia, jest wykonywana zgodnie z opublikowanymi protokołami^11,12,13.
8. Przeprowadzić analizę ekspresji genów mRNA przy użyciu metody ΔCt (Ct jest znormalizowane do genu refencji).
   1. Odejmij wartość Ct genu docelowego od wartości Ct genu odniesienia, aby uzyskać wartość ΔCt.
   2. Uśrednić wartości ΔCt kontrprób technicznych.
   3. Wykreśl i przeanalizuj ekspresję genów za pomocą oprogramowania statystycznego^11,14 (patrz Tabela materiałów).
      Uwaga: Alternatywnie, analiza ekspresji genów jest przeprowadzana zgodnie z opublikowanymi protokołami¹³.

Wyniki

Wcześniej informowaliśmy, że mikroigłowa mikrobiopsja skóry wnika w skórę na głębokość około 500 μm⁷. Konstrukcja mikrobiopsji mikroigłowej skóry jest bardzo podobna do tej w mikrobiopsji chłonnej (Rysunek 2a). Podczas gdy mikrobiopsja chłonna składała się z warstwy chłonnej pośrodku służącej do wchłaniania krwi, mikrobiopsja skóry zawierała kanał do mechanicznego wychwytywania tkanek skóry. Zastosowanie warstwy chłonnej doprowadziło również do niewielkiej różnicy w wymiarze mikroigł (chłonność: 1,50 x 0,50 x 0,21 mm vs skóra: 1,50 x 0,50 x 0,15 mm).

Rysunek 2b pokazuje miejsca aplikacji 5 minut po zastosowaniu mikrobiopsji chłonnej i skórnej na lewym ramieniu ochotnika płci męskiej. Ze względu na podobieństwo między dwoma konstrukcjami mikroigieł, miejsca aplikacji obu urządzeń były porównywalne, z niewielkim rumieniem. Oba miejsca aplikacji nie były zauważalne po 48 godzinach, nie pozostały żadne blizny. Potwierdza to hipotezę, że to minimalnie inwazyjne urządzenie może potencjalnie pomóc w badaniach przesiewowych wielu miejsc aplikacji lub być wykonywane regularnie.

Rysunek 2c pokazuje reprezentatywny obraz warstwy chłonnej mikrobiopsji chłonnej po nałożeniu na ramię męskiego ochotnika. Jak pokazano na rysunku, kilka maleńkich kawałków skóry zostało uchwyconych w pobliżu końcówki mikroigły, a część krwi została wchłonięta przez bibułę filtracyjną. Oznacza to, że urządzenie wniknęło w skórę i wychwyciło jednocześnie skórę i krew w tej samej chłonnej matrycy mikrobiopsyjnej. Rysunek 2d przedstawia dla porównania mikrobiopsję skóry po pobraniu próbek, poprzednią generację mikrobiopsji. Kanał mikrobiopsji skóry uchwycił niewielki fragment skóry, ale ilość krwi na mikroigłach była niewielka w porównaniu z mikrobiopsją chłonną. Oba miejsca aplikacji nie były zauważalne w ciągu 48 godzin. W eksperymencie mikrobiopsję chłonną zastosowano z 10-sekundowym czasem utrzymywania po aplikacji, podczas gdy mikrobiopsja skóry została uwolniona natychmiast po aplikacji ze względu na różnicę w konstrukcji.

Jak pokazano w Rysunek 3a, dwie grupy mikrobiopsji chłonnej były zaangażowane w ten eksperyment oparty na protokole aplikacji: 'Natychmiastowe uwalnianie' i '10-s trzymanie'. W grupie "natychmiastowego zwolnienia" urządzenie zostało zastosowane przy użyciu tego samego oryginalnego protokołu mikrobiopsji skóry, przy czym urządzenie zostało usunięte z miejsca aplikacji natychmiast po aplikacji. W przypadku grupy "10-s holding" urządzenie było trzymane w miejscu po zastosowaniu przez 10 s w celu usprawnienia pobierania próbek. Dwie grupy mikrobiopsji absorpcyjnej zostały stworzone w celu zademonstrowania, w jaki sposób podejście aplikacyjne może wpłynąć na ilość próbki. 10-sekundowy czas utrzymywania został wybrany jako klinicznie uzasadniony czas, aby wykazać, że czas aplikacji wpływa na ilość odzyskiwalnej próbki.

Ilość RNA odzyskanego z dwóch grup mikrobiopsji chłonnej wynosiła 0,33 ± 0,39 ng dla "natychmiastowego uwolnienia" i 1,43 ± 0,88 ng dla "10-s holdingu" (Rysunek 3a, n = 20), co sugeruje 4-krotny wzrost wraz z dodatkowym czasem utrzymywania. Oznacza to, że zastosowanie urządzenia absorpcyjnego z czasem utrzymywania 10 s spowodowało ekstrakcję większej ilości RNA. Różnica może wynikać z obecności zwiększonej próbki krwi w warstwie chłonnej (Ryc. 3c). Rzeczywiście, grupa "natychmiastowego uwalniania" (Ryc. 3b) nie zebrała podobnej ilości krwi za pomocą warstwy chłonnej w porównaniu z grupą "10-s holding" (Ryc. 3c). Należy również zauważyć, że większość natychmiast uwalnianych mikrobiopsji była zbliżona do osi x, co sugeruje, że były to zdarzenia negatywne lub wykazywały bardzo niską ilość RNA. W związku z tym wynik potwierdził hipotezę, że czas utrzymywania będzie miał wpływ na działanie urządzenia, ponieważ wchłonięcie krwi przez warstwę absorpcyjną może zająć trochę czasu.

Ponieważ urządzenie zostało zaprojektowane do pobierania próbek krwi i skóry, qPCR został użyty do wykrywania ekspresji biomarkerów skóry i krwi dla obu urządzeń dla porównania. Użyliśmy tyrozynazy, TYR, jako biomarkera melanocytów i KRT14 jako biomarkera keratynocytów w żywotnym naskórku. Do eksperymentu włączono próbki mikrobiopsji skóry w celu porównania. Jak pokazano na Rysunek 4, chociaż mikrobiopsje skóry i mikrobiopsje chłonne były stosowane inaczej ze względu na różnicę w konstrukcji, poziomy ekspresji dla obu biomarkerów skóry TYR i KRT14 były porównywalne dla obu urządzeń, jak wskazują dane. Stwierdzono, że biomarkery białych krwinek (CD3E, limfocyty T i CD19, limfocyty B) są bardziej rozpowszechnione w chłonnych próbkach mikrobiopsji niż w próbkach mikrobiopsji skóry. Wynik ten sugeruje, że mikrobiopsja chłonna działała lepiej w pobieraniu krwi, ale nadal zachowywała zdolność do wychwytywania skóry w porównaniu z mikrobiopsją skóry (n = 5).

Rysunek 1. Wytwarzanie mikrobiopsji absorpcyjnej. (a) Trójwarstwowa mikroigła. (b) Wszystkie części wyrobu. (c) Zmontowana mikrobiopsja chłonna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Mikrobiopsja chłonna była w stanie uchwycić próbki skóry i krwi jednocześnie bez pozostawiania blizny na lewym ramieniu wolowym ochotnika. a) Porównanie mikroigieł w mikrobiopsjach chłonnych i mikrobiopsji skóry. (b) Miejsca aplikacji pozostawione przez mikrobiopsje chłonne i skórne 5 minut po aplikacji. lit. c,d) Mikroigły chłonne i mikrobiopsje skóry po aplikacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Mikrobiopsja chłonna uchwyciła więcej próbki krwi i RNA, gdy była stosowana przez 10 sekund. (a) 10-sekundowy czas utrzymywania po aplikacji spowodował większą ilość RNA niż natychmiastowe uwolnienie urządzenia (n = 20). Słupki błędów reprezentują SD od średniej (****p<0,0001). lit. b), c) Reprezentatywne zdjęcia mikrobiopsji chłonnej po aplikacji z podejściem "Natychmiastowe uwalnianie" i "10-s trzymanie". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Porównanie poziomów ekspresji mRNA między mikrobiopsjami skórnymi i chłonnymi (n = 5). Ekspresja genu została znormalizowana za pomocą genu referencyjnego RPLP0. Słupki błędów reprezentują SD od średniej (*p<0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wyniki te pokazują, że mikrobiopsja chłonna może być stosowana jako narzędzie do prostego i minimalnie inwazyjnego pobierania próbek mieszaniny skóry i krwi w celu charakterystyki molekularnej. Aplikacja urządzenia zgodnie z naszym protokołem jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych wyników, o czym świadczy różnica w ilości RNA odzyskanego za pomocą różnych protokołów aplikacji (rysunek 3). Po ekstrakcji próbki, kolejny etap przetwarzania próbki do ekstrakcji RNA jest bardzo podobny do ustalonych protokołów^15,16. Oprócz początkowych etapów ekstrakcji RNA, które są modyfikowane pod kątem mikrobiopsji absorpcyjnej, kolejną kluczową zmianą jest użycie wody wolnej od RNaz w celu poprawy wyników w dalszych zastosowaniach. Ponadto warto wspomnieć, że genem referencyjnym wykorzystanym w tym badaniu jest RPLP0. RPLP0, którego funkcja jest dobrze znana dla różnych typów komórek i tkanek¹⁷, został opisany jako odpowiedni gen referencyjny do stosowania w nieczerniakowych nowotworach skóry i zmianach przedrakowych¹⁸.

Jednym z głównych ograniczeń urządzenia jest usunięcie mikrobiopsji z urządzenia, co jest czasochłonne i potencjalnie zwiększa ryzyko utraty próbki, szczególnie w przypadku wrażliwych próbek, takich jak RNA. Niemniej jednak problem można przezwyciężyć poprzez wstępne schłodzenie wszystkich sterylnych narzędzi do przetwarzania, takich jak probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml, na suchym lodzie.

Stosowanie mikrobiopsji chłonnej jest proste i nie wymaga intensywnego treningu. Konwencjonalna biopsja nie jest konieczna, ponieważ mikrobiopsja pozwala na charakterystykę molekularną za pomocą uznanych technik diagnostyki molekularnej, takich jak RT-qPCR. Aby dokładniej określić ilościowo i zademonstrować zdolność mikrobiopsji absorpcyjnej do pobierania próbek, zbadano wcześniejszą literaturę, która obejmowała ekstrakcję RNA z ludzkiej tkanki skórnej. Z typowej biopsji skóry 3,0 lub 4,0 mm, trzy badania wykazały, że wyekstrahowane ilości RNA wahały się od 50 do 200 ng na mg tkanki skórnej 19,20,21. W porównaniu z 1,43 ng RNA, które zostało odzyskane średnio z mikrobiopsji chłonnej (ryc. 3), oczekuje się, że masa pobranych tkanek skóry będzie wynosić od 0,29 do 115 μg w oparciu o ten sam stosunek RNA do tkanki z badań biopsji dziurkowej skóry.

Protokół ten nie jest pozbawiony potencjalnych pułapek, chociaż niektóre problemy można łatwo przezwyciężyć. Na przykład dane dotyczące ekstrakcji RNA sugerowały znaczną zmienność nawet przy czasie utrzymywania 10-sekundowym (Figura 3). Aby rozwiązać ten problem, jednym z potencjalnych rozwiązań jest optymalizacja protokołu aplikacji. Parametry, takie jak siła przyłożona do skóry i czas utrzymywania, powinny być testowane i optymalizowane w celu zmniejszenia różnic w ekstrakcji próbki. Innym potencjalnym problemem jest usunięcie mikrobiopsji z urządzenia, co może mieć wpływ na integralność próbki i jej odzyskiwanie. Chociaż usunięcie mikrobiopsji w celu ekstrakcji RNA jest skutecznym podejściem, cała procedura jest żmudna, a próbka może być narażona na zanieczyszczenie w tym procesie. W związku z tym modyfikacja protokołu przetwarzania próbki jest wysoce pożądana w celu zapewnienia integralności próbki i zapobieżenia utracie próby.

Oczekuje się, że po rozwiązaniu powyższych dwóch problemów urządzenie stanie się standardowym narzędziem do badań klinicznych. Ważne jest, aby pamiętać, że urządzenie przechwytuje jednocześnie zarówno próbkę skóry, jak i krwi, co powinno być brane pod uwagę podczas analizy danych dotyczących ekspresji genów. Podsumowując, protokół ten opisuje szczegóły wykonywania mikrobiopsji chłonnej jako łatwego i minimalnie inwazyjnego narzędzia do łączonego pobierania próbek skóry i krwi oraz późniejszego przetwarzania próbki w celu względnego profilowania ekspresji genów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chłonna mikrobiopsja wytwarzanie i pobieranie próbek
Chłonna mikrobiopsja	Trajan Scientific and Medical	N/A	https://www.trajanscimed.com/
Bibuła filtracyjna Whatman, klasa 1	Sigma Aldrich	WHA1001325	N/A
RNA
Zestaw do izolacji RNA PicoPure	ThermoFisher	KIT0214	Zawiera wszystkie roztwory buforowe opisane w protokole
UltraPure DNase/RNase-Free Woda destylowana	ThermoFisher	10977015	Poprawa jakości RNA na etapie elucji RNA
Probówka mikrowirówkowa 2,0 mL, sterylna	Thomas Scientific	1226S74	N/A
Mikrowirówka 5415R	Eppendorf	Z605212	N/A
cDNA synteza
Zestaw do syntezy cDNA SensiFAST	Bioline	BIO-65053	N/A
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad	1855196	N/A
qPCR i analiza danych
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit	Bioline	BIO-94005	W tym odczynniki opisane w krokach reakcji qPCR
: Optyczna folia samoprzylepna	MicroAmp ThermoFisher Scinentific	4311971	N/A
Optyczna 384-dołkowa płytka reakcyjna	MicroAmp ThermoFisher Scinentific	4343370	Nie dotyczy
QuantStudio 6 Flex System do PCR w czasie rzeczywistym	ThermoFisher Scinentific	4485694	Nie dotyczy
GraphPad Prism (v6.04)	GraphPad	Nie dotyczy; Wersja dla systemu Windows	Wykresy i analiza statystyczna w krokach analizy danych qPCR
PCR startery
emRPLP0 F	Sigma Aldrich	N/A	ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC
RPLP0 R	Sigma Aldrich	N/A	CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG
TYR F	Sigma Aldrich	N/ A	TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA
em>TYR R	Sigma	Aldrich N/A	AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC
KRT14 F	Sigma Aldrich	N/A	CCT CCT CCC AGT TCT CCT
KRT14 R	Sigma Aldrich	N/A	ACA CCT TGC CAT CG
em>CD3E F	Sigma Aldrich	N/A	CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG
CD3E R	Sigma Aldrich	N/A	GTT CTC CAG AGG AGA TG
em>CD19 F	Sigma Aldrich	N/A	TTC TGC CTG TGT TCC CTT G
CD19 R	Sigma Aldrich	N/A	GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T