Artykuł metodologiczny

Chłonne pobieranie próbek mikrobiopsji i ekstrakcja RNA do minimalnie inwazyjnej, jednoczesnej analizy krwi i skóry

10.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58614

⸱

21 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Future Industries Institute, University of South Australia, 2Faculty of Medicine, University of Queensland, 3Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Princess Alexandra Hospital, 5Australian Craniofacial Unit, Women's and Children's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule pokazujemy, jak przeprowadzana jest technika mikrobiopsji absorpcyjnej i jak próbka może być wykorzystana do ekstrakcji RNA w celu prostego i jednoczesnego pobierania próbek skóry i krwi w minimalnie inwazyjny sposób.

Streszczenie

Konwencjonalna biopsja skóry ogranicza badania kliniczne, które obejmują obszary wrażliwe kosmetycznie lub zastosowania pediatryczne, ze względu na swoją inwazyjność. W tym miejscu opisujemy protokół stosowania chłonnego urządzenia na bazie mikroigł, mikrobiopsji chłonnej, do minimalnie inwazyjnego pobierania próbek mieszanki skóry i krwi. Naszym celem jest ułatwienie szybkiego postępu w badaniach klinicznych, ustanowienie biomarkerów chorób skóry i zmniejszenie ryzyka dla uczestników badań klinicznych. W przeciwieństwie do konwencjonalnych technik biopsji skóry, mikrobiopsję chłonną można wykonać w ciągu kilku sekund i nie wymaga intensywnego szkolenia ze względu na prostą konstrukcję. W niniejszym raporcie opisujemy zastosowanie mikrobiopsji chłonnej, w tym ładowanie i aplikację, na ochotniku. Następnie pokazujemy, jak wyizolować RNA z wchłoniętej próbki. Na koniec pokazujemy zastosowanie ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) do ilościowego określenia poziomów ekspresji mRNA zarówno we krwi (CD3E i CD19), jak i skórze (KRT14 i TYR). Metody, które opisujemy, wykorzystują gotowe zestawy i odczynniki. Protokół ten oferuje minimalnie inwazyjne podejście do jednoczesnego pobierania próbek skóry i krwi w tej samej chłonnej matrycy mikrobiopsji. Odkryliśmy, że komisje bioetyczne, klinicyści i wolontariusze popierają to podejście do badań dermatologicznych.

Wprowadzenie

Biopsja skóry jest jedną z najważniejszych technik w dermatologii do pobierania próbek skóry i późniejszej diagnozy chorób skóry poprzez ocenę histopatologiczną. Technika biopsji polega na tym, że lekarz używa biopsji ostrza lub stempla w celu usunięcia podejrzanej zmiany na skórze pacjenta do badania1. Chociaż technika ta jest skuteczna, jest wysoce inwazyjna i ogranicza badania kliniczne, ponieważ punkt końcowy zwykle obejmuje techniki biologii molekularnej2,3. Analiza molekularna chorób skóry może dostarczyć bardzo specyficznych informacji biologicznych, których nie może dostarczyć analiza histopatologiczna, ułatwiając w ten sposób odkrywanie leków i diagnozowanie chorób4,5. Poza tym zapotrzebowanie na próbki w większości technik molekularnych jest stosunkowo niewielkie i może prowadzić do zmniejszenia wykorzystania zwierząt i pozwolić na większą liczbę powtórzeń. W związku z tym istnieje wyraźna potrzeba opracowania alternatywnej techniki, która umożliwi analizę molekularną w badaniach klinicznych i obniży ryzyko dla uczestników.

Aby zaspokoić taką potrzebę w terenie, nasza grupa opracowała nowatorską platformę diagnostyczną opartą na mikroigłach, mikrobiopsję absorpcyjną, która umożliwia pobranie niewielkiej ilości skóry zmieszanej z krwią w prosty i minimalnie inwazyjny sposób6. Celem niniejszej publikacji jest opisanie mikrobiopsji chłonnej jako narzędzia do pobierania próbek ułatwiającego analizę molekularną poprzez ekstrakcję RNA w badaniach klinicznych.

Poprzednio opisaliśmy pierwszą wersję mikrobiopsji, mikrobiopsji skóry, która składa się z mikroigły wykonanej z trójwarstwowej stalowej płytki do ekstrakcji maleńkich fragmentów tkanek skóry7. Nowatorstwo tego urządzenia polega na wielu punktach styku z mikroigłą, które umożliwiają wydajną ekstrakcję tkanek3. W przeciwieństwie do tego, okrągła biopsja dziurkowania skóry zapewnia tylko jeden punkt kontaktu i w niektórych przypadkach po prostu rozrywa skórę, nie pobierając żadnej próbki. Opierając się na mikrobiopsji skóry, opracowaliśmy niedawno mikrobiopsję chłonną, która umożliwia pobieranie próbek zarówno krwi, jak i skóry. W niedawnym badaniu epidemiologicznym wykazano, że urządzenie jest możliwe do użytku na obszarach ubogich w zasoby6.

Ze względu na swoją prostą konstrukcję, mikrobiopsja chłonna może być wykonana w ciągu kilku sekund i nie wymaga intensywnego szkolenia. Dodatkowo nie jest potrzebne znieczulenie miejscowe, a miejsce aplikacji nie powoduje bliznowacenia. Niniejszy protokół umożliwia badaczom lub pracownikom służby zdrowia nieposiadającym odpowiedniego przeszkolenia w zakresie pobierania próbek uzyskanie docelowych danych dotyczących skóry do analizy molekularnej. Spodziewamy się, że w przyszłości urządzenia do mikropobierania próbek staną się rutyną w badaniach nad skórą.

Chociaż mikrobiopsja została opisana w innych badaniach chorób skóry, które obejmowały molekularne techniki diagnostyczne6,8,9,10, takich jak wykrywanie DNA wirusa brodawczaka ludzkiego, ten protokół jest pierwszym, który demonstruje szczegóły technik ekstrakcji i przetwarzania próbek dla mikrobiopsji chłonnej. Co więcej, jest to pierwszy raport opisujący względne profilowanie ekspresji genów komórek skóry i krwi w próbkach z mikrobiopsji.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Naukowych Metro South i Komitet Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Queensland (HREC-13-QPAH-551 i UQ2013001551) oraz Komitet Etyki Człowieka Uniwersytetu Południowej Australii (200607).

1. Produkcja mikrobiopsji chłonnej

  1. Laserowo wycinane części mikroigłowe z blachy ze stali nierdzewnej klasy medycznej 50 μm i warstwy chłonnej (bibuła filtracyjna) odpowiednio ( Rysunek 1).
    Uwaga: Inne części, w tym tłok i obudowa, urządzenia są wytwarzane przy użyciu technik szybkiego prototypowania, takich jak druk 3D.
  2. Namocz wszystkie części, z wyjątkiem warstwy chłonnej, w 70% etanolu (EtOH) przez 5 minut, a następnie wysusz je na powietrzu przez 30 minut.
  3. Zamontuj trójwarstwową mikroigłę, z warstwą chłonną pośrodku (Rysunek 1a).
  4. Włóż zmontowaną mikroigłę do szczeliny tłoka.
  5. Załóż sprężynę i włóż tłok do koperty (Rysunek 1c). Unikaj dotykania czegokolwiek przez mikroigłę podczas montażu, aby zapewnić jakość igły.
  6. Przed użyciem należy zapieczętować zmontowaną mikrobiopsję chłonną w opakowaniu w celu sterylizacji γ promieniowaniem.

2. Pobieranie próbek za pomocą mikrobiopsji chłonnej

  1. Noś jednorazowe rękawiczki i spryskaj ręce i narzędzia, takie jak kleszcze, 70% EtOH.
  2. Zdezynfekuj miejsce aplikacji chusteczką nasączoną alkoholem.
  3. Wyjmij mikrobiopsję z opakowania wysterylizowanego promieniowaniem γ, nie dotykając przy tym mikroigły.
  4. Załaduj urządzenie, pociągając za tłok, aby ścisnąć sprężynę, aż usłyszysz dźwięk "kliknięcia" i tłok zablokuje się na swoim miejscu.
  5. Skierować urządzenie na skórę, od której ma zostać pobrane próbki, upewniając się, że obszar pobierania próbek znajduje się w ustalonym położeniu.
  6. Upewnij się, że urządzenie jest w przybliżeniu prostopadłe do skóry, a następnie przyłóż ≥1 kg siły do urządzenia na skórę.
    Uwaga: Wymagane jest przyłożenie siły w dół do skóry, aby zapewnić wystarczającą penetrację mikroigły.
  7. Naciśnij spust i przytrzymaj urządzenie w miejscu przez co najmniej 10 sekund, aby próbka krwi została wchłonięta.
    Uwaga: Jeśli urządzenie zostanie zwolnione przed upływem 10 sekund, pobrana próbka zostanie pobrana mniej.

3. Ekstrakcja RNA

Uwaga: Procedury ekstrakcji RNA zostały zmodyfikowane w stosunku do protokołu producenta w celu optymalnej izolacji RNA z próbki poddanej mikrobiopsji. Wszystkie odczynniki i kolumna używane do ekstrakcji RNA znajdują się w zestawie, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Delikatnie wyciągnąć tłok i chłonną mikroigłę z etui rękami. Upewnij się, że końcówka mikroigły nie styka się z niczym podczas usuwania.
  2. Wyjąć chłonną mikroigłę z tłoka. Przytrzymaj dwa otwory w mikroigle za pomocą sterylnych kleszczyków i wyciągnij je.
  3. Umieścić nienaruszoną mikroigłę w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml (nie z zestawu do izolacji RNA; patrz Tabela materiałów) wstępnie wypełnionej 50 μl buforu ekstrakcyjnego, stroną z igłą skierowaną w dół w kierunku dołu. Aby zminimalizować utratę próbki, pozostaw probówkę na suchym lodzie na 5 minut przed przetworzeniem próbki.
    4. Krótko przeprowadź
  4. wirowanie (3 - 5 s), aby usunąć część pobranych materiałów z końcówki.
  5. Inkubować mikroigłę w probówce na kołysku przez 30 minut w temperaturze 42 °C.
    Uwaga: Roztwór buforowy zostanie natychmiast wchłonięty przez warstwę chłonną.
  6. Umieść górną część mikroigły (po przeciwnej stronie niż igła) poziomo z górną krawędzią probówki do mikrofug o pojemności 2 ml za pomocą sterylnych kleszczyków.
  7. Zamknij pokrywę probówki tak, aby górna część mikroigły była utrzymywana na miejscu między nasadką a rurką.
  8. Obracaj probówkę z prędkością 16 000 x g lub z maksymalną prędkością przez 30 s, aby usunąć pobrane próbki z warstwy chłonnej urządzenia.
  9. Ostrożnie usunąć mikroigłę kleszczami, nie zanurzając jej z powrotem w roztworze buforowym. Zachowaj probówkę i wyrzuć mikroigłę.
  10. Odwirować próbki o masie 3 000 x g przez 2 minuty. Ostrożnie odpipetować supernatant zawierający wyekstrahowany RNA do nowej probówki do mikrowirówki.
  11. Dodać 250 μl buforu kondycjonującego na membranę filtracyjną kolumny oczyszczającej i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Odwirować kolumnę w probówce zbiorczej przy 16 000 x g lub przy maksymalnej prędkości przez 1 min.
  13. Dodać 50 μl 70% EtOH do pobranej próbki z kroku 3.9. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół.
  14. Przenieść mieszaninę (~100 μl) do wstępnie kondycjonowanej kolumny oczyszczającej.
  15. Natychmiast odwirować przez 2 minuty przy 100 x g, a następnie odwirować przy 16 000 x g przez 30 s w celu usunięcia przepływu.
  16. Dodać 100 μl buforu płuczącego 1 (W1) do kolumny oczyszczającej i wirować przez 1 minutę przy 8 000 x g.
  17. Przygotować roztwór DNazy, dodając 5 μl roztworu podstawowego DNazy I do 35 μl buforu RDD w oddzielnej probówce mikrowirówkowej dla każdej próbki. Mieszać delikatnie odwracając.
    Uwaga: Obróbkę DNazy należy przeprowadzić na kolumnie oczyszczającej, a nie na płytce PCR, ze względu na ilość próbki.
  18. Dodać 40 μl mieszanki inkubacyjnej DNazy bezpośrednio do membrany kolumny oczyszczającej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  19. Dodać 40 μl W1 do membrany kolumny oczyszczającej. Wirować przy 8 000 x g przez 15 s.
  20. Odpipetować 100 μl buforu płuczącego 2 (W2) do kolumny oczyszczającej po obróbce DNazą i odwirować przez 1 minutę przy 8 000 x g.
  21. Dodać kolejne 100 μl W2 do kolumny oczyszczającej i wirować przez 2 minuty przy 16 000 x g. Sprawdzić, czy w kolumnie oczyszczającej nie ma pozostałości buforu do płukania. Ponownie odwirować przy 16 000 x g przez 1 minutę, jeśli pozostał jakikolwiek bufor do płukania.
  22. Przenieś kolumnę oczyszczającą do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml dostarczonej w zestawie.
  23. Odpipetować 11 μl wody wolnej od RNaz (brak w zestawie do izolacji RNA), zamiast buforu elucyjnego (EB), bezpośrednio na membranę kolumny oczyszczającej. Delikatnie przyłóż końcówkę pipety do powierzchni membrany podczas dozowania wody wolnej od RNaz, aby zapewnić maksymalne wchłanianie wody wolnej od RNaz do membrany. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
  24. Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 1 000 x g, aby rozprowadzić wodę wolną od RNaz w kolumnie, a następnie odwirować przez 16 000 x g po 1 minutzie, aby wymyć RNA.
    Uwaga: Kwantyfikacja RNA nie jest zalecana ze względu na małą ilość próbki.
  25. Punkt zatrzymania #1: Przechowuj całą próbkę RNA w temperaturze -80 °C, jeśli synteza cDNA nie zostanie przeprowadzona natychmiast.
    Uwaga: Unikaj zamrażania, jeśli nie jest to konieczne, ze względu na niskie stężenie próbki RNA.

4. Synteza cDNA

  1. Rozmrozić zamrożoną próbkę na lodzie (od etapu 3.25).
  2. Zsyntetyzuj cDNA z całkowitego RNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z poniższą procedurą.
  3. Przygotować mieszaninę reakcyjną: 11 μl całkowitego RNA, 4 μl 5x buforu TransAmp, 1 μl odwrotnej transkryptazy, 4 μl wody wolnej od DNaz/RNaz. Delikatnie wymieszać, pipetując.
  4. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję na termocyklerze: 25 °C przez 10 minut, 42 °C przez 15 minut, a następnie końcowy etap inaktywacji odwrotnej transkryptazy w temperaturze 85 °C przez 5 minut.
  5. Punkt zatrzymania #2: Przechowuj odwróconą transkrybowaną próbkę w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

5. Reakcja qPCR i analiza danych

Uwaga: Startery do reakcji qPCR zostały zaprojektowane tak, aby przekraczać granice intronów, aby uniknąć amplifikacji genomowego DNA za pomocą NCBI Primer BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Gen referencyjny wykorzystany w tym badaniu to RPLP0 (więcej informacji można znaleźć w sekcji Dyskusja).

  1. Rozmrozić zamrożoną próbkę na lodzie (od kroku 4.5).
  2. Wykonaj qPCR za pomocą zestawu qPCR master mix kit zgodnie z poniższą procedurą.
  3. Przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą następujące składniki na reakcję: 5 μl mieszaniny reakcyjnej 2x qPCR, 0,4 μl 10 μM startera do przodu, 0,4 μl 10 μM startera odwrotnego, 2,2 μl wody wolnej od DNaz. Delikatnie wymieszać, pipetując. Ustaw próbki w trzech egzemplarzach.
  4. Najpierw odpipetować 8 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka na 384-dołkowej płytce PCR, a następnie 2 μl cDNA z każdej próbki (łącznie 10 μl na studzienkę).
    Uwaga: Brak kontroli matrycowej (NTC) i kontroli odwrotnej transkryptazy (-RT) nie są uwzględnione jako kontrole ujemne.
  5. Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i krótko odwiruj.
  6. Uruchom reakcję amplifikacji na termocyklerze czasu rzeczywistego: 95 °C przez 2 minuty (aktywacja polimerazy), a następnie 40 cykli po 95 °C przez 5 s (denaturacja), 60 °C przez 10 s (wyżarzanie) i 72 °C przez 10 s (przedłużenie).
  7. Obliczyć stężenie RNA w próbkach przez interpolację z krzywej wzorcowej przygotowanej z matryc o znanych stężeniach.
    1. Utwórz nowy eksperyment w oprogramowaniu.
    2. Kliknij przycisk Definiuj i konfiguruj standardy, aby skonfigurować seryjne rozcieńczanie płyt.
    3. Wybierz i ułóż dołki dla wzorców i próbek. Kliknij przycisk Zastosuj.
    4. Kliknij przycisk Analizuj na karcie Wynik, aby ocenić krzywą standardową. Upewnij się, że nachylenie, wartość R2, wydajność amplifikacji i błąd spełniają kryteria eksperymentalne.
    5. Sprawdź wizualnie ilości nieznanych próbek na krzywej wzorcowej na podstawie ich wartości Ct.
      Uwaga: Konstrukcja krzywej standardowej, w tym wybór współczynnika rozcieńczenia, jest wykonywana zgodnie z opublikowanymi protokołami11,12,13.
  8. Przeprowadzić analizę ekspresji genów mRNA przy użyciu metody ΔCt (Ct jest znormalizowane do genu refencji).
    1. Odejmij wartość Ct genu docelowego od wartości Ct genu odniesienia, aby uzyskać wartość ΔCt.
    2. Uśrednić wartości ΔCt kontrprób technicznych.
    3. Wykreśl i przeanalizuj ekspresję genów za pomocą oprogramowania statystycznego11,14 (patrz Tabela materiałów).
      Uwaga: Alternatywnie, analiza ekspresji genów jest przeprowadzana zgodnie z opublikowanymi protokołami13.

Wyniki

Wcześniej zgłosiliśmy, że mikroiła w mikrobiopsji skóry penetruje skórę na głębokość około 500 µm7. Konstrukcja mikroiły w mikrobiopsji skóry jest bardzo podobna do tej stosowanej w mikrobiopsji absorpcyjnej (Rysunek 2a). Podczas gdy mikrobiopsja absorpcyjna składała się z warstwy absorbującej w środku do pobierania krwi, mikrobiopsja skóry zawierała kanał do mechanicznego wychwytywania tkanek skóry. Zastosowanie warstwy absorbującej doprowadziło również do niewielkiej różnicy w wymiarach mikroiły (absorpcyjna: 1,50 x 0,50 x 0,21 mm vs skóry: 1,50 x 0,50 x 0,15 mm).

Rysunek 2b przedstawia miejsca aplikacji 5 min po zastosowaniu absorbentów i mikrobiopsji skóry na lewej stronie przedramienia ochotnika. Ze względu na podobieństwo obu konstrukcji mikroił, miejsca aplikacji z obu urządzeń były porównywalne, z niewielkim rumieniem. Oba miejsca aplikacji nie były widoczne po 48 h i nie pozostawiły blizn. Potwierdza to hipotezę, że to małoinwazyjne urządzenie ma potencjał do wspomagania badania wielu miejsc aplikacji lub do regularnego stosowania.

Rysunek 2c przedstawia reprezentatywne zdjęcie warstwy absorbującej mikrobiopsji absorbującej po aplikacji na stronę przedramienia wolne ochotnika. Jak pokazano na rysunku, w pobliżu końcówki mikroiły przechwycono kilka niewielkich fragmentów skóry, a do papieru filtrującego wchłonięto niewielką ilość krwi. Wskazuje to, że urządzenie przeniknęło przez skórę i jednocześnie pobrało zarówno tkankę skórną, jak i krew do tej samej matrycy mikrobiopsji absorbującej. Rysunek 2d przedstawia, dla porównania, mikrobiopsję skórną po pobraniu próbki, będącą poprzednią generacją urządzenia. Kanał mikrobiopsji skórnej przechwycił mały fragment skóry, lecz ilość krwi na mikroiśle była niewielka w porównaniu z mikrobiopsją absorbującą. Obie miejsca aplikacji nie były zauważalne w ciągu 48 h. W eksperymencie mikrobiopsję absorbującą przykładano przez 10 s po aplikacji, natomiast mikrobiopsję skórną uwalniano natychmiast po aplikacji ze względu na różnice w konstrukcji.

Jak pokazano na Ryc. 3a, w eksperymencie uczestniczyły dwie grupy absorbencyjnej mikrobiopsji, podzielone zgodnie z protokołem aplikacji: „natychmiastowe zwolnienie” oraz „przytrzymanie przez 10 s”. W grupie „natychmiastowe zwolnienie” urządzenie zastosowano zgodnie z oryginalnym protokołem mikrobiopsji skóry, usuwając urządzenie z miejsca aplikacji bezpośrednio po jej wykonaniu. W grupie „przytrzymanie przez 10 s” urządzenie pozostawiono w miejscu aplikacji na 10 s w celu poprawy pobierania próbki. Dwie grupy absorbencyjnej mikrobiopsji utworzono, aby wykazać, w jaki sposób sposób aplikacji może wpływać na ilość pobranej próbki. Czas przytrzymania wynoszący 10 s wybrano jako klinicznie uzasadniony czas, aby udowodnić, że czas aplikacji wpływa na ilość odzyskiwanej próbki.

Ilość RNA odzyskanego z dwóch grup mikrobiopsji z warstwą absorbującą wyniosła 0,33 ± 0,39 ng dla grupy „Immediate release” oraz 1,43 ± 0,88 ng dla grupy „10-s holding” (Rycina 3a, n = 20), co sugeruje 4-krotny wzrost przy dodatkowym czasie przytrzymania. Wskazuje to, że zastosowanie urządzenia absorbującego z 10-sekundowym czasem przytrzymania doprowadziło do ekstrakcji większej ilości RNA. Różnica ta może wynikać z obecności większej ilości próbki krwi w warstwie absorbującej (Rycina 3c). Rzeczywiście, w grupie „Immediate release” (Rycina 3b) nie udało się zebrać w warstwie absorbującej podobnej ilości krwi, co w grupie „10-s holding” (Rycina 3c). Należy również zauważyć, że większość mikrobiopsji z grupy „Immediate release” znajdowała się blisko osi x, co sugeruje, że były to zdarzenia negatywne lub wykazywały bardzo niską ilość RNA. Zatem wynik ten potwierdził hipotezę, że czas przytrzymania wpłynie na wydajność urządzenia, ponieważ absorpcja krwi przez warstwę absorbującą może wymagać czasu.

Ponieważ urządzenie zostało zaprojektowane do pobierania próbek krwi i skóry, do porównania obu urządzeń wykorzystano qPCR w celu wykrycia ekspresji biomarkerów skóry i krwi. Jako biomarker melanocytów zastosowano tyrozynazę, TYR, a jako biomarker keratynocytów w żywej warstwie naskórka – KRT14. Do porównania w eksperymencie włączono próbki z mikrobiopsji skóry. Jak pokazano na Rysunku 4, mimo że mikrobiopsje skóry i mikrobiopsje absorpcyjne były stosowane w inny sposób ze względu na różnice w konstrukcji, poziomy ekspresji obu biomarkerów skóry, TYR i KRT14, były porównywalne dla obu urządzeń, co wskazały uzyskane dane. Stwierdzono, że biomarkery białych krwinek (CD3E dla limfocytów T oraz CD19 dla limfocytów B) występowały częściej w próbkach z mikrobiopsji absorpcyjnej niż w próbkach z mikrobiopsji skóry. Wynik ten sugeruje, że mikrobiopsja absorpcyjna wykazała wyższą skuteczność w pobieraniu krwi, zachowując jednocześnie zdolność do pobierania tkanek skóry w porównaniu z mikrobiopsją skóry (n = 5).

Montaż urządzenia z mikroigłami: papier Whatman, stalowe płytki, chłonne elementy do mikrobiopsji, tłok, obudowa.
Rycina 1. Wytwarzanie chłonnego urządzenia do mikrobiopsji. (a) Trójwarstwowa mikroigła. (b) Wszystkie części urządzenia. (c) Złożone urządzenie do chłonnej mikrobiopsji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces i montaż mikrobiopsji skóry; miejsca aplikacji, wyniki mikroskopowe; mikrobiopsja absorbująca vs skórna.
Rysunek 2. Absorbująca mikrobiopsja umożliwiła jednoczesne pobranie próbek skóry i krwi bez pozostawienia blizny na lewym przedramieniu mężczyzny-ochotnika. (a) Porównanie mikroigieł mikrobiopsji absorbującej i skórnej. (b) Miejsca aplikacji po mikrobiopsji absorbującej i skórnej 5 min po zastosowaniu. (c,d) Mikroigły mikrobiopsji absorbującej i skórnej po zastosowaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres porównania wydajności RNA i obrazy mikroskopowe; natychmiastowe zwolnienie vs 10-sekundowe przytrzymanie.
Rycina 3. Absorpcyjna mikrobiopsja pobrała więcej krwi i próbki RNA po zastosowaniu przez 10 s. (a) 10-sekundowy czas przytrzymania po aplikacji skutkował uzyskaniem większej ilości RNA niż w przypadku natychmiastowego zwolnienia urządzenia (n = 20). Słupki błędów reprezentują S.D. ze średniej (****p<0.0001). (b,c) Reprezentatywne zdjęcia absorbcyjnych mikrobiopsji po zastosowaniu metodą „natychmiastowego zwolnienia” oraz „10-sekundowego przytrzymania”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dane RT-qPCR porównujące markery skóry i krwi w technikach mikrobiopsji; wykres słupkowy.
Rysunek 4. Porównanie poziomów ekspresji mRNA w mikrobiopsjach skóry i mikrobiopsjach absorbujących (n = 5). Ekspresja genów została znormalizowana względem genu referencyjnego RPLP0. Słupki błędów reprezentują S.D. ze średniej (*p<0.05). Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Wyniki te pokazują, że mikrobiopsja chłonna może być stosowana jako narzędzie do prostego i minimalnie inwazyjnego pobierania próbek mieszaniny skóry i krwi w celu charakterystyki molekularnej. Aplikacja urządzenia zgodnie z naszym protokołem jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych wyników, o czym świadczy różnica w ilości RNA odzyskanego za pomocą różnych protokołów aplikacji (rysunek 3). Po ekstrakcji próbki, kolejny etap przetwarzania próbki do ekstrakcji RNA jest bardzo podobny do ustalonych protokołów15,16. Oprócz początkowych etapów ekstrakcji RNA, które są modyfikowane pod kątem mikrobiopsji absorpcyjnej, kolejną kluczową zmianą jest użycie wody wolnej od RNaz w celu poprawy wyników w dalszych zastosowaniach. Ponadto warto wspomnieć, że genem referencyjnym wykorzystanym w tym badaniu jest RPLP0. RPLP0, którego funkcja jest dobrze znana dla różnych typów komórek i tkanek17, został opisany jako odpowiedni gen referencyjny do stosowania w nieczerniakowych nowotworach skóry i zmianach przedrakowych18.

Jednym z głównych ograniczeń urządzenia jest usunięcie mikrobiopsji z urządzenia, co jest czasochłonne i potencjalnie zwiększa ryzyko utraty próbki, szczególnie w przypadku wrażliwych próbek, takich jak RNA. Niemniej jednak problem można przezwyciężyć poprzez wstępne schłodzenie wszystkich sterylnych narzędzi do przetwarzania, takich jak probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml, na suchym lodzie.

Stosowanie mikrobiopsji chłonnej jest proste i nie wymaga intensywnego treningu. Konwencjonalna biopsja nie jest konieczna, ponieważ mikrobiopsja pozwala na charakterystykę molekularną za pomocą uznanych technik diagnostyki molekularnej, takich jak RT-qPCR. Aby dokładniej określić ilościowo i zademonstrować zdolność mikrobiopsji absorpcyjnej do pobierania próbek, zbadano wcześniejszą literaturę, która obejmowała ekstrakcję RNA z ludzkiej tkanki skórnej. Z typowej biopsji skóry 3,0 lub 4,0 mm, trzy badania wykazały, że wyekstrahowane ilości RNA wahały się od 50 do 200 ng na mg tkanki skórnej 19,20,21. W porównaniu z 1,43 ng RNA, które zostało odzyskane średnio z mikrobiopsji chłonnej (ryc. 3), oczekuje się, że masa pobranych tkanek skóry będzie wynosić od 0,29 do 115 μg w oparciu o ten sam stosunek RNA do tkanki z badań biopsji dziurkowej skóry.

Protokół ten nie jest pozbawiony potencjalnych pułapek, chociaż niektóre problemy można łatwo przezwyciężyć. Na przykład dane dotyczące ekstrakcji RNA sugerowały znaczną zmienność nawet przy czasie utrzymywania 10-sekundowym (Figura 3). Aby rozwiązać ten problem, jednym z potencjalnych rozwiązań jest optymalizacja protokołu aplikacji. Parametry, takie jak siła przyłożona do skóry i czas utrzymywania, powinny być testowane i optymalizowane w celu zmniejszenia różnic w ekstrakcji próbki. Innym potencjalnym problemem jest usunięcie mikrobiopsji z urządzenia, co może mieć wpływ na integralność próbki i jej odzyskiwanie. Chociaż usunięcie mikrobiopsji w celu ekstrakcji RNA jest skutecznym podejściem, cała procedura jest żmudna, a próbka może być narażona na zanieczyszczenie w tym procesie. W związku z tym modyfikacja protokołu przetwarzania próbki jest wysoce pożądana w celu zapewnienia integralności próbki i zapobieżenia utracie próby.

Oczekuje się, że po rozwiązaniu powyższych dwóch problemów urządzenie stanie się standardowym narzędziem do badań klinicznych. Ważne jest, aby pamiętać, że urządzenie przechwytuje jednocześnie zarówno próbkę skóry, jak i krwi, co powinno być brane pod uwagę podczas analizy danych dotyczących ekspresji genów. Podsumowując, protokół ten opisuje szczegóły wykonywania mikrobiopsji chłonnej jako łatwego i minimalnie inwazyjnego narzędzia do łączonego pobierania próbek skóry i krwi oraz późniejszego przetwarzania próbki w celu względnego profilowania ekspresji genów.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować NHMRC Fellowships APP1109749 i APP1111216, University of Queensland Centennial Scholarship oraz International Postgraduate Research Scholarship.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chłonna mikrobiopsja wytwarzanie i pobieranie próbek
Chłonna mikrobiopsjaTrajan Scientific and MedicalN/Ahttps://www.trajanscimed.com/
Bibuła filtracyjna Whatman, klasa 1Sigma AldrichWHA1001325N/A
RNA
Zestaw do izolacji RNA PicoPureThermoFisherKIT0214Zawiera wszystkie roztwory buforowe opisane w protokole
UltraPure DNase/RNase-Free Woda destylowanaThermoFisher10977015Poprawa jakości RNA na etapie elucji RNA
Probówka mikrowirówkowa 2,0 mL, sterylnaThomas Scientific1226S74N/A
Mikrowirówka 5415REppendorfZ605212N/A
cDNA synteza
Zestaw do syntezy cDNA SensiFASTBiolineBIO-65053N/A
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad1855196N/A
qPCR i analiza danych
SensiFAST SYBR Lo-ROX KitBiolineBIO-94005W tym odczynniki opisane w krokach reakcji qPCR
: Optyczna folia samoprzylepnaMicroAmp ThermoFisher Scinentific4311971N/A
Optyczna 384-dołkowa płytka reakcyjnaMicroAmp ThermoFisher Scinentific4343370Nie dotyczy
QuantStudio 6 Flex System do PCR w czasie rzeczywistymThermoFisher Scinentific4485694Nie dotyczy
GraphPad Prism (v6.04)GraphPadNie dotyczy; Wersja dla systemu WindowsWykresy i analiza statystyczna w krokach analizy danych qPCR
PCR startery
emRPLP0 FSigma AldrichN/AATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC
RPLP0 RSigma AldrichN/ACAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG
TYR FSigma AldrichN/ ATCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA
em>TYR RSigmaAldrich N/AAAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC
KRT14 FSigma AldrichN/ACCT CCT CCC AGT TCT CCT
KRT14 RSigma AldrichN/AACA CCT TGC CAT CG
em>CD3E FSigma AldrichN/ACAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG
CD3E RSigma AldrichN/AGTT CTC CAG AGG AGA TG
em>CD19 FSigma AldrichN/ATTC TGC CTG TGT TCC CTT G
CD19 RSigma AldrichN/AGCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T
Reakcja <<<

Bibliografia

  1. Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
  2. Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
  3. Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
  4. Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
  5. Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
  6. Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
  7. Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
  8. Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
  9. Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334(2017).
  10. Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107(2013).
  11. GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
  12. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).
  13. Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
  14. GraphPad Statistics Guide. , (1995).
  15. Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
  16. Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
  17. Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
  18. Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631(2017).
  19. Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
  20. Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438(2011).
  21. Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Minimalnie inwazyjne pobieranie próbekanaliza krwi i skóryRT-qPCRurządzenie z mikroigłamibiomarkery skóryprofilowanie ekspresji genówprobówka do wirówkikolumna do oczyszczania
Chłonne pobieranie próbek mikrobiopsji i ekstrakcja RNA do minimalnie inwazyjnej, jednoczesnej analizy krwi i skóry
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.