Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ultrasonografia wysokiej częstotliwości do analizy rozwoju płodu i łożyska in vivo

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58616

⸱

8 listopada 2018

 ,  , 
1Experimental Obstetrics and Gynecology, Medical Faculty, Otto-von-Guericke University, 2Institute of Molecular and Clinical Immunology, Medical Faculty, Otto-von-Guericke University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy technikę ultradźwięków o wysokiej częstotliwości do analizy in vivo płodów u myszy. Metoda ta pozwala na obserwację płodów i analizę parametrów łożyska, a także przepływu krwi przez matkę i płód przez cały okres ciąży.

Streszczenie

Obrazowanie ultradźwiękowe jest szeroko rozpowszechnioną metodą używaną do wykrywania anomalii narządowych i nowotworów w tkankach ludzkich i zwierzęcych. Metoda jest nieinwazyjna, nieszkodliwa i bezbolesna, a aplikacja jest łatwa, szybka i można ją wykonać w dowolnym miejscu, nawet za pomocą urządzeń mobilnych. W czasie ciąży obrazowanie ultrasonograficzne jest standardowo stosowane w celu ścisłego monitorowania rozwoju płodu. Technika ta jest ważna dla oceny wewnątrzmacicznego ograniczenia wzrostu (IUGR), powikłania ciąży o krótko- i długoterminowych konsekwencjach zdrowotnych zarówno dla matki, jak i płodu. Zrozumienie procesu IUGR jest niezbędne do opracowania skutecznych strategii terapeutycznych.

System ultrasonograficzny używany w tym manuskrypcie to urządzenie ultrasonograficzne przeznaczone do analizy małych zwierząt i może być używane w różnych dziedzinach badawczych, w tym w badaniach nad ciążą. W tym miejscu opisano zastosowanie systemu do analizy in vivo płodów matek z niedoborem komórek NK / komórek tucznych (MC), które rodzą młode z ograniczeniami wzrostu. Protokół obejmuje przygotowanie systemu, postępowanie z myszami przed i w trakcie pomiarów oraz korzystanie z trybu B, trybu kolorowego Dopplera i trybu Dopplera fali pulsacyjnej. Analizowano wielkość płodu, wielkość łożyska i dopływ krwi do płodu. Znaleźliśmy zmniejszone rozmiary implantacji i mniejsze łożyska u myszy z niedoborem NK / MC od połowy ciąży. Ponadto niedobór MC / NK był związany z brakiem i odwróconym końcowym przepływem rozkurczowym w tętnicy pępowinowej płodu (UmA) i podwyższonym wskaźnikiem oporu. Metody opisane w protokole mogą być z łatwością wykorzystane do pokrewnych i niepokrewnych tematów badawczych.

Wprowadzenie

Ultradźwięki to fale dźwiękowe o częstotliwościach przekraczających zakres słyszalny ludzkiego ucha, wyższych niż około 20 kHz1. Zwierzęta takie jak nietoperze, walie, delfiny2,3, myszy4, szczury5 i lemury myszy6 używają ultradźwięków do orientacji lub komunikacji. Ludzie wykorzystują ultradźwięki do wielu zastosowań technicznych i medycznych. Urządzenie ultradźwiękowe jest w stanie wytworzyć falę dźwiękową oraz rozprowadzić i przedstawić sygnał. Jeśli ultradźwięki napotkają przeszkodę, dźwięk jest odbijany, pochłaniany lub może przez nią przejść. Zastosowanie ultradźwięków jako metody obrazowania, zwanej ultrasonografią, jest wykorzystywane do analizy tkanek organicznych w medycynie ludzkiej lub weterynaryjnej, takich jak serce (echokardiografia)7,8, lung9, tarczyca10, nerki11, oraz drogi moczowe i rozrodcze12,13; Wykrywanie kamieni żółciowych14 i nowotwory15; oraz ocena perfuzji naczyń krwionośnych lub narządów16,17. Ultrasonografia jest standardową metodą w opiece prenatalnej w czasie ciąży, a niepełnosprawność lub upośledzenie rozwoju płodu można wcześnie rozpoznać. W szczególności wzrost płodu jest ściśle monitorowany w regularnych odstępach czasu w celu rozpoznania możliwej IUGR. Wreszcie, przepływ krwi w płodzie może być monitorowany, ponieważ może to wskazywać na ograniczenia wzrostu18,19,20,21.

Główną zaletą obrazowania ultradźwiękowego w porównaniu z innymi metodami, takimi jak radiografia, jest nieszkodliwość dźwięku dla analizowanych tkanek. Ta łatwa i szybka metoda jest nieinwazyjna, bezbolesna i może być stosowana wiele razy. Początkowy wydatek na aparat ultrasonograficzny jest kosztowny; Jednak potrzebne materiały eksploatacyjne są tanie. System ultrasonograficzny zastosowany w tym manuskrypcie jest odpowiedni dla wielu modeli zwierzęcych (tj. myszy i ryb) Podczas gdy dla ludzi urządzenie ultrasonograficzne wymaga częstotliwości 3-15 mHz, częstotliwość 15-70 mHz jest wymagana dla myszy.

Niniejszy manuskrypt opisuje protokół do korzystania z trybu B, trybu kolorowego Dopplera i trybu dopplerowskiego fali pulsacyjnej. Opis obejmuje przygotowanie myszy, a także wydajność, akwizycję i przechowywanie danych. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do różnych szczepów myszy we wszystkich dniach ciąży i może być stosowana do badania rozwoju płodu i łożyska, a także parametrów krwi matki i płodu. Tutaj wszystkie zastosowania są wyjaśnione w oparciu o nasze badania z udziałem ciężarnych myszy z niedoborem MC/NK i kontrolnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez "Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt: 42502-2-1296UniMD."

1. Procedura eksperymentalna

  1. Kojarzenie 6 do 8-tygodniowych samic myszy C57BL / 6J-Cpa3Cre / + (Cpa3Cre / +) i myszy C57BL / 6J-Cpa3 +/+ z niedoborem MC (kontrole kolonii; Cpa3+/+) z samcami BALB/c.
  2. Określ dzień ciąży (gd) 0 po potwierdzeniu czopa dopochwowego i potraktuj samice natychmiast po potwierdzeniu czopa dopochwowego.
    UWAGA: Zatyczka to plemnik mężczyzny w otworze pochwy samicy.
    1. Wstrzyknąć 250 μl PBS dootrzewnowo u kontrolnych samic Cpa3+/+.
    2. Wstrzyknąć 250 μl anty-CD122 (0,25 mg) dootrzewnowo kobietom z niedoborem MC Cpa3Cre/+.
      Uwaga: Wstrzyknięcie 0,25 mg anty-CD122 wyczerpuje obwodowe NK i uNK u samic Cpa3Cre/+ z niedoborem MC, jak opisano wcześniej22.
  3. Poczekaj, aż gd5.
    UWAGA: W gd5 istnieje najwcześniejsza możliwość analizy implantacji.
    1. Wykonaj kroki 2-5 w celu przeprowadzenia analizy ultrasonograficznej.
  4. Wykonaj obrazowanie ultrasonograficzne w gd5, 8, 10, 12 i 14.

2. Przygotowanie systemu ultrasonograficznego

  1. Włącz system (Rysunek 1A; główne zasilanie z tyłu i tryb gotowości komputera po lewej stronie), podgrzewaną platformę (Rysunek 1B; na panelu sterowania) i podgrzewacz do żelu (Rysunek 1C).
    UWAGA: Żel do ultradźwięków musi się nagrzewać przez około 0,5 godziny.
  2. Upewnij się, że jednostka izofluranu jest wystarczająco napełniona ( Rysunek 1D).
  3. Otwórz nowe badanie lub nową serię w istniejącym badaniu w przeglądarce. Wypełnij wszystkie wymagane informacje (właściciel, nazwa badania, nazwa serii, dane zwierzęcia) w oknie Informacje o badaniu. Kliknij przycisk OK.
  4. Po kliknięciu przycisku OK upewnij się, że pojawi się okno obrazowania w trybie B, a obrazowanie w trybie B rozpocznie się automatycznie.

3. Obsługa myszy

  1. Znieczulenie myszy
    1. Umieść mysz w pudełku do powalania (Rysunek 1E), zamknij pudełko, otwórz probówkę z izofluranem do pudełka do knockdown i włącz izofluran (stężenie 3,5%).
    2. Gdy mysz jest znieczulona, obniż (do stężenia 1,5%) i przekieruj przepływ izofluranu, otwierając rurkę w kierunku platformy grzewczej i zamykając przepływ do skrzynki do wybijania.
      UWAGA: Aby osiągnąć wystarczające znieczulenie, odczekaj dodatkowe 10 sekund, aż mysz przestanie się poruszać.
    3. Przenieś szybko mysz z pudełka do wybijania na platformę grzewczą (Rysunek 1F) w pozycji grzbietowej i delikatnie umieść jej nos w rurki do znieczulenia znajdującej się na górze platformy.
  2. Utrwalenie, depilacja i przygotowanie myszy do pomiaru
    1. Umieść krem ochronny pod oczami w każdym oku myszy, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
    2. Umieść jedną kroplę żelu elektrodowego na każdym z czterech miedzianych obszarów na podgrzewanej platformie (Rysunek 1F).
    3. Postukaj w łapy taśmą chirurgiczną w pokryte żelem elektrody obszary platformy grzewczej.
    4. Zawsze sprawdzaj EKG [optymalna wartość = 450-550 uderzeń/min (BPM)] i fizjologię układu oddechowego.
      UWAGA: Za pomocą sondy doodbytniczej pomiar temperatury ciała jest możliwy, ale nie jest to konieczne.
    5. Krem do depilacji nanieść na brzuch myszy, krem przetrzeć wacikiem i odczekać około 1 min. Krem usunąć kompresem nasączonym wodą. Powtórz ten krok, jeśli nie wszystkie włosy zniknęły.
    6. Nałóż podgrzany żel ultradźwiękowy na depilowaną skórę.

4. Pomiary i akwizycja obrazów i filmów

  1. Trzymaj przetwornik (Rysunek 1G) w dłoni lub zaciśnij go w urządzeniu trzymającym (Rysunek 1H; zalecane jest urządzenie trzymające).
  2. Zidentyfikuj pęcherz moczowy za pomocą przetwornika i użyj go jako punktu odniesienia. Przesuń głowicę do lewej i prawej części brzucha, aby prześledzić implantacje.
  3. Tryb B do wizualizacji struktur anatomicznych na obrazie 2D w skali szarości
    1. Przesuwaj stół przetwornika lub platformy grzewczej, na której unieruchomiona jest mysz, aż pierwsza implantacja będzie widoczna na ekranie w największym rozmiarze.
      1. Wybierz opcję Image Label (Etykieta obrazu) i wprowadź nazwę lub Frame Store (pamięć bez nazwy), aby przechowywać pojedyncze klatki, lub Cine Store, aby przechowywać cineloop dla całych pomiarów implantacji.
    2. Przesuń głowicę lub stół, aby ustawić łożysko w pozycji, w której widoczny jest przepływ krwi w UmA. Przechowuj pojedynczą klatkę lub cineloop (patrz krok 4.3.1.1) do pomiarów łożyska.
      UWAGA: Pomiary łożyska są możliwe od gd10 wzwyż.
    3. Kontynuuj wszystkie implantacje przy użyciu tej samej metody.
  4. Tryb kolorowego dopplera do wizualizacji i określenia kierunku przepływu krwi
    1. Naciśnij przycisk Kolor.
    2. Przesuń kolorowe pole (w tym obszarze sygnał jest widoczny) do wymaganej pozycji za pomocą trackballa. W razie potrzeby zmień rozmiar pola, naciskając Aktualizuj i przesuń trackball (w prawą stronę/w górę = większy; w lewą stronę/w dół = mniejszy). Gdy pole będzie miało odpowiedni rozmiar, naciśnij przycisk Wybierz.
    3. Przechowuj pojedyncze klatki lub pętle cineloop zgodnie z opisem w kroku 4.3.1.1.
  5. Tryb dopplerowski fali tętna (PW) do ilościowego określania przepływu krwi przez naczynia w tętnicy uterina (tętnica maciczna, UA) i UmA
    1. Zlokalizuj obszar zainteresowania w akwizycji kolorowego Dopplera.
      UWAGA: UA znajduje się ogonowo do pęcherza moczowego, a UmA znajduje się między płodem a łożyskiem.
    2. Naciśnij PW, a pojawi się przerywana linia. Przesuń tę linię do interesującego Cię naczynia krwionośnego i wyreguluj kąt linii za pomocą pokrętła "Kąt Dopplera" zgodnie z przepływem krwi. Naciśnij przycisk Update.
      UWAGA: Kąt między kierunkiem przepływu krwi a przetwornikiem musi być stały u wszystkich zwierząt, zwłaszcza przy użyciu kątów większych niż 60° (tutaj zastosowano 70° dla UA i 45° dla Umas).
    3. Przechowuj cineloop pojawiających się linii dopplerowskich w oknie akwizycji dopplerowskiej PW.

5. Przeglądanie i kończenie pozyskiwania danych oraz zapisywanie serii

  1. Aby przejrzeć dane, naciśnij Study Management. Przewiń do interesującego Cię obrazu miniatury i kliknij dwukrotnie przycisk Aktualizuj.
  2. Naciśnij najpierw Zarządzanie badaniem, a następnie Zamknij w oknie przeglądarki, aby zakończyć pobieranie danych i zapisać nagraną serię.
    UWAGA: Po zamknięciu serii nie jest już możliwe przechowywanie klatek lub pętli cineloop w tej serii.

6. Obsługa myszy po pobraniu danych

  1. Usuń żel ze znieczulonego zwierzęcia za pomocą suchych okładów.
  2. Ostrożnie usuń taśmę chirurgiczną z łap.
  3. Zamknąć probówkę z izofluranem (stężenie 0%).
  4. Kontynuuj analizę ultrasonograficzną w gd5, 8, 10 i 12.
    1. Umieść zwierzę samo w klatce na co najmniej 5 minut, aby miało czas na obudzenie się i orientację.
    2. Umieść mysz z powrotem w oryginalnej klatce.
      UWAGA: Nie wyłączaj izofluranu przed usunięciem żelu i taśmy chirurgicznej, ponieważ myszy budzą się bardzo szybko (około 20 s) po wyłączeniu izofluranu.
  5. Kontynuuj następującą analizę ultrasonograficzną w gd14.
    1. Poświęć samicę, zanim obudzi się z powodu zwichnięcia szyjki macicy. Otwórz zwierzę, wyjmij macicę, oddziel płody i łożyska, a następnie zmierz masę płodu i łożyska.

7. Kopiowanie i importowanie danych

  1. Zaznacz jedną lub więcej serii, klikając przycisk Eksportuj do, a następnie wybierz miejsce do skopiowania danych na dysk twardy.
  2. Otwórz oprogramowanie na komputerze i kliknij przycisk Kopiuj z, a następnie wybierz badanie/serię z dysku twardego, aby zaimportować badanie/serię do oprogramowania.
  3. Analizuj dane za pomocą oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poszczególne komponenty systemu ultradźwiękowego wykorzystanego w niniejszym manuskrypcie przedstawiono w Rysunek 1. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy ultrasonograficzne uzyskane w trybie B w dniach gd5, 8, 10 i 12 (B) or odpowiadające im wyniki pomiaru obszaru implantacji (A)wykazując znacząco zmniejszony obszar implantacji komórek Cpa3 leczonych przeciwciałem anty-CD12Cre/+

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Za pomocą naszego systemu ultrasonograficznego wykazaliśmy ograniczenie wzrostu płodu u matek z niedoborem MC/NK od gd10. Ponadto w gd10 i 12 zaobserwowaliśmy zmniejszone wymiary łożyska, a w gd14 brak lub odwrócenie końcowego przepływu rozkurczowego w UmAs niektórych płodów myszy z niedoborem uMC / uNK. Ten objaw słabego unaczynienia był związany ze znacznym wskaźnikiem oporu tętnic wskazującym na IUGR. Wyniki potwierdzają istotną rolę uMC i uNK w ciąży i dobrostanie płodu oraz w zrozumieniu przebiegu IUGR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wielkie podziękowania dla firmy Imaging Instrument (szczególnie dla Magdaleny Steiner, Katrin Suppelt i Sandry Meyer) za ich miłe i szybkie wsparcie oraz za szybkie i wyczerpujące odpowiedzi na wszystkie nasze pytania dotyczące systemu obrazowania i jego użytkowania. Jesteśmy wdzięczni prof. Hansowi-Reimerowi Rodewaldowi i dr. Thorstenowi Feyerabendowi (DKFZ Heidelberg, Niemcy) za udostępnienie kolonii Cpa3. Dodatkowo dziękujemy Stefanie Langwisch, która była odpowiedzialna za kolonie myszy i która wygenerowała zdjęcia na rysunku 1.

Praca i System Obrazowania zostały sfinansowane z grantów od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dla A.C.Z. (ZE526/6-1 i AZ526/6-2), które były projektami osadzonymi w programie priorytetowym DFG 1394 "Komórki tuczne w zdrowiu i chorobie."

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LEAF anty-Maus CD122 (IL-2Rb)BioLegend123204Klon TM-β 1; 500 i mikro;
g System Vevo 2100  FujiFilm VisualSonics Inc.Przetwornik  MS550D-0421
Oprogramowanie Vevo LAB  FujiFilm VisualSonics Inc.
IsofluraneBaxterPZN: 6497131
Żel elektrodyParker12_8
Taśma chirurgiczna3M Transpore1527-1
Krem pod oczyBayerPZN: 1578675
Aplikatory z bawełnianą końcówkąRaucotupf11969100 sztuk
Krem do depilacjiReckitt Benckiser
KompresyNobamed Paul Danz AG85611010 x 10 cm
Żel do ultradźwiękówGello GmbH246000
2077626

Bibliografia

  1. Abramowicz, J. S., Kremkau, F. W., Merz, E. Ultraschall in der Geburtshilfe: Kann der Fötus die Ultraschallwelle hören und die Hitze spüren? Ultraschall in der Medizin. 33 (3), Stuttgart, Germany. 215-217 (1980).
  2. Jones, G. Echolocation. Current Biology. 15 (13), R484-R488 (2005).
  3. Simmons, J. A. The sonar receiver of the bat. Annals of the New York Academy of Sciences. 188, 161-174 (1971).
  4. Zala, S. M., Reitschmidt, D., Noll, A., Balazs, P., Penn, D. J. Sex-dependent modulation of ultrasonic vocalizations in house mice (Mus musculus musculus). Public Library of Science ONE. 12 (12), e0188647(2017).
  5. Wöhr, M., Seffer, D., Schwarting, R. K. W. Studying Socio-Affective Communication in Rats through Playback of Ultrasonic Vocalizations. Current Protocols in Neuroscience. 75, 1-8 (2016).
  6. Hasiniaina, A. F., et al. High frequency/ultrasonic communication in a critically endangered nocturnal primate, Claire's mouse lemur (Microcebus mamiratra). American Journal of Primatology. , e22866(2018).
  7. Yeo, L., Romero, R. Color and power Doppler combined with Fetal Intelligent Navigation Echocardiography (FINE) to evaluate the fetal heart. Ultrasound in Obstetrics & Gynecology. 50 (4), 476-491 (2017).
  8. Teichholz, L. E. Echocardiography in valvular heart disease. Progress in Cardiovascular Diseases. 17 (4), 283-302 (1975).
  9. Zechner, P. M., et al. Lungensonographie in der Akut- und Intensivmedizin. Der Anaesthesist. 61 (7), 608-617 (2012).
  10. Blank, W., Schuler, A. Sonografie der Schilddrüse - Update 2017. Praxis. 106 (12), 631-640 (2017).
  11. Hansen, K. L., Nielsen, M. B., Ewertsen, C. Ultrasonography of the Kidney: A Pictorial Review. Diagnostics. 6 (1), Basel, Switzerland. (2015).
  12. Older, R. A., Watson, L. R. Ultrasound anatomy of the normal male reproductive tract. Journal of Clinical Ultrasound. 24 (8), 389-404 (1996).
  13. Reeves, J. J., Rantanen, N. W., Hauser, M. Transrectal real-time ultrasound scanning of the cow reproductive tract. Theriogenology. 21 (3), 485-494 (1984).
  14. Sharma, M., Somani, P., Sunkara, T. Imaging of gall bladder by endoscopic ultrasound. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 10 (1), 10-15 (2018).
  15. Weskott, H. -P. Ultraschall in der Diagnostik maligner Lymphome. Der Radiologe. 52 (4), 347-359 (2012).
  16. Shirinifard, A., Thiagarajan, S., Johnson, M. D., Calabrese, C., Sablauer, A. Measuring Absolute Blood Perfusion in Mice Using Dynamic Contrast-Enhanced Ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (8), 1628-1638 (2017).
  17. Quaia, E. Assessment of tissue perfusion by contrast-enhanced ultrasound. European Radiology. 21 (3), 604-615 (2011).
  18. Saw, S. N., Poh, Y. W., Chia, D., Biswas, A., Zaini Mattar, C. N., Yap, C. H. Characterization of the hemodynamic wall shear stresses in human umbilical vessels from normal and intrauterine growth restricted pregnancies. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2018).
  19. Kessler, J., Rasmussen, S., Godfrey, K., Hanson, M., Kiserud, T. Fetal growth restriction is associated with prioritization of umbilical blood flow to the left hepatic lobe at the expense of the right lobe. Pediatric Research. 66 (1), 113-117 (2009).
  20. Laurin, J., Lingman, G., Marsál, K., Persson, P. H. Fetal blood flow in pregnancies complicated by intrauterine growth retardation. Obstetrics and Gynecology. 69 (6), 895-902 (1987).
  21. Arduini, D., Rizzo, G., Romanini, C., Mancuso, S. Fetal blood flow velocity waveforms as predictors of growth retardation. Obstetrics and Gynecology. 70 (1), 7-10 (1987).
  22. Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106(2017).
  23. Meyer, N., Schüler, T., Zenclussen, A. C. Simultaneous Ablation of Uterine Natural Killer Cells and Uterine Mast Cells in Mice Leads to Poor Vascularization and Abnormal Doppler Measurements That Compromise Fetal Well-being. Frontiers in Immunology. 8, 1913(2017).
  24. Evans, D. H., Jensen, J. A., Nielsen, M. B. Ultrasonic color Doppler imaging. Interface Focus. 1 (4), 490-502 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozwój płoduanaliza łożyskaobrazowanie in vivoobrazowanie w trybie Bkolorowy DopplerDoppler pulsacyjnywskaźnik opornościtętnica pępowinowapomiary ciążowe
Ultrasonografia wysokiej częstotliwości do analizy rozwoju płodu i łożyska in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.