Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół i implementację Methyl-Seq, platformy epigenomicznej, wykorzystującej model szczura do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z przewlekłym narażeniem na stres. Wyniki pokazują, że platforma Methyl-Seq u szczurów jest w stanie wykryć różnice w metylacji, które wynikają z ekspozycji na stres u szczurów.

Streszczenie

W miarę jak genomy coraz szerszego rodzaju zwierząt stają się dostępne, rośnie zapotrzebowanie na narzędzia, które mogą uchwycić dynamiczne zmiany epigenetyczne w tych modelach zwierzęcych. Szczur jest szczególnym zwierzęciem modelowym, w przypadku którego narzędzie epigenetyczne może uzupełnić wiele badań farmakologicznych i behawioralnych, aby dostarczyć wnikliwych informacji mechanistycznych. W tym celu dostosowaliśmy system SureSelect Target Capture System (określany jako Methyl-Seq) dla szczura, który może oceniać poziomy metylacji DNA w całym genomie szczura. Projekt na szczurach był ukierunkowany na promotory, wyspy CpG, wybrzeża wysp i regiony bogate w GC ze wszystkich genów RefSeq.

Aby wdrożyć platformę w eksperymencie na szczurach, samce szczurów Sprague Dawley były narażone na przewlekły zmienny stres przez 3 tygodnie, po czym pobrano próbki krwi do ekstrakcji genomowego DNA. Biblioteki Methyl-Seq zostały zbudowane z próbek DNA szczurów poprzez ścinanie, ligację adaptera, wzbogacanie celu, konwersję wodorosiarczynu i multipleksowanie. Biblioteki zsekwencjonowano na platformie sekwencjonowania nowej generacji, a sekwencjonowane odczyty przeanalizowano w celu zidentyfikowania DMR między DNA zestresowanych i niezestresowanych szczurów. Najlepsze kandydatury DMR zostały niezależnie zweryfikowane metodą pirosekwencjonowania wodorosiarczynowego, aby potwierdzić solidność platformy.

Wyniki pokazują, że szczurza platforma Methyl-Seq jest użytecznym narzędziem epigenetycznym, które może uchwycić zmiany metylacji wywołane ekspozycją na stres.

Wprowadzenie

Postępy w sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym doprowadziły do bogactwa sekwencji genomowych zarówno dla organizmów modelowych, jak i niemodelowych. Dostępność takich sekwencji ułatwiła badania w dziedzinie genetyki, genomiki porównawczej i transkryptomiki. Na przykład, dostępne sekwencje genomowe są bardzo przydatne do ujednolicania danych sekwencjonowania z eksperymentów ChIP-Seq, które wzbogacają DNA na podstawie jego związku z modyfikacjami histonów¹, lub sekwencjonowanie wodorosiarczynowe, które mierzy metylację DNA poprzez wykrywanie uracylu powstałego w wyniku konwersji wodorosiarczynu niemetylowanych cytozyn². Wystąpiły jednak opóźnienia we wdrażaniu platform epigenomicznych, które uwzględniają w swoim projekcie dostępne dane z sekwencjonowania genomu, ze względu na brak danych z adnotacjami dotyczącymi sekwencji regulatorowych specyficznych dla gatunku, które mogą wpływać na funkcję genów.

W szczególności, metylacja DNA jest jedną z najczęściej badanych modyfikacji epigenetycznych DNA, która może wykorzystać dostępne dane genomiczne do budowy platformy metylomicznej. Jednym z takich przykładów jest platforma oparta na tablicy dla ludzkiego methylome³, która jest szeroko stosowana w różnych dyscyplinach, od onkologii po psychiatrię^4,5. Niestety, podobne platformy dla modeli zwierzęcych innych niż ludzie są rzadkie, ponieważ praktycznie nie ma powszechnie stosowanych platform, które wykorzystywałyby sekwencję genomową w swoim pierwotnym projekcie.

Powszechną metodą oceny krajobrazu metylomicznego modeli zwierzęcych innych niż ludzkie jest sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji (RRBS)⁶. Takie podejście pozwala przezwyciężyć koszty sekwencjonowania wodorosiarczynów całego genomu, które, zapewniając kompleksowy krajobraz metylomiki, zapewnia mniejsze pokrycie głębokości odczytu ze względu na koszty i ograniczoną ilość informacji funkcjonalnych w dużych obszarach genomu klasy ubogiej w geny2. RRBS obejmuje restrykcyjne, trawienie i selekcję wielkości genomowego DNA w celu wzbogacenia o wysoce bogate w GC sekwencje, takie jak wyspy CpG, które są powszechnie znajdowane w pobliżu promotorów genów i uważa się, że odgrywają rolę w regulacji genów⁷. Chociaż metoda RRBS została wykorzystana w wielu ważnych badaniach, jej zależność od enzymów restrykcyjnych nie jest pozbawiona znaczących wyzwań i ograniczeń. Na przykład wzbogacenie sekwencji bogatych w GC w RRBS jest całkowicie zależne od obecności określonych sekwencji rozpoznawanych przez enzym restrykcyjny, a następnie selekcji wielkości za pomocą elektroforezy. Oznacza to, że wszystkie obszary genomu, które nie zawierają tych miejsc ograniczenia, są wykluczane podczas wyboru rozmiaru. Ponadto porównania międzygatunkowe są trudne, chyba że te same miejsca ograniczeń występują w tych samych loci wśród różnych gatunków.

Jednym z podejść do pokonania ograniczeń RRBS jest użycie metody wzbogacania, która wykorzystuje opublikowaną sekwencję genomową w projekcie platformy. Oparta na macierzy platforma ludzka wykorzystuje sondy starterowe zaprojektowane przeciwko określonym CpG do specyficznego dla alleli (CG vs. TG po konwersji wodorosiarczynu), docelowego wyżarzania i wydłużania startera. Jego konstrukcja odzwierciedla nie tylko dostępną sekwencję ludzkiego genomu, ale także eksperymentalnie zweryfikowane regiony regulatorowe uzyskane z wielu linii badawczych, takich jak ENCODE i ENSEMBL⁸. Pomimo szerokiego zastosowania w badaniach metylomicznych u ludzi, podobna platforma nie istnieje dla zwierząt modelowych. Ponadto format oparty na tablicy nakłada znaczne ograniczenia na powierzchnię dostępną do umieszczenia sondy. W ciągu ostatnich kilku lat podjęto wysiłki w celu połączenia specyficzności docelowej zapewnianej przez konstrukcję sondy wychwytującej z funkcją wysokiej przepustowości sekwencjonowania nowej generacji. Takie przedsięwzięcie zaowocowało opracowaniem opartego na sekwencjonowaniu systemu wzbogacania celu dla genomu myszy (mysi Methyl-Seq), który został wykorzystany do identyfikacji specyficznych dla mózgu lub wywołanych glikokortykosteroidami różnic w metylacji^9,10. Podobne platformy dla innych zwierząt modelowych i niemodelowych są potrzebne, aby ułatwić badania epigenomiczne na tych zwierzętach.

Tutaj demonstrujemy implementację tej nowatorskiej platformy do przeprowadzania analizy metylomicznej na szczurze. Szczur służył jako ważny model zwierzęcy w farmakologii, metabolizmie, neuroendokrynologii i zachowaniu. Na przykład istnieje rosnąca potrzeba zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw toksyczności leków, otyłości, reakcji na stres lub uzależnienia od narkotyków. Wysokoprzepustowa platforma zdolna do wychwytywania zmian metylomomicznych związanych z tymi schorzeniami pogłębiłaby naszą wiedzę na temat tych mechanizmów. Ponieważ genom szczura nadal nie ma adnotacji dla regionów regulacyjnych, włączyliśmy nieredundantne promotory, wyspy CpG, wyspy wysp^{11 i wcześniej zidentyfikowaliśmy} sekwencje bogate w GC do szczurzej platformy Methyl-Seq ¹².

Aby ocenić pomyślne zaprojektowanie i wdrożenie platformy SureSelect Target Enrichment (ogólnie określanej jako Methyl-Seq) dla genomu szczura, użyliśmy szczurzego modelu przewlekłego zmiennego stresu (CVS)¹³ do identyfikacji różnie metylowanych regionów między zwierzętami niezestresowanymi i zestresowanymi. Nasz projekt, protokół i implementacja platformy mogą być przydatne dla badaczy, którzy mogą chcieć przeprowadzić kompleksowe i bezstronne badanie epigenetyczne na organizmie, którego sekwencja genomowa jest już dostępna, ale pozostaje słabo opisana.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi, w tym z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Johns Hopkins School of Medicine.

1. Zwierzęta

1. Uzyskaj samce dorastających szczurów Sprague-Dawley w wieku 4 tygodni. Trzymaj zwierzęta w klatkach dla szczurów z poliwęglanu w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności w 12-godzinnym cyklu świetlnym i 12-godzinnym ciemnym z początkiem światła o godzinie 0600. Zapewnij zwierzętom dostęp do wody ad libitum.
2. Pozwól szczurom zaaklimatyzować się przez 1 tydzień, aby zmniejszyć stres związany z transportem. Trzymaj zwierzęta w parach (N=16), aby wykluczyć stres izolacyjny, a w wieku 5 tygodni rozpocznij schemat przewlekłego stresu zmiennego (CVS) przez 3 tygodnie.

2. Przewlekły zmienny stres

1. Podawaj schemat CVS raz rano (9-11 rano) i raz po południu (13-3 po południu) o nieregularnych porach, aby rutyna była nieprzewidywalna. Włącz łagodne stresory z nocy. Schemat CVS obejmuje: 1) 3 godziny w butli przytrzymującej; 2) 10 min pływania; 3) 3-godzinne pochylenie klatki 4) 1-godzinna platforma do powolnego wytrząsania; i 5) 1 h w komorze chłodniczej o temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Nocne czynniki stresogenne obejmują zatłoczenie społeczne (5 osób na klatkę), izolację społeczną, mokrą ściółkę, ograniczenie jedzenia i włączenie światła. Typowy tygodniowy harmonogram reżimu stresu przedstawiono w tabeli 1.

3. Testy endokrynologiczne

1. Określ poziomy kortykosteronu (CORT) za pomocą próbek krwi z ogona (~50 μL) pobranych w tym samym czasie (9 rano) dwa razy w tygodniu przez cały czas trwania eksperymentu, przed schematem CVS w celu ustalenia wyjściowego poziomu hormonów (Dzień 0), raz w środku tygodniowego CVS (dni 4, 11 i 18), po każdych 7 dniach CVS (dni 7 i 14), oraz na zakończenie CVS (dzień 21). Zbierz próbki krwi przed codziennym schematem stresu.
   1. Pobrać ostatnią próbkę krwi z tułowia podczas eutanazji (dzień 25) w celu RIA i ekstrakcji genomowego DNA.
2. Odwirować wszystkie próbki krwi (600 x g, 4 °C, 10 min) w celu oddzielenia osocza od komórek krwi. Odpipetować plazmę (supernatant) i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.
3. Rozmrozić i użyć osocza do określenia poziomów CORT za pomocą testu radioimmunologicznego (RIA). Upewnij się, że 3-tygodniowy poziom CORT w osoczu jest podwyższony u zwierząt zestresowanych, aby zweryfikować solidność schematu stresu.

4. Zachowanie

1. Po schemacie CVS (dni 23-24) oceń każde zwierzę pod kątem zachowania podobnego do lęku na podwyższonym labiryncie plus (EPM)¹⁴.
2. Za pomocą kamery wideo nagrywaj zwierzęta na aparacie EPM przez 300 sekund i oceń czas spędzony w centrum, z zamkniętymi ramionami i otwartymi ramionami.

5. Projekt szczura Methyl-Seq

1. Korzystając z przeglądarki UCSC Genome Browser, uzyskaj nienadmiarowe współrzędne genomowe (rat nov 2004 rn4 assembly) dla wysp CpG i wybrzeży wysp (± 1 kb flankujących wyspy CpG), promotorów (± 1 kb każdego TSS) każdego genu RefSeq i innych sekwencji, które mogą być dostępne w odpowiedniej literaturze.
   Uwaga: Dla szczura Methyl-Seq dodano dodatkowe sekwencje bogate w GC z poprzedniej platformy metylacji opartej na tablicy¹². W przypadku regionów większych niż 5 kb/s próbkowano naprzemienne regiony o długości 500 kb/s, a następnie 1 kb/s, które zostały pominięte. Ostateczny projekt Methyl-Seq dla szczurów składa się z 111 Mb/s, 2,3 miliona CpG; i średni rozmiar regionu 594 b/s. Jego celem jest 228 800 unikalnych loci.
2. Wprowadź skompilowaną listę współrzędnych genomowych do dostępnego na rynku oprogramowania do projektowania przechwytywania celów w celu odpowiedniego zaprojektowania sondy.

6. Budowa biblioteki Rat Methyl-Seq z genomowego DNA

UWAGA: Aby wyeliminować efekty wsadowe, przetwarzaj wiele próbek jednocześnie i odpowiednio zwiększaj miksy główne. Ekstrakcja DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA. Metody oparte na kolumnie lub strącaniu dają wysokiej jakości genomowe DNA (stosunek 260/280 ~ 1,8). Nie zaleca się stosowania metod opartych na fenolach. Elutować lub ponownie zawiesić DNA w buforze o niskiej zawartości TE (10 mM TE, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).

1. Przygotowanie próbki
   UWAGA: Na każdym etapie korzystania z kulek magnetycznych wiążących DNA, upewnij się, że kulki są zaaklimatyzowane do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut i dobrze wymieszane przed użyciem.
   1. Ścinanie DNA
      1. Użyj fluorometru, aby określić początkowe stężenie dwuniciowego DNA w każdej próbce. Rozcieńczyć >1 μg gDNA do 50 μl buforem o niskiej zawartości TE (10 mM TE, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) w probówkach wirówkowych o niskiej zawartości wiązania DNA.
      2. Ścinanie próbek za pomocą sonikatora izotermicznego (10% cykl pracy, 5 intensywności, 200 cykli na impuls, 6 cykli po 60 s, przemiatanie częstotliwości, 4 °C).
      3. Oceń jakość DNA za pomocą systemu opartego na elektroforezie, który mierzy rozmiar i ilość DNA.
         UWAGA: Zalecana ilość DNA to 1 μg lub 3 μg. W przypadku ograniczonej ilości materiału wyjściowego najmniejsza ilość wejściowa powinna wynosić >500 ng, ponieważ mniejsze ilości wpłyną niekorzystnie na ilość i jakość generowanych bibliotek.
   2. Naprawa DNA kończy się.
      1. Użyj zestawu Methyl-Seq dla szczurów, aby przygotować End-repair Master Mix na lodzie. Dodać 52 μl mieszaniny do każdej próbki i inkubować w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy (20 °C przez 30 minut, 4 °C przetrzymywanie).
         Mieszanka główna naprawy końcowej (na próbkę):
         35,2 μL wody
         10 μL buforu do naprawy końcowej (10x)
         1,6 μl dNTP Mix
         1 μl polimerazy DNA T4
         2 μl polimerazy DNA Klenowa
         2,2 μl kinazy polinukleotydowej T4
      2. Oczyść próbki za pomocą 180 μl kulek magnetycznych wiążących DNA i 400 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu na próbkę. Dodać 180 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Granulki kulkowe, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulat w 200 μL 70% etanolu. Usuń etanol i powtórz mycie raz.
      3. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania jak największej ilości etanolu. Suszyć w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 3–5 minut, aż granulka kulki całkowicie wyschnie. Zawiesić w 44 μl wody wolnej od nukleaz i zebrać około 42 μl supernatantu.
         Punkt zatrzymania: Po naprawieniu końcówek DNA, próbki mogą być zapieczętowane i przechowywane w temperaturze -20 °C.
   3. Adenylate kończy się na 3 '.
      1. Przygotuj Adenylation Master Mix na lodzie. Dodać 9 μl mieszaniny do każdej próbki i inkubować w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy (37 °C przez 30 minut, 4 °C utrzymywanie).
         Mieszanka główna adenylacji (na próbkę):
         5 μl buforu Klenowa
         1 μl dATP
         3 μl polimerazy DNA Klenowa
      2. Oczyść próbki za pomocą 90 μl kulek magnetycznych wiążących DNA i 400 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu na próbkę. Dodać 90 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Granulki kulkowe, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulat w 200 μL 70% etanolu. Usuń etanol i powtórz mycie raz.
      3. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania jak największej ilości etanolu. Suszyć w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 3–5 minut, aż granulka kulki całkowicie wyschnie. Zawiesić w 35 μl wody wolnej od nukleaz i zebrać około 33,5 μl supernatantu.
   4. Zżeluj metylowany adapter.
      1. Przygotować Ligation Master Mix na lodzie i dodać 16,5 μl mieszanki do każdej próbki. Inkubować w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy (20 °C przez 15 min, 4 °C trzymanie).
         Mieszanka główna ligacji (na próbkę):
         2,5 μL wody
         2,5 μl metylo-seq metylowanego adaptera
         10 μL buforu ligazy DNA T4 (5x)
         1,5 μl ligazy DNA T4
      2. Oczyść próbki za pomocą 90 μl kulek magnetycznych wiążących DNA i 400 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu na próbkę. Dodać 90 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Granulki kulkuje, usuwają supernatant i ponownie zawieszają granulki w 200 μl 70% etanolu. Usuń etanol i powtórz mycie raz.
      3. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania jak największej ilości etanolu. Suszyć w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 3–5 minut, aż granulka kulki całkowicie wyschnie. Zawiesić w 22 μl wody wolnej od nukleaz i zebrać około 22 μl supernatantu. Oceń jakość za pomocą bioanalizatora.
         Uwaga: Jeśli całkowita ilość DNA jest mniejsza niż 500 ng, należy ścinać i przetwarzać dodatkowe DNA przed przystąpieniem do kolejnych etapów. Jeśli średni rozmiar DNA nie zwiększa się o więcej niż 30 punktów bazowych, sprawdź, czy odczynniki są nowe, ponieważ polimeraza DNA T4, ligaza Klenowa i/lub ligaza T4 mogą być stare.
         Punkt zatrzymania: Po podwiązaniu metylowanego adaptera próbki mogą być szczelnie zamknięte i przechowywane w temperaturze -20 °C.
2. krzyżowanie
   1. Przenieść próbki do probówek mikrowirówek o niskim stopniu wiązania DNA i użyć podgrzanego koncentratora próżniowego, aby zmniejszyć objętość próbki do mniej niż 3,4 μl. Rozpuść próbki do 3,4 μl.
      UWAGA: Zagęścić próbki do około ~3 μl, aby upewnić się, że próbki zostaną usunięte z koncentratora próżniowego, zanim cała ciecz odparuje.
   2. Przygotuj bufor hybrydyzacyjny w temperaturze pokojowej i Methyl-Seq Block Mix na lodzie. Dodać 5,6 μl mieszanki blokowej Methyl-Seq do każdej próbki i inkubować w termocyklerze (95 °C przez 5 min, 65 °C przez 2 min, 65 °C utrzymywać w 65 °C).
      Bufor hybrydyzacyjny (na próbkę):
      6,63 μl Methyl-Seq Hyb 1
      0,27 μl Methyl-Seq Hyb 2
      2,65 μl Methyl-Seq Hyb 3
      3,45 μl Methyl-Seq Hyb 4
      Methyl-Seq Block Mix (na próbkę):
      2,5 μl bloku indeksującego Methyl-Seq 1
      2,5 μl bloku metylu 2
      0,6 μl Methyl-Seq Block 3
   3. Przygotuj mieszankę bloków RNazy i mieszankę hybrydyzacji biblioteki przechwytywania. Dodać 20 μl mieszanki hybrydyzacyjnej z biblioteki przechwytywania do każdej próbki i inkubować w temperaturze 65 °C przez co najmniej 16 godzin
      Mieszanka blokowa RNazy (na próbkę):
      0,5 μl bloku RNazy
      1,5 μL wody
      Mieszanka hybrydyzacji biblioteki przechwytywania (na próbkę):
      13 μl buforu hybrydyzacyjnego
      2 μl bloku RNazy Mix
      5 μL biblioteki wychwytywania mertylu u szczurów
      UWAGA: Utrzymuj reakcje w temperaturze 65 °C podczas dodawania mieszanki hybrydyzacyjnej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
   4. Porcję 50 μl kulek magnetycznych streptawidyny na próbkę do nowej 8-dołkowej probówki paskowej. Przemyć kulki 200 μl buforu wiążącego Methyl-Seq. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania supernatantu między każdym praniem, co daje w sumie 3 prania. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić kulki streptawidyny w 200 μl buforu wiążącego metylo-sekr.
   5. Dodać próbki do 200 μl przemytych kulek magnetycznych streptawidyny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut za pomocą mieszalnika obrotowego. Podczas mieszania podatkować 200 μl buforu 2 do płukania metodą sekwencjonu metylu do trzech dołków na 96-dołkową płytkę na próbkę i umieścić w termocyklerze w celu wstępnego ogrzania do temperatury 65 °C.
   6. Po inkubacji osadzać kulki magnetyczne streptawidyny za pomocą płytki magnetycznej i ponownie zawieś kulki w 200 μl buforu do płukania metylu 1. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Użyj płytki magnetycznej do osadzania i odrzucania supernatantu.
   7. Umyj kulki 3 razy za pomocą Methyl-Seq Wash Buffer 2: ponownie zawiesić granulki kulek w 200 μl buforu do płukania 2 (wstępnie podgrzanego w kroku 6.2.5), inkubować kulki w termocyklerze (65 °C, 10 min) i granulki. Wyrzuć supernatant po każdym praniu za pomocą płytki magnetycznej.
      UWAGA: Utrzymuj reakcje hybrydyzacji w temperaturze 65 °C podczas dodawania buforu myjącego 2, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
   8. Dodać 20 μl buforu elucyjnego Methyl-Seq do przemytych kulek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min. Za pomocą płytki magnetycznej obrać kulki i przenieść supernatant do nowej probówki paskowej. Wyrzuć koraliki.
      Uwaga: Podczas inkubacji przygotować odczynnik do konwersji wodorosiarczynu.
3. Konwersja wodorosiarczynu
   UWAGA: Przeprowadzić konwersję wodorosiarczynową eluowanego ssDNA przy użyciu odpowiednich odczynników i instrukcji z dostępnego w handlu zestawu do konwersji wodorosiarczynu.
   1. Dodać 130 μl przygotowanego odczynnika konwersji wodorosiarczynu do supernatantu z poprzedniego etapu. Podzielić każdą ze 150 μl reakcji równo na dwie studzienki. Inkubować w termocyklerze (64 °C przez 2,5 h, 4 °C trzymanie).
      UWAGA: Reakcja 150 μl jest podzielona równo na dwie oddzielne studzienki, aby zapewnić jednorodną temperaturę. Po inkubacji przez 2,5 godziny natychmiast przejdź do następnego kroku.
   2. Związać próbki z kolumnami wirowymi, dodając 600 μl buforu wiążącego i przepłukać raz 100 μl buforu do przemywania. Kolumny wirówkowe (15 000 x g, 1 min) między wszystkimi etapami konwersji wodorosiarczynu i przepływają odrzuty.
   3. Próbki odsulfonianów przez dodanie 200 μl buforu odsiarczającego do kolumn. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 - 20 minut. Powtórz wirowanie i wyrzuć przepływ.
   4. Przepłukać kolumny dwukrotnie 200 μl buforu do mycia. Eluować każdą próbkę, dodając 10 μl buforu elucyjnego do kolumny, inkubując przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i odwirowując (15 000 x g, 1 min). Powtórzyć etap elucji, uzyskując łącznie 20 μl.
   5. Przygotować reakcję PCR Master Mix 1 na lodzie. Do każdej próbki dodać 82 μl mieszanki. Inkubować w termocyklerze za pomocą następującego programu.
      Główna mieszanka reakcji PCR 1 (na próbkę):
      30 μL wody
      50 μL preparatu Methyl-Seq PCR Master Mix
      1 μl podkładu Methyl-Seq PCR1 Primer F
      1 μL preparatu Methyl-Seq PCR1 Primer R
      Program termocyklera:
      Etap 1, 1 cykl: 95 °C 2 min
      Etap 2, 8 cykli: 95 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s
      Etap 3, 1 cykl: 72 °C 7 min
      Etap 4, 1 cykl: 4 °C Przytrzymaj
   6. Oczyść próbki za pomocą 180 μl kulek magnetycznych wiążących DNA i 400 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu na próbkę. Dodać 180 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Granulki kulkowe, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulat w 200 μL 70% etanolu. Usuń etanol i powtórz mycie raz.
   7. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania jak największej ilości etanolu. Suszyć w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 3–5 minut, aż granulka kulki całkowicie wyschnie. Zawiesić w 21 μl wody wolnej od nukleaz i zebrać około 19,5 μl supernatantu.
4. Indeksowania
   1. Przygotuj reakcję PCR Master Mix 2 na lodzie. Do każdej próbki dodać 25,5 μl Master Mix 2. Dodać 5 μl komercyjnych starterów indeksujących do pojedynczych próbek i inkubować w termocyklerze.
      PCR Reaction Master Mix 2 (na próbkę):
      25 μL Methyl-Seq PCR Master Mix
      0,5 μl wspólnego podkładu indeksującego methyl-seq
      Program termocyklera:
      Etap 1, 1 cykl: 95 °C 2 min
      Etap 2, 6 cykli: 95 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s
      Etap 3, 1 cykl: 72 °C 7 min
      Etap 4, 1 cykl: 4 °C Hold
      UWAGA: Dodatkowe cykle (2 - 3) mogą być konieczne, jeśli początkowe stężenie DNA jest poniżej zalecanych wartości.
   2. Oczyść próbki za pomocą 90 μl kulek magnetycznych wiążących DNA i 400 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu na próbkę. Dodać 90 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Granulki kulkowe, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulat w 200 μL 70% etanolu. Usuń etanol i powtórz mycie raz.
   3. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania jak największej ilości etanolu. Suszyć w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 3–5 minut, aż granulka kulki całkowicie wyschnie. Zawiesić w 24 μl wody wolnej od nukleaz i zebrać około 24 μl supernatantu.
   4. Oceń stężenie i wielkość bp za pomocą odczynników do wykrywania DNA o wysokiej czułości w bioanalizatorze.
      Uwaga: Jeśli bioanalizator nie wykryje obecności DNA z biblioteki, powtórz kroki przygotowania z dodatkowym DNA.
      Punkt zatrzymania: Po oczyszczeniu zindeksowane próbki mogą być szczelnie zamknięte i przechowywane w temperaturze -20 °C.
   5. Łączenie próbek dla odpowiedniej używanej platformy sekwencjonowania nowej generacji.
      1. Korzystając z danych o stężeniu z bioanalizatora, który określa molowość DNA na podstawie wielkości biblioteki i ilości w danej objętości, rozcieńczyć buforem o niskiej zawartości TE (6.1.1.1) i połączyć wszystkie próbki do końcowego stężenia 15 pM.
         UWAGA: Bardziej czułą metodą ilościowego określania biblioteki jest ilościowy PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów, które są ukierunkowane na ligowane adaptery.
      2. Uruchom próbki zbiorcze na liczbie linii, która jest wystarczająca dla 4 próbek na linię w sekwencerze nowej generacji.
         UWAGA: Na przykład, jeśli 16 próbek biblioteki zostało jednoznacznie zindeksowanych i połączonych, uruchom biblioteki na 4 torach, co odpowiada 4 próbkom na linię.

7. Sekwencjonowanie na sekwencerze nowej generacji

1. Wyślij próbki do instytucjonalnego rdzenia sekwencjonowania w celu zgrupowania biblioteki Methyl-Seq, a następnie sekwencjonowania na maszynie do sekwencjonowania nowej generacji.

8. Analiza w celu identyfikacji DMR

1. Zaimplementuj Bismark¹⁵, który wywołuje Bowtie 2.0 jako wewnętrzny wyrównywacz sekwencji^16,17, aby wyrównać surowe odczyty wejściowe do genomu z dodatnią nicią przekształconą w wodorosiarczyn. Po wyrównaniu użyj Bismark_methylation_extractor do przeprowadzenia kontroli jakości i przypisania szacowanej wartości metylacji do każdego CpG.
2. Wygeneruj listę DMR-ów za pomocą pakietu BS-Seq¹⁸ w Bioconductor. Filtruj DMR na podstawie liczby większej niż 3 kolejnych CpG i wartości P <0,05,
   UWAGA: Wygeneruj listę DMR, która zawiera współrzędne genomowe, odległość do najbliższego genu RefSeq, liczbę CpG w każdym DMR, średnią% wartość metylacji CpG w DMR dla dwóch grup porównawczych (np. zestresowany vs. nieobciążony), wartość P i wartość FDR (wskaźnik fałszywych odkryć). Użyj listy DMR, tj. współrzędnych genomowych, do zaprojektowania starterów pirosekwencjonowania do walidacji.

9. Walidacja za pomocą pirosekwencjonowania wodorosiarczynu

1. Projekt podkładu
   1. Zaprojektuj startery do PCR wodorosiarczynu i pirosekwencjonowania. Zaprojektuj dwa zestawy starterów PCR (na zewnątrz i zagnieżdżone) tak, aby zagnieżdżony PCR wzmacniał 150–400 bps DMR.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, zaprojektowane startery mają co najmniej 24 zasady długości z co najmniej 4-5 nienastępującymi po sobie G (C dla odwrotnego startera), aby uwzględnić obniżoną temperaturę wyżarzania spowodowaną utratą złożoności sekwencji. Jeden z zagnieżdżonych starterów zostanie znakowany biotyną i oczyszczony metodą HPLC. Jednak najpierw należy zamówić standardowe startery, aby zoptymalizować etap PCR poprzez rozdzielenie reakcji na żelu agarozowym.
      1. Zaprojektuj starter do pirosekwencjonowania w taki sposób, aby był ukierunkowany na komplementarną biotynylowaną nić zaledwie 1–2 zasady przed CpG, które mają być testowane. W razie potrzeby zaprojektuj wiele starterów pirosekwencjonujących, ponieważ każdy starter pirosekwencjonujący może niezawodnie testować 30 punktów bazowych poniżej.
   2. W przypadku Rt1-m4 użyj następujących elementów:
      rRT1M4 Na zewnątrz – F TGTAYGATTTGGTTATYGTAAAT
      rRT1M4 Na zewnątrz – R AACTTACAAATTTCACCAACTCA
      rRT1M4 zagnieżdżony – F GTGGGTTAYGTGGATAATATAG
      rRT1M4 zagnieżdżony – R AATCACTTACCATTCTCTCTCTAACTA
      rRT1M4 Pyro1 TAYGTGGATAATATATAGAT
      rRT1M4 Pyro2 GATAGTTATTTGGYGAGTTAG
      rRT1M4 Pyro3 GAGTATTTGGAGGAGTTGAT
      rRT1M4 Pyro4 GGATTTTAATATTTGGT powiedział:
2. Użyj dostępnego w handlu zestawu do konwersji wodorosiarczynu gDNA krwi szczura.
   UWAGA: Etapy konwersji wodorosiarczynu zostały zaadaptowane z dostępnego na rynku zestawu z następującymi modyfikacjami: W kroku 1 dodaj 50–100 ng gDNA krwi i rozcieńcz wodą do 20 μl. W kroku 9 eluuj 20 μl na próbkę.
   1. Przygotować odczynnik do konwersji wodorosiarczynu zgodnie z protokołem producenta i połączyć z rozcieńczonym gDNA. Inkubować w termocyklerze (64 °C przez 2,5 h, 4 °C trzymanie).
   2. Dodaj bufor wiążący do przekształconego gDNA w kolumnach wirowych i odwiruj (15 000 x g, 1 min). Jednokrotnie umyć kolumny, a następnie dodać do nich bufor odsiarczający i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Wirówka (15 000 x g, 1 min).
   3. Kolumna płucząca z buforem płuczącym i wirówką (15 000 x g, 1 min). Powtórzyć etap mycia z odwirowaniem (15 000 x g, 2 min). Dodać 20 μl buforu elucyjnego i odwirować (15 000 x g, 1 min) do elucji.
3. Amplifikacja PCR
   1. Przygotuj zewnętrzną mieszankę wzorcową PCR. Dodaj 21,5 μl Master Mix do 3,5 μl gDNA przekształconego w wodorosiarczyn i uruchom program termocyklera.
      Zewnętrzna mieszanka główna PCR:
      16,25 μL wody
      2,5 μL buforu polimerazy [10x]
      0,5 μL dNTP [10 mM]
      1 μL Forward Primer [0,1 μM]
      1 μL Reverse Primer [0,1 μM]
      0,25 μl polimerazy DNA Taq [5000 U/ml].
      Program termocyklera:
      Etap 1, 1 cykl: 94 °C 4 min
      Etap 2, 47 cykli: 94 °C 1 min, 53 °C 30 s, 72 °C 1 min
      Etap 3, 1 cykl: 72 °C 8 min, 4 °C Przytrzymaj
   2. Przygotuj zagnieżdżoną mieszankę wzorcową PCR. Dodać 23 μl Master Mix do 2 μl próbki z zewnątrz PCR i powtórzyć program termocyklera zewnętrznego PCR. Oceń jakość produktu PCR za pomocą elektroforezy żelowej (1x bufor TAE, 1% żel agarozowy).
      Zagnieżdżony PCR Master Mix:
      17,75 μL wody
      2,5 μL buforu polimerazy [10x]
      0,5 μL dNTP [10 mM]
      1 μL Forward Primer [0,1 μM]
      1 μL Reverse Primer [0,1 μM]
      0,25 μL polimerazy DNA Taq [5000 U/ml]
      Uwaga: W przypadku zagnieżdżonego PCR starter do przodu lub do tyłu musi być biotynylowany.
4. Pirosekwencjonowanie
   1. Sporządzić mieszankę wzorcową zawierającą 38 μl buforu wiążącego, 35 μl wody i 2 μl kulek sefarozy pokrytych streptawidyną na próbkę. Do płytki 96-dołkowej dodać 75 μl mieszanki wzorcowej i 5 μl zagnieżdżonego produktu PCR. Wstrząsać na talerzu przez 15 - 60 minut.
   2. Podczas wytrząsania dodać 12 μl startera (0,5 μM, rozcieńczonego w buforze do wyżarzania) do studzienek płytki do pirosekwencjonowania.
   3. Po wstrząśnięciu należy wykonać etapy mycia za pomocą wiążących reakcyjnych. Umieść narzędzie próżniowe w korycie wypełnionym wodą, a następnie zbierz próbki z płyty. Zanurz narzędzie próżniowe w częściowo wypełnionych korytach zawierających 70% etanolu, NaOH (0,2 M) i bufor octanu Tris (10 mM, pH 7,4). Odłącz od próżni i umieść narzędzie próżniowe na płytce testowej HS, aby przenieść kulki.
   4. Umieścić płytkę na bloku grzewczym i inkubować w temperaturze 80 °C przez 2 minuty. Pozostawić płytkę do ostygnięcia przez 5 minut, a następnie rozpocząć program pirotechniczny.

Wyniki

Pomyślne wdrożenie platformy Methyl-Seq dla szczurów zależy od kilku kryteriów. Rysunek 1 pokazuje ogólny przebieg badania i podkreśla konkretne etapy kontroli jakości (QC), które są potrzebne przed przejściem dalej. Jednym z pierwszych czynników, które należy wziąć pod uwagę, jest solidność modelu zwierzęcego i schemat stresu, które określają wielkość zmian epigenetycznych zachodzących w metylomie. Ponieważ nasza praca na zwierzętach opiera się na naszej poprzedniej obserwacji, że ekspozycja na kortykosteron (CORT) może prowadzić do zmian w metylacji DNA^19,20, nasz schemat przewlekłego stresu zmiennego (CVS) musiał być wystarczająco rygorystyczny, aby wyprodukować zestresowane szczury z podwyższonym poziomem CORT w osoczu. Typowy tygodniowy schemat CVS jest przedstawiony w Tabeli 1 i składa się z codziennych stresorów rano, po południu i w nocy, które są stale zmieniane, aby zapobiec przyzwyczajeniu i zmniejszonej reakcji na stres. W trakcie 3-tygodniowego reżimu zestresowane zwierzęta wykazywały znacznie podwyższone poziomy średniego CORT w osoczu [dni 4–21, kontrola: 32,7 3,7 ng / ml, stres: 103,0 11,9 ng / ml (średnia SEM), P = 2,2 x ^10-4, Rysunek 2A] w porównaniu z niezestresowanymi zwierzętami kontrolnymi. Konsekwentnie, zwierzęta te wykazywały również większe zachowania podobne do lęku w labiryncie na podwyższonym plusie (EPM), na co wskazuje znacznie więcej czasu spędzonego w zamkniętych ramionach EPM i mniej czasu w otwartych ramionach (Rysunek 2B). Wyniki te pokazują, że ekspozycja na CVS doprowadziła do znaczących zmian endokrynologicznych i behawioralnych, co skłoniło nas do zbadania, czy zmiany te były związane ze specyficznymi sygnaturami metylacji DNA.

Kładziemy nacisk na kilka punktów kontrolnych, które są kluczowe dla pomyślnej budowy biblioteki Methyl-Seq. Rozpoczęcie od wystarczającej ilości DNA jest konieczne, ponieważ sonikacja, wielokrotne mycie/oczyszczanie, wzbogacanie celu i etapy konwersji wodorosiarczynów sukcesywnie zmniejszają ilość DNA w gotowej bibliotece. Chociaż kilka etapów amplifikacji PCR łagodzi utratę matrycy DNA, nadmierna liczba cykli PCR może powodować wyższe zduplikowane odczyty. W obecnym badaniu Methyl-Seq na szczurach użyto 2 μg gDNA krwi na szczura. Zwracamy uwagę, że biblioteki Methyl-Seq mogą być tworzone z początkową ilością DNA tak niską, jak 500 ng. Mniejszy materiał wyjściowy pozwala użytkownikom na generowanie bibliotek z DNA wyizolowanego za pomocą FACS (sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją) lub igł, chociaż istnieje zwiększone ryzyko wytworzenia niewystarczającej liczby bibliotek do późniejszego sekwencjonowania. Kontrolę jakości przeprowadza się przez elektroforezę 1 μl próbki na bioanalizatorze, który zapewnia masę cząsteczkową DNA, ilość i molowość. Trzy krytyczne kroki, które wymagają użycia bioanalizatora, to: 1) następujący etap sonikacji w celu zapewnienia wystarczającego ścinania DNA (~170 pz, czerwony, Rysunek 3); 2) następujący po etapie ligacji adaptera wskazywany przez zmianę średniej wielkości ściętego DNA (~200 pz, niebieski, Rysunek 3) w celu zapewnienia ich późniejszej amplifikacji metodą PCR; oraz 3) po ostatnim kroku oczyszczania biblioteki w celu zapewnienia ilości i rozmiaru biblioteki do sekwencjonowania.

Pakiety R BSSeq i BSmooth w Bioconductor zostały użyte do analizy danych sekwencjonowania wodorosiarczynów¹⁸. Obejmują one narzędzia i metody do ujednolicania odczytów sekwencji, przeprowadzania kontroli jakości i identyfikacji regionów metylowanych różnicowo (DMR). Oprogramowanie BSmooth wywołuje Bowtie 2.0^16,17 jako wewnętrzny wyrównywacz sekwencji w celu uzyskania podsumowań pomiarów na poziomie CpG, poprzez wyrównanie surowych odczytów wejściowych do sekwencji genomowych przekształconych w wodorosiarczyn. Wyrównane odczyty są następnie filtrowane przez rygorystyczne procedury kontroli jakości, które mają na celu zidentyfikowanie systematycznych błędów sekwencjonowania i wywoływania bazy, które mogą zniekształcić dalsze analizy. Generowana jest seria wykresów, które wizualnie pomagają w tym procesie filtrowania. Generowane są również metryki sekwencjonowania w celu udokumentowania istotnych informacji, takich jak między innymi liczba wyrównanych odczytów, % docelowy i pokrycie CpG (Tabela 2). Po przefiltrowaniu danych wykonywany jest algorytm wygładzania/normalizacji, w którym każdemu CpG przypisywana jest szacowana wartość metylacji na podstawie wszystkich odczytów QC z każdej próbki i szacunków z sąsiednich CpG, aby zapewnić dokładniejsze wywoływanie stanu metylacji nawet w przypadkach, gdy pokrycie sekwencji jest niskie. Wartość ta zapewnia wygładzone oszacowanie prawdopodobieństwa metylacji w każdym miejscu CpG. Porównując średnią wygładzonych oszacowań metylacji każdej próbki między dwiema grupami poddanymi działaniu substancji i klasyfikując regiony genomu od najbardziej znacząco różniących się do najmniejszych, generowana jest lista DMR (Tabela 3).

Najwyższy DMR między grupami zestresowanymi i niezestresowanymi znajdował się w promotorze głównego genu zgodności tkankowej szczura Rt1-m4, przy czym zwierzęta zestresowane wykazywały wyższy poziom metylacji u wszystkich CpG niż zwierzęta niezestresowane (Rysunek 4A). Aby potwierdzić pomyślne wdrożenie platformy Methyl-Seq i analizę danych, zaprojektowano startery w odniesieniu do DMR, a poziomy metylacji DNA krwi w całej kohorcie zwierząt zestresowanych i niezestresowanych (8 zsekwencjonowanych przez Methyl-Seq i 8 niezsekwencjonowanych) oceniono za pomocą pirosekwencjonowania wodorosiarczynowego. Wyniki wskazują na znaczny wzrost metylacji DNA w 10 z 12 badanych CpG (5,1–10,4 zmiana % metylacji, P <0,037, Figura 4B). Analizę szlaku KEGG przeprowadzono na wszystkich nominalnie istotnych DMR w celu zidentyfikowania szlaków związanych ze stresem. Konsekwentnie, szlaki związane z DMR wiązały się z chorobami związanymi z przewlekłym narażeniem na stres, takimi jak cukrzyca, choroby sercowo-naczyniowe i rak (Tabela 4). ^21,22,23 Aby wykazać związek między danymi epigenetycznymi a stopniem narażenia na stres, poziomy metylacji w CpG-10 porównano ze średnimi 3-tygodniowymi poziomami CORT dla każdego zwierzęcia. Wyniki wykazały niewielką korelację między danymi endokrynologicznymi a danymi dotyczącymi metylacji (R² = 0,54, P = 0,001, Rysunek 5).

Rysunek 1: Ogólny schematyczny przebieg pracy dla szczurzej platformy Methyl-Seq. Jeden μg genomowego DNA wyekstrahowanego z krwi zestresowanych i kontrolnych szczurów jest najpierw przetwarzany w celu skonstruowania bibliotek Methyl-Seq do sekwencjonowania, analizy i identyfikacji celu. Kolejne 100 ng DNA wykorzystuje się do niezależnej walidacji zidentyfikowanych celów epigenetycznych poprzez pirosekwencjonowanie wodorosiarczynów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Narażenie na przewlekły zmienny stres (CVS) prowadzi do zmian endokrynologicznych i behawioralnych u szczurów. (A) Wielokrotne pobieranie próbek kortykosteronu (CORT) wykazuje solidność 3-tygodniowego schematu CVS. Próbki krwi pobierano rano przed codziennym reżimem stresu. (B) Zestresowane zwierzęta spędzały więcej czasu w zamkniętych ramionach, a mniej w otwartych ramionach podwyższonego labiryntu plus (EPM). Pokazane są wykresy skrzynkowe z punktem danych dla każdego zwierzęcia. Test T Studenta został przeprowadzony dla istotności statystycznej. *P<0,05, **P<0,01 oraz ***P<0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Kwantyfikacja strzyżonego i podwiązanego adapterowo DNA szczura na bioanalizatorze. Czerwona i niebieska krzywa pokazują ilość i rozmiar genomowego DNA (czerwonego) po ścinaniu odpowiednio w izotermicznym sonikatorze i ligacji adaptera. Każda linia reprezentuje jedną próbkę, a czerwona i niebieska krzywa odzwierciedlają zarówno utratę DNA podczas kilku etapów (naprawa końca, adenylacja 3' i oczyszczanie próbki), jak i wzrost wielkości pz w wyniku ligacji adapterów. Ostre piki przy 25 pz i 1500 pz to standardowe znaczniki, które zostały dodane do bufora ładowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Zmiany epigenetyczne wywołane przez CVS są wykrywane przez szczurzego Methyl-Seq. (A) Analiza danych Methyl-Seq u szczurów wykazała, że promotor genu Rt1m4 jest zróżnicowanym regionem metylowym (DMR) między szczurami zestresowanymi (czerwonymi) i kontrolnymi (niebieskimi). Graficzne wyjście dla Rt1m4 DMR (różowy zacieniony region) wyświetla każdy CpG (pionowa szara linia), cztery próbki w każdej grupie (czerwone lub niebieskie linie) oraz % poziomów metylacji dla każdego zwierzęcia (czerwona lub niebieska kropka). (B) Dwanaście CpG w DMR zostało zwalidowanych przez pirosekwencjonowanie wodorosiarczynowe. Wykresy słupkowe są reprezentowane jako średnia SEM, a test T Studenta został przeprowadzony w celu uzyskania istotności statystycznej. *P<0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Analiza regresji liniowej wykazała niewielką korelację między % metylacji DNA w CpG-10 Rt1m4 a 3-tygodniowymi średnimi poziomami CORT w osoczu zarówno zwierząt zestresowanych, jak i kontrolnych (N = 16). Dane dotyczące zwierząt zestresowanych są oznaczone czerwonymi kółkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

tydzień	Dzień 1	Dzień 2	Dzień 3	Dzień 4	Dzień 5	Dzień 6	Dzień 7
Am	powściągliwość	pływać	Chłodnia	pływać	powściągliwość	Shakerze bostońskim	pływać
Pm	Shakerze bostońskim	Nachylenie klatki	powściągliwość	Shakerze bostońskim	Chłodnia	powściągliwość	Chłodnia
Noc	Ograniczenie żywności	mokra pościel	Izolacja	Światło włączone	Wyparcia	Światło włączone	mokra pościel

Tabela 1: Typowy tygodniowy harmonogram schematu przewlekłego zmiennego stresu (CVS).

osób osób osób osób osób osób osób osób TGL osób TGL osób osób osób osób osób

Metryki sekwencjonowania	Stres1	Sterowanie1
	(n = 4)	(n = 4)
Sparowane odczyty końcowe (PER)	89 290 397	80 165 674
Unikalnie mapowane sparowane odczyty końcowe (UMPER)	39 200 255	35 013 406
Szybkość wyrównania/wydajność mapowania (UMPER/PER)	44%	44%
Zduplikowane odczyty (% UMPER)	73%	65%
Deduplikowany UMPER	10 481 031	12 306 018
Średnie pokrycie głębokości odczytu (x) (ARDC)	6-krotnie	6-krotnie
CpG (N)	12 056 878	12 056 878
ARDC (x) CpG	2x	2x
CpG z co najmniej 10 odczytami (N)	481 383	595 850
ARDC (X) CpG z co najmniej 10 odczytami	Rozdział 19	Rozdział 19
On Target CpG (pełne pokrywanie się z obszarami docelowymi sondy)	1 923 872	2 007 638
Na celu ARDC (x) CpG	7x	8x
Na celu CpG z co najmniej 10 odczytami (N)	428 249	531 419
On Target ARDC (x) CpG z co najmniej 10 odczytami	18-krotny	18-krotny
On Target (PER z 1 lub więcej parami podstawowymi nakładającymi się na regiony docelowe sondy) (UMPER)	8 277 715	9 369 523
% w miejscu docelowym (deduplikowanego UMPER)	78%	77%
On Target (łączna liczba zmapowanych baz) Mb	125 Mb	128 Mb
Docelowe średnie pokrycie głębokości odczytu (x) (ARDC)	9-krotnie	10x
1Metryki sekwencjonowania oparte na średnich dla osób w każdej grupie

Tabela 2: Metryki sekwencjonowania uzyskane z platformy szczurzego Methyl-Seq.

powiedział: osób osób zł pkt. pkt. osób osób pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: osób osób pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: osób osób powiedział: pkt. pkt. pkt. powiedział: osób osób powiedział: pkt. pkt. pkt. powiedział: osób osób powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: osób osób pkt. pkt. pkt. pkt. osób osób powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: osób osób pkt. pkt. pkt. powiedział: osób osób powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt.

Chr	początek	koniec	gen	odległość	areaStat (Statystyka obszaru)	meanDiff (średnia różnica)	stres	kontrola	kierunek
CHR20	1 644 246	1 644 390	Zobacz materiał RT1-M4	in_gene	93.03	0,22	0,33	0,11	korzyść
Czujnik CHR5	160 361 352	160 361 564	LOC690911	in_gene	-70,75	-0,19	0,72	0,91	strata
CHR3	61 138 281	61 138 330	RGD1564319	265569	61,79	0,21	0,94	0,72	korzyść
CHR2	143 064 811	143 065 010	Ufm1	Numer katalogowy: 8569	-59,48	-0,11	0,13	0,24	strata
Certyfikat CHR7	30 764 111	30 764 284	Ntn4	in_gene	Norma 57.04	0,21	0,94	0,73	korzyść
CHR17	12 469 112	12 469 218	Idnk	Numer katalogowy: 41996	-50,91	-0,13	0,74	0,88	strata
Certyfikat CHR7	47 101 725	47 101 930	Pawr	in_gene	-50,54	-0,12	0,64	0,76	strata
Czujnik CHR5	76 111 248	76 111 822	Zobacz materiał Txndc8	151703	-50,38	-0,11	0,85	0,96	strata
CHR11	80 640 132	80 640 356	dgkg powiedział:	in_gene	-50.07	-0,16	0,73	0,89	strata
CHR8	71 759 248	71 759 411	Mir190	210226	-47,84	-0,17	0,58	0,75	strata

Tabela 3: 10 najbardziej zróżnicowanych regionów metylowanych. Dla każdego DMR tabela wyników pokazuje od lewej do prawej kolumny: lokalizacja chromosomu (chr), współrzędne (początek/koniec), nazwa genu, odległość od miejsca rozpoczęcia transkrypcji, statystyki obszaru różnicowego między grupą zestresowaną a kontrolną (areaStat), średnia różnica metylacji (meanDiff), średnie poziomy metylacji w każdym DMR dla grup stresowych i kontrolnych (stres/kontrola) oraz kierunek zmiany metylacji z kontroli.

szt. szt. Rozdział pkt.

Warunki korzystania ze ścieżki KEGG	Liczba genów	%	Wartość P	Beniamini
Cukrzyca
Cukrzyca typu II	12	0,1	Wymiary: 3,6 x 10-4	9,8 x 10-3
Choroby układu krążenia
Skurcz mięśni gładkich naczyń krwionośnych	Rozdział 18	0,1	1,6 x 10-3	Wymiary: 3,6 x 10-2
Arytmogenna kardiomiopatia prawej komory (ARVC)	13	0,1	4,0 x 10-3	7,1 x 10-2
Kardiomiopatia rozstrzeniowa	14	0,1	7,6 x 10-3	1,2 x 10-1
Funkcja neuronu
Długotrwałe wzmocnienie	11	0,1	1,5 x 10-2	1,4 x 10-1
Sygnalizacja
Szlak sygnałowy MAPK	35	0,2	Wymiary: 2,4 x 10-4	9,9 x 10-3
Szlak sygnalizacji wapniowej	22 Rozdział 22	0,1	1,2 x 10-2	1,4 x 10-1
Szlak sygnalizacyjny chemokiny	21	0,1	1,2 x 10-2	Wymiary 1,3 x 10-1
Rak
Szlaki w raku	42 Rozdział 42	0,3	4,1 x 10-5	Wymiary: 3,4 x 10-3
Glejaka	15	0,1	4,4 x 10-5	Wymiary: 2,4 x 10-3
Niedrobnokomórkowy rak płuca	10	0,1	7,9 x 10-3	1,1 x 10-1
Rak jelita grubego	13	0,1	8,4 x 10-3	1,1 x 10-1
Przewlekła białaczka szpikowa	12	0,1	1,2 x 10-2	Wymiary 1,3 x 10-1

Tabela 4: Analiza szlaku KEGG DMR zidentyfikowanych na szczurzym Methyl-Seq.

Dyskusja

W tym badaniu zaprojektowaliśmy i wdrożyliśmy platformę Methyl-Seq dla genomu szczura. Demonstrując jego użyteczność za pomocą szczurzego modelu stresu, wykazaliśmy, że eksperymentalny i analityczny potok może zapewnić zróżnicowane metylowane regiony między dwiema grupami porównawczymi.

Aby zapewnić pomyślne wdrożenie platformy, należy przestrzegać kilku krytycznych kroków. Po pierwsze, początkowa jakość i ilość DNA ma znaczący wpływ na jakość i ilość końcowej biblioteki Methyl-Seq. Użyliśmy fluorometru, a nie spektrofotometru, aby upewnić się, że nasz pomiar DNA odzwierciedla ilość obecnego dwuniciowego DNA. Bioanalizator został użyty do pomiaru wielkości cząsteczkowej i ilości DNA po ścinaniu i po podwiązaniu adaptera. Weryfikacja "przesunięcia" wielkości cząsteczki między tymi etapami ma kluczowe znaczenie dla potwierdzenia obecności adapterów na końcach każdego fragmentu DNA, który zostanie poddany PCR za pośrednictwem adaptera w kolejnych etapach. Ilość DNA pozostała na końcu etapu ligacji adaptera jest również ważna, ponieważ na tym etapie potrzebne jest co najmniej 100 ng produktu bibliotecznego, aby zapewnić wystarczającą ilość po docelowych etapach wzbogacania i konwersji wodorosiarczynu. Końcowy pomiar wysokiej czułości został przeprowadzony na skonstruowanej bibliotece Methyl-Seq, tak aby biblioteka mogła być odpowiednio rozcieńczona w celu późniejszego grupowania na sekwencerze nowej generacji. Wreszcie, pirosekwencjonowanie wodorosiarczynu zastosowano jako wysoce ilościową, niezależną metodę oceny dokładności rurociągu analitycznego. Ostateczna walidacja z wykorzystaniem oryginalnych próbek i replikacja przy użyciu dodatkowych zwierząt są kluczowymi krokami zapewniającymi, że eksperyment może wykryć biologicznie istotne zmiany w metylacji DNA.

Zamieszczamy również kilka wskazówek w przypadku odstępstwa od protokołu lub napotkania problemów. Po pierwsze, możliwa jest utrata zbyt dużej ilości DNA podczas naprawy końcówki, podwiązania adaptera lub etapów oczyszczania kulek magnetycznych. Alternatywnie, początkowe ilości DNA mogą być małe (<200 ng) ze względu na ograniczoną dostępność tkanki/DNA lub zastosowanie różnych metod wzbogacania, takich jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Zwiększenie liczby cyklu podczas dwóch etapów amplifikacji biblioteki może być w stanie zrekompensować nadmierną utratę DNA lub niską początkową ilość DNA w całym protokole budowy biblioteki. Zaleca się jednak nie więcej niż dodatkowe 2–3 cykle, ponieważ nadmierne wzmocnienie szablonu może prowadzić do wzrostu liczby sekwencjonowanych zduplikowanych odczytów. Te duplikaty są wykluczane na etapie wyrównywania, aby zapobiec odchyleniu w obliczeniach procentowej metylacji. Po drugie, jeśli średni rozmiar DNA nie zwiększa się o więcej niż 30 punktów bazowych, sprawdź, czy odczynniki są nowe, ponieważ polimeraza DNA T4, ligaza Klenowa i/lub ligaza T4 mogą być stare. Można stosować dostępne w handlu odczynniki zamienne.

Ponadto możliwe jest, że przewidywane DMR mogą nie zostać zweryfikowane przez pirosekwencjonowanie, w którym różnice w metylacji DNA nie występują lub są znacznie mniejsze niż te przewidywane przez analizę. Słaba walidacja regionów kandydujących jest problemem zbyt powszechnym w wielu analizach całego genomu, na przykład gdy wyniki pirosekwencjonowania nie potwierdzają zróżnicowanej metylacji lub wielkość efektu jest znacznie mniejsza niż przewidywana w analizie. BSmooth to jeden pakiet analityczny, który "wygładza" poziomy metylacji w oknie wielu CpG. W obecnym eksperymencie BSmooth zasugerował DMR, którego poziomy metylacji zostały potwierdzone przez pirosekwencjonowanie wodorosiarczynów. Jednak prawdopodobnie wystąpią rozbieżności między poziomami metylacji przewidywanymi przez BSmooth a tymi zweryfikowanymi przez pirosekwencjonowanie. Rozbieżności wynikają z funkcji wygładzania, która szacuje średnie wartości metylacji dla wszystkich CpG w DMR, w tym kolejnych CpG, które mogą różnić się metylacją DNA o więcej niż 50% lub CpG, których wartości metylacji zostały wykluczone ze względu na podprogową głębokość odczytu. Pakiety R, takie jak MethylKit²⁴ , mogą być używane do identyfikacji mniejszych okien CpG, a nawet pojedynczych CpG, których poziomy metylacji silnie korelują z tymi zwalidowanymi przez pirosekwencjonowanie. Implementacja różnych pakietów i testowanie ich przewidywanych regionów lub CpG metylacji różnicowej za pomocą pirosekwencjonowania zapewni solidność danych. Alternatywnie, oryginalne biblioteki Methyl-Seq można ponownie sekwencjonować i dodawać do odczytywanych plików w celu zwiększenia głębokości odczytu. Ponieważ oznaczanie poziomów metylacji jest półilościowe i podyktowane liczbą odczytów [(# CpGs)/(# TpGs+CpGs)], zwiększenie głębokości odczytu dla danego CpG zwiększy dokładność jego procentowej wartości metylacji. W tym badaniu wzięliśmy pod uwagę tylko CpG, których wartości metylacji zostały określone przez co najmniej dziesięć odczytów i osiągnęliśmy ogólne pokrycie odczytu 19x dla każdego CpG.

Platforma Methyl-Seq dla szczurów nie jest pozbawiona ograniczeń. Chociaż jest bardziej opłacalna niż sekwencjonowanie wodorosiarczynu całego genomu, jest znacznie droższa niż inne metody. Niemniej jednak większość kosztów pochodziła z zakupu pasów ruchu w sekwencerze, a nie z systemu przechwytywania. W zależności od wymaganej głębokości odczytu, przy czym porównania między tkankami wymagają mniej ze względu na duże (25–70%) różnice¹² w metylacji DNA, koszt można zmniejszyć poprzez multipleksowanie większej liczby próbek na linię i zastosowanie platformy o większej pojemności. Ponadto przygotowanie próbki jest bardziej czasochłonne niż inne metody. Chociaż podobnie jak w przypadku innych podejść pulldown, które obejmują sekwencjonowanie nowej generacji, dodatkowe etapy konwersji i oczyszczania wodorosiarczynu zwiększają obciążenie pracą. Ogólnie rzecz biorąc, platforma Methyl-Seq jest opłacalną alternatywą dla sekwencjonowania całego genomu i zapewnia rozdzielczość par zasad na poziomie ponad 2,3 miliona CpG, czyli znacznie więcej niż w przypadku platform opartych na mikromacierzach. Do tej pory dostępne na rynku platformy Methyl-Seq dla ludzi i myszy były wykorzystywane do dokumentowania zależnych od alkoholu zmian w mózgu makaków^25,26, genów neurorozwojowych w mózgu myszy⁹ oraz celów glikokortykosteroidów krew-mózg¹⁰. Co więcej, możliwość celowania w określone regiony niezależnie od rozpoznawania sekwencji przez enzymy restrykcyjne sprawia, że jest to idealna platforma do porównań międzygatunkowych. Na potrzeby tego badania zaprojektowaliśmy platformę Methyl-Seq dla szczurów, dla której przeprowadza się wiele eksperymentów farmakologicznych, metabolicznych i behawioralnych bez korzystania z narzędzia metylomicznego obejmującego cały genom. Nasze dane pokazują, że można go wykorzystać do wykrywania DMR w szczurzym modelu stresu i skorelowania innych parametrów fizjologicznych, takich jak ogólny poziom CORT w osoczu.

Platforma Methyl-Seq jest idealna do eksperymentów epigenetycznych na zwierzętach ze zsekwencjonowanymi genomami, które mogą nie mieć wystarczających dowodów eksperymentalnych dokumentujących regiony regulatorowe. Gdy takie regiony zostaną udostępnione, dodatkowe regiony mogą zostać zaprojektowane i dołączone do bieżącej wersji. Co więcej, platforma idealnie nadaje się do genomiki porównawczej, ponieważ wzbogacenie docelowe nie jest ograniczone przez rozpoznawanie enzymów restrykcyjnych. Na przykład region promotorowy dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania może zostać uchwycony niezależnie od tego, czy zawiera określone miejsce ograniczenia. Podobnie można uchwycić wszelkie regiony regulatorowe, takie jak te zidentyfikowane u myszy lub ludzi, które są konserwatywne w genomie będącym przedmiotem zainteresowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Test radioimmunologiczny (RIA)	MP Biomedicals	7120126	Kortykosteron, 125I oznaczony
Pure DNA Purification Kit	Epicentre/Illumina	MC85200
Thermal-LOK 2-pozycyjna sucha kąpiel termiczna	USA Scientific	2510-1102	Używany z probówkami 1,5 ml
Vortex Genie 2	Fisher	12-812	Vortex Mixer
Alkohol etylowy, czysty	Sigma-Aldrich	E7023	100% etanol, wirówka klasy molekularnej
5424 R	Eppendorf-Musi		być zdolna do 20 000 x g
Qubit 2.0	ThermoFisher Scientific	Q32866	fluorometru
Qubit dsDNA BR	ThermoFisher Scientific	Q32850
Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HS	ThermoFisher Scientific	Q32851	Odczynniki do wykrywania DNA o wysokiej czułości
Probówki do testów kubitowych	ThermoFisher Scientific	Q32856
Zestaw odczynników SureSelectXT Rat Methyl-Seq	Odczynniki Agilent Technologies	G9651A	do przygotowania biblioteki Methyl-Seq
Biblioteka SureSelect Rat Methyl-Seq			Przynęty 931143 RNA do wzbogacania celów szczurzych
IDTE, pH 8.0	IDT DNA	11-05-01-09	10 mM TE, 0,1 mM EDTA
DNA LoBind Probówka 1,5 ml	Eppendorf	22431021
Covaris E-series lub S-series	Covaris-Isothermal		sonikator
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25)	Covaris	520045
Woda, Ultra Pure (klasa biologii molekularnej)	Jakość Biologiczna	351-029-721
Veriti 96 Well-Thermal Cycler	Applied Biosystems	4375786
Koraliki AMPure XP	Beckman Coulter	A63880	Kulki magnetyczne wiążące DNA
96S Super Magnet	ALPAQUA	A001322	Płytka magnetyczna do etapów oczyszczania
2200 TapeStation	Agilent Technologies	G2965AA	Bioanalizator oparty na elektroforezie
D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5582
D1000 ScreenTape Agilent Technologies o wysokiej czułości		5067-5584
D1000 Odczynniki	Agilent Technologies	5067-5583
D1000 Wysoka czułość	Agilent Technologies	5067-5585
DNA110 SpeedVac	ThermoFisher	Scientific-Vacuum	Koncentrator
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Koraliki magnetyczne	Invitrogen	65601	Streptawidin
Kulki magnetyczne Labquake Tube Rotator	ThermoFisher Scientific	415110Q	Nutator jest również dopuszczalny
Zestaw do metylacji DNA EZ DNA	Zymo Research	D5006	. Zawiera wiążące, przemywające, odsulfonujące i elucyjne
Illumina Hi-Seq 2500	Illumina-Maszyna		sekwencjonowania nowej generacji
Startery PCR i pirosekwencjonowania	IDT DNA	Zmienna
Polimeraza DNA Taq z buforem ThermoPol - 2,000 jednostek	New England BioLabs	M0267L
Zestaw roztworów deoksynukleotydu (dNTP)	New England BioLabs	N0446S
Pyromark MD96	QIAGEN-Pirosekwencjonowanie
Alkohol etylowy 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200	70% roztwór etanolu
Granulki wodorotlenku sodu	Sigma-Aldrich	221465	0,2 M roztwór buforowy denaturacji NaOH
Tris (baza) od J.T. Baker	Fisher Scientific	02-004-508	10 mM Tris Acetate Buffer roztwór buforowy do płukania
Odczynniki PyroMark Gold Q96 (50x96)	QIAGEN	972807	Odczynniki wymagane do pirosekwencjonowania
PyroMark Bufor do wyżarzania	QIAGEN	979009
PyroMark Bufor wiążący (200 ml)	QIAGEN	979006
Streptawidyna Sepharose o wysokiej wydajności	GE Healthcare	17-5113-01	Koraliki
sefarozy pokryte streptawidynąPyroMark Q96 HS Plate	QIAGEN	979101	Płytka do pirosekwencjonowania
Eppendorf Thermomixer R	Fisher Scientific	05-400-205	Mieszarka płytkowa. Blok 96-dołkowy sprzedawany oddzielnie (kat. Nr 05-400-207)
Strona internetowa SureDesign	Agilent	Technologies-Oprogramowanie	projektowania przechwytywania celów (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)
UCSC Przeglądarka genomu	Uniwersytet Kalifornijski Santa	Cruz-rat	listopad 2004 rn4 montaż
Agilent Methyl-Seq Protocol	Agilent	Technologies-https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf