Artykuł metodologiczny

Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58617

⸱

24 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Psychiatry and Behavioral Sciences, Johns Hopkins School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins School of Medicine, 3Department of Mental Health, Johns Hopkins School of Public Health

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół i implementację Methyl-Seq, platformy epigenomicznej, wykorzystującej model szczura do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z przewlekłym narażeniem na stres. Wyniki pokazują, że platforma Methyl-Seq u szczurów jest w stanie wykryć różnice w metylacji, które wynikają z ekspozycji na stres u szczurów.

Streszczenie

W miarę jak genomy coraz szerszego rodzaju zwierząt stają się dostępne, rośnie zapotrzebowanie na narzędzia, które mogą uchwycić dynamiczne zmiany epigenetyczne w tych modelach zwierzęcych. Szczur jest szczególnym zwierzęciem modelowym, w przypadku którego narzędzie epigenetyczne może uzupełnić wiele badań farmakologicznych i behawioralnych, aby dostarczyć wnikliwych informacji mechanistycznych. W tym celu dostosowaliśmy system SureSelect Target Capture System (określany jako Methyl-Seq) dla szczura, który może oceniać poziomy metylacji DNA w całym genomie szczura. Projekt na szczurach był ukierunkowany na promotory, wyspy CpG, wybrzeża wysp i regiony bogate w GC ze wszystkich genów RefSeq.

Aby wdrożyć platformę w eksperymencie na szczurach, samce szczurów Sprague Dawley były narażone na przewlekły zmienny stres przez 3 tygodnie, po czym pobrano próbki krwi do ekstrakcji genomowego DNA. Biblioteki Methyl-Seq zostały zbudowane z próbek DNA szczurów poprzez ścinanie, ligację adaptera, wzbogacanie celu, konwersję wodorosiarczynu i multipleksowanie. Biblioteki zsekwencjonowano na platformie sekwencjonowania nowej generacji, a sekwencjonowane odczyty przeanalizowano w celu zidentyfikowania DMR między DNA zestresowanych i niezestresowanych szczurów. Najlepsze kandydatury DMR zostały niezależnie zweryfikowane metodą pirosekwencjonowania wodorosiarczynowego, aby potwierdzić solidność platformy.

Wyniki pokazują, że szczurza platforma Methyl-Seq jest użytecznym narzędziem epigenetycznym, które może uchwycić zmiany metylacji wywołane ekspozycją na stres.

Wprowadzenie

Postępy w sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym doprowadziły do bogactwa sekwencji genomowych zarówno dla organizmów modelowych, jak i niemodelowych. Dostępność takich sekwencji ułatwiła badania w dziedzinie genetyki, genomiki porównawczej i transkryptomiki. Na przykład, dostępne sekwencje genomowe są bardzo przydatne do ujednolicania danych sekwencjonowania z eksperymentów ChIP-Seq, które wzbogacają DNA na podstawie jego związku z modyfikacjami histonów1, lub sekwencjonowanie wodorosiarczynowe, które mierzy metylację DNA poprzez wykrywanie uracylu powstałego w wyniku konwersji wodorosiarczynu niemetylowanych cytozyn2. Wystąpiły jednak opóźnienia we wdrażaniu platform epigenomicznych, które uwzględniają w swoim projekcie dostępne dane z sekwencjonowania genomu, ze względu na brak danych z adnotacjami dotyczącymi sekwencji regulatorowych specyficznych dla gatunku, które mogą wpływać na funkcję genów.

W szczególności, metylacja DNA jest jedną z najczęściej badanych modyfikacji epigenetycznych DNA, która może wykorzystać dostępne dane genomiczne do budowy platformy metylomicznej. Jednym z takich przykładów jest platforma oparta na tablicy dla ludzkiego methylome3, która jest szeroko stosowana w różnych dyscyplinach, od onkologii po psychiatrię4,5. Niestety, podobne platformy dla modeli zwierzęcych innych niż ludzie są rzadkie, ponieważ praktycznie nie ma powszechnie stosowanych platform, które wykorzystywałyby sekwencję genomową w swoim pierwotnym projekcie.

Powszechną metodą oceny krajobrazu metylomicznego modeli zwierzęcych innych niż ludzkie jest sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji (RRBS)6. Takie podejście pozwala przezwyciężyć koszty sekwencjonowania wodorosiarczynów całego genomu, które, zapewniając kompleksowy krajobraz metylomiki, zapewnia mniejsze pokrycie głębokości odczytu ze względu na koszty i ograniczoną ilość informacji funkcjonalnych w dużych obszarach genomu klasy ubogiej w geny2. RRBS obejmuje restrykcyjne, trawienie i selekcję wielkości genomowego DNA w celu wzbogacenia o wysoce bogate w GC sekwencje, takie jak wyspy CpG, które są powszechnie znajdowane w pobliżu promotorów genów i uważa się, że odgrywają rolę w regulacji genów7. Chociaż metoda RRBS została wykorzystana w wielu ważnych badaniach, jej zależność od enzymów restrykcyjnych nie jest pozbawiona znaczących wyzwań i ograniczeń. Na przykład wzbogacenie sekwencji bogatych w GC w RRBS jest całkowicie zależne od obecności określonych sekwencji rozpoznawanych przez enzym restrykcyjny, a następnie selekcji wielkości za pomocą elektroforezy. Oznacza to, że wszystkie obszary genomu, które nie zawierają tych miejsc ograniczenia, są wykluczane podczas wyboru rozmiaru. Ponadto porównania międzygatunkowe są trudne, chyba że te same miejsca ograniczeń występują w tych samych loci wśród różnych gatunków.

Jednym z podejść do pokonania ograniczeń RRBS jest użycie metody wzbogacania, która wykorzystuje opublikowaną sekwencję genomową w projekcie platformy. Oparta na macierzy platforma ludzka wykorzystuje sondy starterowe zaprojektowane przeciwko określonym CpG do specyficznego dla alleli (CG vs. TG po konwersji wodorosiarczynu), docelowego wyżarzania i wydłużania startera. Jego konstrukcja odzwierciedla nie tylko dostępną sekwencję ludzkiego genomu, ale także eksperymentalnie zweryfikowane regiony regulatorowe uzyskane z wielu linii badawczych, takich jak ENCODE i ENSEMBL8. Pomimo szerokiego zastosowania w badaniach metylomicznych u ludzi, podobna platforma nie istnieje dla zwierząt modelowych. Ponadto format oparty na tablicy nakłada znaczne ograniczenia na powierzchnię dostępną do umieszczenia sondy. W ciągu ostatnich kilku lat podjęto wysiłki w celu połączenia specyficzności docelowej zapewnianej przez konstrukcję sondy wychwytującej z funkcją wysokiej przepustowości sekwencjonowania nowej generacji. Takie przedsięwzięcie zaowocowało opracowaniem opartego na sekwencjonowaniu systemu wzbogacania celu dla genomu myszy (mysi Methyl-Seq), który został wykorzystany do identyfikacji specyficznych dla mózgu lub wywołanych glikokortykosteroidami różnic w metylacji9,10. Podobne platformy dla innych zwierząt modelowych i niemodelowych są potrzebne, aby ułatwić badania epigenomiczne na tych zwierzętach.

Tutaj demonstrujemy implementację tej nowatorskiej platformy do przeprowadzania analizy metylomicznej na szczurze. Szczur służył jako ważny model zwierzęcy w farmakologii, metabolizmie, neuroendokrynologii i zachowaniu. Na przykład istnieje rosnąca potrzeba zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw toksyczności leków, otyłości, reakcji na stres lub uzależnienia od narkotyków. Wysokoprzepustowa platforma zdolna do wychwytywania zmian metylomomicznych związanych z tymi schorzeniami pogłębiłaby naszą wiedzę na temat tych mechanizmów. Ponieważ genom szczura nadal nie ma adnotacji dla regionów regulacyjnych, włączyliśmy nieredundantne promotory, wyspy CpG, wyspy wysp11 i wcześniej zidentyfikowaliśmy sekwencje bogate w GC do szczurzej platformy Methyl-Seq 12.

Aby ocenić pomyślne zaprojektowanie i wdrożenie platformy SureSelect Target Enrichment (ogólnie określanej jako Methyl-Seq) dla genomu szczura, użyliśmy szczurzego modelu przewlekłego zmiennego stresu (CVS)13 do identyfikacji różnie metylowanych regionów między zwierzętami niezestresowanymi i zestresowanymi. Nasz projekt, protokół i implementacja platformy mogą być przydatne dla badaczy, którzy mogą chcieć przeprowadzić kompleksowe i bezstronne badanie epigenetyczne na organizmie, którego sekwencja genomowa jest już dostępna, ale pozostaje słabo opisana.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi, w tym z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Johns Hopkins School of Medicine.

1. Zwierzęta

  1. Uzyskaj samce dorastających szczurów Sprague-Dawley w wieku 4 tygodni. Trzymaj zwierzęta w klatkach dla szczurów z poliwęglanu w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności w 12-godzinnym cyklu świetlnym i 12-godzinnym ciemnym z początkiem światła o godzinie 0600. Zapewnij zwierzętom dostęp do wody ad libitum.
  2. Pozwól szczurom zaaklimatyzować się przez 1 tydzień, aby zmniejszyć stres związany z transportem. Trzymaj zwierzęta w parach (N=16), aby wykluczyć stres izolacyjny, a w wieku 5 tygodni rozpocznij schemat przewlekłego stresu zmiennego (CVS) przez 3 tygodnie.

2. Przewlekły zmienny stres

  1. Podawaj schemat CVS raz rano (9-11 rano) i raz po południu (13-3 po południu) o nieregularnych porach, aby rutyna była nieprzewidywalna. Włącz łagodne stresory z nocy. Schemat CVS obejmuje: 1) 3 godziny w butli przytrzymującej; 2) 10 min pływania; 3) 3-godzinne pochylenie klatki 4) 1-godzinna platforma do powolnego wytrząsania; i 5) 1 h w komorze chłodniczej o temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Nocne czynniki stresogenne obejmują zatłoczenie społeczne (5 osób na klatkę), izolację społeczną, mokrą ściółkę, ograniczenie jedzenia i włączenie światła. Typowy tygodniowy harmonogram reżimu stresu przedstawiono w tabeli 1.

3. Testy endokrynologiczne

  1. Określ poziomy kortykosteronu (CORT) za pomocą próbek krwi z ogona (~50 μL) pobranych w tym samym czasie (9 rano) dwa razy w tygodniu przez cały czas trwania eksperymentu, przed schematem CVS w celu ustalenia wyjściowego poziomu hormonów (Dzień 0), raz w środku tygodniowego CVS (dni 4, 11 i 18), po każdych 7 dniach CVS (dni 7 i 14), oraz na zakończenie CVS (dzień 21). Zbierz próbki krwi przed codziennym schematem stresu.
    1. Pobrać ostatnią próbkę krwi z tułowia podczas eutanazji (dzień 25) w celu RIA i ekstrakcji genomowego DNA.
  2. Odwirować wszystkie próbki krwi (600 x g, 4 °C, 10 min) w celu oddzielenia osocza od komórek krwi. Odpipetować plazmę (supernatant) i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.
  3. Rozmrozić i użyć osocza do określenia poziomów CORT za pomocą testu radioimmunologicznego (RIA). Upewnij się, że 3-tygodniowy poziom CORT w osoczu jest podwyższony u zwierząt zestresowanych, aby zweryfikować solidność schematu stresu.

4. Zachowanie

  1. Po schemacie CVS (dni 23-24) oceń każde zwierzę pod kątem zachowania podobnego do lęku na podwyższonym labiryncie plus (EPM)14.
  2. Za pomocą kamery wideo nagrywaj zwierzęta na aparacie EPM przez 300 sekund i oceń czas spędzony w centrum, z zamkniętymi ramionami i otwartymi ramionami.

5. Projekt szczura Methyl-Seq

  1. Korzystając z przeglądarki UCSC Genome Browser, uzyskaj nienadmiarowe współrzędne genomowe (rat nov 2004 rn4 assembly) dla wysp CpG i wybrzeży wysp (± 1 kb flankujących wyspy CpG), promotorów (± 1 kb każdego TSS) każdego genu RefSeq i innych sekwencji, które mogą być dostępne w odpowiedniej literaturze.
    Uwaga: Dla szczura Methyl-Seq dodano dodatkowe sekwencje bogate w GC z poprzedniej platformy metylacji opartej na tablicy12. W przypadku regionów większych niż 5 kb/s próbkowano naprzemienne regiony o długości 500 kb/s, a następnie 1 kb/s, które zostały pominięte. Ostateczny projekt Methyl-Seq dla szczurów składa się z 111 Mb/s, 2,3 miliona CpG; i średni rozmiar regionu 594 b/s. Jego celem jest 228 800 unikalnych loci.
  2. Wprowadź skompilowaną listę współrzędnych genomowych do dostępnego na rynku oprogramowania do projektowania przechwytywania celów w celu odpowiedniego zaprojektowania sondy.

6. Budowa biblioteki Rat Methyl-Seq z genomowego DNA

UWAGA: Aby wyeliminować efekty wsadowe, przetwarzaj wiele próbek jednocześnie i odpowiednio zwiększaj miksy główne. Ekstrakcja DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA. Metody oparte na kolumnie lub strącaniu dają wysokiej jakości genomowe DNA (stosunek 260/280 ~ 1,8). Nie zaleca się stosowania metod opartych na fenolach. Elutować lub ponownie zawiesić DNA w buforze o niskiej zawartości TE (10 mM TE, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).

  1. Przygotowanie próbki
    UWAGA: Na każdym etapie korzystania z kulek magnetycznych wiążących DNA, upewnij się, że kulki są zaaklimatyzowane do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut i dobrze wymieszane przed użyciem.
    1. Ścinanie DNA
      1. Użyj fluorometru, aby określić początkowe stężenie dwuniciowego DNA w każdej próbce. Rozcieńczyć >1 μg gDNA do 50 μl buforem o niskiej zawartości TE (10 mM TE, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) w probówkach wirówkowych o niskiej zawartości wiązania DNA.
      2. Ścinanie próbek za pomocą sonikatora izotermicznego (10% cykl pracy, 5 intensywności, 200 cykli na impuls, 6 cykli po 60 s, przemiatanie częstotliwości, 4 °C).
      3. Oceń jakość DNA za pomocą systemu opartego na elektroforezie, który mierzy rozmiar i ilość DNA.
        UWAGA: Zalecana ilość DNA to 1 μg lub 3 μg. W przypadku ograniczonej ilości materiału wyjściowego najmniejsza ilość wejściowa powinna wynosić >500 ng, ponieważ mniejsze ilości wpłyną niekorzystnie na ilość i jakość generowanych bibliotek.
    2. Naprawa DNA kończy się.
      1. Użyj zestawu Methyl-Seq dla szczurów, aby przygotować End-repair Master Mix na lodzie. Dodać 52 μl mieszaniny do każdej próbki i inkubować w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy (20 °C przez 30 minut, 4 °C przetrzymywanie).
        Mieszanka główna naprawy końcowej (na próbkę):
        35,2 μL wody
        10 μL buforu do naprawy końcowej (10x)
        1,6 μl dNTP Mix
        1 μl polimerazy DNA T4
        2 μl polimerazy DNA Klenowa
        2,2 μl kinazy polinukleotydowej T4
      2. Oczyść próbki za pomocą 180 μl kulek magnetycznych wiążących DNA i 400 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu na próbkę. Dodać 180 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Granulki kulkowe, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulat w 200 μL 70% etanolu. Usuń etanol i powtórz mycie raz.
      3. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania jak największej ilości etanolu. Suszyć w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 3–5 minut, aż granulka kulki całkowicie wyschnie. Zawiesić w 44 μl wody wolnej od nukleaz i zebrać około 42 μl supernatantu.
        Punkt zatrzymania: Po naprawieniu końcówek DNA, próbki mogą być zapieczętowane i przechowywane w temperaturze -20 °C.
    3. Adenylate kończy się na 3 '.
      1. Przygotuj Adenylation Master Mix na lodzie. Dodać 9 μl mieszaniny do każdej próbki i inkubować w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy (37 °C przez 30 minut, 4 °C utrzymywanie).
        Mieszanka główna adenylacji (na próbkę):
        5 μl buforu Klenowa
        1 μl dATP
        3 μl polimerazy DNA Klenowa
      2. Oczyść próbki za pomocą 90 μl kulek magnetycznych wiążących DNA i 400 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu na próbkę. Dodać 90 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Granulki kulkowe, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulat w 200 μL 70% etanolu. Usuń etanol i powtórz mycie raz.
      3. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania jak największej ilości etanolu. Suszyć w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 3–5 minut, aż granulka kulki całkowicie wyschnie. Zawiesić w 35 μl wody wolnej od nukleaz i zebrać około 33,5 μl supernatantu.
    4. Zżeluj metylowany adapter.
      1. Przygotować Ligation Master Mix na lodzie i dodać 16,5 μl mieszanki do każdej próbki. Inkubować w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy (20 °C przez 15 min, 4 °C trzymanie).
        Mieszanka główna ligacji (na próbkę):
        2,5 μL wody
        2,5 μl metylo-seq metylowanego adaptera
        10 μL buforu ligazy DNA T4 (5x)
        1,5 μl ligazy DNA T4
      2. Oczyść próbki za pomocą 90 μl kulek magnetycznych wiążących DNA i 400 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu na próbkę. Dodać 90 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Granulki kulkuje, usuwają supernatant i ponownie zawieszają granulki w 200 μl 70% etanolu. Usuń etanol i powtórz mycie raz.
      3. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania jak największej ilości etanolu. Suszyć w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 3–5 minut, aż granulka kulki całkowicie wyschnie. Zawiesić w 22 μl wody wolnej od nukleaz i zebrać około 22 μl supernatantu. Oceń jakość za pomocą bioanalizatora.
        Uwaga: Jeśli całkowita ilość DNA jest mniejsza niż 500 ng, należy ścinać i przetwarzać dodatkowe DNA przed przystąpieniem do kolejnych etapów. Jeśli średni rozmiar DNA nie zwiększa się o więcej niż 30 punktów bazowych, sprawdź, czy odczynniki są nowe, ponieważ polimeraza DNA T4, ligaza Klenowa i/lub ligaza T4 mogą być stare.
        Punkt zatrzymania: Po podwiązaniu metylowanego adaptera próbki mogą być szczelnie zamknięte i przechowywane w temperaturze -20 °C.
  2. krzyżowanie
    1. Przenieść próbki do probówek mikrowirówek o niskim stopniu wiązania DNA i użyć podgrzanego koncentratora próżniowego, aby zmniejszyć objętość próbki do mniej niż 3,4 μl. Rozpuść próbki do 3,4 μl.
      UWAGA: Zagęścić próbki do około ~3 μl, aby upewnić się, że próbki zostaną usunięte z koncentratora próżniowego, zanim cała ciecz odparuje.
    2. Przygotuj bufor hybrydyzacyjny w temperaturze pokojowej i Methyl-Seq Block Mix na lodzie. Dodać 5,6 μl mieszanki blokowej Methyl-Seq do każdej próbki i inkubować w termocyklerze (95 °C przez 5 min, 65 °C przez 2 min, 65 °C utrzymywać w 65 °C).
      Bufor hybrydyzacyjny (na próbkę):
      6,63 μl Methyl-Seq Hyb 1
      0,27 μl Methyl-Seq Hyb 2
      2,65 μl Methyl-Seq Hyb 3
      3,45 μl Methyl-Seq Hyb 4
      Methyl-Seq Block Mix (na próbkę):
      2,5 μl bloku indeksującego Methyl-Seq 1
      2,5 μl bloku metylu 2
      0,6 μl Methyl-Seq Block 3
    3. Przygotuj mieszankę bloków RNazy i mieszankę hybrydyzacji biblioteki przechwytywania. Dodać 20 μl mieszanki hybrydyzacyjnej z biblioteki przechwytywania do każdej próbki i inkubować w temperaturze 65 °C przez co najmniej 16 godzin
      Mieszanka blokowa RNazy (na próbkę):
      0,5 μl bloku RNazy
      1,5 μL wody
      Mieszanka hybrydyzacji biblioteki przechwytywania (na próbkę):
      13 μl buforu hybrydyzacyjnego
      2 μl bloku RNazy Mix
      5 μL biblioteki wychwytywania mertylu u szczurów
      UWAGA: Utrzymuj reakcje w temperaturze 65 °C podczas dodawania mieszanki hybrydyzacyjnej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
    4. Porcję 50 μl kulek magnetycznych streptawidyny na próbkę do nowej 8-dołkowej probówki paskowej. Przemyć kulki 200 μl buforu wiążącego Methyl-Seq. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania supernatantu między każdym praniem, co daje w sumie 3 prania. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić kulki streptawidyny w 200 μl buforu wiążącego metylo-sekr.
    5. Dodać próbki do 200 μl przemytych kulek magnetycznych streptawidyny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut za pomocą mieszalnika obrotowego. Podczas mieszania podatkować 200 μl buforu 2 do płukania metodą sekwencjonu metylu do trzech dołków na 96-dołkową płytkę na próbkę i umieścić w termocyklerze w celu wstępnego ogrzania do temperatury 65 °C.
    6. Po inkubacji osadzać kulki magnetyczne streptawidyny za pomocą płytki magnetycznej i ponownie zawieś kulki w 200 μl buforu do płukania metylu 1. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Użyj płytki magnetycznej do osadzania i odrzucania supernatantu.
    7. Umyj kulki 3 razy za pomocą Methyl-Seq Wash Buffer 2: ponownie zawiesić granulki kulek w 200 μl buforu do płukania 2 (wstępnie podgrzanego w kroku 6.2.5), inkubować kulki w termocyklerze (65 °C, 10 min) i granulki. Wyrzuć supernatant po każdym praniu za pomocą płytki magnetycznej.
      UWAGA: Utrzymuj reakcje hybrydyzacji w temperaturze 65 °C podczas dodawania buforu myjącego 2, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
    8. Dodać 20 μl buforu elucyjnego Methyl-Seq do przemytych kulek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min. Za pomocą płytki magnetycznej obrać kulki i przenieść supernatant do nowej probówki paskowej. Wyrzuć koraliki.
      Uwaga: Podczas inkubacji przygotować odczynnik do konwersji wodorosiarczynu.
  3. Konwersja wodorosiarczynu
    UWAGA: Przeprowadzić konwersję wodorosiarczynową eluowanego ssDNA przy użyciu odpowiednich odczynników i instrukcji z dostępnego w handlu zestawu do konwersji wodorosiarczynu.
    1. Dodać 130 μl przygotowanego odczynnika konwersji wodorosiarczynu do supernatantu z poprzedniego etapu. Podzielić każdą ze 150 μl reakcji równo na dwie studzienki. Inkubować w termocyklerze (64 °C przez 2,5 h, 4 °C trzymanie).
      UWAGA: Reakcja 150 μl jest podzielona równo na dwie oddzielne studzienki, aby zapewnić jednorodną temperaturę. Po inkubacji przez 2,5 godziny natychmiast przejdź do następnego kroku.
    2. Związać próbki z kolumnami wirowymi, dodając 600 μl buforu wiążącego i przepłukać raz 100 μl buforu do przemywania. Kolumny wirówkowe (15 000 x g, 1 min) między wszystkimi etapami konwersji wodorosiarczynu i przepływają odrzuty.
    3. Próbki odsulfonianów przez dodanie 200 μl buforu odsiarczającego do kolumn. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 - 20 minut. Powtórz wirowanie i wyrzuć przepływ.
    4. Przepłukać kolumny dwukrotnie 200 μl buforu do mycia. Eluować każdą próbkę, dodając 10 μl buforu elucyjnego do kolumny, inkubując przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i odwirowując (15 000 x g, 1 min). Powtórzyć etap elucji, uzyskując łącznie 20 μl.
    5. Przygotować reakcję PCR Master Mix 1 na lodzie. Do każdej próbki dodać 82 μl mieszanki. Inkubować w termocyklerze za pomocą następującego programu.
      Główna mieszanka reakcji PCR 1 (na próbkę):
      30 μL wody
      50 μL preparatu Methyl-Seq PCR Master Mix
      1 μl podkładu Methyl-Seq PCR1 Primer F
      1 μL preparatu Methyl-Seq PCR1 Primer R
      Program termocyklera:
      Etap 1, 1 cykl: 95 °C 2 min
      Etap 2, 8 cykli: 95 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s
      Etap 3, 1 cykl: 72 °C 7 min
      Etap 4, 1 cykl: 4 °C Przytrzymaj
    6. Oczyść próbki za pomocą 180 μl kulek magnetycznych wiążących DNA i 400 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu na próbkę. Dodać 180 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Granulki kulkowe, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulat w 200 μL 70% etanolu. Usuń etanol i powtórz mycie raz.
    7. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania jak największej ilości etanolu. Suszyć w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 3–5 minut, aż granulka kulki całkowicie wyschnie. Zawiesić w 21 μl wody wolnej od nukleaz i zebrać około 19,5 μl supernatantu.
  4. Indeksowania
    1. Przygotuj reakcję PCR Master Mix 2 na lodzie. Do każdej próbki dodać 25,5 μl Master Mix 2. Dodać 5 μl komercyjnych starterów indeksujących do pojedynczych próbek i inkubować w termocyklerze.
      PCR Reaction Master Mix 2 (na próbkę):
      25 μL Methyl-Seq PCR Master Mix
      0,5 μl wspólnego podkładu indeksującego methyl-seq
      Program termocyklera:
      Etap 1, 1 cykl: 95 °C 2 min
      Etap 2, 6 cykli: 95 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s
      Etap 3, 1 cykl: 72 °C 7 min
      Etap 4, 1 cykl: 4 °C Hold
      UWAGA: Dodatkowe cykle (2 - 3) mogą być konieczne, jeśli początkowe stężenie DNA jest poniżej zalecanych wartości.
    2. Oczyść próbki za pomocą 90 μl kulek magnetycznych wiążących DNA i 400 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu na próbkę. Dodać 90 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Granulki kulkowe, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulat w 200 μL 70% etanolu. Usuń etanol i powtórz mycie raz.
    3. Użyj płytki magnetycznej do granulowania kulek i usuwania jak największej ilości etanolu. Suszyć w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 3–5 minut, aż granulka kulki całkowicie wyschnie. Zawiesić w 24 μl wody wolnej od nukleaz i zebrać około 24 μl supernatantu.
    4. Oceń stężenie i wielkość bp za pomocą odczynników do wykrywania DNA o wysokiej czułości w bioanalizatorze.
      Uwaga: Jeśli bioanalizator nie wykryje obecności DNA z biblioteki, powtórz kroki przygotowania z dodatkowym DNA.
      Punkt zatrzymania: Po oczyszczeniu zindeksowane próbki mogą być szczelnie zamknięte i przechowywane w temperaturze -20 °C.
    5. Łączenie próbek dla odpowiedniej używanej platformy sekwencjonowania nowej generacji.
      1. Korzystając z danych o stężeniu z bioanalizatora, który określa molowość DNA na podstawie wielkości biblioteki i ilości w danej objętości, rozcieńczyć buforem o niskiej zawartości TE (6.1.1.1) i połączyć wszystkie próbki do końcowego stężenia 15 pM.
        UWAGA: Bardziej czułą metodą ilościowego określania biblioteki jest ilościowy PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów, które są ukierunkowane na ligowane adaptery.
      2. Uruchom próbki zbiorcze na liczbie linii, która jest wystarczająca dla 4 próbek na linię w sekwencerze nowej generacji.
        UWAGA: Na przykład, jeśli 16 próbek biblioteki zostało jednoznacznie zindeksowanych i połączonych, uruchom biblioteki na 4 torach, co odpowiada 4 próbkom na linię.

7. Sekwencjonowanie na sekwencerze nowej generacji

  1. Wyślij próbki do instytucjonalnego rdzenia sekwencjonowania w celu zgrupowania biblioteki Methyl-Seq, a następnie sekwencjonowania na maszynie do sekwencjonowania nowej generacji.

8. Analiza w celu identyfikacji DMR

  1. Zaimplementuj Bismark15, który wywołuje Bowtie 2.0 jako wewnętrzny wyrównywacz sekwencji16,17, aby wyrównać surowe odczyty wejściowe do genomu z dodatnią nicią przekształconą w wodorosiarczyn. Po wyrównaniu użyj Bismark_methylation_extractor do przeprowadzenia kontroli jakości i przypisania szacowanej wartości metylacji do każdego CpG.
  2. Wygeneruj listę DMR-ów za pomocą pakietu BS-Seq18 w Bioconductor. Filtruj DMR na podstawie liczby większej niż 3 kolejnych CpG i wartości P <0,05,
    UWAGA: Wygeneruj listę DMR, która zawiera współrzędne genomowe, odległość do najbliższego genu RefSeq, liczbę CpG w każdym DMR, średnią% wartość metylacji CpG w DMR dla dwóch grup porównawczych (np. zestresowany vs. nieobciążony), wartość P i wartość FDR (wskaźnik fałszywych odkryć). Użyj listy DMR, tj. współrzędnych genomowych, do zaprojektowania starterów pirosekwencjonowania do walidacji.

9. Walidacja za pomocą pirosekwencjonowania wodorosiarczynu

  1. Projekt podkładu
    1. Zaprojektuj startery do PCR wodorosiarczynu i pirosekwencjonowania. Zaprojektuj dwa zestawy starterów PCR (na zewnątrz i zagnieżdżone) tak, aby zagnieżdżony PCR wzmacniał 150–400 bps DMR.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, zaprojektowane startery mają co najmniej 24 zasady długości z co najmniej 4-5 nienastępującymi po sobie G (C dla odwrotnego startera), aby uwzględnić obniżoną temperaturę wyżarzania spowodowaną utratą złożoności sekwencji. Jeden z zagnieżdżonych starterów zostanie znakowany biotyną i oczyszczony metodą HPLC. Jednak najpierw należy zamówić standardowe startery, aby zoptymalizować etap PCR poprzez rozdzielenie reakcji na żelu agarozowym.
      1. Zaprojektuj starter do pirosekwencjonowania w taki sposób, aby był ukierunkowany na komplementarną biotynylowaną nić zaledwie 1–2 zasady przed CpG, które mają być testowane. W razie potrzeby zaprojektuj wiele starterów pirosekwencjonujących, ponieważ każdy starter pirosekwencjonujący może niezawodnie testować 30 punktów bazowych poniżej.
    2. W przypadku Rt1-m4 użyj następujących elementów:
      rRT1M4 Na zewnątrz – F TGTAYGATTTGGTTATYGTAAAT
      rRT1M4 Na zewnątrz – R AACTTACAAATTTCACCAACTCA
      rRT1M4 zagnieżdżony – F GTGGGTTAYGTGGATAATATAG
      rRT1M4 zagnieżdżony – R AATCACTTACCATTCTCTCTCTAACTA
      rRT1M4 Pyro1 TAYGTGGATAATATATAGAT
      rRT1M4 Pyro2 GATAGTTATTTGGYGAGTTAG
      rRT1M4 Pyro3 GAGTATTTGGAGGAGTTGAT
      rRT1M4 Pyro4 GGATTTTAATATTTGGT powiedział:
  2. Użyj dostępnego w handlu zestawu do konwersji wodorosiarczynu gDNA krwi szczura.
    UWAGA: Etapy konwersji wodorosiarczynu zostały zaadaptowane z dostępnego na rynku zestawu z następującymi modyfikacjami: W kroku 1 dodaj 50–100 ng gDNA krwi i rozcieńcz wodą do 20 μl. W kroku 9 eluuj 20 μl na próbkę.
    1. Przygotować odczynnik do konwersji wodorosiarczynu zgodnie z protokołem producenta i połączyć z rozcieńczonym gDNA. Inkubować w termocyklerze (64 °C przez 2,5 h, 4 °C trzymanie).
    2. Dodaj bufor wiążący do przekształconego gDNA w kolumnach wirowych i odwiruj (15 000 x g, 1 min). Jednokrotnie umyć kolumny, a następnie dodać do nich bufor odsiarczający i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Wirówka (15 000 x g, 1 min).
    3. Kolumna płucząca z buforem płuczącym i wirówką (15 000 x g, 1 min). Powtórzyć etap mycia z odwirowaniem (15 000 x g, 2 min). Dodać 20 μl buforu elucyjnego i odwirować (15 000 x g, 1 min) do elucji.
  3. Amplifikacja PCR
    1. Przygotuj zewnętrzną mieszankę wzorcową PCR. Dodaj 21,5 μl Master Mix do 3,5 μl gDNA przekształconego w wodorosiarczyn i uruchom program termocyklera.
      Zewnętrzna mieszanka główna PCR:
      16,25 μL wody
      2,5 μL buforu polimerazy [10x]
      0,5 μL dNTP [10 mM]
      1 μL Forward Primer [0,1 μM]
      1 μL Reverse Primer [0,1 μM]
      0,25 μl polimerazy DNA Taq [5000 U/ml].
      Program termocyklera:
      Etap 1, 1 cykl: 94 °C 4 min
      Etap 2, 47 cykli: 94 °C 1 min, 53 °C 30 s, 72 °C 1 min
      Etap 3, 1 cykl: 72 °C 8 min, 4 °C Przytrzymaj
    2. Przygotuj zagnieżdżoną mieszankę wzorcową PCR. Dodać 23 μl Master Mix do 2 μl próbki z zewnątrz PCR i powtórzyć program termocyklera zewnętrznego PCR. Oceń jakość produktu PCR za pomocą elektroforezy żelowej (1x bufor TAE, 1% żel agarozowy).
      Zagnieżdżony PCR Master Mix:
      17,75 μL wody
      2,5 μL buforu polimerazy [10x]
      0,5 μL dNTP [10 mM]
      1 μL Forward Primer [0,1 μM]
      1 μL Reverse Primer [0,1 μM]
      0,25 μL polimerazy DNA Taq [5000 U/ml]
      Uwaga: W przypadku zagnieżdżonego PCR starter do przodu lub do tyłu musi być biotynylowany.
  4. Pirosekwencjonowanie
    1. Sporządzić mieszankę wzorcową zawierającą 38 μl buforu wiążącego, 35 μl wody i 2 μl kulek sefarozy pokrytych streptawidyną na próbkę. Do płytki 96-dołkowej dodać 75 μl mieszanki wzorcowej i 5 μl zagnieżdżonego produktu PCR. Wstrząsać na talerzu przez 15 - 60 minut.
    2. Podczas wytrząsania dodać 12 μl startera (0,5 μM, rozcieńczonego w buforze do wyżarzania) do studzienek płytki do pirosekwencjonowania.
    3. Po wstrząśnięciu należy wykonać etapy mycia za pomocą wiążących reakcyjnych. Umieść narzędzie próżniowe w korycie wypełnionym wodą, a następnie zbierz próbki z płyty. Zanurz narzędzie próżniowe w częściowo wypełnionych korytach zawierających 70% etanolu, NaOH (0,2 M) i bufor octanu Tris (10 mM, pH 7,4). Odłącz od próżni i umieść narzędzie próżniowe na płytce testowej HS, aby przenieść kulki.
    4. Umieścić płytkę na bloku grzewczym i inkubować w temperaturze 80 °C przez 2 minuty. Pozostawić płytkę do ostygnięcia przez 5 minut, a następnie rozpocząć program pirotechniczny.

Wyniki

Pomyślna implementacja platformy Methyl-Seq u szczurów zależy od kilku kryteriów. Rycina 1 przedstawia ogólny schemat badania i wyróżnia konkretne etapy kontroli jakości (QC), które są niezbędne przed przejściem do kolejnych kroków. Jednym z pierwszych czynników, które należy wziąć pod uwagę, jest solidność modelu zwierzęcego oraz schemat stresowy, które determinują skalę zmian epigenetycznych zachodzących w całym metylomie. Ponieważ nasze prace na zwierzętach opierały się na wcześniejszej obserwacji, że ekspozycja na kortykosteron (CORT) może prowadzić do zmian w metylacji DNA19,20, nasz schemat przewlekłego stresu zmiennego (CVS) musiał być wystarczająco rygorystyczny, aby u zestresowanych szczurów uzyskać podwyższony poziom CORT w osoczu. Typowy tygodniowy schemat CVS przedstawiono w Tabeli 1; składał się on z codziennych stresorów stosowanych rano, po południu i w nocy, które były stale zmieniane, aby zapobiec habituacji i osłabieniu reakcji stresowej. Przez cały 3-tygodniowy okres stosowania schematu u zestresowanych zwierząt odnotowano istotnie podwyższony średni poziom CORT w osoczu [dni 4–21, grupa kontrolna: 32,7 ± 3,7 ng/mL, grupa stresowa: 103,0 ± 11,9 ng/mL (średnia ± SEM), P = 2,2 x 10-4, Rycina 2A] w porównaniu z niezestresowanymi zwierzętami kontrolnymi. Spójnie z tymi wynikami, zwierzęta te wykazywały również silniejsze zachowania lękowe w podwyższonym labiryncie krzyżowym (EPM), co przejawiało się istotnie dłuższym czasem spędzonym w ramionach zamkniętych EPM i krótszym czasem w ramionach otwartych (Rycina 2B). Wyniki te dowodzą, że ekspozycja na CVS doprowadziła do istotnych zmian endokrynologicznych i behawioralnych, co skłoniło nas do zbadania, czy zmiany te są związane ze specyficznymi sygnaturami metylacji DNA.

Kładziemy nacisk na kilka punktów kontrolnych, które są kluczowe dla pomyślnego przygotowania biblioteki Methyl-Seq. Konieczne jest rozpoczęcie procesu od wystarczającej ilości DNA, ponieważ sonikacja, wielokrotne etapy przemywania/oczyszczania, wzbogacanie celu oraz konwersja bisulfitowa sukcesywnie redukują ilość DNA w gotowej bibliotece. Chociaż kilka etapów amplifikacji PCR niweluje utratę matrycy DNA, nadmierna liczba cykli PCR może prowadzić do zwiększenia liczby duplikatów odczytów. W niniejszym badaniu Methyl-Seq u szczura użyto 2 μg gDNA z krwi na szczura. Zauważamy, że biblioteki Methyl-Seq można przygotować z ilości wyjściowej DNA wynoszącej nawet 500 ng. Mniejsza ilość materiału wyjściowego pozwala użytkownikom na generowanie bibliotek z DNA wyizolowanego metodą FACS (sortowanie komórek aktywowane fluorescencją) lub za pomocą biopsji gruboigłowej, choć wiąże się to ze zwiększonym ryzykiem uzyskania niewystarczającej ilości bibliotek do późniejszego sekwencjonowania. Kontrola jakości (QC) jest przeprowadzana za pomocą elektroforezy 1 μL próbki na bioanalizatorze, który określa masę cząsteczkową, ilość i molarność DNA. Trzy krytyczne etapy wymagające użycia bioanalizatora to: 1) po etapie sonikacji, aby upewnić się, że DNA zostało odpowiednio pofragmentowane (~170 bp, kolor czerwony, Rysunek 3); 2) po etapie ligacji adapterów, co objawia się przesunięciem średniej wielkości pofragmentowanego DNA (~200 bp, kolor niebieski, Rysunek 3), aby zapewnić ich późniejszą amplifikację metodą PCR; oraz 3) po końcowym etapie oczyszczania biblioteki, aby potwierdzić ilość i wielkość biblioteki przeznaczonej do sekwencjonowania.

Do analizy danych z sekwencjonowania bisulfitowego wykorzystano pakiety R BSSeq oraz BSmooth z platformy Bioconductor18. Zawierają one narzędzia i metody do mapowania odczytów sekwencji, przeprowadzania kontroli jakości oraz identyfikacji regionów różnicowo zmetylowanych (DMRs). Oprogramowanie BSmooth wykorzystuje Bowtie 2.016,17 jako wewnętrzny algorytm mapowania sekwencji w celu uzyskania podsumowań pomiarów na poziomie CpG, poprzez dopasowanie surowych odczytów wejściowych do sekwencji genomicznych po konwersji bisulfitowej. Zmapowane odczyty są następnie filtrowane za pomocą rygorystycznych procedur kontroli jakości, które mają na celu zidentyfikowanie systematycznych błędów sekwencjonowania i odczytu zasad, które mogłyby zafałszować późniejsze analizy. W celu wizualnego wspomagania tego procesu filtrowania generowana jest seria wykresów. Generowane są również metryki sekwencjonowania w celu udokumentowania istotnych informacji, takich jak między innymi liczba zmapowanych odczytów, % target oraz pokrycie na CpG (Tabela 2). Po przefiltrowaniu danych zastosowano algorytm wygładzania/normalizacji, w którym każdemu CpG przypisano szacowaną wartość metylacji na podstawie wszystkich odczytów QC z każdej próbki oraz szacunków z sąsiednich CpG, aby zapewnić dokładniejsze określenie stanu metylacji nawet w przypadkach niskiego pokrycia sekwencją. Wartość ta stanowi wygładzoną szacunkową wartość prawdopodobieństwa metylacji w każdym miejscu CpG. Poprzez porównanie średnich wygładzonych szacunków metylacji dla każdej próbki między dwiema grupami traktowania i uszeregowanie regionów genomicznych od najbardziej do najmniej istotnie różniących się, wygenerowano listę DMRs (Tabela 3).

Najważniejszy DMR pomiędzy grupami poddanymi stresowi i grupami kontrolnymi znajdował się w promotorze szczurzego genu głównego układu zgodności tkankowej Rt1-m4, przy czym u zwierząt poddanych stresowi odnotowano wyższe poziomy metylacji we wszystkich miejscach CpG niż u zwierząt kontrolnych (Rysunek 4A). Aby potwierdzić prawidłowe wdrożenie platformy Methyl-Seq oraz analizy danych, zaprojektowano startery skierowane przeciwko DMR, a poziomy metylacji DNA we krwi w całej kohorcie zwierząt poddanych stresowi i zwierząt kontrolnych (8 zsekwencjonowanych za pomocą Methyl-Seq i 8 niezesekwencjonowanych) oceniono za pomocą pirosekwencjonowania z konwersją bisulfitową. Wyniki wykazują istotny wzrost metylacji DNA w 10 z 12 badanych miejsc CpG (zmiana o 5,1–10,4% metylacji, P <0,037, Rysunek 4B). Analizę szlaków KEGG przeprowadzono dla wszystkich nominalnie istotnych DMR w celu zidentyfikowania szlaków związanych ze stresem. Spójnie z tym, szlaki związane z DMR obejmowały choroby towarzyszące przewlekłej ekspozycji na stres, takie jak cukrzyca, choroby układu sercowo-naczyniowego oraz nowotwory (Tabela 4).21,22,23 Aby wykazać związek między danymi epigenetycznymi a stopniem ekspozycji na stres, poziomy metylacji w miejscu CpG-10 porównano ze średnimi poziomami CORT z okresu 3 tygodni dla każdego zwierzęcia. Wyniki wykazały umiarkowaną korelację między danymi endokrynnymi a danymi o metylacji (R2=0,54, P=0,001, Rysunek 5).

Schemat analizy DNA pod wpływem stresu u szczurów; Methyl-Seq, konwersja bisulfitowa, sekwencjonowanie, etapy walidacji.
Rycina 1: Ogólny schemat przepływu pracy dla platformy Methyl-Seq u szczurów. 1 μg genomowego DNA wyekstrahowanego z krwi szczurów w grupie stresowej i kontrolnej jest najpierw przetwarzane w celu stworzenia bibliotek Methyl-Seq do sekwencjonowania, analizy i identyfikacji celów. Kolejne 100 ng DNA jest wykorzystywane do niezależnej walidacji zidentyfikowanych celów epigenetycznych za pomocą pirosekwencjonowania z konwersją bisulfitową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Poziomy kortykosteronu w osoczu, wyniki w labiryncie krzyżowym (EPM) w grupach kontrolnej i stresowej, wykresy, badanie CVS.
Rycina 2: Ekspozycja na chroniczny stres zmienny (CVS) prowadzi do zmian endokrynnych i behawioralnych u szczurów. (A) Wielokrotne pobrania kortykosteronu (CORT) potwierdzają skuteczność 3-tygodniowego schematu CVS. Próbki krwi pobierano rano, przed codziennym schematem stresowym. (B) Zwierzęta poddane stresowi spędzały więcej czasu w ramionach zamkniętych i mniej czasu w ramionach otwartych labiryntu krzyżowego (EPM). Przedstawiono wykresy pudełkowe z punktami danych dla każdego zwierzęcia. W celu oceny istotności statystycznej przeprowadzono test t Studenta. *P<0.05, **P<0.01 i ***P<0.001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres analizy fluorescencji DNA, rozkład wielkości DNA, diagram jednostek fluorescencji w funkcji par zasad.
Rysunek 3: Ilościowe oznaczenie pociętego i ligowanego z adapterami DNA szczura za pomocą bioanalizatora. Czerwone i niebieskie krzywe przedstawiają ilość i wielkość genomicznego DNA (czerwone) odpowiednio po pocięciu w sonikatorze izotermicznym oraz po ligacji adapterów. Każda linia reprezentuje jedną próbkę, a krzywe czerwone i niebieskie odzwierciedlają zarówno ubytek DNA podczas kilku etapów (naprawa końców, adenylacja 3' oraz oczyszczanie próbki), jak i wzrost wielkości w bp wynikający z ligacji adapterów. Wyraźne piki przy 25 bp i 1500 bp to markery standardowe dodane do buforu do nakładania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza metylacji DNA; A) wykres trendu, B) wykres słupkowy; pozycje CpG w grupie kontrolnej i stresowej.
Rycina 4: Epigenetyczne zmiany wywołane CVS zostają wykryte za pomocą Methyl-Seq u szczurów. (A) Analiza danych Methyl-Seq u szczurów wykazała, że promotor genu Rt1m4 stanowi region o zróżnicowanej metylacji (DMR) pomiędzy szczurami stresowanymi (czerwony) a kontrolnymi (niebieski). Wynik graficzny dla DMR genu Rt1m4 (obszar zacieniony na różowo) przedstawia każdą pozycję CpG (pionowa szara linia), cztery próbki w każdej grupie (linie czerwone lub niebieskie) oraz poziomy % metylacji dla każdego zwierzęcia (czerwona lub niebieska kropka). (B) Dwanaście pozycji CpG w obrębie DMR zostało zwalidowanych za pomocą pirosekwencjonowania z konwersją bisulfitową. Wykresy słupkowe przedstawiono jako średnia SEM, a w celu oceny istotności statystycznej przeprowadzono test t Studenta. *P<0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres rozrzutu metylacji DNA w stosunku do poziomu CORT w osoczu; korelacja liniowa, R²=0.54, P=0.001.
Rysunek 5: Analiza regresji liniowej wykazała umiarkowaną korelację między % metylacji DNA w miejscu CpG-10 genu Rt1m4 a średnim poziomem CORT w osoczu w 3. tygodniu u zwierząt stresowanych oraz kontrolnych (N=16). Dane pochodzące od zwierząt stresowanych przedstawiono czerwonymi kółkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

TydzieńDzień 1Dzień 2Dzień 3Dzień 4Dzień 5Dzień 6Dzień 7
AMUnieruchomieniePływanieChłodniaPływanieUnieruchomienieMieszadło orbitalnePływanie
PMMieszadło orbitalnePrzechylenie klatkiUnieruchomienieMieszadło orbitalneChłodniaUnieruchomienieChłodnia
Przez nocOgraniczenie spożycia pokarmuWilgotna ściółkaIzolacjaWłączenie światłaZatłoczenie molekularneWłączenie światłaMokra ściółka

Tabela 1: Typowy tygodniowy harmonogram schematu przewlekłego stresu zmiennego (CVS).

Metryki sekwencjonowaniaStres1Kontrola1
 (n = 4)(n = 4)
Odczyty par końcowych (PER)89,290,39780,165,674
Jednoznacznie zmapowane odczyty par końcowych (UMPER)39,200,25535,013,406
Wskaźnik dopasowania/wydajność mapowania (UMPER/PER)44%44%
Duplikaty odczytów (% UMPER)73%65%
UMPER po usunięciu duplikatów10,481,03112,306,018
Średnia głębokość pokrycia odczytów (x) (ARDC)6x6x
CpGs (N)12,056,87812,056,878
ARDC (x) dla CpGs2x2x
CpGs z co najmniej 10 odczytami (N)481,383595,850
ARDC (X) dla CpGs z co najmniej 10 odczytami1919
CpGs w obrębie celu (pełne pokrycie z regionami docelowymi sond)1,923,8722,007,638
ARDC (x) w obrębie celu dla CpGs7x8x
CpGs w obrębie celu z co najmniej 10 odczytami (N)428,249531,419
ARDC (x) w obrębie celu dla CpGs z co najmniej 10 odczytami18x18x
W obrębie celu (PER z pokryciem 1 lub więcej par zasad z regionami docelowymi sond) (UMPER)8,277,7159,369,523
% w obrębie celu (z UMPER po usunięciu duplikatów)78%77%
W obrębie celu (całkowita liczba zmapowanych zasad) Mb125 Mb128 Mb
Średnia głębokość pokrycia odczytów w obrębie celu (x) (ARDC)9x10x
1Metryki sekwencjonowania oparte na średnich dla osobników w każdej grupie

Tabela 2: Metryki sekwencjonowania uzyskane z platformy Methyl-Seq u szczura.

chrProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.koniecgenodległośćareaStatróżnica średnichstreskontrolakierunek
chr201,644,2461,644,390RT1-M4wewnątrzgenowy93.030.220.330.11wzmocnienie
chr5160,361,352160,361,564LOC690911wewnątrzgenowy-70.75-0.190.720.91strata
chr361,138,28161,138,330RGD156431926556961.790.210.940.72wzmocnienie
chr2143,064,811143,065,010Ufm18569-59.48-0.110.130.24strata
chr730,764,11130,764,284Ntn4w obrębie genu57.040.210.940.73wzmocnienie
chr1712,469,11212,469,218Nie wiem41996-50.91-0.130.740.88strata
chr747,101,72547,101,930Pawrw obrębie genu-50.54-0.120.640.76strata
chr576,111,24876,111,822Txndc8151703-50.38-0.110.850.96strata
chr1180,640,13280,640,356Dgkgwewnątrzgenowy-50.07-0.160.730.89strata
chr871,759,24871,759,411Mir190210226-47.84-0.170.580.75strata

Tabela 3: 10 najważniejszych regionów o zróżnicowanej metylacji. Dla każdego DMR tabela wynikowa przedstawia w kolumnach od lewej do prawej: lokalizację chromosomową (chr), współrzędne (start/end), nazwę genu, odległość od miejsca rozpoczęcia transkrypcji, statystyki obszaru zróżnicowania pomiędzy grupami poddanymi stresowi a kontrolnymi (areaStat), średnią różnicę w metylacji (meanDiff), średnie poziomy metylacji w każdym DMR dla grup poddanych stresowi i kontrolnych (stress/control) oraz kierunek zmiany metylacji względem grup kontrolnych.

Terminy ścieżek KEGGLiczba genów%wartość pBenjamini
Cukrzyca
Cukrzyca typu 2120.13,6 x 10-49,8 x 10-3
Choroby układu sercowo-naczyniowego
Skurcz mięśni gładkich naczyń krwionośnych180.11,6 x 10-33,6 x 10-2
Kardiomiopatia arytmogenna prawej komory (ARVC)130.14,0 x 10-37,1 x 10-2
Kardiomiopatia rozstrzeniowa140.17,6 x 10-31,2 x 10-1
Funkcja neuronu
Długotrwałe wzmocnienie synaptyczne110.11,5 x 10-21,4 x 10-1
Sygnalizacja
Szlak sygnałowy MAPK350.22,4 x 10-49,9 x 10-3
Szlak sygnalizacji wapniowej220.11,2 x 10-21,4 x 10-1
Szlak sygnalizacyjny chemokin210.11,2 x 10-21,3 x 10-1
Nowotwór
Szlaki sygnałowe w nowotworach420.34,1 x 10-53,4 x 10-3
Glioma150.14,4 x 10-52,4 x 10-3
Niedrobnokomórkowy rak płuca100.17,9 x 10-31,1 x 10-1
Rak jelita grubego130.18,4 x 10-31,1 x 10-1
Przewlekła białaczka szpikowa120.11,2 x 10-21,3 x 10-1

Tabela 4: Analiza ścieżek KEGG dla DMR zidentyfikowanych w badaniu Methyl-Seq szczura.

Dyskusja

W tym badaniu zaprojektowaliśmy i wdrożyliśmy platformę Methyl-Seq dla genomu szczura. Demonstrując jego użyteczność za pomocą szczurzego modelu stresu, wykazaliśmy, że eksperymentalny i analityczny potok może zapewnić zróżnicowane metylowane regiony między dwiema grupami porównawczymi.

Aby zapewnić pomyślne wdrożenie platformy, należy przestrzegać kilku krytycznych kroków. Po pierwsze, początkowa jakość i ilość DNA ma znaczący wpływ na jakość i ilość końcowej biblioteki Methyl-Seq. Użyliśmy fluorometru, a nie spektrofotometru, aby upewnić się, że nasz pomiar DNA odzwierciedla ilość obecnego dwuniciowego DNA. Bioanalizator został użyty do pomiaru wielkości cząsteczkowej i ilości DNA po ścinaniu i po podwiązaniu adaptera. Weryfikacja "przesunięcia" wielkości cząsteczki między tymi etapami ma kluczowe znaczenie dla potwierdzenia obecności adapterów na końcach każdego fragmentu DNA, który zostanie poddany PCR za pośrednictwem adaptera w kolejnych etapach. Ilość DNA pozostała na końcu etapu ligacji adaptera jest również ważna, ponieważ na tym etapie potrzebne jest co najmniej 100 ng produktu bibliotecznego, aby zapewnić wystarczającą ilość po docelowych etapach wzbogacania i konwersji wodorosiarczynu. Końcowy pomiar wysokiej czułości został przeprowadzony na skonstruowanej bibliotece Methyl-Seq, tak aby biblioteka mogła być odpowiednio rozcieńczona w celu późniejszego grupowania na sekwencerze nowej generacji. Wreszcie, pirosekwencjonowanie wodorosiarczynu zastosowano jako wysoce ilościową, niezależną metodę oceny dokładności rurociągu analitycznego. Ostateczna walidacja z wykorzystaniem oryginalnych próbek i replikacja przy użyciu dodatkowych zwierząt są kluczowymi krokami zapewniającymi, że eksperyment może wykryć biologicznie istotne zmiany w metylacji DNA.

Zamieszczamy również kilka wskazówek w przypadku odstępstwa od protokołu lub napotkania problemów. Po pierwsze, możliwa jest utrata zbyt dużej ilości DNA podczas naprawy końcówki, podwiązania adaptera lub etapów oczyszczania kulek magnetycznych. Alternatywnie, początkowe ilości DNA mogą być małe (<200 ng) ze względu na ograniczoną dostępność tkanki/DNA lub zastosowanie różnych metod wzbogacania, takich jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Zwiększenie liczby cyklu podczas dwóch etapów amplifikacji biblioteki może być w stanie zrekompensować nadmierną utratę DNA lub niską początkową ilość DNA w całym protokole budowy biblioteki. Zaleca się jednak nie więcej niż dodatkowe 2–3 cykle, ponieważ nadmierne wzmocnienie szablonu może prowadzić do wzrostu liczby sekwencjonowanych zduplikowanych odczytów. Te duplikaty są wykluczane na etapie wyrównywania, aby zapobiec odchyleniu w obliczeniach procentowej metylacji. Po drugie, jeśli średni rozmiar DNA nie zwiększa się o więcej niż 30 punktów bazowych, sprawdź, czy odczynniki są nowe, ponieważ polimeraza DNA T4, ligaza Klenowa i/lub ligaza T4 mogą być stare. Można stosować dostępne w handlu odczynniki zamienne.

Ponadto możliwe jest, że przewidywane DMR mogą nie zostać zweryfikowane przez pirosekwencjonowanie, w którym różnice w metylacji DNA nie występują lub są znacznie mniejsze niż te przewidywane przez analizę. Słaba walidacja regionów kandydujących jest problemem zbyt powszechnym w wielu analizach całego genomu, na przykład gdy wyniki pirosekwencjonowania nie potwierdzają zróżnicowanej metylacji lub wielkość efektu jest znacznie mniejsza niż przewidywana w analizie. BSmooth to jeden pakiet analityczny, który "wygładza" poziomy metylacji w oknie wielu CpG. W obecnym eksperymencie BSmooth zasugerował DMR, którego poziomy metylacji zostały potwierdzone przez pirosekwencjonowanie wodorosiarczynów. Jednak prawdopodobnie wystąpią rozbieżności między poziomami metylacji przewidywanymi przez BSmooth a tymi zweryfikowanymi przez pirosekwencjonowanie. Rozbieżności wynikają z funkcji wygładzania, która szacuje średnie wartości metylacji dla wszystkich CpG w DMR, w tym kolejnych CpG, które mogą różnić się metylacją DNA o więcej niż 50% lub CpG, których wartości metylacji zostały wykluczone ze względu na podprogową głębokość odczytu. Pakiety R, takie jak MethylKit24 , mogą być używane do identyfikacji mniejszych okien CpG, a nawet pojedynczych CpG, których poziomy metylacji silnie korelują z tymi zwalidowanymi przez pirosekwencjonowanie. Implementacja różnych pakietów i testowanie ich przewidywanych regionów lub CpG metylacji różnicowej za pomocą pirosekwencjonowania zapewni solidność danych. Alternatywnie, oryginalne biblioteki Methyl-Seq można ponownie sekwencjonować i dodawać do odczytywanych plików w celu zwiększenia głębokości odczytu. Ponieważ oznaczanie poziomów metylacji jest półilościowe i podyktowane liczbą odczytów [(# CpGs)/(# TpGs+CpGs)], zwiększenie głębokości odczytu dla danego CpG zwiększy dokładność jego procentowej wartości metylacji. W tym badaniu wzięliśmy pod uwagę tylko CpG, których wartości metylacji zostały określone przez co najmniej dziesięć odczytów i osiągnęliśmy ogólne pokrycie odczytu 19x dla każdego CpG.

Platforma Methyl-Seq dla szczurów nie jest pozbawiona ograniczeń. Chociaż jest bardziej opłacalna niż sekwencjonowanie wodorosiarczynu całego genomu, jest znacznie droższa niż inne metody. Niemniej jednak większość kosztów pochodziła z zakupu pasów ruchu w sekwencerze, a nie z systemu przechwytywania. W zależności od wymaganej głębokości odczytu, przy czym porównania między tkankami wymagają mniej ze względu na duże (25–70%) różnice12 w metylacji DNA, koszt można zmniejszyć poprzez multipleksowanie większej liczby próbek na linię i zastosowanie platformy o większej pojemności. Ponadto przygotowanie próbki jest bardziej czasochłonne niż inne metody. Chociaż podobnie jak w przypadku innych podejść pulldown, które obejmują sekwencjonowanie nowej generacji, dodatkowe etapy konwersji i oczyszczania wodorosiarczynu zwiększają obciążenie pracą. Ogólnie rzecz biorąc, platforma Methyl-Seq jest opłacalną alternatywą dla sekwencjonowania całego genomu i zapewnia rozdzielczość par zasad na poziomie ponad 2,3 miliona CpG, czyli znacznie więcej niż w przypadku platform opartych na mikromacierzach. Do tej pory dostępne na rynku platformy Methyl-Seq dla ludzi i myszy były wykorzystywane do dokumentowania zależnych od alkoholu zmian w mózgu makaków25,26, genów neurorozwojowych w mózgu myszy9 oraz celów glikokortykosteroidów krew-mózg10. Co więcej, możliwość celowania w określone regiony niezależnie od rozpoznawania sekwencji przez enzymy restrykcyjne sprawia, że jest to idealna platforma do porównań międzygatunkowych. Na potrzeby tego badania zaprojektowaliśmy platformę Methyl-Seq dla szczurów, dla której przeprowadza się wiele eksperymentów farmakologicznych, metabolicznych i behawioralnych bez korzystania z narzędzia metylomicznego obejmującego cały genom. Nasze dane pokazują, że można go wykorzystać do wykrywania DMR w szczurzym modelu stresu i skorelowania innych parametrów fizjologicznych, takich jak ogólny poziom CORT w osoczu.

Platforma Methyl-Seq jest idealna do eksperymentów epigenetycznych na zwierzętach ze zsekwencjonowanymi genomami, które mogą nie mieć wystarczających dowodów eksperymentalnych dokumentujących regiony regulatorowe. Gdy takie regiony zostaną udostępnione, dodatkowe regiony mogą zostać zaprojektowane i dołączone do bieżącej wersji. Co więcej, platforma idealnie nadaje się do genomiki porównawczej, ponieważ wzbogacenie docelowe nie jest ograniczone przez rozpoznawanie enzymów restrykcyjnych. Na przykład region promotorowy dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania może zostać uchwycony niezależnie od tego, czy zawiera określone miejsce ograniczenia. Podobnie można uchwycić wszelkie regiony regulatorowe, takie jak te zidentyfikowane u myszy lub ludzi, które są konserwatywne w genomie będącym przedmiotem zainteresowania.

Oświadczenia

Rękopis jest częścią nagrody konkursowej przyznanej przez Agilent Technologies.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez NIH grant MH101392 (RSL) oraz wsparcie z następujących nagród i fundacji: NARSAD Young Investigator Award, Margaret Ann Price Investigator Fund, James Wah Mood Disorders Scholar Fund poprzez Charles T. Bauer Foundation, Baker Foundation i Project Match Foundation (RSL).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Test radioimmunologiczny (RIA)MP Biomedicals7120126Kortykosteron, 125I oznaczony
Pure DNA Purification KitEpicentre/IlluminaMC85200
Thermal-LOK 2-pozycyjna sucha kąpiel termicznaUSA Scientific2510-1102Używany z probówkami 1,5 ml
Vortex Genie 2Fisher12-812Vortex Mixer
Alkohol etylowy, czystySigma-AldrichE7023100% etanol, wirówka klasy molekularnej
5424 REppendorf-Musibyć zdolna do 20 000 x g
Qubit 2.0ThermoFisher ScientificQ32866fluorometru
Qubit dsDNA BRThermoFisher ScientificQ32850
Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HSThermoFisher ScientificQ32851Odczynniki do wykrywania DNA o wysokiej czułości
Probówki do testów kubitowychThermoFisher ScientificQ32856
Zestaw odczynników SureSelectXT Rat Methyl-SeqOdczynniki Agilent TechnologiesG9651Ado przygotowania biblioteki Methyl-Seq
Biblioteka SureSelect Rat Methyl-SeqPrzynęty 931143 RNA do wzbogacania celów szczurzych
IDTE, pH 8.0IDT DNA11-05-01-0910 mM TE, 0,1 mM EDTA
DNA LoBind Probówka 1,5 mlEppendorf22431021
Covaris E-series lub S-seriesCovaris-Isothermalsonikator
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25)Covaris520045
Woda, Ultra Pure (klasa biologii molekularnej)Jakość Biologiczna351-029-721
Veriti 96 Well-Thermal CyclerApplied Biosystems4375786
Koraliki AMPure XPBeckman CoulterA63880Kulki magnetyczne wiążące DNA
96S Super MagnetALPAQUAA001322Płytka magnetyczna do etapów oczyszczania
2200 TapeStationAgilent TechnologiesG2965AABioanalizator oparty na elektroforezie
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582
D1000 ScreenTape Agilent Technologies o wysokiej czułości5067-5584
D1000 OdczynnikiAgilent Technologies5067-5583
D1000 Wysoka czułośćAgilent Technologies5067-5585
DNA110 SpeedVacThermoFisherScientific-Vacuum Koncentrator
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Koraliki magnetyczneInvitrogen65601Streptawidin
Kulki magnetyczne Labquake Tube RotatorThermoFisher Scientific415110QNutator jest również dopuszczalny
Zestaw do metylacji DNA EZ DNAZymo ResearchD5006. Zawiera wiążące, przemywające, odsulfonujące i elucyjne
Illumina Hi-Seq 2500Illumina-Maszynasekwencjonowania nowej generacji
Startery PCR i pirosekwencjonowaniaIDT DNAZmienna
Polimeraza DNA Taq z buforem ThermoPol - 2,000 jednostekNew England BioLabsM0267L
Zestaw roztworów deoksynukleotydu (dNTP)New England BioLabsN0446S
Pyromark MD96QIAGEN-Pirosekwencjonowanie
Alkohol etylowy 200 ProofPharmco-Aaper11100020070% roztwór etanolu
Granulki wodorotlenku soduSigma-Aldrich2214650,2 M roztwór buforowy denaturacji NaOH
Tris (baza) od J.T. BakerFisher Scientific02-004-50810 mM Tris Acetate Buffer roztwór buforowy do płukania
Odczynniki PyroMark Gold Q96 (50x96)QIAGEN972807Odczynniki wymagane do pirosekwencjonowania
PyroMark Bufor do wyżarzaniaQIAGEN979009
PyroMark Bufor wiążący (200 ml)QIAGEN979006
Streptawidyna Sepharose o wysokiej wydajnościGE Healthcare17-5113-01Koraliki
sefarozy pokryte streptawidynąPyroMark Q96 HS PlateQIAGEN979101Płytka do pirosekwencjonowania
Eppendorf Thermomixer RFisher Scientific05-400-205Mieszarka płytkowa. Blok 96-dołkowy sprzedawany oddzielnie (kat. Nr 05-400-207)
Strona internetowa SureDesignAgilentTechnologies-Oprogramowanieprojektowania przechwytywania celów (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)
UCSC Przeglądarka genomuUniwersytet Kalifornijski SantaCruz-ratlistopad 2004 rn4 montaż
Agilent Methyl-Seq ProtocolAgilentTechnologies-https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf
Master Zestaw do oznaczania Zestaw do konwersji wodorosiarczynu do do

Bibliografia

  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Meissner, A., et al. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).
  3. Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
  4. Naumov, V. A., et al. Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips. Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).
  5. Wockner, L. F., et al. Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients. Translational Psychiatry. 4, e339(2014).
  6. Meissner, A., et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).
  7. Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes. Methods. 48 (3), 226-232 (2009).
  8. Slieker, R. C., et al. Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array. Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26(2013).
  9. Hing, B., et al. Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment. Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).
  10. Seifuddin, F., et al. Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure. Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).
  11. Irizarry, R. A., et al. The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores. Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).
  12. Lee, R. S., et al. Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences. Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).
  13. Jankord, R., et al. Stress vulnerability during adolescent development in rats. Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).
  14. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
  15. Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
  16. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  17. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), R25(2009).
  18. Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions. Genome Biology. 13 (10), R83(2012).
  19. Lee, R. S., et al. Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice. Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).
  20. Lee, R. S., et al. A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice. Psychopharmacology. , (2011).
  21. Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).
  22. Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. Platelets, coronary heart disease, and stress. Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).
  23. McKlveen, J. M., et al. Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction. Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).
  24. Akalin, A., et al. methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles. Genome Biology. 13 (10), R87(2012).
  25. Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes. Translational Psychiatry. 7 (1), e994(2017).
  26. Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking. Alcohol. 60, 103-113 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metylacja DNAwychwyt celowanykonwersja pirosiarczynowasekwencjonowanie nowej generacjiregiony różnicowo zmetylowaneszczury Sprague Dawleyprzewlekły stres zmiennywalidacja pirosekwencjonowaniem
Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.