Artykuł metodologiczny

Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

DOI:

10.3791/58621

⸱

7 stycznia 2019

 ,  , 
1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, School of Medicine, 2Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W wątrobie, naczynia limfatyczne znajdują się w triadzie portalowej, a ich opisaną funkcją jest usuwanie płynu śródmiąższowego z wątroby do węzłów chłonnych, gdzie można badać resztki komórkowe i antygeny. Jesteśmy bardzo zainteresowani zrozumieniem, w jaki sposób układ naczyniowy limfatyczny może być zaangażowany w stan zapalny i funkcjonowanie komórek odpornościowych w wątrobie. Jednak bardzo niewiele opublikowano ustanawiając protokoły trawienia do izolacji komórek śródbłonka limfatycznego (LEC) z wątroby lub specyficzne markery, które można wykorzystać do oceny LEC wątroby w przeliczeniu na komórkę. Dlatego zoptymalizowaliśmy metodę trawienia i barwienia wątroby w celu oceny populacji LEC w wątrobie. Jesteśmy przekonani, że opisana tutaj metoda będzie przydatna do identyfikacji i izolacji LEC z wątroby i wzmocni nasze zrozumienie, w jaki sposób LEC reagują na mikrośrodowisko wątroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rola naczyń limfatycznych i LEC w wątrobie nie jest dobrze poznana. Podczas gdy naczynia limfatyczne znajdują się w triadzie wrotnej wątroby1 i rozszerzają się podczas choroby2, bardzo niewiele wiadomo na temat funkcji i fenotypu LEC w wątrobie. Wraz z odkryciem markerów, które znajdują się głównie w LECs3, znaczenie tych komórek w różnych niszach tkankowych w homeostazie i chorobie wypełni znaczącą lukę w naszym zrozumieniu. LEC odgrywają główną rolę w utrzymaniu tolerancji obwodowej w węzłach chłonnych i nowotworach przerzutowych poprzez bezpośrednią interakcję z limfocytami T4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13. LEC w węźle chłonnym mogą promować odporność ochronną poprzez interakcje z migrującymi komórkami dendrytycznymi14,15,16. W związku z tym istnieje wiele ról dla LEC, które mogą być specyficzne dla tkanek i interakcji, w których są obecne. Jednak bardzo niewiele wiadomo na temat tego, w jaki sposób LEC oddziałują z komórkami odpornościowymi w tkance lub jak LEC funkcjonują w różnych układach narządów; w związku z tym ocena LEC na podstawie komórki w wątrobie lub innych narządach może prowadzić do postępów w sposobie, w jaki LEC programują odporność specyficzną dla tkanek. Podczas gdy większość literatury, która koncentruje się na LEC w wątrobie, wykorzystuje mikroskopię do wizualizacji LEC za pomocą jednego lub dwóch markerów i morfologii17, bardzo niewiele zrobiono, aby konkretnie ocenić LEC na podstawie komórki po komórce za pomocą cytometrii przepływowej, chociaż jedno badanie oceniło różnice między sinusoidalnymi komórkami śródbłonka wątroby (LSEC) a LEC18. Możliwość analizowania populacji LEC w wątrobie za pomocą cytometrii przepływowej pozwala na dogłębne badanie fenotypu LEC podczas normalnej homeostazy lub choroby.

Aby ocenić LEC za pomocą cytometrii przepływowej, potrzebne jest wiele znaczników powierzchniowych. Zazwyczaj LEC są wizualizowane przez ekspresję homeoboksu 1 związanego z prospero (Prox-1), receptora hialuronianu śródbłonka naczyń limfatycznych 1 (LYVE1) lub receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 3 (VEGFR3) za pomocą mikroskopii. Jednak w wątrobie ekspresja tych markerów nie jest ograniczona do LEC. Prox-1 jest szeroko wyrażany przez hepatocyty podczas rozwoju, regeneracji i uszkodzenia wątroby19, a LYVE1 i VEGFR3 są wyrażane przez sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby18. W węźle chłonnym LEC są identyfikowane za pomocą cytometrii przepływowej jako skupiska różnicowania (CD) CD45-, CD31+ i podoplaniny+ (PDPN)16. Jednak to podejście jest zbyt minimalne, aby wyizolować LEC w wątrobie, ponieważ komórki CD45-CD31 + wychwytują komórki śródbłonka, a dominującą populacją komórek śródbłonka naczyń krwionośnych w wątrobie są LSEC. W związku z tym potrzebne są inne markery, aby odróżnić rzadką populację LEC od obfitej populacji LSEC. Zarówno CD16/32 (wyrażony przez dojrzałe LSEC18), jak i CD146 (powszechny marker komórek śródbłonka naczyniowego, który ulega ekspresji głównie w sinusoidach wątroby przez sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby20 z niewielką lub żadną ekspresją przez komórki śródbłonka limfatycznego21) były markerami kandydującymi.

Dlatego zoptymalizowaliśmy metodę izolacji i wizualizacji LEC w wątrobie za pomocą powyższych markerów, CD45, CD31, CD146, CD16/32 i PDPN do cytometrii przepływowej. Opisujemy zastosowanie kolagenazy IV, DNazy 1 i mechanicznej separacji do trawienia tkanek wątroby do zawiesiny jednokomórkowej. Opisano również zastosowanie gradientu gęstości jodeksanolu do izolacji komórek niemiąższowych (NPC) i eliminacji resztek komórkowych. Wreszcie, używając wielu markerów, określamy optymalną strategię bramkowania cytometrii przepływowej w celu identyfikacji LEC z wątroby z PDPN jako dominującym markerem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Kampusu Medycznego Anschutz Uniwersytetu Kolorado.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Przygotować 5 mg/ml roztworu DNazy I w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
  2. Przygotuj mieszaninę trawiącą, dodając 5,000 U/ml kolagenazy IV do pożywki EHAA firmy Click.
  3. Przed użyciem podgrzać mieszaninę wytrawiającą w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  4. Wykonać bufor izolacyjny, dodając 4,8% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS).
  5. Wykonać bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC), dodając 100 mM chlorku amonu, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM EDTA do destylowanego H2O.

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z wątroby myszy

  1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO2 i zwichnięcia szyjki macicy.
  2. Spryskaj mysz 70% etanolem, aby zmoczyć jej sierść. Przypnij stopy myszy do deski preparcyjnej.
  3. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć skórę około 1 cm powyżej odbytu, uważając, aby przeciąć tylko skórę (około 1 mm). Odciągnij skórę od ciała za pomocą ząbkowanych kleszczy i włóż nożyczki między skórę a otrzewną. Otwórz nożyczki, aby oddzielić skórę od otrzewnej, a następnie przetnij skórę od nacięcia do szyi.
  4. Przypnij skórę do deski preparacyjnej za pomocą jednej szpilki pod każdym ramieniem i nad każdą nogą. Pociągnij worek otrzewnowy do góry i przetnij w górę w kierunku szyi. Chwyć płaty wątroby i przetnij tuż poniżej mostka.
    Uwaga: Należy zachować ostrożność, jeśli którakolwiek część wątroby będzie używana do badań immunohistochemicznych (IHC).
  5. Przeciąć wokół wątroby i usunąć wątrobę z myszy i umieścić ją w 4 ml pożywki EHAA firmy Click.
  6. Za pomocą skalpela pokrój wątrobę na kawałki o średnicy ~1 mm.
  7. Dodać 500 μl mieszaniny wytrawiającej i 500 μl DNazy I (2 mg/ml) do wątroby.
  8. Inkubować wątrobę przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po 15 minutach wymieszaj płyn za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
  9. Po 30 minutach inkubacji przenieść strawioną próbkę przez sitko o wielkości 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  10. Delikatnie przepchnąć pozostałe kawałki przez filtr za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml.
  11. Umyć filtr 5 ml buforu izolacyjnego i delikatnie przepchnąć chusteczkę przez sitko grzbietem tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml. Powtarzaj tę czynność, aż filtr zostanie przemyty 25 ml buforu izolacyjnego.
  12. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut. Ostrożnie odessać supernatant.
  13. Zawiesić osad z 4 ml buforu do lizy RBC. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  14. Przemyć komórki 10 ml buforu izolacyjnego i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.
  15. Policz komórki na hemocytometrze, aby określić pełną liczbę wątroby.
  16. Zawieś komórki w 5 ml 20% jodiksanolu i ułóż je warstwami z 1 ml PBS.
  17. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 15 minut bez przerwy.
  18. Usunąć warstwę między PBS a jodiksanolem i umieścić je przez filtr 100 μm w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  19. Przemyć komórki 10 ml buforu izolacyjnego i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.
  20. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS).

3. Analiza cytometryczna przepływu pojedynczych komórek z wątroby

  1. Policz komórki za pomocą hemocytometru i mikroskopu, używając wykluczenia błękitu trypanowego do pomiaru żywotnych komórek. Dodać 10 μl komórek do 10 μl błękitu trypanowego i natychmiast umieścić je na hemocytometrze i policzyć żywe komórki (nie niebieskie) pod mikroskopem. Następnie oblicz liczbę komórek na mikrolitr
    2. .
  2. Podwielokrotność około 5 milionów pozostałych komórek niemiąższowych do pojedynczego dołka 96-dołkowej płytki.
  3. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 90 μl PBS z 2% FBS.
  5. Dodaj anty-CD45 (1:200), anty-CD146 (1:200), anty-CD31 (1:200) i PDPN (1:200) rozcieńczone w 10 μl 10x 2,4G2 lub anty-CD16/32 (1:200).
    nuta: Nie stosowano bloku Fc (2,4G2), gdy stosowano przeciwciało znakowane anty-CD16/32.
  6. Aby określić, gdzie należy ustawić bramki dodatnie i ujemne, uwzględnij barwnik fluorescencji minus jeden (FMO) dla każdego koloru i przeciwciało kontrolne izotypu.
  7. Aby określić żywe i martwe komórki, zabarwić markerem żywotności (np. duch czerwony 780). Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  8. Przemyj komórki 100 μl PBS z 2% FBS.
  9. Użyj małej porcji komórek, aby dostosować ustawienia lasera i kompensacji w cytometrze przepływowym. Wybarwić komórki przeciwciałem przeciwko każdemu pojedynczemu fluoroforowi i jednym bez przeciwciała.
    nuta: W zależności od używanego cytometru przepływowego należy ustalić matrycę kompensacyjną w celu usunięcia nakładania się widma.
  10. Umieść probówkę z próbką na sondzie cytometru i zbierz i zapisz wszystkie zdarzenia.

4. Analiza danych

  1. Patrząc na obszar rozproszenia bocznego w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu, bramka na "żywych" komórkach na podstawie rozmiaru i ziarnistości oraz barwnika znacznika żywotności.
  2. Następnie, używając CD45 Brilliant Violet 510 i CD31 PerCp Cy5.5, bramkuj komórki CD45-CD31 + za pomocą kontroli izotypu i FMO w celu określenia populacji dodatnich i ujemnych.
  3. Na koniec, używając CD146 v450 lub CD16 / 32 FITC i PDPN APC, weź komórki CD146-PDPN+ lub CD16/32- PDPN+, ponownie używając kontroli izotypu i FMO, aby określić populacje dodatnie i ujemne. Tymi komórkami są LEC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania analizujące układ limfatyczny wątroby wykorzystywały przede wszystkim immunohistochemię do ilościowego określania częstości i średnicy naczyń limfatycznych w wątrobie. Jednak metoda ta nie pozwala na ocenę LEC na podstawie komórki po komórce ani na ekspresję wielu markerów, cytokin, chemokin lub czynników transkrypcyjnych. Dlatego zapytaliśmy, czy LEC wątroby można wyizolować z wątroby i ocenić za pomocą cytometrii przepływowej. Poprzednie prace polegające na izolowaniu węzłów chł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno wyszło na jaw ogólne znaczenie LEC w homeostazie i regulacji immunologicznej25. Znaczna część opublikowanej literatury limfatycznej koncentruje się na skórze i węzłach chłonnych; Jednak limfy znajdują się w całym ciele26 i dlatego potrzebne jest zrozumienie ich znaczenia w różnych narządach. Tutaj pokazujemy metodę, w której LEC w wątrobie można badać komórka po komórce, aby lepiej zrozumieć ich jednoczesną ekspresję różnych markerów powierzchniowych, cytokin, chem...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Programom GI i Liver Innate Immune za wsparcie finansowe tego projektu. B.A.J.T. jest również finansowany przez R01 AI121209.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kliknięcia/EHAA mediaIrvine Scientific9195
Kolagenaza IVWorthington Biochemical CorporationLS004188
DNase IWorthington Biochemical CorporationLS002145Deoksyrybonukleaza 1
OptiPrepSigma AldrichD1556Density Gradient Medium
V450 anty myszy CD146 (klon ME-9F1)BD nauki biologiczne562232
FITC anty myszy CD146 (klon ME-9F1)Biolegend134706izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)
Pacific Blue anty myszy CD31 (klon 390)Biolegend102422
PerCp / Cy5.5 anty myszy CD31 (klon 390)Biolegend102420Białka perydyninowo-chlorofilowe - cyjanina 5,5 (PerCP-Cy5,5)
APC anty myszy PDPN (klon 8.1.1)Biolegend127410Allofikocyjanina (APC), podoplanina (PDPN)
APC/Cy7 anty mysz CD45 (klon 30-F11)Biolegend103116
Brilliant Violet 510 anty myszy CD45 (klon 30-F11)Biolegend103138
FITC anty myszy CD16/32 (klon 93)Biolegend101306Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)
PerCp/Cy5.5 anty myszy CD16/32 (klon 93)Biolegend101324Białka perydyninowo-chlorofilowe-Cyjanina 5,5 (PerCP-Cy5,5)
duch czerwony 780 barwnik żywotnościTONBO biosceinces3-0865-T100
APC chomik syryjski IgG (klon SHG-1)Biolegened402102
PerCp/Cy5.5 szczur IgG2a (klon RTK2758)Biolegend400531
FITC szczur IgG2 (klon eBR2a)ebioscience1-4321-80
Przeciw myszy LYVE1 (klon 223322)R& Systemy DFAB2125A
anty-mysie Cytokeratyna (klon EPR17078)abcamab181598
anty-mysz F4/80 (klon Cl:A3-1)Bio-radMCA497
BSA (frakcja V)FischerBP1600-100Albumina surowicy bydlęcej (BSA)
Surowica koziaJackson Immunoresearch017-000-121
Surowica osłaJackson Immunoresearch017-000-121
EDTAVWRE177Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) -dla buforu do lizy RBC,
Chlorek amonuFischerA687-500, dla RBC, Bufor do lizy
Wodorowęglan potasuFischerP184-500dla RBC, Bufor do lizy
SkalpelFeather2975#21
100 μ Filtr siatkowy komórekm Fischer22363549
2.4G2w domu/Blok ATCCATCC HB-197FC w celu zahamowania niespecyficznego wiązania z komórkami Fc gamma + -wykonany z hybrydoma
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Corning21-040-CV
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)Gibco14185-052
Surowica bydlęca płodu (FBS)Atlanta biologiczneS11550
Płytka 96-dołkowaCorning3788
Płytka 6-dołkowaCorning3506
50 ml stożkowaTrulineTR2004
15 mL stożkowaFalcon352196
1 mL Końcówka do pipetUSAscientific 1111-2721
200 µ Końcówka do pipet LUSA scientific1110-1700
10 µ Końcówka do pipety LUSA scientific1111-3700
seriologiczna pipeta 10 mlgreiner bio-one607107
seriologiczna pipeta 5 mlgreiner bio-one606107
Inkubator komórekFischerHeracell 160i
BD FacsCanto II cytometr przepływowyBD biosciences
Beckman redlica wysiewającamodel X-14R
, , , , , , , Wirówka kliniczna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
  2. Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
  3. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  4. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  5. Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740(2014).
  6. Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771(2015).
  7. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
  8. Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
  9. Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
  10. Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
  11. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  12. Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
  13. Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
  14. Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034(2017).
  15. Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
  16. Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989(2014).
  17. Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131(2010).
  18. Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
  19. Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
  20. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  21. Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
  22. Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
  23. Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
  24. Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
  25. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
  26. Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

limfatyczne kom rki r db onka w trobyprotok trawienia w trobyizolacja frakcji naczyniowo stromalnejseparacja w gradiencie g sto cihemoliza erytrocyt wbarwienie na podoplaninCD45 negatywne CD31 pozytywneprob wki do cytometrii przep ywowejbarwnik wyznaczaj cy ywotno

Powiązane artykuły