Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Rola naczyń limfatycznych i LEC w wątrobie nie jest dobrze poznana. Podczas gdy naczynia limfatyczne znajdują się w triadzie wrotnej wątroby¹ i rozszerzają się podczas choroby², bardzo niewiele wiadomo na temat funkcji i fenotypu LEC w wątrobie. Wraz z odkryciem markerów, które znajdują się głównie w LECs³, znaczenie tych komórek w różnych niszach tkankowych w homeostazie i chorobie wypełni znaczącą lukę w naszym zrozumieniu. LEC odgrywają główną rolę w utrzymaniu tolerancji obwodowej w węzłach chłonnych i nowotworach przerzutowych poprzez bezpośrednią interakcję z limfocytami T^{4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13}. LEC w węźle chłonnym mogą promować odporność ochronną poprzez interakcje z migrującymi komórkami dendrytycznymi^14,15,16. W związku z tym istnieje wiele ról dla LEC, które mogą być specyficzne dla tkanek i interakcji, w których są obecne. Jednak bardzo niewiele wiadomo na temat tego, w jaki sposób LEC oddziałują z komórkami odpornościowymi w tkance lub jak LEC funkcjonują w różnych układach narządów; w związku z tym ocena LEC na podstawie komórki w wątrobie lub innych narządach może prowadzić do postępów w sposobie, w jaki LEC programują odporność specyficzną dla tkanek. Podczas gdy większość literatury, która koncentruje się na LEC w wątrobie, wykorzystuje mikroskopię do wizualizacji LEC za pomocą jednego lub dwóch markerów i morfologii¹⁷, bardzo niewiele zrobiono, aby konkretnie ocenić LEC na podstawie komórki po komórce za pomocą cytometrii przepływowej, chociaż jedno badanie oceniło różnice między sinusoidalnymi komórkami śródbłonka wątroby (LSEC) a LEC¹⁸. Możliwość analizowania populacji LEC w wątrobie za pomocą cytometrii przepływowej pozwala na dogłębne badanie fenotypu LEC podczas normalnej homeostazy lub choroby.

Aby ocenić LEC za pomocą cytometrii przepływowej, potrzebne jest wiele znaczników powierzchniowych. Zazwyczaj LEC są wizualizowane przez ekspresję homeoboksu 1 związanego z prospero (Prox-1), receptora hialuronianu śródbłonka naczyń limfatycznych 1 (LYVE1) lub receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 3 (VEGFR3) za pomocą mikroskopii. Jednak w wątrobie ekspresja tych markerów nie jest ograniczona do LEC. Prox-1 jest szeroko wyrażany przez hepatocyty podczas rozwoju, regeneracji i uszkodzenia wątroby¹⁹, a LYVE1 i VEGFR3 są wyrażane przez sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby¹⁸. W węźle chłonnym LEC są identyfikowane za pomocą cytometrii przepływowej jako skupiska różnicowania (CD) CD45-, CD31+ i podoplaniny+ (PDPN)¹⁶. Jednak to podejście jest zbyt minimalne, aby wyizolować LEC w wątrobie, ponieważ komórki CD45-CD31 + wychwytują komórki śródbłonka, a dominującą populacją komórek śródbłonka naczyń krwionośnych w wątrobie są LSEC. W związku z tym potrzebne są inne markery, aby odróżnić rzadką populację LEC od obfitej populacji LSEC. Zarówno CD16/32 (wyrażony przez dojrzałe LSEC¹⁸), jak i CD146 (powszechny marker komórek śródbłonka naczyniowego, który ulega ekspresji głównie w sinusoidach wątroby przez sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby²⁰ z niewielką lub żadną ekspresją przez komórki śródbłonka limfatycznego²¹) były markerami kandydującymi.

Dlatego zoptymalizowaliśmy metodę izolacji i wizualizacji LEC w wątrobie za pomocą powyższych markerów, CD45, CD31, CD146, CD16/32 i PDPN do cytometrii przepływowej. Opisujemy zastosowanie kolagenazy IV, DNazy 1 i mechanicznej separacji do trawienia tkanek wątroby do zawiesiny jednokomórkowej. Opisano również zastosowanie gradientu gęstości jodeksanolu do izolacji komórek niemiąższowych (NPC) i eliminacji resztek komórkowych. Wreszcie, używając wielu markerów, określamy optymalną strategię bramkowania cytometrii przepływowej w celu identyfikacji LEC z wątroby z PDPN jako dominującym markerem.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Kampusu Medycznego Anschutz Uniwersytetu Kolorado.

1. Przygotowanie materiałów

1. Przygotować 5 mg/ml roztworu DNazy I w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
2. Przygotuj mieszaninę trawiącą, dodając 5,000 U/ml kolagenazy IV do pożywki EHAA firmy Click.
3. Przed użyciem podgrzać mieszaninę wytrawiającą w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
4. Wykonać bufor izolacyjny, dodając 4,8% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS).
5. Wykonać bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC), dodając 100 mM chlorku amonu, 10 mM KHCO₃ i 0,1 mM EDTA do destylowanego H₂O.

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z wątroby myszy

1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO₂ i zwichnięcia szyjki macicy.
2. Spryskaj mysz 70% etanolem, aby zmoczyć jej sierść. Przypnij stopy myszy do deski preparcyjnej.
3. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć skórę około 1 cm powyżej odbytu, uważając, aby przeciąć tylko skórę (około 1 mm). Odciągnij skórę od ciała za pomocą ząbkowanych kleszczy i włóż nożyczki między skórę a otrzewną. Otwórz nożyczki, aby oddzielić skórę od otrzewnej, a następnie przetnij skórę od nacięcia do szyi.
4. Przypnij skórę do deski preparacyjnej za pomocą jednej szpilki pod każdym ramieniem i nad każdą nogą. Pociągnij worek otrzewnowy do góry i przetnij w górę w kierunku szyi. Chwyć płaty wątroby i przetnij tuż poniżej mostka.
   Uwaga: Należy zachować ostrożność, jeśli którakolwiek część wątroby będzie używana do badań immunohistochemicznych (IHC).
5. Przeciąć wokół wątroby i usunąć wątrobę z myszy i umieścić ją w 4 ml pożywki EHAA firmy Click.
6. Za pomocą skalpela pokrój wątrobę na kawałki o średnicy ~1 mm.
7. Dodać 500 μl mieszaniny wytrawiającej i 500 μl DNazy I (2 mg/ml) do wątroby.
8. Inkubować wątrobę przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po 15 minutach wymieszaj płyn za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
9. Po 30 minutach inkubacji przenieść strawioną próbkę przez sitko o wielkości 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
10. Delikatnie przepchnąć pozostałe kawałki przez filtr za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml.
11. Umyć filtr 5 ml buforu izolacyjnego i delikatnie przepchnąć chusteczkę przez sitko grzbietem tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml. Powtarzaj tę czynność, aż filtr zostanie przemyty 25 ml buforu izolacyjnego.
12. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut. Ostrożnie odessać supernatant.
13. Zawiesić osad z 4 ml buforu do lizy RBC. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
14. Przemyć komórki 10 ml buforu izolacyjnego i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.
15. Policz komórki na hemocytometrze, aby określić pełną liczbę wątroby.
16. Zawieś komórki w 5 ml 20% jodiksanolu i ułóż je warstwami z 1 ml PBS.
17. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 15 minut bez przerwy.
18. Usunąć warstwę między PBS a jodiksanolem i umieścić je przez filtr 100 μm w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
19. Przemyć komórki 10 ml buforu izolacyjnego i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.
20. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS).

3. Analiza cytometryczna przepływu pojedynczych komórek z wątroby

1. Policz komórki za pomocą hemocytometru i mikroskopu, używając wykluczenia błękitu trypanowego do pomiaru żywotnych komórek. Dodać 10 μl komórek do 10 μl błękitu trypanowego i natychmiast umieścić je na hemocytometrze i policzyć żywe komórki (nie niebieskie) pod mikroskopem. Następnie oblicz liczbę komórek na mikrolitr
.
2. Podwielokrotność około 5 milionów pozostałych komórek niemiąższowych do pojedynczego dołka 96-dołkowej płytki.
3. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut.
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 90 μl PBS z 2% FBS.
5. Dodaj anty-CD45 (1:200), anty-CD146 (1:200), anty-CD31 (1:200) i PDPN (1:200) rozcieńczone w 10 μl 10x 2,4G2 lub anty-CD16/32 (1:200).
   nuta: Nie stosowano bloku Fc (2,4G2), gdy stosowano przeciwciało znakowane anty-CD16/32.
6. Aby określić, gdzie należy ustawić bramki dodatnie i ujemne, uwzględnij barwnik fluorescencji minus jeden (FMO) dla każdego koloru i przeciwciało kontrolne izotypu.
7. Aby określić żywe i martwe komórki, zabarwić markerem żywotności (np. duch czerwony 780). Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
8. Przemyj komórki 100 μl PBS z 2% FBS.
9. Użyj małej porcji komórek, aby dostosować ustawienia lasera i kompensacji w cytometrze przepływowym. Wybarwić komórki przeciwciałem przeciwko każdemu pojedynczemu fluoroforowi i jednym bez przeciwciała.
   nuta: W zależności od używanego cytometru przepływowego należy ustalić matrycę kompensacyjną w celu usunięcia nakładania się widma.
10. Umieść probówkę z próbką na sondzie cytometru i zbierz i zapisz wszystkie zdarzenia.

4. Analiza danych

1. Patrząc na obszar rozproszenia bocznego w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu, bramka na "żywych" komórkach na podstawie rozmiaru i ziarnistości oraz barwnika znacznika żywotności.
2. Następnie, używając CD45 Brilliant Violet 510 i CD31 PerCp Cy5.5, bramkuj komórki CD45-CD31 + za pomocą kontroli izotypu i FMO w celu określenia populacji dodatnich i ujemnych.
3. Na koniec, używając CD146 v450 lub CD16 / 32 FITC i PDPN APC, weź komórki CD146-PDPN+ lub CD16/32- PDPN+, ponownie używając kontroli izotypu i FMO, aby określić populacje dodatnie i ujemne. Tymi komórkami są LEC.

Badania analizujące układ limfatyczny wątroby wykorzystywały przede wszystkim immunohistochemię do ilościowego określania częstości i średnicy naczyń limfatycznych w wątrobie. Jednak metoda ta nie pozwala na ocenę LEC na podstawie komórki po komórce ani na ekspresję wielu markerów, cytokin, chemokin lub czynników transkrypcyjnych. Dlatego zapytaliśmy, czy LEC wątroby można wyizolować z wątroby i ocenić za pomocą cytometrii przepływowej. Poprzednie prace polegające na izolowaniu węzłów chłonnych LEC przeprowadzono przy użyciu Liberazy DL (kolagenazy I-II-i-dispazy) i DNazy 1 w połączeniu z mechanicznym oddzieleniem tkanki węzła chłonnego za pomocą igieł14,16. W związku z tym zastosowano ten sam protokół trawienia na tkance wątroby, lub kolagenazę IV i DNazę 1, jak opisano wcześniej, do izolacji komórek odpornościowych z wątroby22, a następnie wytrawianie z etapem separacji gradientu gęstości (jodixanol) w celu usunięcia hepatocytów i zwiększenia częstości występowania innych typów komórek w wątrobie (Rysunek 1A). Po trawieniu wątroby i odwirowaniu z gradientem gęstości, komórki barwiono CD45, CD31, PDPN i CD16/32. Opisano CD16/32 jako wyrażany przez dojrzałe populacje LSEC, ale nie przez populacje LEC18. Tak więc LEC były bramkowane jako komórki CD45-, CD31+, CD16/32-, PDPN+, podczas gdy LSEC były bramkowane jako CD45-, CD31+, CD16/32+ i PDPN- (Figura 1A). Bramki ustawiono na żywych komórkach (duch czerwony ujemny) i oparto na kontrolach izotypowych i barwieniu FMO (Rysunek 1A). Potwierdzono również obecność LYVE-1 APC w populacji LEC (Ryc. 1B). Obie metody pozwoliły na wizualizację populacji LEC w wątrobie; jednak profil barwienia komórek był wizualnie lepszy przy użyciu kolagenazy IV i DNazy 1 niż kolagenazy I-II i dyspazy (Figura 1C). Dlatego wszystkie przyszłe manipulacje przeprowadzono przy użyciu kolagenazy IV i DNazy 1, zgodnie z opisem w protokole. Średnio uzyskaliśmy około 1300 LEC na gram tkanki wątroby lub 2200 LEC na nieleczoną wątrobę, stosując tę metodę trawienia.

Aby zoptymalizować strategię bramkowania i kombinację fluoroforów oraz wyeliminować zanieczyszczenie LSEC, użyto zarówno CD16/32, jak i CD146. CD16/32 to receptory gamma Fc II i III i wyraża się na dojrzałych LSEC, ale nie na LECach18. CD16 / 32 może odróżnić komórki PDPN + CD16 / 32- od komórek PDPN-CD16 / 32 +, szczególnie przy użyciu PDPN sprzężonego z APC lub PE i CD16 / 32 sprzężonego z FITC (Figura 1A), ale gorzej, gdy PDPN był sprzężony z PE-Cy7 (Figura 1C). Ekspresja CD16/32 nie występuje w LEC, ale znajduje się w LSEC. Blok Fc wykorzystuje przeciwciało CD16/32 w celu zminimalizowania wiązania receptora Fc i niespecyficznego dla antygenu wiązania immunoglobulin z receptorami Fc. Ponieważ CD16/32 został użyty do wizualizacji LSEC, niespecyficzne wiązanie immunoglobulin było wyższe, a CD146 został zoptymalizowany jako alternatywa do pomiaru LSEC. Dlatego przetestowaliśmy CD146 sprzężony z V450, markerem komórek śródbłonka naczyń krwionośnych o wysokiej ekspresji przez LSEC i inne komórki śródbłonka naczyniowego20, ale z niską lub zerową ekspresją przez LECs23. Najpierw zoptymalizowaliśmy barwienie CD146 za pomocą kontroli FMO i izotypu zarówno dla CD16/32, jak i CD146 (Rysunek 2A). Jeśli oceniliśmy tylko komórki CD16 / 32 + lub komórki CD16 / 32-, komórki CD16 / 32 + były wszystkie CD146 + i PDPN-, podczas gdy komórki CD16 / 32- były głównie CD146- i albo PDPN- lub PDPN+ (Figura 2B). Aby potwierdzić to zabarwienie, użyto FMO. Usuwając PDPN z plamy, populacja PDPN+ zniknęła (Rysunek 2C). Co ciekawe, nie było komórek PDPN + CD146 +, co potwierdza, że CD146 nie ulega lub jest bardzo nisko wyrażany przez LEC PDPN +. Dlatego jesteśmy przekonani, że każdy z tych markerów może być wykorzystany do usunięcia komórek śródbłonka naczyń krwionośnych w wątrobie.

Aby dodatkowo potwierdzić, że PDPN jest odpowiednim markerem dla LEC, skrawki wątroby myszy zostały zabarwione zarówno PDPN (zielony), jak i F4/80 (brązowy) (Rysunek 3A). Ani śródbłonek naczyń krwionośnych, ani makrofagi nie wykazywały ekspresji PDPN w wątrobie myszy. Udało nam się również odróżnić cholangiocyty, które mogą wybarwiać się dodatnio na PDPN, od naczyń limfatycznych, w oparciu o odrębne struktury jądrowe dróg żółciowych i barwienie cytokeratyną 7 (Figura 3B; czerwony: cytokeratyna 7, zielony: PDPN). Ponieważ do cytometrii przepływowej stosuje się wiele markerów, takich jak CD31, który nie ulega ekspresji przez cholangiocyty24, jesteśmy pewni, że usuwamy te komórki z analizy, potwierdzając w ten sposób, że komórki z wątroby, które są CD45-, CD31+, CD146lo/neg, CD16/32- i PDPN+ są LEC. Wreszcie, aby dostarczyć dowodów na to, że barwione komórki są LEC, posortowaliśmy tę populację komórek i zastosowaliśmy jakościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym do oceny ekspresji Vegfr3 i prox-1. Oceniano zarówno Vegfr3, jak i prox-1, ponieważ te transkrypty są wyrażane przez inne komórki w wątrobie - prox1 przez hepatocyty i Vegfr3 przez LSECS (między innymi) - ale żadne inne komórki poza LEC nie wyrażają obu. Ekspresja obu tych markerów była znacznie wyższa w posortowanej populacji niż w hodowlanej mysiej linii komórkowej makrofagów (RAW264.7), która normalnie nie wyraża tych markerów, ale jest podobna w ekspresji do hodowanych mysich LEC (Figura 3C).

Rysunek 1: Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej kolagenazy I-II-dispazy i kolagenazy trawionej IV mysiej tkanki wątroby. (A) Ten panel pokazuje strategię bramkowania, fluorescencję minus jedno barwienie i kontrole izotypu dla procedury. (B) Ten panel pokazuje barwienie LYVE-1 komórek CD16 / 32-PDPN +. (C) Ten panel pokazuje końcową bramkę cytometrii przepływowej po trawieniu wątroby myszy za pomocą kolagenazy I-II-dispazy (np. Liberazy DL) lub kolagenazy IV i ocenie CD16 / 32 PerCP X PDPN PE-Cy7, gdzie LEC to CD16 / 32- i PDPN +. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Identyfikacja CD146 i PDPN jako odpowiednich markerów dla komórek śródbłonka limfatycznego wątroby. (A) Ten panel pokazuje kontrole fluorescencji minus jeden i izotypu dla CD16/32 (po lewej) i CD146 (po prawej). (B) Ten panel pokazuje bramkowane dodatnie lub ujemne komórki CD16 / 32 określone z panelu A. Pokazano CD146XPDPN z obu populacji. (C) Ten panel pokazuje fluorescencję minus jeden dla PDPN, aby wykazać, że barwienie jest nieobecne, gdy przeciwciało nie jest dodawane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Identyfikacja przepływowych komórek PDPN+ jako komórek śródbłonka limfatycznego. (A) Ten panel pokazuje reprezentatywną immunohistochemię z wątroby myszy wybarwionej PDPN (niebieski / zielony) i F4 / 80 (brązowy). Naczynie limfatyczne (LV), naczynie krwionośne (BV) i makrofagi (MF) są oznaczone. Podziałka = 100 μm. Utrwalona w formalinie tkanka zatopiona w parafinie była deparafinizowana przez 20 minut w ksylenie. Tkanki uwodniono do wody za pomocą gradientu etanolu, a pobieranie antygenu przeprowadzono przy użyciu buforu do odzyskiwania antygenu o pH 6 w szybkowarze przez 15 minut. Tkankę zablokowano za pomocą 0,1% BSA i wybarwiono za pomocą anty-mysiego PDPN i anty-mysiego F4/80 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jako przeciwciała drugorzędowe zastosowano przeciwciała przeciw chomikowi IgG i przeciw króliczemu IgG HRP. Do wykrycia odpowiednio F4/80 i PDPN użyto 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)+ i Vina Green. Tkankę podbarwiono przeciwstawnie hematoksyliną i zobrazowano pod mikroskopem. (B) Ten panel pokazuje ten sam eksperyment przeprowadzony jak w panelu A, z wyjątkiem tego, że PDPN jest pokazany na zielono, cytokeratyna 7 na czerwono, a 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) na niebiesko. Podziałka = 100 μm. Tkankę zablokowano za pomocą 5% surowicy osła i 5% kozy i wybarwiono za pomocą anty-mysiego PDPN (8.1.1) 1:100 i anty-mysiej cytokeratyny 7 1:200 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jako przeciwciała drugorzędowe zastosowano przeciwciała przeciw chomikowi IgG AF647 i anty-królicze IgG-PE. Tkankę podbarwiono przeciwstawnie DAPI i zobrazowano. Podziałka = 100 μm. Naczynie limfatyczne (LV), naczynie krwionośne (BV) i przewód żółciowy (BD) są oznaczone. (C) Ten panel pokazuje logarytmiczną zmianę krotności w ekspresji Vegfr3 i prox-1 z posortowanych LEC wątroby na podstawie barwienia w protokole (CD45-, CD31 +, CD146lo / neg i PDPN +) w porównaniu z komórkami RAW lub pierwotnymi LEC mysich węzłów chłonnych. Posortowane komórki przepuszczono przez kolumnę rozdrabniającą biopolimery, RNA wyekstrahowano za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA, a cDNA wytworzono za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji. Obfitość transkryptów została znormalizowana do genu porządkowego, Gapdh, dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.