Method Article

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

DOI:

10.3791/58634

⸱

October 25th, 2018

 ,  ,  , 
1Physics Department, Technical University of Munich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immobilizacja genów na litograficznie strukturalnych powierzchniach pozwala na badanie procesów ekspresji genów w otwartym systemie mikroprzepływowego bioreaktora. W przeciwieństwie do innych podejść do sztucznych systemów komórkowych, taka konfiguracja pozwala na ciągłe zaopatrywanie w odczynniki do ekspresji genów i jednoczesne odprowadzanie produktów przemiany materii. Ułatwia to realizację bezkomórkowych procesów ekspresji genów w dłuższych okresach czasu, co jest ważne dla realizacji dynamicznych systemów regulacyjnego sprzężenia zwrotnego genów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wytwarzania biochipów genetycznych przy użyciu prostej w użyciu techniki litograficznej opartej na reakcjach przemieszczenia nici DNA, która wykorzystuje wyłącznie dostępne na rynku komponenty. Zapewniamy również protokół integracji genów podzielonych na przedziały z systemem mikroprzepływowym opartym na polidimetylosiloksanie (PDMS). Ponadto wykazaliśmy, że system jest kompatybilny z mikroskopią fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), która może być używana do bezpośredniej obserwacji oddziaływań molekularnych między DNA a cząsteczkami zawartymi w mieszance ekspresji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezkomórkowe reakcje ekspresji genów są bardzo interesujące dla różnych zastosowań w biochemii, biotechnologii i biologii syntetycznej. Bezkomórkowa ekspresja białek odegrała zasadniczą rolę w przygotowaniu próbek czystych białek, które stanowiły podstawę licznych badań z zakresu biologii strukturalnej. Na przykład systemy bezkomórkowe zostały z powodzeniem wykorzystane do ekspresji kompleksów białkowych1 lub białek błonowych2, które są trudne do wytworzenia przy użyciu ekspresji opartej na komórkach. Warto zauważyć, że bezkomórkowe reakcje ekspresji genów zostały również wykorzystane do wyjaśnienia struktury kodu genetycznego, począwszy od przełomowych eksperymentów przeprowadzonych przez Nirenberga i Matthaeia w 1961 roku3.

Ostatnio ponownie pojawiło się zainteresowanie metodami bezkomórkowymi w biotechnologii i biologii syntetycznej4,5,6. Systemy bezkomórkowe mogą być wzbogacane o związki niebiologiczne, a składniki o różnym pochodzeniu biologicznym mogą być łatwiej łączone7. Mimo że systemy bezkomórkowe mają tę wyraźną wadę, że nie "rosną i nie dzielą się", można sobie wyobrazić przygotowanie otwartych, bezkomórkowych bioreaktorów z podstawowymi funkcjami metabolicznymi i pozwolenie im na syntezę metabolitów, gdy są wyposażone w proste dane wejściowe węgla i energii8. W rozwijającej się dziedzinie biologii syntetycznej systemy bezkomórkowe mogą być bardziej przewidywalnym "podwoziem" do realizacji syntetycznych funkcji biologicznych.

Obecnie, reakcje ekspresji genów bez komórek są przeprowadzane albo za pomocą ekstraktów komórkowych (z różnych źródeł, takich jak bakterie, drożdże, owady), albo systemów transkrypcji/translacji, które zostały zoptymalizowane pod kątem różnych zastosowań (np. ekspresja genów prokariotycznych i eukariotycznych, produkcja białek błonowych, itp.). Popularny protokół przygotowania ekstraktu z komórek bakteryjnych (powszechnie określany jako TXTL) został niedawno dostarczony przez V. Noireaux i współpracowników9. Jego właściwości biofizyczne zostały dokładnie scharakteryzowane10, a system TXTL został już z powodzeniem wykorzystany do wykonania szeregu złożonych zadań biochemicznych: np. składanie funkcjonalnych bakteriofagów poprzez bezkomórkową ekspresję genomu faga11, synteza włókien białek bakteryjnych12, lub implementacja obwodów genowych bezkomórkowych13,14.

Innym systemem popularnym w bezkomórkowej biologii syntetycznej jest system PURE, który jest odtwarzany z oczyszczonych składników15,16. W porównaniu z systemem TXTL nie zawiera nukleaz ani maszynerii degradacji białek. Podczas gdy degradacja liniowego DNA, cząsteczek RNA lub białek jest mniejszym problemem w systemie PURE, szlaki rozpadu są w rzeczywistości ważne dla realizacji funkcji dynamicznych. W celu zmniejszenia efektu degradacji egzonukleazy liniowych matryc genów w systemie TXTL (poprzez RecBCD), należy dodać białko GamS chroniące końce. Zarówno TXTL, jak i system PURE są dostępne na rynku.

Temat ściśle związany z biologią bezkomórkową dotyczy badania wpływu podziału na reakcje biochemiczne oraz dalszego tworzenia sztucznych struktur podobnych do komórek lub protokomórek17,18,19,20. Badania nad sztucznymi komórkami zazwyczaj obejmują enkapsulację biochemicznego systemu reakcji wewnątrz przedziałów pęcherzykowych wykonanych z fosfolipidów lub innych amfifilów. Podczas gdy takie systemy pomagają badać podstawowe aspekty kompartmentalizacji lub pojawiania się struktur komórkowych i samoreplikujących, napotykają typowe problemy systemów zamkniętych: przy braku funkcjonującego metabolizmu i odpowiednich mechanizmów transportu błonowego trudno jest utrzymać reakcje przedziałowe przez dłuższy czas - cząsteczki paliwa są zużywane, a produkty odpadowe gromadzą się.

Ciekawą alternatywą dla podziału wewnątrz takich przedziałów naśladujących komórki jest przestrzenna organizacja materiału genetycznego za pomocą metod fotolitograficznych. Immobilizacja "genów na chipie" została zapoczątkowana przez grupę Bar-Ziv w Instytucie Weizmanna ponad dziesięć lat temu21. Do głównych problemów, które należało rozwiązać, należały niespecyficzna adsorpcja DNA i potencjalna denaturacja białek na powierzchni chipa. Bar-Ziv i in. opracowali dedykowany rezystor fotolitograficzny o nazwie "Daisy", który składał się z reaktywnego końcowego silanu do immobilizacji cząsteczek rezystu na powierzchniach dwutlenku krzemu, długiego dystansera z glikolu polietylenowego (PEG), który zapewniał biokompatybilność, oraz fotorozszczepialnej grupy czołowej, która została przekształcona w reaktywną aminę po naświetleniu światłem ultrafioletowym (UV). Wykazano, że Daisy może być używana do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu (o długości kilku kilopar zasad (kbp)) na powierzchni chipa. Z punktu widzenia fizyki polimerów systemy te reprezentowały szczotki polimerowe przeszczepione na stałe podłoże. Ze względu na polielektrolitowy charakter DNA, na konformację tych szczotek duży wpływ mają efekty osmotyczne i inne specyficzne dla jonów22,23.

Najważniejsze, wykazano, że geny unieruchomione przez substrat są nadal funkcjonalne i mogą być transkrybowane i tłumaczone na RNA i białka. Szczotki genowe są dostępne dla polimeraz RNA z solution24, a złożona makromolekularna mieszanina transkrypcji/translacji nie ulega denaturacji na powierzchni. Jedną z zalet immobilizacji składników genetycznych na podłożu jest to, że mogą one pracować w otwartym systemie reaktora mikroprzepływowego, który jest stale zasilany małymi cząsteczkami prekursorowymi i z którego można usunąć produkty przemiany materii25,26.

Niedawno opracowaliśmy wariant tej metody o nazwie Bephore (od Biocompatible electron-beam and photoresist)27, który opierał się wyłącznie na komercyjnie dostępnych komponentach i wykorzystywał specyficzne dla sekwencji reakcje inwazji nici DNA do realizacji prostej do wdrożenia wieloetapowej procedury litografii do tworzenia sztucznych komórek opartych na chipach. Schematyczny przegląd procedury przedstawiono na rysunku 1. Opiera się na cząsteczkach DNA spinki do włosów zawierających grupę fotorozszczepialną, które są unieruchomione na biokompatybilnej warstwie PEG. Fotorozszczepienie spinki do włosów odsłania jednoniciową sekwencję trzymania palca, przez którą interesujące cząsteczki DNA (zawierające "wypierającą" sekwencję DIS) mogą być przyłączane poprzez inwazję nici za pośrednictwem palca.

Chociaż Bephore jest potencjalnie prostszy do wdrożenia, Daisy pozwala na realizację bardzo gęstych i czystych "szczotek genowych", co ma zalety w niektórych zastosowaniach. W zasadzie jednak litografię Daisy i Bephore można było łatwo połączyć. Powiązana metoda litograficzna wykorzystująca przemieszczenie nici DNA do strukturyzacji szczotek DNA na złocie została wcześniej opracowana przez Huang i wsp., ale nie została wykorzystana w kontekście ekspresji genów bez komórek28,29.

W poniższym protokole podajemy szczegółowy opis produkcji szczotek DNA do ekspresji genów bez komórek przy użyciu metody Bephore. Opisujemy, w jaki sposób wytwarzane są chipy genowe i demonstrujemy zastosowanie wieloetapowej fotolitografii do przestrzennie ustrukturyzowanej immobilizacji genów na chipie. Omawiamy również wytwarzanie komór reakcyjnych i zastosowanie mikrofluidyki do przeprowadzania reakcji ekspresji genów w układzie scalonym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Harmonogram kroków w różnych sekcjach jest podany w informacjach uzupełniających (sekcja 1).

1. Produkcja chipów

UWAGA: Jako podłoża użyj wafli krzemowych (średnica 100 mm, grubość 0,525 mm) z warstwą dwutlenku krzemu o grubości 50 nm lub szkiełek szklanych (24 mm x 24 mm, nr 1.5; 22 mm x 50 mm, nr 4). W zależności od zastosowania, inne rozmiary i grubości mogą być bardziej odpowiednie.

  1. Czyszczenie podłoży za pomocą procedury RCA clean (woda, roztwór amoniaku NH3(aq) 30% i nadtlenek wodoruH2O2 30%, w stosunku 5:1:1)
    1. Wymieszaj wodę i roztwór amoniaku w szklance zlewki i podgrzej mieszaninę do 70 °C na gorącej płycie, mieszając.
    2. Dodaj nadtlenek wodoru i substrat. Aby uzyskać większą przepustowość, umieść wiele podłoży (zwłaszcza małe szkiełka podstawowe) w uchwycie z politetrafluoroetylenu (PTFE).
    3. Po 30 minutach wyjmij podłoże, dokładnie spłucz je wodą z butelki do mycia i osusz pistoletem do azotu. Natychmiast przystąp do pegylacji substratu.
      UWAGA: Nosić ochronę skóry i oczu oraz pracować pod wyciągiem. Nie zamykać szczelnie pojemnika na odpady, aby umożliwić uwolnienie się gazu z mieszaniny.
  2. PEGylacja substratu
    UWAGA: Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie materiału Biotin-PEG-Silane zmniejsza reaktywność silanu w wyniku kondensacji wilgoci z powietrza. Dlatego należy przygotować probówki o pojemności 5 ml z odpowiednią ilością Biotyny-PEG-Silanu (np. 10-20 mg) i napełnić je suchym argonem przed zamrożeniem do czasu użycia.
    1. Rozpuścić Biotynę-PEG-Silane w suchym toluenie przez wirowanie (5 mg/ml).
    2. Umieść podłoże w szklanej szalce Petriego (średnica 120 cm, wysokość 2 cm) w dygestorium.
    3. Odpipetować roztwór (≈200 μl dla pojedynczego szklanego szkiełka nakrywkowego, kilka ml dla dużej płytki krzemowej) na podłoże, pokrywając całą powierzchnię, ale nie dopuszczaj do tego, aby roztwór przechodził przez krawędź podłoża.
    4. Zamknij szalkę Petriego. Aby ograniczyć wysychanie podłoża, dodaj dodatkowe pokrycie mokrym ręcznikiem papierowym.
    5. Po 30 minutach należy dodać około 40 ml alkoholu izopropylowego, następnie wyjąć podłoże, ponownie dokładnie spłukać alkoholem izopropylowym i osuszyć pistoletem do azotu (w przypadku szkiełek należy pamiętać o stronie PEGylowanej). Przechowuj podłoże w ciemności do czasu użycia.
      UWAGA: Nosić ochronę skóry i oczu oraz pracować pod wyciągiem.

2. Przygotowanie genów do unieruchomienia

UWAGA: Sekwencje starterów, modyfikacje DNA i przykładowy protokół PCR są podane w informacjach uzupełniających (sekcje 2-4).

  1. Użyj zmodyfikowanych starterów, aby amplifikować interesujący nas gen za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Jeden starter zawiera fluorofor do wizualizacji w mikroskopii fluorescencyjnej, a drugi starter jest oddzielony od sekwencji DIS za pomocą przekładki z glikolu trietylenowego, aby utrzymać jednoniciową sekwencję DIS przez cały czas PCR.
  2. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania kolumny wirowej i zmierz jego stężenie za pomocą fotometru absorpcyjnego. Stężenie nie powinno być dużo niższe niż 100 nM.
  3. Dostosować stężenie NaCl do 1 M za pomocą stężonego roztworu 5 M NaCl. Wysokie stężenie soli ułatwia proces składania szczoteczki DNA22.

3. Fotolitografia

UWAGA: Fotorozszczepialne DNA (PC) powinno być obsługiwane tylko w środowisku o żółtym świetle. Żółta folia do pomieszczeń czystych może być używana do filtrowania światła konwencjonalnych lamp ze światłem białym.

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Przygotować Bephore-mix (1 μM streptawidyny, 1,5 μM PC DNA, 7,5 μM PH DNA w 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)) i mieszaninę pasywacyjną (10 μM nieznakowanego DNA DIS, 1 mg/ml BSA (albumina surowicy bydlęcej), w 1x PBS). Oba można przechowywać w ciemności w lodówce przez kilka tygodni.
    2. Pokrój podłoże na mniejsze kawałki (kilkacm2) za pomocą noża do szkła lub łamiąc płytkę krzemową wzdłuż linii krystalicznej, dociskając do krawędzi skalpelem. Jako prosty znak wyrównania utwórz krótką rysę od środka w kierunku krawędzi podłoża za pomocą noża do szkła. Zdmuchnij małe cząstki z chipa za pomocą pistoletu do azotu.
    3. Wymieszaj dwie kropelki dwuskładnikowego kleju silikonowego, mieszając go np. końcówką pipety, a następnie nałóż klej na powierzchnię chipa, pozostawiając obszar wokół końcówki półfabrykatu do rysowania ( Rysunek 2A). Klej zapewnia hydrofobową barierę, która ułatwia etapy mycia i zmniejsza ilość DNA potrzebną do inkubacji. W późniejszym kroku klej można łatwo odkleić.
    4. Inkubować 10 μl (lub tyle, ile jest konieczne do przykrycia chipa) mieszanki Bephore w temperaturze pokojowej (RT) na chipsie. Podczas inkubacji należy umieścić chip w pudełku, np. pudełku z końcówką do pipet, częściowo wypełnionym wodą, aby zmniejszyć parowanie.
    5. Po 1 godzinie kilkakrotnie przemyć chip (5x 50 μl), pipetując za pomocą 1x PBS, aby usunąć niezwiązaną mieszankę Bephore.
    6. Usunąć jak najwięcej buforu bez suszenia wióra i inkubować 10 μl mieszanki pasywacyjnej na wiórze w temperaturze pokojowej.
    7. Po 2 godzinach kilkakrotnie przemyć chip (10x 50 μl), pipetując z 1x PBS w celu usunięcia niezwiązanych środków pasywacyjnych.
  2. Litografia projekcyjna
    UWAGA: Do litografii można użyć mikroskopu pionowego z obiektywem 60-krotnym zanurzeniem w wodzie. Czas świecenia zależy od obiektywu, źródła światła, maski, podłoża (chipa krzemowego lub szkiełka podstawowego) i pożądanej gęstości powierzchni DNA. W przypadku obiektywu 60x typowe czasy naświetlania wahały się od poniżej jednej minuty w przypadku dwuetapowej litografii z nakładającymi się obszarami (15 s w przypadku chipów krzemowych, 45 s w przypadku szkiełek szklanych) do 2-3 minut w przypadku pełnej ekspozycji. Nie używaj szkiełka nakrywkowego (z wyjątkiem stopionego kwarcu) na wierzchu podłoża, ponieważ blokuje on światło UV.
    1. Przytnij wydrukowaną fotomaskę (patrz plik uzupełniający z przykładowymi maskami litografii i sekcją uzupełniającą 5) do odpowiedniego rozmiaru, aby pasował do odpowiedniego uchwytu maski, który można włożyć w miejscu ogranicznika pola (Rysunek 2B). Aby uzyskać precyzyjną litografię wieloetapową, wyrównaj maskę ze znacznikami wyrównania na uchwycie.
    2. Umieść podłoże na szkiełku mikroskopowym i przenieś je do stolika mikroskopowego. W celu wykonania wzoru na szkiełkach Bephore należy włożyć czarną folię (np. zapasową folię z wydrukowanych fotomasek) między szkiełko mikroskopowe a szkiełko Bephore, aby zapewnić ciemne tło dla litografii.
    3. Włóż czerwony filtr do ścieżki oświetlenia, skup się na powierzchni podłoża i przejdź do obszaru podłoża, który zostanie odsłonięty, np. obszaru na końcu rysy.
    4. Włóż uchwyt maski, zablokuj oświetlenie i zmień filtr na UV (Rysunek 2C). Przy niskim natężeniu światła otwórz migawkę i użyj aparatu, aby szybko ustawić ostrość maski na podłożu.
    5. Zablokuj drogę światła do aparatu i oświetl podłoże o dużym natężeniu światła, aby uzyskać żądany czas ekspozycji.
    6. Pobrać próbkę z mikroskopu i ostrożnie usunąć jak najwięcej buforu z podłoża bez jego suszenia.
    7. Dodać 10-20 μl DNA z sekwencją DIS. Umieść podłoże w mokrym pudełku, aby nie wyschło. Inkubować DNA na podłożu przez 2 godziny (oligonukleotydy w stężeniu mikromolowym) lub kilka godzin/noc (DNA o długości kbp przy stężeniu około 100 nM) w temperaturze pokojowej.
    8. Usuń DNA z chipa i umyj go kilka razy 1x PBS. Aby zmniejszyć marnotrawstwo DNA (szczególnie w przypadku dłuższych fragmentów), przechowuj DNA pobrane z podłoża i wykorzystaj je ponownie.
  3. Litografia wieloetapowa
    UWAGA: Aby uzyskać precyzyjne wyrównanie dwóch lub więcej ekspozycji w jednym obszarze, należy trzymać próbkę na stoliku, aby uniknąć niewspółosiowości kątowej. Upewnij się, że wiór nie wysycha. Aby umieścić kilka szczoteczek DNA w różnych obszarach na podłożu, użyj zmotoryzowanego stolika, aby wjechać do wyznaczonego obszaru lub użyj podłoża z odpowiednimi znacznikami wyrównania.
    1. Po pierwszej ekspozycji (sekcja 3.2) inkubować DNA z sekwencją DIS na podłożu. Ważne jest, aby wszystkie miejsca wiązania powstałe w wyniku pierwszej ekspozycji były zajęte. Dlatego inkubować oligonukleotydy (10 μM) przez około 3 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Aby unieruchomić geny znakowane DIS, umieść je na podłożu na kilka godzin lub na noc w temperaturze pokojowej, a następnie umyj próbkę i dodaj mieszankę pasywacyjną przez kolejne 2 godziny w temperaturze pokojowej. Kontynuuj następną ekspozycję.
    3. W przypadku dodatkowych ekspozycji powtórz poprzednie kroki (3.2.3 - 3.3.2).

4. Urządzenia PDMS

UWAGA: Najlepiej pracować w pomieszczeniu czystym. Produkcja urządzenia PDMS odbywa się zgodnie ze standardowym protokołem, takim jak opisany przez McDonalda i wsp.30

  1. Wytwarzanie form wzorcowych za pomocą fotolitografii
    1. Oczyść płytkę krzemową (średnica 76,2 mm, grubość 525 μm) za pomocą sonikacji w acetonie przez 5 minut przy dużej mocy i spłucz alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną. Następnie umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 150 °C na 15 minut.
    2. Opcjonalnie, w celu poprawy przyczepności rezystu do płytki, należy dodać 2-3 ml promotora przyczepności i wirować z prędkością 3000 obr./min przez 30 s. Podgrzej wafel do 120 °C przez 2 min.
    3. Dodać około 2-3 ml fotorezystu (patrz tabela materiałów). Wiruj wafel przez 15 s przy 500 obr./min, a następnie przy 3000 obr./min przez 30 s. W ten sposób powinna powstać warstwa fotorezystu o grubości 20 μm. Pozwól warstwie fotorezystu zrelaksować się w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    4. W celu wypieku przed ekspozycją umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 50 °C na 2 minuty, a następnie w temperaturze 85 °C na 5 minut.
    5. Umieść wafel pod fotomaską z planem przegródek. Najlepiej użyć nakładki na maskę. Fotomaska powinna mieć rozdzielczość 64 000 dpi (patrz plik uzupełniający z maskami litograficznymi i sekcja uzupełniająca 5).
    6. Naświetlić wafel przez 1 minutę światłem UV (I-line 5-10 mW/cm2) przez fotomaskę.
    7. Do wypieku po ekspozycji umieść wafel w temperaturze 50 °C na 2 minuty, a następnie w temperaturze 85 °C na 5 minut. Pozostaw wafel do ostygnięcia i zrelaksuj się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    8. Umieść wafel w naczyniu z wywoływaczem na 3 minuty, delikatnie mieszając zlewkę. Opłucz wafel alkoholem izopropylowym i osusz go pistoletem do azotu. Umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 130 °C na 45 minut.
  2. Przygotowanie urządzenia PDMS
    1. Wymieszaj bazę PDMS i utwardzacz PDMS w proporcji 10:1 i wylej na wafel w zamkniętym pojemniku, aż nad waflem utworzy się warstwa około 5 mm. Aby uzyskać urządzenie PDMS o grubości zaledwie 1 mm, zamiast tego należy obtoczyć płytkę PDMS z prędkością 100 obr./min przez 2 minuty.
    2. Umieścić pojemnik w eksykatorze i stosować podciśnienie (około 85 kPa) przez około 30 minut. Następnie podgrzej PDMS do około 70°C przez 1-2 godziny w piekarniku.
    3. Oddziel urządzenie PDMS od płytki. Pokrój PDMS na płyty tak, aby każdy element zawierał jeden zestaw przegródek. W przypadku, gdy PDMS będzie podłączony do układu mikroprzepływowego, należy przebić otwory (o średnicy 1 mm) jako wlot i wylot na końcach kanału zasilającego.
    4. Wyczyść PDMS alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną i wysusz go pistoletem do azotu. Przechowuj PDMS w sposób wolny od kurzu.

5. Ekspresja genów w przedziałach

UWAGA: Poniższa procedura opisuje montaż uchwytu na próbkę (Rysunek 3) do obserwacji ekspresji genów w przedziałach na odwróconym mikroskopie z inkubatorem klatkowym do kontroli temperatury. Uchwyt został zbudowany przy użyciu łatwo dostępnych materiałów i narzędzi (tworzywa sztuczne z polichlorku winylu (PVC) o grubości 3,5-5 mm, i nakrętki, wiertarka) i można go dostosować do różnych typów mikroskopów. Czynności opisane w ppkt 5.1 i 5.2 powinny być wykonane w taki sposób, aby obie części uchwytu były gotowe w tym samym czasie.

  1. Montaż dolnego uchwytu
    1. Przygotuj chip Bephore ze znacznikiem wyrównania (np. zadrapaniem) i przyklej go do uchwytu na wióry za pomocą dwustronnej taśmy klejącej (Rysunek 3B). Chip powinien być większy niż urządzenie PDMS, które go zakryje.
    2. Unieruchomić jeden lub wiele genów na chipie (patrz punkty 2 i 3).
    3. Dodaj trochę smaru próżniowego wokół środkowego otworu dolnego uchwytu, a następnie podłącz uchwyt na wióry.
      UWAGA: Uchwyt wiórów przylega teraz do dolnego uchwytu za pomocą smaru, zachowując jednocześnie możliwość zmiany położenia wióra w płaszczyźnie x-y.
  2. Montaż górnego uchwytu
    1. Przygotuj cienki chip PDMS z przegródkami, stosując procedurę powlekania wirowego w kroku 4.2.1. Przyciąć PDMS tak mało, jak to możliwe, pozostawiając kanał otwarty z jednej strony, aby umożliwić wymianę odpadów i cząsteczek prekursorowych przez dyfuzję.
    2. Wyczyść szklane szkiełko nakrywkowe (24 mm x 24 mm, nr 1.5) i tylną stronę chipa PDMS (strona bez komór) plazmą tlenową przez 42 s (pracującą przy 200 W i 0,8 mbar z próbką w klatce Faradaya).
    3. Umieść chip PDMS na środku szklanego szkiełka z przegródkami skierowanymi do góry. Piecz szklankę z PDMS przez 1 godzinę w temperaturze 70 °C.
    4. Dodaj trochę smaru próżniowego wokół dużego otworu górnego uchwytu.
    5. Przed rozpoczęciem eksperymentu wyczyść szkiełko podstawowe i chip PDMS plazmą tlenową przez 42 sekundy, aby uczynić PDMS hydrofilowym.
    6. Umieść szkiełko szkiełkowe z PDMS na górnym uchwycie ( Rysunek 3C) i delikatnie dociśnij szklankę do smaru ( Rysunek 3C).
  3. Montaż uchwytu
    1. Przygotuj 100 μl bezkomórkowego systemu do odciągania pokarmu i trzymaj go na lodzie.
    2. Ostrożnie wyjąć bufor z chipa i przemyć go jednorazowo 10 μl bezkomórkowego systemu do odciągania. Następnie dodaj 60 μl bezkomórkowego systemu ekspresji na chip i usuń dwuskładnikowy klej silikonowy z krawędzi chipa (już usunięty w Rysunek 3B).
    3. Dodać 20 μl systemu do odciągania pokarmu do PDMS. Po umieszczeniu kropli na PDMS należy szybko sprawdzić w mikroskopie stereoskopowym, czy komory są dobrze mokre i bez pęcherzyków powietrza. Jeśli są pęcherzyki powietrza, spróbuj je zmyć resztą bezkomórkowego systemu odciągania.
    4. Aby zmontować dwie części uchwytu i wyrównać komory i szczoteczki DNA, pracuj pod mikroskopem stereoskopowym i unieruchom dolny uchwyt za pomocą ramienia chwytaka, tak aby dwie i nakrętki motylkowe były łatwo dostępne obiema rękami (Rysunek 3D-F).
    5. Włóż górny uchwyt do dolnego uchwytu i opuść go, aż krople systemu ekspresji bez komórek połączą się (Rysunek 3D). Sprawdź za pomocą mikroskopu stereoskopowego, czy przedziały i znak wyrównania znajdują się w podobnym obszarze w płaszczyźnie x-y, w przeciwnym razie pociągnij górny uchwyt i ponownie umieść szkiełko na górnym uchwycie.
    6. Od dołu przykręć nakrętki motylkowe, aż dotkną dolnej części uchwytu. Ostrożnie dokręć nakrętki motylkowe, jednocześnie wyrównując przedziały i chip w płaszczyźnie x-y za pomocą uchwytu na wióry w dolnej części uchwytu na wióry (Rysunek 3E). Po zetknięciu się z nakrętkami motylkowymi dokręcaj je bardzo delikatnie (Rysunek 3F).
      UWAGA: Ten krok wymaga pewnego doświadczenia i zależy od konfiguracji eksperymentalnej. Pod mikroskopem wzorce interferencyjne powstające z cieczy między PDMS a szkłem mogą wskazywać, że przyłożona siła jest zbyt mała, podczas gdy niższa intensywność fluorescencji (z pędzla DNA lub wyrażonych białek) w środku komory wskazuje na zbyt wysokie ciśnienie (patrz również informacje uzupełniające, sekcja 6).
    7. Spryskaj gąbkę w obudowie zapobiegającej parowaniu wodą i włóż uchwyt do pudełka. Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml dwuskładnikowym klejem silikonowym i użyj go do uszczelnienia pudełka (Rysunek 3G).
    8. Przenieś pudełko do mikroskopu o kontrolowanej temperaturze i zobrazuj szczoteczkę DNA i reakcję w mikroskopii fluorescencyjnej. Nawet bez oświetlenia fluorescencja szczoteczki DNA zanika w bezkomórkowym systemie ekspresji. Niemniej jednak szczoteczka zachowuje swoją aktywność, co może wykazać powtarzająca się ekspresja genów z tej samej szczoteczki.
      UWAGA: W przypadku korzystania ze szkiełka Bephore zamiast chipa krzemowego, można zamienić pozycję (góra/dół) PDMS i chipa Bephore, co pozwala na stosowanie obiektywów o mniejszych odległościach roboczych.

6. Trwała ekspresja w urządzeniach mikroprzepływowych

UWAGA: Eksperymentalny zestaw składa się z części pokazanych w Rysunek 4A. Szczegóły dotyczące montażu stopnia z kontrolowaną temperaturą są podane w informacjach uzupełniających (sekcja 7).

  1. Bezkomórkowy system odciągania pokarmu i rurki
    1. Przygotować bezkomórkowy system do odciągania pokarmu w probówce z próbką (około 200 μl). Koraliki polistyrenowe oznaczone barwnikami fluorescencyjnymi można dodawać w celu późniejszego monitorowania natężenia przepływu przez kanał zasilający.
    2. Podłącz rurkę do regulatora ciśnienia. Umieść rurkę w dużym zbiorniku na lód, który utrzymuje zimno przez około 12 godzin. W razie potrzeby uzupełnij lód.
      UWAGA: Jako alternatywa dla regulatora ciśnienia, pompa strzykawkowa zapewnia stałe natężenie przepływu bezkomórkowego systemu odciągania, nawet jeśli opór przepływu ulega zmianie, np. z powodu pęcherzyków powietrza, co może pomóc w długoterminowych eksperymentach.
    3. Podłączyć rurkę zawierającą bezkomórkowy system odciągania do rurki PTFE (średnica wewnętrzna 0,8 mm), która sięga do podgrzewanego stolika. Rozbij igłę strzykawki (średnica 0,9 mm) na 1-2 cm kawałki z końcami i włóż jedną część do rurki PTFE. Później będzie służył jako łącznik do PDMS. Spróbuj zminimalizować długość rurki między stolikiem a rurką (Rysunek 4C).
    4. Aby schłodzić rurkę PTFE, owiń ją wokół większej gumowej rurki, która jest podłączona do zbiornika lodowej wody i pompy perystaltycznej. Zaklej je taśmą klejącą (Rysunek 4C).
  2. Montaż górnego uchwytu
    1. Oczyść płaską stronę chipa PDMS plazmą tlenową (42 s) i umieść ją na szkiełku mikroskopowym z otworami pasującymi do wlotu i wylotu PDMS (Rysunek 4B). Otwory w szkle można wcześniej wywiercić za pomocą głowicy do wiercenia szkła. Upewnij się, że mikrokomory nie są skierowane w stronę szkiełka podstawowego.
    2. Nałóż dwustronną taśmę klejącą na płaską stronę uchwytu PDMS. Przyklej kawałek czarnej folii (np. z maski litograficznej) w obszarze między dwoma otworami uchwytu, aby uniknąć fluorescencji tła z taśmy klejącej.
    3. Przyklej szkiełko szkiełkowe z chipem PDMS do uchwytu.
    4. Potraktuj PDMS i uchwyt PDMS dołączonym szklanym szkiełkiem z plazmą tlenową w czyszczalni plazmowej (42 s).
    5. Nałóż smar próżniowy wokół dużego otworu w górnym uchwycie i włóż uchwyt PDMS ( Rysunek 4B). Uchwyt PDMS przylega teraz do górnego uchwytu, zachowując jednocześnie możliwość zmiany położenia w kierunkach x-y.
    6. Podłącz rurkę PTFE ze złączem igły strzykawki do wlotu chipa PDMS. Aby ułatwić dostęp do PDMS przez górny uchwyt, górną plastikową płytkę można na krótko zdjąć w tym i następnym kroku.
    7. Włóż drugi kawałek rurki PTFE (około 5 cm) ze złączem igły strzykawki do wylotu (Rysunek 4D).
    8. Umieść uchwyt PDMS w górnym uchwycie, aby mógł się swobodnie poruszać we wszystkich kierunkach. Umieść górny uchwyt luźno na podgrzewanej scenie, jak w Rysunek 4E, bez dokręcania żadnych nakrętek motylkowych.
    9. Za pomocą mikroskopu przejdź do pozycji komór PDMS i wyśrodkuj je w polu widzenia kamery. Od tego momentu nie przesuwaj sceny.
    10. Zdejmij górny uchwyt z PDMS ze sceny.
  3. Podgrzewana scena i szklana zjeżdżalnia Bephore
    1. Ustaw temperaturę podgrzewanego stage na 37 °C
    2. Przyklej szkiełko podstawowe Bephore (nr 4) ze szczoteczkami genowymi do stolika odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego o kontrolowanej temperaturze za pomocą dwustronnej taśmy klejącej, tak aby znacznik wyrównania znajdował się mniej więcej w środku pola widzenia mikroskopu. Takie umiejscowienie znaku wyrównania zapewnia, że przedziały zostaną opuszczone mniej więcej do tego samego obszaru.
    3. Zrób zdjęcie w odpowiednim kanale fluorescencyjnym pędzla genowego i zaznacz jego położenie na obrazie z kamery.
    4. Usuń bufor z pędzla genowego, ale nie pozwól mu wyschnąć. Dodaj 20 μl bezkomórkowego systemu ekspresji do szczoteczki genowej i użyj pęsety, aby usunąć silikonową ramkę z kleju.
  4. Montaż zestawu mikroprzepływowego
    1. Zwiększaj ciśnienie w probówce z próbką, aż bezkomórkowy system odciągania napełni rurkę PTFE i pojawi się na spodzie urządzenia PDMS. Dodatkowo należy odpipetować 10 μl bezkomórkowego systemu ekspresji do mikrokomór w PDMS. Upewnij się, że w komorach nie ma pęcherzyków powietrza.
    2. Ostrożnie opuść górny uchwyt na szklane szkiełko i wyrównaj mikrokomory ze szczoteczką genową. Zanim zarówno PDMS, jak i znacznik wyrównania dotrą do tej samej płaszczyzny ogniskowej, użyj małych z tyłu uchwytu PDMS, aby precyzyjnie wyrównać pozycję x-y i orientację urządzenia PDMS za pomocą szczoteczki genowej (Rysunek 4E).
    3. Przytrzymaj pozycję i dociśnij PDMS do szkiełka podstawowego, dokręcając nakrętki motylkowe wzdłuż łączących górny uchwyt ze stolikiem mikroskopu (Rysunek 4E).
    4. Zwiększ ciśnienie w probówce zawierającej bezkomórkowy system odciągania pokarmu i monitoruj przepływ kulek fluorescencyjnych przez kanał zasilający (zalecane natężenie przepływu od 0,5 do 5 μl na godzinę) (Rysunek 4F). W razie potrzeby zwiększ nacisk PDMS na szkło, dokręcając nakrętki motylkowe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Litografia dwuetapowa: Rysunek 5 pokazuje wynik dwuetapowego procesu litograficznego na szkiełku z nakładającymi się na siebie wzorami fluorescencyjnie znakowanych nici DIS.

Ekspresja białka fluorescencyjnego z pędzla genowego: Rysunek 6 pokazuje ekspresję białka fluorescencyjnego YPet z unieruchomionego DNA. W kilku momentach oceniliśmy tempo ekspresji genów, częściowo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Litografia Bephore jest solidną i wszechstronną techniką wzorzystego unieruchomienia DNA lub RNA. Procedura obejmuje jednak kilka kroków, które - jeśli zostaną zmienione - mogą być źródłem awarii lub obniżonej wydajności systemu.

Kluczowym krokiem w wytwarzaniu chipów Bephore jest pegylacja podłoża, która zapewnia biokompatybilność powierzchni. W tym przypadku ważny jest etap czyszczenia za pomocą procedury RCA, ponieważ aktywuje on również powierzchnię do późniejszej silanizacji. Podczas właś...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe dla tego projektu przez Volkswagen Stiftung (grant nr 89 883) i Europejską Radę ds. Badań Naukowych (umowa o grant nr 694410 - AEDNA). M.S.-S. potwierdza wsparcie ze strony DFG za pośrednictwem GRK 2062.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Wafel krzemowy z dwutlenkiem krzemu 50 nm (podłoże Bephore)Grubość wafla(µ m): 525 ± 25, Średnica (mm): 100
Wafel krzemowy (do formy głównej PDMS)Grubość wafla(&mikro; m): 525 ± 25, Średnica (mm): 76,2 (3 ")
Szkiełka szklane nr 4Menzel22 mm x 50 mm
Szkiełka szklane nr 1.5Assistent24 mm x 24 mm
Biotyna-PEG-SilaneLaysan BioMW 5 000
Bezwodny toluenSigma Aldrich (Merck)244511
StreptawidynaThermo-FisherScientific S888
DNAZintegrowane technologie DNA ( IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HFZestaw do PCRNew England BiolabsM0531S
Żel Wizard SV i system czyszczenia PCR PromegaA9281Zestaw do czyszczenia PCR z kolumną spinową
PURExpressNew England BiolabsE6800SBezkomórkowy system ekspresji
PDMS Dow CorningSlygard 184
FluoSpheresThermo-Fisher ScientificF8771
Rurka PTFE (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)BolaS 1810-10
EpoCore 20technologia mikrorezystu  Photoresist
mr-Dev 600technologia mikrorezystu  Twórca fotorezystu
Ti-PrimeMicroChemicalsPromotor przyczepności
Dwuskładnikowy klej silikonowyPicodentTwinsil 
Żółta folia chroniąca przed promieniowaniem UVLithoprotect (via MicroChemicals)Y520E212
Equipment
Maski do fotolitografiiZitzmann GmbH64.000 dpi, 180x240 mm
Mikroskop pionowyOlympusBX51Fotolitografia i obrazowanie fluorescencyjne
Obiektyw 60x zanurzeniowy w wodzieOlympusLumPlanFlUżywany z Olympus BX51, NA 0.9
20x obiektyw do zanurzenia w wodzieOlympusLumPlanFlUżywany z aparatem Olympus BX51, NA 0.5
FotometriaCoolsnap HQUżywany z Olympus BX51
Źródło światłaEXFOX-Cite 120QUżywany z Olympus BX51
Mikroskop odwróconyNikonTi2-EFluorescencja obrazowanie ekspresji genów
4x obiektywNikonCFI P-Apo 4x LambdaUżywany z aparatem Nikon Ti2-E
AndorNeo5.5Używany z Nikon Ti2-E
Źródło światłaLumencorSOLA SM IINikon Ti2-E
Okolabbold lineNikon Ti2-E
ElveflowOB1 MK3
NanoPhotometerImplenpomiar stężenia DNA
Myjka plazmowaDienerFemto200 W, działająca przy 0,8 mbar z próbką w klatce Faradaya
Siegert Siegert GmbH GmbH Używany z inkubatorem klatkowym Używany z regulatorem ciśnienia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
  2. Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
  3. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
  4. Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
  5. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
  6. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  7. Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
  8. Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113(2014).
  9. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  10. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104(2011).
  11. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
  12. Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
  13. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
  14. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771(2015).
  15. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  16. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
  17. Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
  18. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  19. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
  20. van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583(2018).
  21. Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
  22. Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
  23. Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
  24. Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
  25. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
  26. Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
  27. Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
  28. Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
  29. Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
  30. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Strand DisplacementBephore LithographyGene ImmobilizationMicrofluidic IntegrationTIRF MicroscopyPDMS CompartmentsFluorescence MicroscopySubstrate PEGylationPhotocleavable DNASelf re Expression System

Related Articles