Artykuł metodologiczny

Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu

DOI:

10.3791/58636

⸱

18 kwietnia 2019

 , 
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy synergii przeciwdrobnoustrojowej są używane do oceny efektu dwóch lub więcej antybiotyków stosowanych w połączeniu i zazwyczaj są wykonywane za pomocą jednej z dwóch metod: szachownicy lub testu zabijania czasu. W tym miejscu przedstawiamy zautomatyzowaną, wspomaganą drukarką atramentową technikę synergii tablicy szachownicowej oraz klasyczne badanie synergii zabijania czasu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ wskaźniki patogenów wielolekoopornych (MDR) wciąż rosną, wyprzedzając rozwój nowych środków przeciwdrobnoustrojowych, coraz częściej konieczne stają się nowatorskie podejścia do leczenia bakterii MDR. Jednym z takich podejść jest terapia skojarzona, w której dwa lub więcej antybiotyków stosuje się razem w leczeniu infekcji, przeciwko której jeden lub oba leki mogą być nieskuteczne samodzielnie. Kiedy dwa leki w połączeniu wywierają efekt większy niż addytywny, uważa się je za synergiczne. Badanie działania synergistycznego in vitro jest ważnym pierwszym krokiem w ocenie możliwej skuteczności kombinacji leków. Opracowano dwie główne metody testowania synergii in vitro: szachownicę i badanie zabijania czasu. W tym artykule przedstawiamy zautomatyzowaną metodę szachownicy, która wykorzystuje technologię druku atramentowego w celu zwiększenia wydajności i dokładności tej techniki, a także standardową metodę synergii ręcznego zabijania czasu. Zautomatyzowana tablica szachownicy może służyć jako wysokoprzepustowy test przesiewowy, podczas gdy ręczne badanie zabijania czasu dostarcza dodatkowych, uzupełniających danych na temat synergistycznego działania i zabijania.

Tablica szachownicy jest modyfikacją standardowych testów minimalnego stężenia hamującego (MIC), w których bakterie są inkubowane z antybiotykami w różnych kombinacjach stężeń i oceniane pod kątem zahamowania wzrostu po całonocnej inkubacji. Ręczne wykonanie tablicy szachownicy wymaga pracochłonnej i podatnej na błędy serii obliczeń i rozcieńczeń. W przedstawionej tutaj metodzie zautomatyzowanej obliczanie i dozowanie wymaganych objętości roztworu podstawowego antybiotyku jest zautomatyzowane dzięki zastosowaniu technologii drukarki atramentowej. W teście synergii zabijania w czasie bakterie są inkubowane z antybiotykami będącymi przedmiotem zainteresowania, zarówno razem, jak i pojedynczo, a następnie pobierane są próbki w odstępach czasu w ciągu 24 godzin w celu hodowli ilościowej. Wyniki mogą określić, czy kombinacja jest synergistyczna i czy jest bakteriobójcza, a także dostarczyć danych na temat hamowania i zabijania bakterii w czasie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozprzestrzenianie się patogenów bakteryjnych opornych na wiele leków (MDR), szczególnie bakterii Gram-ujemnych MDR, takich jak oporne na karbapenemy Enterobacteriaceae (CRE), pozostawiło klinicystom coraz bardziej ograniczone możliwości skutecznej terapii przeciwinfekcyjnej1, problem zaostrzony przez powolne tempo odkrywania nowych leków przeciwbakteryjnych2,3. Synergia przeciwdrobnoustrojowa, w której dwa leki stosowane w połączeniu wywierają efekt większy niż addytywny, daje możliwość uratowania istniejących antybiotyków do stosowania w leczeniu bakterii MDR, nawet jeśli bakterie te są oporne na jeden lub oba antybiotyki indywidualnie. Techniki opisane w tym artykule zapewniają dwie uzupełniające się metody testowania synergii in vitro, które, gdy są stosowane razem, pozwalają badaczom na skuteczne badanie przesiewowe interesujących kombinacji środków przeciwdrobnoustrojowych pod kątem dowodów na synergiczne działanie (metoda zautomatyzowanej szachownicy), a następnie na dalszą ocenę kinetyki hamowania i zabijania wykazanej przez obiecujące kombinacje zidentyfikowane na etapie badań przesiewowych (ręczna metoda zabijania w czasie).

Jedną z najczęściej stosowanych metod testowania synergii in vitro jest test szachownicy, modyfikacja testu minimalnego stężenia hamującego (MIC), w którym aktywność hamująca dwóch różnych antybiotyków przeciwko izolatowi bakteryjnemu jest testowana w zakresie kombinacji stężeń4,5. Jeśli oba leki wywierają większą aktywność niż addytywna, gdy są stosowane razem, połączenie jest uważane za synergiczne6. Jednak ręczne skonfigurowanie tablicy szachownicy wiąże się z szeregiem obliczeń oraz etapów rozcieńczania i pipetowania, które są pracochłonne i podatne na błędy ludzkie. Ograniczenia te spowodowały ograniczenie stosowania testów synergicznych przede wszystkim do retrospektywnej oceny niewielkiej liczby kombinacji antybiotyków i izolatów bakteryjnych, a wyniki nie zawsze były spójne między badaniami7,8,9,10,11. Co więcej, złożoność testów synergicznych przyczyniła się do ich niedostępności w klinicznym laboratorium mikrobiologicznym oraz do faktycznego braku danych z badań synergii in vitro z badań klinicznych terapii skojarzonej12,13.

Aby zwiększyć wydajność i przepustowość metody szachownicy, skorzystaliśmy z techniki automatycznego testowania MIC, wcześniej opracowanej w naszym laboratorium, która wykorzystuje technologię druku atramentowego do precyzyjnego i konsekwentnego dozowania małych objętości roztworu podstawowego antybiotyku do studzienek na płytce do mikromiareczkowania14. Platforma eliminuje konieczność wykonywania skomplikowanych obliczeń i wykonywania wielu etapów pipetowania. Powiązane oprogramowanie oblicza i dozuje odpowiednie ilości antybiotyków, aby stworzyć dwuwymiarową szachownicę, jeśli użytkownik po prostu wprowadzi żądany zakres stężeń i stężenie roztworu podstawowego antybiotyków. Początkowo przetestowaliśmy tę metodę na kolekcji izolatów CRE15, a następnie skupiliśmy się na testowaniu kombinacji zawierających kolistynę pod kątem aktywności przeciwko izolatom opornym na kolistynę16. Kolistyna jest lekiem ostatniej szansy, zwykle zarezerwowanym do stosowania w leczeniu patogenów Gram-ujemnych MDR17,18, a oporność na kolistynę sprawia, że bakterie MDR są już prawie odporne na pan19, co czyni je idealnymi kandydatami do opracowania nowych strategii terapeutycznych przy użyciu leków, na które są indywidualnie niewrażliwe. Odkryliśmy, że połączenie kolistyny i inhibitora syntezy białek, antybiotyku minocykliny, miało bardzo wysoki wskaźnik synergii, nawet przeciwko szczepom, które były oporne na każdy z tych leków z osobna, prawdopodobnie dlatego, że kolistyna wywiera subhamujący efekt przepuszczalności nawet na bakterie oporne na kolistynę. Wybraliśmy tę kombinację, aby użyć jej jako przykładu w tym artykule. Warto zauważyć, że testy synergiczne mogą być również wykorzystywane do oceny zwiększonej skuteczności dwóch leków, które są skuteczne indywidualnie.

Zautomatyzowana metoda szyku szachownicy umożliwia szybkie i wysokoprzepustowe testowanie synergii. Jednak metoda tablicy szachownicy ma ograniczenia. Jako zmodyfikowany test MIC dostarcza danych tylko na temat hamowania wzrostu bakterii, a nie na temat zabijania, i nie dostarcza danych na temat działania antybiotyków w czasie. Z kolei ręczne wykonywanie testów synergii zabijania czasu jest bardziej pracochłonne, ale dostarcza informacji zarówno na temat hamowania, jak i zabijania w ciągu 24 godzin kursu czasowego20,21. Zastosowaliśmy analizę zabijania czasu na mniejszej liczbie izolatów, aby potwierdzić nasze wyniki w szachownicę i określić, czy zidentyfikowane przez nas synergiczne kombinacje były również bakteriobójcze.

Zarówno metody synergii szachownicy, jak i time-kill dostarczają cennych informacji na temat aktywności kombinacji leków i są szczególnie przydatne w ocenie potencjalnych nowych opcji terapeutycznych dla wysoce odpornych patogenów bakteryjnych. Metody te mają również nieodłączne ograniczenia. Standardowa metoda MIC rozcieńczania mikrobulionu ma znany oczekiwany zakres błędu wynoszący 1 dwukrotne rozcieńczenie22, który zwiększa się, gdy dwa leki są testowane razem w układzie szachownicy. Standardowa definicja synergii, która uznaje połączenie za synergiczne tylko wtedy, gdy leki są aktywne razem na poziomie jednej czwartej swoich odpowiednich wartości MICs6, uwzględnia tę oczekiwaną zmienność, ale taką zmienność (która jest uważana za wynikającą z połączenia fluktuacji biologicznych i technicznych23) nieuchronnie prowadzi do niepewności co do wiarygodności wyników synergii. Obecnym ograniczeniem jest również brak ustalonych standardów kontroli jakości dla testów synergii. Być może najbardziej znaczącym ograniczeniem wszystkich metod testowania synergii jest brak ustalonych korelacji między wynikami in vitro a wynikami klinicznymi, gdy w leczeniu pacjentów stosuje się kombinacje24. Prostsze i szybsze metody testowania synergii, takie jak opisana tutaj zautomatyzowana metoda szachownicy, mogą ułatwić integrację testów synergii in vitro z badaniami klinicznymi lub innymi ocenami wyników pacjentów w celu lepszego scharakteryzowania związku między efektami in vitro i in vivo w przyszłości.

Zautomatyzowana metoda szachownicy, którą tutaj prezentujemy, oferuje opcję wysokoprzepustowego przesiewania różnych kombinacji i pozwala na szybką ocenę nietypowych kombinacji "wysokiego ryzyka i wysokiej nagrody" bez większego inwestowania czasu i zasobów. Metoda zabijania czasu, którą następnie demonstrujemy, może dostarczyć dodatkowych informacji na temat synergicznego działania kombinacji i może pomóc w scharakteryzowaniu jej działania bakteriobójczego i kinetyki przeciwbakteryjnej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Stosuj odpowiednie procedury bezpieczeństwa podczas pracy z bakteriami. Przez cały czas noś rękawice i fartuch laboratoryjny. Wykonuj prace w komorze bezpieczeństwa biologicznego, jeśli będą generowane aerozole lub pracuj z patogenami wysokiego ryzyka.

UWAGA: Dwadzieścia do 24 godzin przed rozpoczęciem eksperymentów, wyrzuć izolat (izolaty) bakterii do testowania (z oczyszczonego przez kolonię, minimalnie pasażowanego bulionu zamrożonego w temperaturze -80 °C w tryptycznym bulionie sojowym z 50% bulionu glicerynowego) na płytkę z agarem z krwią. Inkubować płytkę w temperaturze 35 °C w otaczającym powietrzu.

1. Synergia zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową

  1. Przygotuj podstawowe roztwory przeciwdrobnoustrojowe (kolistyna i minocyklina).
    1. Określ stężenia roztworu podstawowego antybiotyku na podstawie rozpuszczalności antybiotyków i pożądanych stężeń końcowych w szachownicy. Zrób zapasy 10 mg/ml kolistyny i minocykliny dla tego przykładu. Skorzystaj z dokumentu CLSI M100, aby określić odpowiednie rozpuszczalniki dla każdego antybiotyku25. Zarówno kolistyna, jak i minocyklina są rozpuszczalne w wodzie; ponieważ drukarka atramentowa D300 wymaga dodania środka powierzchniowo czynnego w celu prawidłowego obchodzenia się z płynami wodnymi, należy rozpuścić antybiotyki w ultraczystej wodzie dejonizowanej z 0,3% polisorbatem 20.
    2. Odważyć antybiotyk w proszku za pomocą wagi analitycznej i obliczyć objętość rozpuszczalnika potrzebną do uzyskania docelowego stężenia zapasu.
      1. Jeśli antybiotyk jest dostarczany w postaci soli (np. siarczan kolistyny, chlorowodorek minocykliny) lub w postaci uwodnionej (np. meropenem trójwodny) lub jeśli producent podaje, że jego czystość jest mniejsza niż 100%, należy obliczyć siłę działania26, aby określić wymaganą ilość rozpuszczalnika.
      2. Postępuj zgodnie z tym przykładem chlorowodorku minocykliny o podanej czystości 900 μg/mg:
        Czystość testu: 900 μg/mg
        Zawartość wody: Brak
        Frakcja aktywna: 0,926 (otrzymana przez podzielenie masy cząsteczkowej minocykliny (457,48 Da) przez masę cząsteczkową chlorowodorku minocykliny (493,94 Da)).
        Moc = (Czystość testu) * (1 – zawartość wody) * (frakcja aktywna)
        = (900 μg/mg) * (1) * (0,926) = 833,4 μg/mg lub 83,34%
        Następnie określ wymaganą objętość rozpuszczalnika w następujący sposób:
        Objętość (ml) = [Waga (mg) * Moc (μg/mg)] ÷ [Stężenie (μg/ml)]
        Tak więc, na przykład, jeśli zważy się 34,7 mg chlorowodorku minocykliny w proszku, użyj następującego obliczenia, aby określić objętość rozpuszczalnika wymaganą do przygotowania roztworu 10 mg/mL:
        Objętość = (34,7 mg) * (833,4 μg/mg) = 2,89 ml
        10 000 μg/ml
    3. Wlej antybiotyk w proszku do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj odpowiednią objętość wody plus 0,3% polisorbatu 20. Wirować aż do rozpuszczenia.
    4. Podwielokrotny roztwór podstawowy antybiotyku rozlać do probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do użycia.
  2. Przeprowadzić kontrolę jakości (QC) zapasów przeciwdrobnoustrojowych do wykorzystania w eksperymentach z szachownicą co najmniej jeden dzień przed testami synergii, aby można było ocenić wyniki kontroli jakości przed użyciem zapasu do testów synergii.
    UWAGA:     Opisana tutaj technika kontroli jakości jest identyczna z techniką, która byłaby stosowana do badania minimalnego stężenia hamującego (MIC) poszczególnych leków i może być stosowana jako taka z dowolnymi szczepami interesującymi badacza.
    1. Przygotować zawiesinę bakteryjną.
      1. Wyjąć porcję każdego wywaru antybiotykowego z zamrażarki w temperaturze -80 °C, aby rozpocząć rozmrażanie podczas przygotowywania zawiesiny bakteryjnej. Vortex po rozmrożeniu, aby upewnić się, że antybiotyk jest w roztworze.
      2. Wybierz odpowiedni szczep QC i określ dopuszczalny zakres MIC dla testowanych leków na podstawie tabeli 5A-1 w CLSI M10025. W przypadku tutejszych leków użyj E. coli ATCC 25922; zakresy MIC dla tego szczepu wynoszą 0,25-1 μg/ml dla minocykliny i 0,25-2 μg/ml dla kolistyny.
      3. Wybierz zakres stężeń antybiotyków do przetestowania, który będzie obejmował cały zakres kontroli jakości. Użyj zakresu od 0,0156 μg/ml do 8 μg/ml dla minocykliny i kolistyny dla ATCC 25922.
      4. Dodać 1 ml 0,9% chlorku sodu do szklanej probówki hodowlanej o wymiarach 12 mm x 75 mm z okrągłym dnem. Wybierz jedną lub dwie kolonie z nocnej płytki ATCC 25922 i delikatnie wiruj, aby zawiesić.
      5. Sprawdź stężenie bakterii za pomocą czytnika McFarland. Dostosuj w razie potrzeby, dodając więcej 0,9% chlorku sodu lub więcej bakterii, aby uzyskać odczyt zmętnienia 0,5 McFarlanda.
      6. Zawiesinę McFarlanda należy rozcieńczyć w stosunku 1:300, dodając 100 μl zawiesiny do 30 ml bulionu Muellera-Hintona (CAMHB) z dostosowaniem kationowym w probówce stożkowej o pojemności 50 ml, aby osiągnąć końcową gęstość komórek 5x105 CFU/ml, zgodnie z zaleceniami CLSI27.
      7. Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, wyizolować kroplę początkowego inokulum na płytkę z agarem z krwią, aby potwierdzić czystość inokulum i inkubować w temperaturze 35 °C w otaczającym powietrzu.
    2. Dodaj środki przeciwdrobnoustrojowe do płaskodennej, kwadratowej, przezroczystej, niepoddanej obróbce płytki 384-dołkowej za pomocą D300. Wykonaj ten krok natychmiast po przygotowaniu zawiesiny bakteryjnej, tak aby zawiesina mogła zostać dodana do płytek w ciągu 15 minut od przygotowania26.
      1. Włącz drukarkę atramentową D300 i skojarzony z nią komputer. Otwórz oprogramowanie.
      2. Rozpocznij tworzenie nowego pliku. Nad obrazem siatki blachy kliknij prawym przyciskiem myszy Blacha 1 i wybierz Edytuj blachę. Wybierz odpowiedni typ płytki (384 dołki) i dodatkową objętość (50 μL).
      3. Dodaj płyny (tj. zapasy antybiotyków) do protokołu, klikając znak plus obok pozycji Płyny w panelu po lewej stronie. Dodaj dwa płyny (kolistynę i minocyklinę).
        1. Najedź kursorem na panel, który pojawił się dla płynu 1 i kliknij ołówek, aby edytować. Nazwij płyn "Kolistyna", zmień klasę na "Wodny + Tween 20", zmień stężenie na 10 000 i zmień jednostki stężenia na μg/ml (zwróć uwagę, że stężenie podstawowe wynosi 10 μg/ml, tj. 10 000 mg/ml). Pozostaw Dozowanie by w pozycji Koncentracja i pozostaw pozostałe pola z ustawieniami domyślnymi. Kliknij przycisk OK.
        2. Powtórz powyższą procedurę dla płynu 2 (minocykliny).
        3. Kliknij kartę Bieżący protokół u góry ekranu i zmień Stężenie (masa) na μg/ml, aby określić jednostki używane do końcowych stężeń antybiotyków w studzience.
      4. Wybierz 10 dołków w siatce, klikając i przeciągając, a następnie kliknij opcję Miareczkowanie u góry ekranu. W polu Określ miareczkowanie przy użyciu wybierz Najwyższe stężenie, w polu Płyn wybierz Kolistynę, w polu Najwyższe stężenie wprowadź wartość 8 (upewnij się, że jednostki to μg/ml), a w polu Dystrybucja wybierz 1:2 (50%). Pozostaw wartości domyślne w pozostałej części okna i kliknij przycisk OK.
      5. Powtórz powyższą procedurę dla minocykliny, aby wygenerować miareczkowanie minocykliny.
      6. Zapisz protokół, a następnie kliknij przycisk Uruchom w lewym górnym rogu.
      7. Kliknij przycisk Start. Załaduj płytkę 384-dołkową (ze zdjętą pokrywką) do uchwytu płytki i naciśnij Załadowano pod komunikatem "Załaduj płytkę 1 – Synergia".
        nuta: Ten monit jest wybierany przez oprogramowanie i nie oznacza, że wykonywane są testy synergii. Umieść kasetę T8+ w gnieździe kasety i naciśnij przycisk Załadowane pod monitem Załaduj kasetę T8+.
      8. Po wyświetleniu monitu dodaj podstawowy roztwór antybiotyku do wskazanych zbiorników na kasecie. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby prawidłowo załadować i ostrożnie dozować, aby uniknąć dostania się pęcherzyków do roztworu. Po dodaniu każdego roztworu naciśnij przycisk Napełniony.
      9. Gdy drukarka atramentowa doda materiał antybiotykowy w odpowiednich ilościach do każdego dołka i pojawi się pole Uruchom zakończone, kliknij przycisk Zamknij, wyjmij płytkę i wyłącz D300.
    3. Dodać zawiesiny bakteryjne do płytki 384-dołkowej i płytki do inkubacji.
      1. Przygotowany wcześniej zawiesinę bakteryjną wlać do sterylnego zbiornika na odczynnik.
      2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 μl zawiesiny bakteryjnej do wszystkich studzienek zawierających antybiotyki. Dodać 50 μl CAMHB bez bakterii do pustego dołka; Będzie to dobrze kontrola negatywna, aby potwierdzić sterylność pożywki.
      3. Umieścić płytkę w inkubatorze z powietrzem otoczenia o temperaturze 35 °C i inkubować przez 16-20 h26.
        nuta: Inny czas inkubacji może być wymagany, jeżeli badane są organizmy inne niż Enterobacteriaceae; skonsultuj się z CLSI M10025, aby uzyskać zalecenia dotyczące konkretnego organizmu.
    4. Odczytaj płytkę na czytniku mikropłytek o gęstości optycznej 600 (OD600) i przeanalizuj wyniki.
      1. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, zacienij komórki o wartości OD600 ≥0,07 na zielono, wskazując wzrost, oraz komórki o wartości <0,07 na czerwono, wskazując brak wzrostu.
        UWAGA: Wartości te zostały określone na podstawie oględzin wzrostu i braku wzrostu oraz korelacji z odczytami OD dla tych eksperymentów; Odczyty OD600 ze studni zawierających same media były stale poniżej 0,07. Odpowiednie odcięcia mogą się różnić w zależności od różnych czytników płytek i bakterii.
      2. Określ wartość MIC dla każdego leku. MIC jest najniższym stężeniem leku, przy którym wzrost bakterii jest zahamowany. Jeśli wartość MIC mieści się w oczekiwanym zakresie kontroli jakości zgodnie z dokumentem CLSI M100 document25, roztwór podstawowy jest odpowiedni do użycia.
  3. Przygotuj zawiesinę bakteryjną do szyku szachownicy.
    1. Wyjąć porcję każdego wywaru antybiotykowego z zamrażarki w temperaturze -80 °C, aby rozpocząć rozmrażanie podczas przygotowywania zawiesiny bakteryjnej. Vortex po rozmrożeniu, aby upewnić się, że antybiotyk jest w roztworze.
    2. Dodaj ~ 1 ml 0,9% chlorku sodu do szklanej probówki hodowlanej o okrągłym dnie 12 mm x 75 mm. Wybierz jedną lub dwie kolonie z nocnej płytki bakterii (w tym przypadku szczep E. coli FDA-CDC 0494) i delikatnie wiruj, aby zawiesić je w 0,9% chlorku sodu.
    3. Sprawdź stężenie bakterii za pomocą czytnika McFarland. Dostosuj w razie potrzeby, dodając więcej 0,9% chlorku sodu lub więcej bakterii, aby uzyskać odczyt zmętnienia 0,5 McFarlanda.
    4. Zawiesinę McFarlanda należy rozcieńczyć w stosunku 1:300, dodając 100 μl zawiesiny do 30 ml CAMHB w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aby osiągnąć końcową gęstość komórek 5 x 105 CFU/mL27.
  4. Dodaj środki przeciwdrobnoustrojowe do płaskodennej, kwadratowej, przezroczystej, niepoddanej obróbce płytki 384-dołkowej za pomocą D300.
    UWAGA:     Wykonaj ten krok natychmiast po przygotowaniu zawiesiny bakteryjnej, aby zawiesina mogła zostać dodana do płytek w ciągu 15 minut od przygotowania26.
    1. Włącz drukarkę atramentową, uruchom nowy plik i dodaj płyny do protokołu, jak w krokach 1.2.2.1-1.2.2.3.
    2. Wygeneruj siatkę synergii.
      1. Kliknij ikonę Synergy u góry ekranu i postępuj zgodnie z instrukcjami. W polu Typ wybierz opcję Dwa lub więcej płynów współczynnikowanych razem. W przypadku płyty nie jest konieczne wykluczanie żadnych studni; Kliknij Dalej w tym kroku bez wprowadzania zmian.
      2. Na karcie Miareczkowanie wprowadź stężenie i rozmieszczenie antybiotyku.
        1. Aby dodać minocyklinę w zmniejszających się podwajających rozcieńczeniach od 32 do 0,031 μg / ml, oprócz ujemnego dołka bez antybiotyku, w dół osi y, wprowadź 12 dla poziomów miareczkowania na lewym panelu. W polu Określ miareczkowanie za pomocą wybierz opcję Najwyższe stężenie; dla Płynu wybierz Minocyklina; dla Najwyższego stężenia wprowadź 32 (upewnij się, że jednostka jest ustawiona na μg/ml; jeśli tak nie jest, zamknij okno dialogowe Synergia i zmień na karcie Bieżący protokół). Upewnij się, że pole Uwzględnij wartość 0 jest zaznaczone. Zmień rozkład na 1:2 (50%).
        2. Powtórz te kroki dla kolistyny na panelu po prawej stronie, stosując 12 poziomów miareczkowania i najwyższe stężenie 16. Kliknij Dalej.
      3. Na karcie Układ wybierz opcję Poziomy miareczkowania pierwszych 2 płynów określają liczbę wierszy i kolumn w siatce układu. Kliknij Dalej. Jeśli siatka jest wyświetlana zgodnie z oczekiwaniami, kliknij przycisk Zakończ.
    3. Zapisz protokół, a następnie kliknij przycisk Uruchom w lewym górnym rogu.
    4. Kliknij przycisk Start. Załaduj płytkę 384-dołkową (ze zdjętą pokrywką) do uchwytu płytki i naciśnij Załadowano pod monitem Płytka obciążeniowa 1 – Synergia. Umieść kasetę T8+ w gnieździe kasety i naciśnij przycisk Załadowane pod monitem Załaduj kasetę T8+.
    5. Po wyświetleniu monitu dodaj podstawowy roztwór antybiotyku do wskazanych zbiorników na kasecie. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby prawidłowo załadować i ostrożnie dozować, aby uniknąć dostania się pęcherzyków do roztworu. Po dodaniu każdego roztworu naciśnij przycisk Napełniony.
    6. Gdy dozownik D300 doda zapas antybiotyku w odpowiednich ilościach do każdej studzienki i pojawi się pole Zakończono uruchamianie, kliknij przycisk Wyjdź, wyjmij płytkę i wyłącz D300.
  5. Dodać zawiesiny bakteryjne do płytki 384-dołkowej i płytki do inkubacji.
    1. Przygotowany wcześniej zawiesinę bakteryjną wlać do sterylnego zbiornika na odczynnik.
    2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 μl zawiesiny do wszystkich studzienek w układzie szachownicy. Dodać 50 μl CAMHB bez bakterii do pustego dołka; Będzie to dobrze kontrola negatywna, aby potwierdzić sterylność pożywki. Inkubować w inkubatorze powietrza atmosferycznego o temperaturze 35 °C przez 16-20 h26.
  6. Odczytaj płytkę na czytniku mikropłytek przy OD600 i przeanalizuj wyniki tablicy szachownicowej.
    1. Najpierw należy sprawdzić tabliczkę dotyczącą czystości i upewnić się, że wyizolowane kolonie mają jedną morfologię, która jest zgodna z oczekiwaną morfologią badanego organizmu.
    2. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, zacienij komórki, aby wskazać wzrost i brak wzrostu, jak w kroku 1.2.4.1.
    3. Określ wartość MIC dla każdego leku. W przypadku leku, który nie hamuje wzrostu bakterii w najwyższym badanym stężeniu, uważa się, że MIC jest poza skalą.
    4. Dla każdej studzienki, w której wzrost jest zahamowany, należy określić frakcyjne stężenie hamujące (FIC) dla każdego antybiotyku w oparciu o wartość MIC tego antybiotyku (patrz rysunek 1B i rysunek 2B).
      nuta: FIC jest stosunkiem stężenia antybiotyku w studzince, w której wzrost jest zahamowany, do jego MIC; tak więc dla leku o MIC 8 μg/ml, studzienka zawierająca 8 μg/ml tego leku ma FIC 1, podczas gdy studzienka zawierająca 4 μg / ml ma FIC 0,5.
    5. Obliczyć wartość wskaźnika frakcji stężenia hamującego (FICI) dla każdej studzienki, w której wzrost jest zahamowany, jako sumę FIC każdego z leków w tym dołku.
    6. Określić najniższą FICI, przy której wzrost jest zahamowany (minimalny FICI). Jeśli minimalny FICI wynosi 0,5 GBP, należy wziąć pod uwagę synergiczną kombinację; jeśli 0,5-4, uznaj kombinację za obojętną; A jeśli >4, rozważ kombinację antagonistyczną. Jeśli kombinacja jest synergistyczna w niektórych kombinacjach stężeń, ale antagonistyczna w innych, należy zwrócić uwagę na ten wynik, ale należy wziąć pod uwagę, że połączenie jest ogólnie antagonistyczne.

2. Testowanie synergii zabijania czasu

  1. Przygotuj podstawowe roztwory przeciwdrobnoustrojowe. Jeśli ten krok zostanie wykonany przed eksperymentem, należy zamrozić bulion w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowy do użycia.
    1. Określ stężenia roztworu podstawowego antybiotyku na podstawie rozpuszczalności antybiotyków i pożądanych stężeń końcowych w badaniach zabijających czas. W tym przykładzie należy przygotować zapasy kolistyny i minocykliny w stężeniu 1 mg/ml. Skorzystaj z dokumentu CLSI M100, aby określić odpowiednie rozpuszczalniki dla każdego antybiotyku25. Używaj wody, zgodnie z zaleceniami, zarówno do kolistyny, jak i minocykliny.
    2. Odważyć antybiotyk w proszku za pomocą wagi analitycznej i obliczyć objętość rozpuszczalnika potrzebną do uzyskania docelowego stężenia podstawowego. W razie potrzeby należy wykonać obliczenia siły działania przed określeniem wymaganej ilości rozpuszczalnika, jak opisano w kroku 1.1.2.1 powyżej.
    3. Wlej antybiotyk w proszku do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i dodaj odpowiednią objętość wody. Wirować aż do rozpuszczenia.
  2. Korzystając z metody ręcznego mikrorozcieńczania bulionu opisanej w CLSI M0726, przeprowadź kontrolę jakości zapasów przeciwdrobnoustrojowych do wykorzystania w eksperymentach z synergią zabijania w czasie. Wykonaj ten krok co najmniej jeden dzień przed testami synergii, aby można było zapoznać się z wynikami kontroli jakości przed użyciem zapasów.
    1. Wybierz odpowiedni szczep QC i określ dopuszczalny zakres MIC dla testowanych leków na podstawie tabeli 5A-1 w CLSI M10025. W przypadku tutejszych leków użyj E. coli ATCC 25922; zakresy MIC dla tego szczepu wynoszą 0,25-1 μg/ml dla minocykliny i 0,25-2 μg/ml dla kolistyny.
    2. Przygotować płytki do mikrorozcieńczania bulionu zawierające antybiotyki.
      1. Wybierz najwyższe stężenie antybiotyku do przetestowania, aby uwzględnić cały zakres kontroli jakości. Użyj zakresu od 0,016 do 8 μg/ml dla minocykliny i kolistyny dla ATCC 25922.
      2. Rozcieńczyć zapasy antybiotyków do roztworu roboczego w CAMHB o dwukrotnie wyższym stężeniu niż najwyższe potrzebne (ponieważ zostanie on rozcieńczony w stosunku 1:1 z zawiesiną bakterii). W tym przykładzie należy rozcieńczyć oba zapasy od 10 mg/ml do 16 μg/ml.
      3. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl każdej z 2 zawiesin antybiotyku do studzienki w pierwszej kolumnie przezroczystej, okrągłodennej, niepoddanej działaniu substancji 96-dołkowej płytki i dodać 50 μl zwykłego bulionu (tj. bez antybiotyku) do każdej studzienki z kolejnych kolumn.
      4. Usunąć 50 μl bulionu zawierającego antybiotyk z każdej studzienki w pierwszej kolumnie i dodać do studzienek w drugiej kolumnie. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać zawartość, uzyskując stężenie antybiotyku o połowę mniejsze niż stężenie w pierwszej kolumnie.
      5. Powtórzyć krok 2.2.2.4 dla każdej kolumny, tak aby przygotować serię seryjnych dwukrotnych rozcieńczeń, każde o objętości 50 μl. W razie potrzeby należy wymieniać końcówki pipet między każdym etapem rozcieńczania, aby wyeliminować możliwość przeniesienia antybiotyku. Należy pamiętać, że wszystkie wynikowe stężenia są nadal 2x stężeniami końcowymi, ponieważ zostaną następnie rozcieńczone 1:1 zawiesiną bakteryjną.
      6. Nie dodawaj żadnego antybiotyku do dwóch ostatnich kolumn, ponieważ będą to kolumny ujemne i kontrolne wzrostu.
    3. Przygotować zawiesinę bakteryjną.
      1. Przygotować 0,5 zawiesiny McFarlanda z płytki na noc E. coli ATCC 25922 w 0,9% chlorku sodu, jak opisano w krokach 1.2.1.5-1.2.1.6.
      2. Rozcieńczyć 0,5 zawiesiny McFarlanda w stosunku 1:150, dodając 50 μl zawiesiny do 7,5 ml CAMHB.
        nuta: Końcowa zawiesina bakteryjna zostanie rozcieńczona w stosunku 1:300 po zmieszaniu 1:1 z roztworem antybiotyku, osiągając zalecaną przez CLSI gęstość komórek 5 x 105 CFU/mL27).
    4. Dodaj bakterie do mikropłytki i inkubuj.
      1. Dodać 50 μl zawiesiny bakteryjnej do każdej studzienki, z wyjątkiem 11. kolumny. Dodać 50 μl CAMHB do 11. kolumny (kolumna kontroli ujemnej).
      2. Inkubować płytkę w temperaturze 35 °C przez 16-20 h.
        nuta: Inny czas inkubacji może być wymagany, jeżeli badane są organizmy inne niż Enterobacteriaceae; skonsultuj się z CLSI M10025, aby uzyskać zalecenia dotyczące konkretnego organizmu.
      3. Odczytaj wizualnie tabliczkę wzrostu za pomocą światła przechodzącego i dla każdego antybiotyku określ najniższe stężenie, w którym nie ma wzrostu; jest to MIC. Zapoznaj się z dokumentem CLSI M07, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat wizualnej interpretacji MIC26. Jeśli wartość MIC mieści się w oczekiwanym zakresie kontroli jakości, roztwór podstawowy jest odpowiedni do użycia.
  3. Rozpocznij początkową kulturę.
    1. Wykonać 0,5 zawiesiny McFarlanda badanego organizmu w sterylnym 0,9% NaCl, jak opisano powyżej.
    2. Dodaj 100 μl 0,5 zawiesiny McFarland do 5 ml CAMHB w szklanej probówce hodowlanej o wymiarach 25 mm x 150 mm z okrągłym dnem z zamknięciem ze stali nierdzewnej i delikatnie wymieszaj.
    3. Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, wyizolować kroplę rozcieńczonej zawiesiny na płytce z agarem z krwią, aby potwierdzić czystość inokulum i inkubować w temperaturze 35 °C w otaczającym powietrzu.
    4. Założyć zamknięcie na probówkę i inkubować w stojaku na probówki na wytrząsarce w temperaturze 35 °C w temperaturze 35 °C w otaczającym powietrzu przez co najmniej 3 godziny, aż do osiągnięcia wzrostu fazy logarytmicznej (patrz krok 2.6.1). Przejdź do kroku 2.4, gdy hodowla znajduje się w inkubatorze.
  4. Przygotuj roztwory przeciwdrobnoustrojowe w szklanych probówkach hodowlanych o wymiarach 25 mm x 150 mm.
    1. Wyjąć podwielokrotności zapasów środków przeciwdrobnoustrojowych z zamrażarki w temperaturze -80 °C do rozmrożenia. Vortex po rozmrożeniu, aby upewnić się, że antybiotyk jest w roztworze.
    2. Podczas inkubacji początkowej hodowli dodaj 10 ml CAMHB do pięciu autoklawowanych szklanych probówek hodowlanych o wymiarach 25 mm x 150 mm i dodaj przeciwdrobnoustrojowe roztwory podstawowe w następujący sposób.
      nuta: W przypadku badania synergii co najmniej jeden lek powinien mieć stężenie, które nie wpływa indywidualnie na krzywą wzrostu28; Można to ustalić, oceniając wpływ stężeń poszczególnych leków przed badaniem synergii.
      1. Tuba 1: Dodaj odpowiednią ilość antybiotyku #1, aby uzyskać docelowe końcowe stężenie antybiotyku. W takim przypadku dodaj 10 μl 1 mg/ml kolistyny podstawowej, aby uzyskać końcowe stężenie kolistyny 1 μg/ml, ponieważ jest to stężenie, które jest nieskuteczne w stosunku do szczepu użytego w tym przykładzie.
      2. Probówka 2: Dodaj odpowiednią ilość antybiotyku #2, aby uzyskać końcowe stężenie antybiotyku do badania. W takim przypadku dodaj 10 μl 1 mg/ml minocykliny, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μg/ml, stężenie, które jest nieskuteczne w przypadku szczepu używanego w tym przykładzie.
      3. Probówka 3: Dodaj taką samą ilość antybiotyku #1 i antybiotyku #2, jak w probówkach 1 i 2. W takim przypadku dodać 10 μl 1 mg/ml zapasu minocykliny i 10 μl 1 mg/ml kolozyny.
      4. Probówka 4: Nie dodawaj antybiotyków, to będzie probówka kontrolująca wzrost.
      5. Rurka 5: Nie dodawaj antybiotyków, to będzie probówka z kontrolą negatywną.
  5. Przygotować 96 głębokich płytek polipropylenowych z 2 ml studzienek do seryjnych rozcieńczeń, dodając 900 μl sterylnego 0,9% chlorku sodu do rzędów B-H kolumn 1-5 za pomocą pipety wielokanałowej.
  6. Przygotować inokulum początkowe i dodać do probówek.
    1. Gdy początkowa hodowla osiągnie logarytmiczną fazę wzrostu (~3 godziny dla Klebsiella pneumoniae, organizmu użytego w tym przykładzie), wyjmij probówkę hodowlaną z shakera, delikatnie przemieszaj, przenieś ~1 ml zawiesiny do szklanej probówki hodowlanej o wymiarach 12 mm x 75 mm i sprawdź gęstość za pomocą czytnika McFarland.
      1. Jeśli jest mniejsza niż 1,0 McFarlanda, włóż rurkę z powrotem do wytrząsarki i inkubuj dłużej. Jeśli jest większa niż 1,0 McFarlanda, dodaj CAMHB do probówki, delikatnie zwiruj i ponownie próbkuj, powtarzając proces, aż zawiesina osiągnie wartość 1,0 McFarlanda.
    2. Dodaj 100 μl zawiesiny 1.0 McFarland do probówek 1-4 i delikatnie wiruj.
  7. Pobrać próbki porcji z każdej kultury i wykonać seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenia.
    1. W czasie 0 (bezpośrednio po dodaniu bakterii do probówek) i po 1, 2, 4, 6 i 24 godzinach należy usunąć 150 μl podwielokrotności z każdej probówki hodowlanej, przechylając probówkę tak, aby tylko sterylna końcówka pipety weszła do probówki, a nie niesterylny trzon pipety podczas pobierania podwielokrotności. Dodać podwielokrotności odpowiednio do kolejnych studzienek w pierwszym rzędzie wcześniej przygotowanej płytki studzienkowej o głębokości 96. Umieścić probówki z powrotem na stojaku na probówki na wytrząsarce w inkubatorze z powietrzem otoczenia o temperaturze 35 °C natychmiast po usunięciu podwielokrotności w każdym punkcie czasowym.
    2. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń 100 μl z rzędu A, dodaj do rzędu B (który zawiera 900 μl 0,9% chlorku sodu) i pipetuj w górę i w dół 4-5 razy, aby wymieszać, tworząc rozcieńczenie 1:10. Wyrzuć końcówki po każdym etapie rozcieńczania, aby zapobiec przenoszeniu bakterii, co może prowadzić do fałszywie zawyżonej liczby kolonii.
    3. Powtórz krok 2.7.2 dla rzędów B-H z nowymi końcówkami do pipet dla każdego rzędu.
  8. Próbki rozcieńczone płytką do zliczania kolonii przy użyciu metody płytki kroplowej29,30.
    1. Oznaczyć płytki agarowe Muellera-Hintona warunkami antybiotykowymi i rozcieńczeniem, które mają być platerowane.
    2. Za pomocą pipety wielokanałowej i bardzo długich końcówek (aby upewnić się, że końcówki sięgają do zawiesiny), usuń 10 μl z każdej studzienki w kolumnie pierwszej i ostrożnie dozuj w rzędzie na odpowiednio oznakowaną płytkę. W przypadku stosowania małych płytek (o średnicy 100 mm) należy dozować 3 rzędy (każdy składający się z kropli z rzędów A-H pojedynczej kolumny) na płytkę; Na dużych (o średnicy 150 mm) płytkach należy dozować 8 rzędów na płytkę.
    3. Pozostaw krople do całkowitego wyschnięcia (~15 min).
    4. Po 24 godzinach umieścić 10 μl kropli pobranej bezpośrednio z probówki kontroli ujemnej we wskazanym obszarze jednej z płytek w celu sprawdzenia sterylności. Odwrócić płytki i inkubować przez noc w temperaturze 35 °C w otaczającym powietrzu.
  9. Policz kolonie i oblicz gęstość komórek. Oznacz kolonie markerem permanentnym z cienką końcówką na odwrocie płytki, aby uniknąć podwójnego liczenia lub brakujących kolonii.
    1. Najpierw należy sprawdzić tabliczkę dotyczącą czystości i upewnić się, że wyizolowane kolonie mają jedną morfologię, która jest zgodna z oczekiwaną morfologią badanego organizmu.
    2. Dla każdej serii rozcieńczeń należy zidentyfikować krople zawierające 3-30 kolonii (zazwyczaj jedna kropla na serię rozcieńczeń). Policz kolonie w tych kroplach i zapisz liczbę wraz ze współczynnikiem rozcieńczenia.
      1. Jeśli w serii rozcieńczeń z 3-30 koloniami nie ma kropli, policz kolonie w ostatniej kropli z >30 koloniami i pierwszą kroplą z <3 koloniami (powinny to być sąsiednie krople).
    3. Dla każdej serii rozcieńczeń obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr (jtk/ml) w próbce na podstawie liczby kolonii w kropli, stosując następujący wzór: jtk/ml = n(1/d)(100) gdzie n jest liczbą kolonii, d jest współczynnikiem rozcieńczenia (1 dla próbki nierozcieńczonej (rząd A), 0,1 lub 10-1 dla pierwszego rozcieńczenia 1:10 (wiersz B), 0,01 lub 10-2 dla drugiego rozcieńczenia 1:10 (wiersz C) i tak dalej, a stała 100 odpowiada za fakt, że całkowita objętość kropli wynosi 10 μl, podczas gdy wartość końcowa jest wyrażona w jtk/ml, tj. jtk/1,000 μl. Aby uprościć ten proces, użyj arkusza kalkulacyjnego zawierającego formuły, które obliczają jtk/ml na podstawie liczby kolonii.
      1. W przypadku serii rozcieńczeń, w których można było policzyć więcej niż jedną kroplę (lub w której trzeba było policzyć dwie krople, ponieważ żadna kropla nie mieściła się w zakresie), należy uśrednić końcowe liczby CFU/ml dla wszystkich policzonych kropli.
      2. Ponieważ dolna granica wykrywalności wynosi 300 CFU/ml (3 kolonie w nierozcieńczonej kropli), zapisz i wykreśl kolonię jako 300 CFU/ml dla serii rozcieńczeń, w której w nierozcieńczonej kropli znajdują się <3 kolonie.
    4. Sprawdzić kroplę kontrolną sterylności od czasu 24; jeśli zaobserwuje się jakikolwiek wzrost w tej kropli, wyniki eksperymentu nie powinny być używane.
  10. Twórz wykresy i analizuj wyniki.
    1. Na tym samym wykresie należy narysować krzywe wzrostu z trzech kultur zawierających antybiotyki i kontrolę wzrostu. Wykreśl czas na osi x i CFU/ml, używając skali logarytmicznej, na osi y.
    2. Obliczyć różnicę w jtk/ml między probówką złożoną w czasie 24 a najbardziej aktywnym pojedynczym czynnikiem w czasie 24. Jeśli różnica wynosi ≥2 log10, rozważ synergiczną kombinację. Następnie obliczyć różnicę w jtk/ml między probówką kombinowaną w czasie 24 i w czasie 0. Jeśli różnica wynosi ≥3 log10, rozważ kombinację bakteriobójczą.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1A przedstawia siatkę z eksperymentu synergicznego z szachownicą, w którym minocyklina w stężeniach 0-32 μg/ml została połączona z kolistyną w stężeniach 0-16 μg/ml i przetestowana przeciwko szczepowi E. coli FDA-CDC 0494. Wartości reprezentują odczyty spektrofotometryczne przy gęstości optycznej 600 nm (OD600). Studzienki o wartościach OD600 poniżej 0,07 (co odpowiada brakowi wzrostu przez oględziny) są zacieniowane na czerwono, podczas gdy studzienki o wartościach OD600 0,07 (co odpowiada wzrostowi przez oględziny) są zacieniowane na zielono. Dla każdego leku minimalne stężenie hamujące (MIC; pogrubione) to najniższe stężenie leku, które hamuje wzrost bakterii. W przypadku minocykliny jest to 32 μg/ml, a dla kolistyny 8 μg/ml. Cieniowanie jest zachowywane w Rysunek 1B, ale wartości w dołkach, w których wzrost jest hamowany, są zastępowane wartościami wskaźnika frakcji stężenia hamującego (FICI). Określa się je w następujący sposób: w każdym dołku wskaźnik frakcji stężenia hamującego (FIC) każdego leku oblicza się, dzieląc stężenie antybiotyku w tym studzience przez MIC leku, a FICI oblicza się przez zsumowanie dwóch FIC. Studnie o wartości FICI wynoszącej 0,5, która jest uważana za granicę synergii, są oznaczone linią przerywaną, a studnia o najniższej wartości FICI (0,094) jest pogrubiona. Ponieważ minimalna wartość FICI mieści się w zakresie synergii, połączenie uznaje się za synergiczne.

Rysunek 2A i Rysunek 2B pokazuje siatki analogiczne do tych w Rysunek 1A i Rysunek 1B, ale w tym przypadku kombinacja nie wykazuje synergii w stosunku do badanego izolatu (izolat K. pneumoniae BIDMC 4), ponieważ minimalna FICI, przy której wzrost jest zahamowany, wynosi 1, co wynosi >0,5.

Rysunek 3 ilustruje odczyty gęstości optycznej z siatki synergii szachownicy, w której wystąpiło kilka pominiętych dołków (izolat kompleksu Enterobacter cloacae BIDMC 27). Studnie pominięte to studnie, w których rozwój bakterii jest zahamowany pomimo obecności wzrostu bakterii w sąsiednich studzienkach o wyższych stężeniach antybiotyku. Zjawisko to, o którym wiadomo, że występuje również w standardowych testach MIC, jest prawdopodobnie spowodowane biologiczną zmiennością w charakterystyce wzrostu bakterii od studni do studni oraz wrażliwością niektórych antybiotyków na niewielkie różnice w inokulum bakteryjnym23,31,32. Jeśli w tablicy szachownicy wystąpiła więcej niż jedna pominięta studnia, odrzucaliśmy wyniki i powtarzaliśmy test.

Rysunek 4 przedstawia przykłady wyników synergii zabijania czasu trzech kombinacji testowanych przeciwko izolatowi K. pneumoniae BIDMC 32. Liczebność kolonii jest oznaczona w skali logarytmicznej na osi y, a czas w godzinach na osi x. Różnica między początkowym stężeniem inokulum w probówce zawierającej kombinację leków a stężeniem bakterii w tej probówce po 24 godzinach jest zilustrowana czerwoną kreską i liczbą, podczas gdy różnica między stężeniem bakterii w ciągu 24 godzin między probówką zawierającą kombinację a probówką zawierającą najbardziej aktywny pojedynczy czynnik jest zilustrowana niebieskim paskiem i liczbą. Rysunek 4A pokazuje wyniki połączenia kolistyny i minocykliny; ta kombinacja była synergistyczna (różnica między stężeniami bakterii narażonych na połączenie a samą większością substancji czynnej ≥2 log10 CFU/ml po 24 godzinach) i bakteriobójcza (spadek od początkowego inokulum do stężenia po 24 godzinach ≥3 log10 CFU/ml). Rysunek 4B pokazuje wyniki kombinacji kolistyny i klindamycyny, kombinacji, która była synergistyczna, ale nie była bakteriobójcza. Ta kombinacja hamowała wzrost bakterii, czego żaden lek nie robił sam, ale nie zabijał ich. Rysunek 4C pokazuje wyniki połączenia kolistyny i erytromycyny, które nie było ani bakteriobójcze, ani synergiczne.

figure-results-1
Rycina 1: Wyniki w szachownicę wykazujące synergię (minocyklina + kolistyna testowane przeciwko szczepowi E. coli FDA-CDC 0494). (A) Odczyt spektrofotometryczny i interpretacja wzrostu szachownicy szachownicy. Wartości w komórkach są odczytami gęstości optycznej przy 600 nm (OD600). Komórki o wartościach OD600 poniżej 0,07 (odpowiadających brakowi wzrostu przy kontroli wzrokowej) są zacieniowane na czerwono, podczas gdy komórki o wartościach OD600 0,07 (odpowiadających wzrostowi przy kontroli wzrokowej) są zacieniowane na zielono. (B) Obliczanie wskaźnika frakcji stężenia hamującego (FICI). Cieniowanie wskazujące na wzrost lub brak wzrostu zostało zachowane. Wartości kolistyny i minocykliny odpowiednio wzdłuż osi x i y reprezentują teraz frakcyjne stężenie hamujące (FIC), czyli stosunek stężenia leku w tej kolumnie lub wierszu do minimalnego stężenia hamującego (MIC) samego leku. Wartość w każdej komórce to FICI, czyli suma FIC dwóch leków w tym dołku. Duże pudełko z łamaną linią otacza studnie o FICI równym 0,5. Komórka z grubym brzegiem wskazuje studzienkę o najniższym FICI, w którym wzrost jest zahamowany, lub minimalną FICI. Ponieważ minimalny FICI wynosi 0,5, połączenie jest uważane za synergiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Wyniki w szachownicy kombinacji, która nie wykazuje synergii (minocyklina + kolistyna testowana przeciwko izolatowi K. pneumoniae BIDMC 4). (A) Wartości gęstości optycznej przy 600 nm i interpretacja wzrostu wyników tablicy szachownicy zgodnie z opisem dla Rysunek 1A. (B) Obliczanie wskaźnika frakcji stężenia hamującego (FICI) zgodnie z opisem dla Rysunek 1A. Ponieważ minimalny FICI wynosi >0,5, połączenie nie jest uważane za synergiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Wyniki w szachownicę, które są nieinterpretowalne z powodu pominiętych studzienek (minocyklina + kolistyna testowane przeciwko izolatowi kompleksu Enterobacter cloacae BIDMC 27). Wartości gęstości optycznej przy długości fali 600 nm i interpretacja wzrostu wyników tablicy szachownicy zgodnie z opisem dla Rysunek 1A. Wykazano kilka pominiętych studzienek, w których rozwój bakterii jest zahamowany pomimo obecności wzrostu w sąsiednich studzienkach o wyższych stężeniach antybiotyku. Wyniki nie są interpretowalne i eksperyment należy powtórzyć. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Wyniki synergii zabijania w czasie trzech kombinacji testowanych przeciwko izolatowi K. pneumoniae BIDMC 32. Liczebność kolonii jest oznaczona w skali logarytmicznej na osi y, a czas w godzinach na osi x. Różnica między stężeniem bakterii w połączeniu po 24 godzinach a początkowym inokulum w probówce jest zilustrowana czerwonym paskiem i liczbą. Jeśli spadek od początkowego inokulum do stężenia po 24 godzinach wynosi ≥3 log10 jtk/ml, połączenie uważa się za bakteriobójcze. Różnica między stężeniem bakterii w ciągu 24 godzin między probówką zawierającą mieszaninę a probówką zawierającą sam najbardziej aktywny pojedynczy czynnik jest zilustrowana niebieskim paskiem i liczbą; jeśli występuje redukcja ≥2 log10 jtk/ml, połączenie uważa się za synergiczne. (A) Kolistyna (CST) + minocyklina (MIN), połączenie, które jest zarówno synergiczne, jak i bakteriobójcze. (B) Kolistyna + klindamycyna (CLI), połączenie, które jest synergistyczne, ale nie bakteriobójcze. (C) Kolistyna + erytromycyna (ERY), połączenie, które nie jest ani synergiczne, ani bakteriobójcze. Wyniki te zostały początkowo opublikowane w ramach badania synergistycznego działania kombinacji zawierających kolistynę przeciwko opornym na kolistynę Enterobacteriaceae, w którym wykazaliśmy, że kolistyna była synergistyczna z wieloma antybiotykami, które są aktywne tylko indywidualnie (np. klindamycyna) lub głównie (np. erytromycyna) przeciwko bakteriom Gram-dodatnim16. (Zauważ, że erytromycyna była synergistyczna w szachownicę przeciwko pokazanemu szczepowi, ale nie zabijała czas, więc została wybrana tutaj jako przykład kombinacji niesynergicznej.) Postawiliśmy hipotezę, że kolistyna, o której wiadomo, że działa poprzez przenikanie zewnętrznej błony Gram-ujemnej, wywiera subhamujący wpływ przepuszczalny na bakterie Gram-ujemne oporne na kolistynę, umożliwiając wnikanie leków, takich jak klindamycyna, które normalnie nie mogą dostać się do komórki Gram-ujemnej. Panel (A) tego rysunku został zmodyfikowany z Brennan-Krohn, Pironti, and Kirby 201816, copyright © American Society for Microbiology, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obie opisane tutaj metody dostarczają informacji na temat aktywności środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w połączeniu w porównaniu z ich indywidualną aktywnością. Zautomatyzowana, wspomagana drukarką atramentową metoda dozowania cyfrowego jest adaptacją metody opisanej w Podręczniku procedur mikrobiologii klinicznej33, podczas gdy metoda zabijania czasu jest bardziej zbliżona do odpowiedniego protokołu z tego samego odniesienia34.

W metodzie szachownicy obliczenia mające na celu określenie niezbędnej objętości materiału przeciwdrobnoustrojowego do dodania do każdej studzienki, a także dozowanie tych objętości są zautomatyzowane, eliminując w ten sposób niektóre z głównych potencjalnych źródeł błędów napotkanych w ręcznym układzie szachownicy. Nadal jednak ważne jest, aby badacz ustalił, czy pierwotne zapasy są wytwarzane przy zamierzonym stężeniu i czy docelowe stężenia końcowe są prawidłowo wprowadzane do oprogramowania D300. Dodawanie zawiesiny przeciwdrobnoustrojowej do studzienek w płytce 384-dołkowej może być na początku trudne i wymaga ostrożności, aby końcówki pipet dostały się do odpowiednich studzienek i aby ciecz nie rozpryskiwała się po krawędziach studzienek. Zautomatyzowana maszyna do obsługi cieczy może być używana zamiast ręcznej pipety wielokanałowej, aby zwiększyć szybkość i dokładność, z jaką zawiesina bakteryjna jest dodawana do studzienek. Jak opisano w protokole, D300 wymaga dodania środka powierzchniowo czynnego, polisorbatu 20 (P-20), w celu prawidłowego obchodzenia się z cieczą. Zauważono, że inny środek powierzchniowo czynny, polisorbat 80, w stężeniu 0,002%, obniża wartości MIC kolistyny dla organizmów z MIC kolistyny wynoszącymi <2 μg/ml w standardowych testach mikrorozcieńczenia bulionu. 35,36 Nasze laboratorium wykazało wcześniej, że P-20 w stężeniach do 0,0015% nie miał wpływu na wyniki MIC wspomagane D300 w porównaniu z referencyjnym BMD14. W przedstawionym tutaj przykładzie testu maksymalne stężenie P-20 wynosi 0,0014%.

Jednym z problemów, które napotkaliśmy przy niektórych testach w szachownicę, była duża liczba pominiętych studzienek. Zdarzało się to w nieproporcjonalnie częstym przypadku niektórych antybiotyków. W szczególności, w badaniu przesiewowym kombinacji przeciwko kolekcji opornych na karbapenemy Enterobacteriaceae, stwierdziliśmy, że podczas gdy 49 z 521 badań (9,4%) było bezużytecznych z powodu wielu pominiętych studzienek, 2 z 12 testowanych antybiotyków (fosfomycyna i cefepim) stanowiły 46 z tych badań (94%). Takie zwiększone wskaźniki mogą być bardziej prawdopodobne w przypadku leków, które są szczególnie podatne na efekt inokulum 31,32,37. Warto zauważyć, że CLSI nie zaleca testowania fosfomycyny w rozcieńczeniu bulionu25 ze względu na obawy o wiarygodność wyników tą metodą, co może wyjaśniać niewiarygodne wyniki obserwowane w przypadku tego leku. Niektóre modyfikacje mogą być wprowadzone do automatycznej metody szachownicy zgodnie z preferencjami badacza. Środki przeciwdrobnoustrojowe mogą być dozowane do płytek już zawierających zawiesinę bakteryjną, a nie do pustych studzienek, jeśli jest to preferowane ze względu na przebieg pracy w laboratorium. Podczas gdy zastosowano tutaj płytki 384-dołkowe, metoda może być również przeprowadzana w testach płytkowych 96-dołkowych z odpowiednią modyfikacją objętości dołka. Zastosowanie formatu płytki 96-dołkowej może pomóc w zmniejszeniu liczby pominiętych dołków w przypadku antybiotyków, które są szczególnie wrażliwe na niewielkie zmiany w inokulum. Przy obliczaniu FICI mogą wystąpić sytuacje, w których wartość MIC jest poza skalą (tj. wyższa niż badana), w tym sytuacje, w których badany lek nie wykazuje indywidualnej aktywności w stosunku do badanego typu organizmu. W takich przypadkach FIC można obliczyć na podstawie założenia, że wartość MIC jest o jedno rozcieńczenie wyższa niż najwyższe badane stężenie. Jest to najbardziej konserwatywna strategia, ponieważ zakłada maksymalną możliwą wartość FIC dla każdego rozcieńczenia, w którym zaobserwowano zahamowanie podczas badania synergii. Na przykład, jeśli rzeczywisty MIC byłby zamiast tego dwoma podwojeniami rozcieńczeń powyżej najwyższego badanego stężenia, to odpowiadające im FIC byłyby dwa razy niższe niż konserwatywne przypisania i tak dalej.

Aby dokładnie ocenić działanie bakteriobójcze leków w teście zabijania w czasie, konieczne jest, aby hodowle znajdowały się we wzroście w fazie logarytmicznej, szczególnie gdy testowane są aktywne antybiotyki w ścianie komórkowej28. W przypadku szybko rosnących bakterii użytych w tym przykładzie (K. pneumoniae) 3 godziny inkubacji z wytrząsaniem były odpowiednie, aby osiągnąć tę fazę wzrostu, ale dla różnych organizmów może być konieczne różne czasy. Ogólnie rzecz biorąc, kultura powinna być widocznie, ale nie mocno mętna. Odpowiednią ilość czasu można określić, konstruując krzywą wzrostu z liczbą kolonii pobieraną w kolejnych punktach czasowych (np. co 30 minut przez 4-6 godzin)38. Ważne jest również zamierzone inokulum wyjściowe w badaniu zabijającym czas. Docelowe stężenie inokulum wyjściowego wynosi około 5 x 105 do 1 x 106 jtk/ml. Opisane tutaj rozcieńczenie (100 μl zawiesiny 1,0 McFarlanda w 10 ml pożywki) generuje to inokulum dla Klebsiella pneumoniae i innych gatunków Enterobacteriaceae , na których je testowaliśmy. Jeśli gęstość wyjściowej inokuli w eksperymencie z użyciem różnych organizmów jest znacznie wyższa lub niższa, może być potrzebne inne rozcieńczenie. (Odpowiednie rozcieńczenie wymagane dla danego gatunku można określić, wykonując liczenie na płytce 0,5 lub 1,0 zawiesiny McFarlanda w celu określenia, ile organizmów reprezentuje to zmętnienie, a następnie obliczając ilość, o jaką początkowa zawiesina musi zostać rozcieńczona, aby osiągnąć odpowiednie stężenie końcowe). Jeżeli, po przeglądzie liczby bakterii z badania synergii, okaże się, że inokulum wyjściowe którejkolwiek z probówek zawierających antybiotyk było znacznie niższe niż inokulum wyjściowe grupy kontrolnej wzrostu, może to wskazywać albo na przeniesienie antybiotyku, albo na bardzo szybkie zabicie bakterii w krótkim czasie między dodaniem bakterii do probówki zawierającej antybiotyk a usunięciem podwielokrotności do posiewu. Jeśli rzeczywista liczba kolonii w nierozcieńczonym spadku w serii jest mniejsza niż liczba kolonii w kolejnych rozcieńczeniach, sugeruje to efekt przeniesienia antybiotyku. Opisano różne opcje zapobiegania temu efektowi, w tym rozprowadzenie pojedynczej podwielokrotności na całej płytce38 lub odwirowanie próbki, usunięcie supernatantu i ponowne zawieszenie w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przed posiewem39. W każdym punkcie czasowym metody zabijania czasu ważne jest również, aby badacz skutecznie, ale dokładnie usunął podwielokrotność z każdej probówki hodowlanej i przeprowadził seryjne rozcieńczenia. Opóźnienia podczas tego procesu, szczególnie we wczesnych punktach czasowych, które występują w krótkich odstępach czasu, mogą prowadzić do długich okresów, podczas których kultury nie są inkubowane i wstrząsane, podczas gdy nieostrożne dozowanie i seryjne rozcieńczanie mogą prowadzić do niedokładnego liczenia płytek. W porównaniu z metodą liczenia płytek rozprowadzających, w której 100 μl każdego rozcieńczenia rozprowadza się na całej płytce agarowej, opisana metoda płytek wkroplowych jest znacznie szybsza, wymaga znacznie mniejszej liczby płytek agarowych i pozwala na szybsze liczenie, ponieważ maksymalna policzalna liczba kolonii dla każdej kropli wynosi 30, podczas gdy z płytki rozsiewającej można zwykle policzyć do 300 kolonii. Jednak metoda płytki rozsiewającej jest również opcją, jeśli badacze czują się bardziej komfortowo z tą techniką. Jeśli krople rozlają się na siebie po rezygnacji z pipety wielokanałowej, można zamiast tego wykonać indywidualne nałożenie bardziej rozstawionych kropli za pomocą pipety jednokanałowej. Z naszego doświadczenia wynika, że płyty chłodzące w temperaturze 4 °C przed dozowaniem kropli wydawały się zmniejszać nadmierne rozprowadzanie.

Jednym z ograniczeń opisanych tutaj technik jest to, że wyniki dwóch typów testów synergii (szachownica i zabijanie czasu) nie zawsze są zgodne, a ponieważ większość opublikowanych artykułów dotyczących synergii wykorzystuje jedną lub drugą metodę, a nie obie razem, może być trudno wiedzieć, jak zintegrować dane z tych dwóch typów testów. Ponieważ opracowana przez nas zautomatyzowana metoda szachownicy jest prosta i wysokoprzepustowa, wykorzystaliśmy ją jako rodzaj ekranu do testowania kombinacji w stosunku do większej liczby izolatów i określenia, które kombinacje stężeń są synergiczne. Następnie przeprowadziliśmy mniejszą liczbę badań zabijających czas, wybierając kombinacje i stężenia, które były skuteczne w układzie szachownicy. Warto zauważyć, że ponieważ test szachownicy jest zwykle wykonywany na skali rozcieńczania mikrobulionu, podczas gdy test zabijania w czasie wykorzystuje większe objętości (podobnie jak rozcieńczanie makrobulionu), stwierdziliśmy, że FIC czasami różniły się między tymi dwiema metodami, przy czym wyższe stężenia są zwykle wymagane w teście zabijania w czasie, aby wykazać aktywność. Zjawisko to zostało zaobserwowane wcześniej, gdy porównano wyniki testu MIC rozcieńczania makrobulionu i mikrobulionu dla pałeczek Gram-ujemnych26 i gdy większe inokulum (stosowane w badaniach zabijania w czasie) porównano ze standardowym inokulum stosowanym w rozcieńczaniu mikrobulionu i testach szachownicy32. Szczególnym ograniczeniem szachownicy jest nieodłączna zmienność w badaniu MIC rozcieńczenia mikrobulionu22. Podczas gdy odcięcia FICI dla synergii matematycznie odpowiadają za tę zmienność6 , taka zmienność nieuchronnie budzi obawy o niezawodność i spójność wyników tablicy szachownicowej.

Ze względu na ograniczenia nieodłącznie związane ze wszystkimi metodami badań synergii in vitro (w tym hodowla bakterii w sztucznej pożywce wzrostowej, statyczne stężenia antybiotyków i ograniczony przebieg w czasie), wyniki uzyskane tymi metodami muszą zostać potwierdzone i poddane dalszej ocenie przy użyciu technik uzupełniających. Metody te obejmują badania farmakokinetyczne/farmakodynamiczne (PK/PD) in vitro (np. model zakażenia pustymi włóknami40), modele zwierzęce i ostatecznie badania farmakokinetyki/PD u ludzi i ich skuteczności. Opisana tutaj zautomatyzowana metoda szyku szachownicy, dostarczając szybką metodę przesiewania kombinacji pod kątem potencjalnej synergicznej aktywności, pozwala na bardziej ukierunkowane wykorzystanie tych technik. Dalsza automatyzacja wszystkich tych metod, a także bardziej systematyczne badanie związku między parametrami in vitro a wynikami klinicznymi, będą miały istotne znaczenie dla zwiększenia skali wykorzystania testów synergicznych i zwiększenia ich zastosowania klinicznego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dozownik cyfrowy D300 i związane z nim materiały eksploatacyjne zostały dostarczone przez firmę Tecan (Morrisville, Karolina Północna). Tecan nie odgrywał żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu/interpretacji danych, przygotowywaniu manuskryptu ani podejmowaniu decyzji o publikacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Thea Brennan-Krohn była wspierana przez grant szkoleniowy Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development w zakresie pediatrycznych chorób zakaźnych (T32HD055148), grant szkoleniowy National Institute of Allergy and Infectious Diseases (T32AI007061), stypendium Biura Rozwoju Wydziału Faculty Leadership Fellowship oraz nagrodę Rozwoju Kariery Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (1K08AI132716). J.E.K. był wspierany przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody o numerze R33 AI119114. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Escherichia coli szczep ATCC 25922ATCC25922QC szczep
0,5 ml mikroprobówki wirówkoweUSA Scientific1605-0000
1 L 0,22 i mikro; m filtr butelkowyThermo Scientific Nalgene597-4520
12 mm x 75 mm probówki hodowlane z okrągłym dnem ze szkła borokrzemianowegoFisherbrand14-961-26
Probówki stożkowe 15 mlPhenixSS-PH15
15 x 100 mm lub 15 x 150 mm Płytki agarowe Mueller HintonThermo ScientificR01620 lub R04050
Zamknięcia ze stali nierdzewnej 25 mm do kultury szkła 25 x 150 mm probówkiBellco2005-02512
25 x 150 mm probówki hodowlane z okrągłym dnem ze szkła borokrzemianowegoBellco2011-25150
348-dołkowe sterylne przezroczyste, płaskodenne, nieobrobione mikropłytki z pokrywkamiGreiner Bio-One781186
50 ml probówki stożkowePhenixSS-PH50
50 ml sterylne zbiorniki na odczynnikiCorning4870
96-dołkowa mikropłytka polipropylenowa z 2 ml dołkamiFisherbrand12-566-612
96-dołkowe sterylne, przezroczyste, okrągłodenne, nieobrobione mikropłytki z pokrywkamiEvergreen222-8032-01R
Regulowany kationowo bulion Mueller HintonBD Diagnostyka212322
Siarczan kolistynyOprogramowanie sterujące Alfa AesarJ60915
D300eHP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland czytnikbioMé rieux21250
Arkusz kalkulacyjny ExcelMicrosoft
Extra long SHARP 10 i micro; L Precyzyjne końcówki barieroweDenville ScientificP1096-FR
Dozownik cyfrowy HP D300HP/Tecan
Kasety HP D300 T8+HP/Tecan30097370
Chlorowodorek minocyklinyChem-Impex14302
Picus 12-kanałowy 10-300 i mikro; Pipeta LSartorius735461
Polisorbat 20Odczynniki FisherBP-337Nazwa handlowa: Tween 20
Chlorek soduFisher ChemicalS271
SpektrofotometrTecanInfinite M1000 PRO
Xplorer 12-kanałowy 50-1200 µ Pipeta LEppendorf2231000328

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management. Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).
  2. Spellberg, B. The future of antibiotics. Critical Care. 18 (3), (2014).
  3. Spellberg, B., et al. The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).
  4. Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).
  5. Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).
  6. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).
  7. Zusman, O., et al. Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).
  8. Clock, S. A., et al. In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).
  9. Hirsch, E. B., et al. Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae. Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).
  10. Tängdén, T., et al. Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).
  11. Tascini, C., et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).
  12. Paul, M., et al. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).
  13. Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).
  14. Smith, K. P., Kirby, J. E. Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).
  15. Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology. J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).
  16. Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  17. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections. Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).
  18. Nation, R. L., Li, J. Colistin in the 21st century. Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).
  19. Ah, Y. -M., Kim, A. -J., Lee, J. -Y. Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae. International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).
  20. Bratu, S., et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).
  21. Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).
  22. MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing. Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).
  23. Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance. Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).
  24. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  25. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  26. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).
  27. Clinical and Laboratory Standards Institute. M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  28. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. 7(1999).
  29. Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests. Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).
  30. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  31. Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology. Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).
  32. Smith, K. P., Kirby, J. E. The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  33. Leber, A. L. Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.16.1-5.16.23 (2016).
  34. Leber, A. L. Time-Kill Assay for Determining Synergy. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.14.3.1-5.14.3.6 (2016).
  35. Hindler, J. A., Humphries, R. M. Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).
  36. Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls. Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810(2014).
  37. Fuchs, P. C., Barry, aL., Brown, S. D. Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine. European journal of clinical microbiology & infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).
  38. Leber, A. L. Minimum Bactericidal Concentration Testing. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , 5.14.1.11 (2016).
  39. Cai, Y., et al. In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).
  40. Bulman, Z. P., et al. Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era. mBio. 8 (4), (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda szachownicytechnologia drukarek atramentowychzautomatyzowany test przesiewowyminimalne st enie hamuj cefrakcyjne st enie hamuj cehamowanie wzrostu bakteriiterapia skojarzona lekamipatogeny wielolekooporne

Powiązane artykuły