Artykuł metodologiczny

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

DOI:

10.3791/58644

⸱

24 października 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Michigan State University, 2Department of BioHealth Informatics, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 3Center for Computational Biology and Bioinformatics, Indiana University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowy protokół jest opisany do separacji, identyfikacji i charakterystyki proteoform w próbkach białek za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej-elektrorozpylania jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (CZE-ESI-MS/MS). Protokół może być wykorzystany do charakterystyki proteoform w prostych próbkach białkowych w wysokiej rozdzielczości oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas w strefie kapilarnej-jonizacja elektronatryskowa (CZE-ESI-MS/MS) została uznana za użyteczne narzędzie do proteomiki odgórnej, która ma na celu scharakteryzowanie proteoform w złożonych proteomach. Jednak zastosowanie CZE-MS/MS w proteomice odgórnej na dużą skalę było utrudnione ze względu na niską zdolność ładowania próbek i wąskie okno separacji CZE. W tym miejscu opisano protokół wykorzystujący CZE-MS/MS z objętością próbki w skali mikrolitrów i 90-minutowym oknem separacji dla proteomiki na dużą skalę od góry do dołu. Platforma CZE-MS/MS opiera się na liniowej kapilarze separacyjnej pokrytej poliakrylamidem (LPA) o wyjątkowo niskim przepływie elektroosmotycznym, dynamicznej metodzie zatężania próbki online opartej na złączu pH o wysokiej wydajności układania białek, elektrokinetycznie pompowanym interfejsie CE-MS z przepływem w osłonie o wyjątkowo wysokiej czułości oraz spektrometrze masowym z pułapką jonową o wysokiej rozdzielczości masy i prędkości skanowania. Platforma może być wykorzystywana do charakteryzowania w wysokiej rozdzielczości prostych, nienaruszonych próbek białek oraz do charakteryzowania na dużą skalę proteoform w różnych złożonych proteomach. Jako przykład pokazano wysoce wydajną separację standardowej mieszaniny białkowej i bardzo czułe wykrywanie wielu zanieczyszczeń za pomocą platformy. Innym przykładem jest to, że platforma ta może wyprodukować ponad 500 proteoform i 190 identyfikacji białek z proteomu Escherichia coli w jednym cyklu CZE-MS/MS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomika odgórna (TDP) ma na celu scharakteryzowanie proteoform w proteomie na dużą skalę. TDP opiera się na efektywnym rozdzielaniu nienaruszonych białek w fazie ciekłej przed analizą ESI-MS/MS (ESI-MS/MS) za pomocą efektywnej separacji faz ciekłych i fazy ciekłej przed analizą metodą tandemowej spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylaną (ESI-MS/MS) ze względu na wysoką złożoność i duży zakres dynamiki stężeń proteomu<><>="xref"<> < sup class="xref">5. Elektroforeza w strefie kapilarnej (CZE) jest potężną techniką rozdzielania biomolekuł na podstawie ich stosunku wielkości do ładunku6. CZE jest stosunkowo proste, wymaga jedynie otwartej kapilary krzemionkowej z rurką, elektrolitu tła (BGE) i zasilacza. Próbka nienaruszonych białek może zostać załadowana do kapilary za pomocą ciśnienia lub napięcia, a separacja jest inicjowana przez zanurzenie obu końców kapilary w BGE i przyłożenie wysokiego napięcia. CZE może zbliżyć się do ultra-wysokiej wydajności separacji (> miliona teoretycznych płytek) do separacji biomolekuł7. CZE-MS ma znacznie wyższą czułość niż powszechnie stosowana chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (RPLC)-MS do analizy nienaruszonych białek8. Chociaż CZE-MS ma ogromny potencjał w zakresie proteomiki odgórnej na dużą skalę, jej szerokie zastosowanie w proteomice zostało utrudnione przez kilka problemów, w tym niską zdolność ładowania próbek i wąskie okno separacji. Typowa objętość obciążenia próbki w CZE wynosi około 1% całkowitej objętości kapilarnej, co zwykle odpowiada mniej niż 100 nL9,10,11. Okno separacji CZE jest zwykle krótsze niż 30 minut ze względu na silny przepływ elektroosmotyczny (EOF)9,10. Zagadnienia te ograniczają CZE-MS/MS do identyfikacji dużej liczby proteoform i mało obfitych proteoform ze złożonego proteomu.

Wiele wysiłku włożono w poprawę objętości ładowania próbki CZE za pomocą metod koncentracji próbek online (np. mikroekstrakcja w fazie stałej [SPME]12,13, układanie próbek w terenie [FESS]9,11,14 i dynamiczne połączenie pH15,16,17,18). FESS i dynamiczne złącze pH są prostsze niż SPME, wymagają jedynie znacznej różnicy między buforem próbki a BGE pod względem przewodności i pH. FESS wykorzystuje bufor próbki o znacznie niższej przewodności niż BGE, co prowadzi do układania analitów na granicy między strefą próbki a strefą BGE w kapilarze. Dynamiczne złącze pH wykorzystuje zasadową zatyczkę próbki (np. 50 mM wodorowęglanu amonu, pH 8) i kwaśny BGE (np. 5% [v/v] kwas octowy, pH 2,4) po obu stronach korka próbki. Po przyłożeniu wysokiego napięcia dodatniego na końcu iniekcji kapilary, następuje miareczkowanie korka próbki podstawowej, skupiając anality w szczelnym korku przed poddaniem ich separacji CZE. Ostatnio grupa Sun systematycznie porównywała FESS i dynamiczne połączenie pH dla układania w stos online nienaruszonych białek, wykazując, że dynamiczne połączenie pH może zapewnić znacznie lepszą wydajność niż FESS dla stężenia online nienaruszonych białek, gdy objętość wstrzyknięcia próbki wynosiła 25% całkowitej objętości kapilary19.

Neutralnie powlekane kapilary separacyjne (np. liniowy poliakrylamid [LPA]) zostały zastosowane w celu zmniejszenia EOF w kapilarze, spowalniając separację CZE i poszerzając okno separacji20,21. Niedawno grupa Dovichi opracowała prostą procedurę przygotowania stabilnej powłoki LPA na wewnętrznej ścianie naczyń włosowatych, wykorzystując nadsiarczan amonu (APS) jako inicjator i temperaturę (50 °C) do produkcji wolnych rodników i polimeryzacji22. Całkiem niedawno grupa Sun zastosowała kapilarnę separacyjną pokrytą LPA i metodę dynamicznego połączenia pH do separacji CZE nienaruszonych białek, osiągając objętość ładowania próbki w skali mikrolitrów i 90-minutowe okno separacji19. Ten system CZE otwiera drzwi do wykorzystania CZE-MS/MS w proteomice odgórnej na dużą skalę.

CZE-MS wymaga bardzo solidnego i czułego interfejsu do połączenia CZE z MS. Trzy interfejsy CE-MS zostały dobrze rozwinięte i skomercjalizowane w historii CE-MS, a są to współosiowy interfejs przepływu osłony23, interfejs bez osłony wykorzystujący porowatą końcówkę jako emiter ESI24, oraz elektrokinetycznie pompowany interfejs przepływu płaszcza25,26. Pompowany elektrokinetycznie interfejs przepływu osłonki CZE-MS/MS osiągnął niską granicę wykrywalności peptydów zeptomole9, ponad 10 000 identyfikacji peptydów (ID) z proteomu komórkowego HeLa w jednym przebiegu14, szybka charakterystyka nienaruszonych białek11, oraz wysoce stabilne i powtarzalne analizy biomolekuł26. Ostatnio kapilara separacyjna pokryta LPA, metoda dynamicznego połączenia pH i elektrokinetycznie pompowany interfejs przepływu osłonki zostały wykorzystane do proteomiki na dużą skalę proteEscherichia coli (E. coli) proteomu Escherichia coli (E. coli) class="xref">19,27. Platforma CZE-MS/MS zbliżyła się do ponad 500 identyfikatorów proteoform w jednym przebiegu19 i prawie 6 000 identyfikatorów proteoform poprzez sprzężenie z chromatografią wykluczania wielkości (SEC)-frakcjonowanie RPLC27. Wyniki wyraźnie wskazują na możliwości CZE-MS/MS w proteomice odgórnej na dużą skalę.

Tutaj opisana jest szczegółowa procedura użycia CZE-MS/MS do proteomiki na dużą skalę z góry na dół. System CZE-MS/MS wykorzystuje kapilarnę pokrytą LPA w celu redukcji EOF w kapilarze, metodę dynamicznego połączenia pH do koncentracji białek w trybie online, elektrokinetycznie pompowany interfejs przepływu osłonki do sprzężenia CZE z MS, spektrometr masowy orbitrap do zbierania widm białek MS i MS/MS oraz oprogramowanie TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform Identification and Characterization) do identyfikacji proteoform poprzez wyszukiwanie w bazie danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie powłoki LPA na wewnętrznej ścianie kapilary separacyjnej

  1. Wstępna obróbka naczyń włosowatych
    1. Przepłukać kapilarę ze stopionej krzemionki (120 cm długości, 50 μm średnicy wewnętrznej [id], 360 μm średnicy zewnętrznej [o.d.]) kolejno 500 μl 1 M wodorotlenku sodu, wody dejonizowanej, 1 M kwasu solnego, wody dejonizowanej i metanolu klasy LC-MS za pomocą pompy strzykawkowej.
    2. Osuszyć kapilarę gazowym azotem (10 psi, ≥ 12 godzin) i napełnić kapilarę 50% (v/v) metakrylanem 3-(trimetoksysililo)propylu w metanolu za pomocą pompy strzykawkowej. Uszczelnić oba końce kapilary kauczukiem krzemionkowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny
      UWAGA: Na tym etapie wewnętrzna ściana kapilary jest funkcjonalizowana za pomocą C=C. Dłuższa inkubacja skutkuje lepszym pokryciem kapilar dzięki bardziej kompletnej reakcji.
    3. Odetnij niewielką część (~5 mm) kapilary z obu końców za pomocą kamienia do rozłupywania. Przepłukać kapilarę metanolem (500 μl) za pomocą pompy strzykawkowej w celu oczyszczenia nieprzereagowanych odczynników. Osuszyć kapilarę gazowym azotem (10 psi, ≥12 h).
  2. Przygotowanie powłoki LPA
    UWAGA: Ta procedura jest oparta na Zhu i wsp.22 z niewielkimi modyfikacjami.
    1. Przygotować roztwór akrylamidu (40 mg akrylamidu w 1 ml wody) i roztwór nadsiarczanu amonu (APS) (5% [w/v] w wodzie).
    2. Dodać 2 - 3 μl roztworu APS do 500 μl roztworu akryloamidu, odwirować mieszaninę i odgazować ją azotem gazowym przez 5 minut w celu usunięcia tlenu z roztworu.
    3. Załadować mieszaninę do wstępnie przygotowanej kapilary za pomocą próżni, uszczelnić oba końce kapilary gumą krzemionkową i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 50 °C przez 40 minut.
    4. Usuń niewielką część (~5 mm) kapilary z obu końców za pomocą kamienia rozłupującego. Wypchnąć nieprzereagowany roztwór z kapilary wodą (200 μl) za pomocą pompki strzykawkowej.
      UWAGA: Upewnij się, że polimer wypchnięty z kapilary ma konsystencję przypominającą żel agarozowy. Dłuższy etap inkubacji (do ~45 - 50 min) może skutkować lepszą powłoką kapilarną. Przy dłuższych okresach reakcji kapilara może zostać zablokowana i do wypchnięcia polimeru z wodą wymagane jest wysokie ciśnienie. W tym celu można użyć pompy HPLC.

2. Wytrawianie kapilary kwasem fluorowodorowym

UWAGA: Stosuj odpowiednie procedury bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z roztworami kwasu fluorowodorowego (HF). Wszystkie operacje związane z HF muszą być wykonywane w okapie chemicznym. Przed jakąkolwiek operacją związaną z HF upewnij się, że 2.5% żel glukonianu wapnia jest dostępny do użycia w przypadku narażenia. Wymagane są podwójne rękawice, typowa rękawica nitrylowa wewnątrz i ciężka rękawica neoprenowa na zewnątrz. Nosić fartuch laboratoryjny i okulary ochrony przeciwchemicznej. Po operacjach HF należy przechowywać płynne i stałe odpady niebezpieczne oddzielnie. Ciekłe odpady HF muszą być natychmiast zneutralizowane roztworem wodorotlenku sodu o wysokim stężeniu w celu czasowego składowania przed odbiorem odpadów. Stałe odpady HF muszą być tymczasowo przechowywane w plastikowym pojemniku wyłożonym dwoma grubymi plastikowymi workami Ziploc o pojemności jednego galona i pokrywką. Zarówno odpady stałe, jak i płynne muszą być odpowiednio oznakowane.

  1. Spal część kapilary za pomocą delikatnego płomienia (np. zapalniczki kieszonkowej), aby usunąć zewnętrzną powłokę poliimidową (o długości 1 cm) w odległości około 4 cm od jednego końca kapilary. Delikatnie oczyść spaloną część kapilary, wycierając, aby całkowicie usunąć powłokę poliimidową.
    UWAGA: Postępuj ostrożnie, ponieważ część kapilary bez powłoki poliimidowej będzie trochę delikatna.
  2. Wywierć mały otwór na końcu rurki o pojemności 200 μl mniej więcej tego samego rozmiaru co zewnętrzna średnica kapilary, aby wystarczająco utrzymać kapilarę na miejscu po jej przewleczeniu przez ten otwór. Przeciągnij koniec kapilary, która znajduje się blisko spalonej części, przez otwór, aż spalona część znajdzie się w probówce.
    UWAGA: Zaleca się przetestowanie rozmiaru otworu z końcem kapilary z dala od spalonej części, aby zapewnić prawidłowy rozmiar, ponieważ spalona część kapilary jest delikatna
    3. .
  3. Dodaj ~150 μL HF (48% - 51% roztwór w wodzie) do probówki 200 μL, tak aby roztwór HF znajdował się mniej więcej w połowie wysokości spalonej części na kapilarze. Inkubować kapilarnę w roztworze HF w temperaturze pokojowej przez 90 - 100 min.
    UWAGA: Zaleca się, aby w wieczku probówki utworzyć kolejny otwór i użyć jakiegoś małego przedmiotu (np. małej końcówki pipety) do podtrzymania probówki podczas inkubacji. Końcówka pipety może być używana do nakłuwania pianki lub innej solidnej platformy, na której może zwisać komora reakcyjna, tworząc bezpieczne środowisko. Umieść ręczniki papierowe pod tubą zawierającą HF i postępuj zgodnie z odpowiednimi procedurami w przypadku rozlania.
  4. Wyjmij kapilę z rurki i umyj zewnętrzną stronę wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości HF.
    UWAGA: Upewnij się, że zewnętrzna średnica kapilary w najwęższej części spalonej części jest teraz mniejsza niż 100 μm, tak jak powinna.
  5. Przeciąć wytrawioną część kapilary pośrodku najwęższej części za pomocą kamienia rozszczepiającego, aby uzyskać kapilarnę separacyjną o średnicy zewnętrznej mniejszej niż 100 μm na jednym końcu. Odetnij niewytrawiony koniec kapilary, aby uzyskać kapilarnę separacyjną o długości 1 m.
    UWAGA: Odpady HF należy utylizować zgodnie z protokołem określonym przez instytucję.

3. Przygotowanie próbek

  1. Przygotowanie wzorcowej mieszanki białkowej
    1. Przygotować wzorcową mieszaninę białkową zawierającą cytochrom c (Cyto.c, 12 kDa, 0,1 mg/ml), lizozym (14,3 kDa, 0,1 mg/ml), β-kazeinę (24 kDa, 0,4 mg/ml), mioglobinę (16,9 kDa, 0,1 mg/ml), anhydrazę węglanową (CA, 29 kDa, 0,5 mg/ml) i albuminę surowicy bydlęcej (BSA, 66,5 kDa, 1,0 mg/ml) w wodzie klasy LC-MS jako roztwór podstawowy.
      UWAGA: Roztwór podstawowy można porcjować i przechowywać w temperaturze -80 °C do użycia.
    2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy 10-krotnie roztworem wodorowęglanu amonu o stężeniu 50 mM (pH 8,0) w wodzie klasy LC-MS do analizy CZE-MS.
      UWAGA: Przed użyciem przefiltrować roztwór wodorowęglanu amonu z filtrem membranowym (np. 0,2 μm membrany z azotanu celulozy i średnicy 50 mm).
  2. Przygotowanie próbki E. coli
    1. Hodować komórki E. coli (K-12 MG1655) w pożywce LB w temperaturze 37 °C, wstrząsając przy 225 obr./min, aż wartość OD600 zbliży się do 0,7. Zebrać komórki E. coli przezodwirowanie (3,283 x g, 10 min) i przemyć je wielokrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia pożywki.
    2. Zawiesić komórki E. coli w buforze do lizy zawierającym 8 M mocznika, inhibitory proteazy i 100 mM wodorowęglanu amonu (pH 8,0) i ultradźwięki na lodzie przez 15 minut za pomocą ultradźwiękowego zakłócacza komórek z rogiem kubkowym w celu całkowitej lizy komórek.
      1. Ustaw cykl pracy (%) na 50 i ustaw sterowanie wyjściem na 7 dla ultradźwiękowego zakłócacza komórek.
    3. Odwirować lizat przy 18 000 x g przez 10 minut. Zebrać supernatant i wyrzucić osad. Użyć małej porcji supernatantu do pomiaru stężenia białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA).
      UWAGA: Lizat należy rozcieńczyć co najmniej trzykrotnie, aby zmniejszyć stężenie mocznika poniżej 3 M, aby stał się zgodny z testem BCA. Test BCA jest wykonywany w oparciu o procedurę producenta.
    4. Zmieszać 1 mg białek E. coli z zimnym acetonem w stosunku objętościowym 1:4 i utrzymywać mieszaninę w temperaturze -20 °C przez noc, aby wytrącić białka.
      UWAGA: Wykonuj wszystkie eksperymenty przy użyciu acetonu w okapie chemicznym.
    5. Odwirować wytrącone białka (12 000 x g, 5 min) i usunąć supernatant. Ponownie umyj granulkę zimnym acetonem (ta sama objętość co poprzednio) i ponownie odwiruj.
    6. Usunąć supernatant i pozostawić granulat do wyschnięcia w okapie chemicznym na kilka minut.
      UWAGA: Nie przesuszaj granulatu białkowego.
    7. Rozpuścić wytrącone białka E. coli (1 mg) w 200 μl 8 M mocznika w 100 mM wodorowęglanie amonu (pH 8,0).
    8. Denaturacja, redukcja i alkilowanie próbki.
      1. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu denaturacji białek.
      2. Zredukować za pomocą ditiotreitolu (DTT), dodając 2 μl 1 M roztworu DTT (w 100 mM wodorowęglanu amonu) do próbki i inkubując próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
      3. Alkilować białka jodoacetamidem (IAA) przez dodanie 6 μl 1 M roztworu IAA (w 100 mM wodorowęglanu amonu) do próbki i inkubować próbkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      4. Ugasić nadmiar IAA za pomocą naziemnej telewizji cyfrowej, dodając 2 μl 1 M roztworu DTT i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zakwasić próbkę kwasem mrówkowym (FA), aby uzyskać końcowe stężenie FA 1% (v/v).
        UWAGA: Redukcja i alkilacja są wykonywane w celu wspomagania rozwijania białek w celu dalszej fragmentacji. Te kroki spowodują utratę informacji o wiązaniach dwusiarczkowych. Jeśli celem jest zbadanie wiązań dwusiarczkowych na białkach, unikaj tych kroków. Pamiętaj, aby obchodzić się ze wszystkimi stężonymi roztworami kwasów w okapie chemicznym.
    9. Odsalać próbkę za pomocą kolumny pułapki C4 (np. 4 mm średnicy wewnętrznej i długości 10 mm, wypełnionej cząstkami o średnicy 3 μm o porach 300 A) za pomocą systemu HPLC. Do wykrywania należy użyć detektora UV o długości fali 254 nm.
      1. Ustaw natężenie przepływu fazy ruchomej na 1 ml/min. Aktywuj kolumnę, przepłukując ją 80% (v/v) acetonitrylem (ACN), 0,1% FA w wodzie przez 10 minut i zrównoważyć, przepłukując ją 2% (v/v) ACN, 0,1% FA w wodzie przez 10 min.
      2. Załaduj białka 500 μg do kolumny i odsal, przepłukując je 2% (v/v) ACN, 0,1% FA w wodzie przez 10 minut przy natężeniu przepływu 1 ml/min.
      3. Eluować białka za pomocą 80% (v/v) ACN, 0,1% FA w wodzie przez 3 minuty przy natężeniu przepływu 1 ml/min. Zebrać eluat i liofilizować go za pomocą koncentratora próżniowego.
        UWAGA: Kolumna pułapki C4 może być używana do odsalania dużych ilości białek, ale nie małych mikrogramów białek ze względu na możliwą utratę próbki. W przypadku materiałów o ograniczonej zawartości białka należy rozważyć użycie końcówek do pipet z pożywką C4 do odsalania białek. Należy uważać, aby nie przesuszyć białek podczas liofilizacji próbki.
    10. Rozpuścić 500 μg białek (zakładając brak utraty próbki podczas przygotowywania próbki) w 250 μl 50 mM wodorowęglanu amonu (pH 8,0) do doświadczeń CZE-MS.

4. Konfiguracja systemu CZE-MS/MS i analiza próbek

  1. Konfiguracja systemu CZE
    1. Przygotować BGE zawierający 5% lub 10% (v/v) kwas octowy (pH ~2,4 lub ~2,2) w wodzie klasy LC-MS. Umieścić ~1,5 ml BGE w fiolce BGE, która pasuje do tacki buforowej automatycznego podajnika próbek CZE.
      UWAGA: Przygotuj świeże BGE co tydzień i codziennie zmieniaj roztwór BGE w fiolce, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    2. Dodać roztwór próbki (5–200 μl) do probówki do wkładki i umieścić probówkę do fiolki z próbką, która pasuje do tacki na próbki automatycznego podajnika próbek CZE.
    3. Załadować próbkę, BGE i kapilarnę separacyjną do automatycznego podajnika próbek CZE.
      UWAGA: Język używany w tym protokole najdokładniej odzwierciedla użycie jednego konkretnego automatycznego podajnika próbek (patrz Tabela materiałów), ale zasady te można zastosować do innych automatycznych podajników próbek.
      1. Wybierz opcję Sample load (Obciążenie próbki) na stronie sterowania ręcznego automatycznego podajnika próbek CZE. Załadować fiolkę BGE do tacki buforowej automatycznego podajnika próbników, zwracając uwagę na jej położenie w zasobniku buforowym. Załaduj fiolkę z próbką do tacki na próbki automatycznego podajnika próbek, zwracając uwagę na jej położenie w tacy na próbki.
        UWAGA: Przyrząd można obsługiwać w trybie sterowania ręcznego, klikając zdjęcie przyrządu dla Monitora urządzenia na głównej stronie instrumentu, a następnie wybierając opcję Ręczny w obszarze Sterowanie bezpośrednie.
      2. Załadować kapilarnę separacyjną do automatycznego podajnika próbek CZE, używając niewytrawionego końca kapilary. Ustaw automatyczny podajnik próbek w pozycji wyrównania za pomocą sterowania ręcznego. Nawlecz niewytrawiony koniec kapilary do otworu, który służy do przytrzymywania kapilary separacyjnej, dopóki nie będzie można jej fizycznie przewlekać dalej.
        UWAGA: W tym przypadku koniec kapilary znajduje się prawie na tej samej wysokości co koniec elektrody i wymagane jest co najmniej 50 μl próbki w fiolce z próbką, aby upewnić się, że koniec kapilary jest zanurzony w próbce podczas wstrzykiwania. Jeżeli objętość próbki jest mała (tj. 5 μl), wysokość końca iniekcyjnego kapilary należy dostosować zgodnie z opisem w kroku 4.1.3.2.1.
        1. Wyregulować wysokość końcówki iniekcyjnej kapilary, jeżeli objętość próbki jest mniejsza niż 50 μl (tj. 5 μl). Przełącz automatyczny podajnik próbek w tryb czuwania za pomocą sterowania ręcznego. Wpisz pozycję próbki w systemie i przesuń kapilatę do próbki. Wcisnąć końcówkę kapilary do wstrzykiwań bardziej w dół, aby dotrzeć do dna fiolki z próbką.
          UWAGA: W takim przypadku wstrzyknięcie próbki można wykonać, gdy w fiolce znajduje się próbka o objętości zaledwie 5 μl.
      3. Kontynuując korzystanie ze sterowania ręcznego, przepłucz kapilarę BGE przez 20 minut, stosując ciśnienie 20 psi.
  2. Konfiguracja interfejsu CZE-MS
    1. Pociągnij kapilę ze szkła borokrzemianowego (1 mm średnicy zewnętrznej, 0,75 mm średnicy wewnętrznej, 10 cm długości) do dwóch emiterów elektrorozpylania z kryzą 20 - 40 μm w średnicy zewnętrznej
      UWAGA: Utrzymuj długość emitera elektrorozpylania jako 4 - 5 cm i w razie potrzeby przyciąć go kamieniem do rozłupywania. Wyrzuć wszystkie odpady szklane do pojemnika na ostre przedmioty. Ustawienia, aby uzyskać końcówki od 20 do 40 μm, są następujące. Ustaw ciepło na 498, ciąg na 5, prędkość na 10, opóźnienie na 150, a ciśnienie na 200. Przed użyciem sprawdź rozmiar emiterów za pomocą mikroskopu. W razie potrzeby nieznacznie dostosuj parametry.
    2. Zamontuj komercyjny interfejs przepływu w osłonie pompowanej elektrokinetycznie (patrz tabela materiałów) z przodu spektrometru masowego. Napełnij zbiornik buforowy osłony buforem zawierającym 10% (v/v) metanolu i 0.2% (v/v) FA w wodzie klasy LC-MS.
    3. Przepłukać T w interfejsie z buforem osłony, wywierając nacisk ręcznie za pomocą strzykawki. Nawlecz średnicę zewnętrzną 1 mm koniec emitera elektrorozpylania przez rurkę osłonową i połączyć emiter z jednym portem Tza pomocą złączki. Wystarczy ponownie ręcznie przepłukać T za pomocą strzykawki, aby napełnić emiter buforem osłony.
    4. Dostosuj odległość między kryzą emitera a wejściem spektrometru masowego do ~2 mm za pomocą kamery dołączonej do interfejsu. Przyłożyć napięcie od 2 do 2,2 kV do fiolki z buforem osłonowym do elektrorozpylania. Dostosuj napięcie natrysku, aby osiągnąć stabilny elektrospray.
      UWAGA: Jeśli nie zaobserwuje się elektrorozpylania lub niestabilnego elektrorozpylania, sprawdź interfejs, aby upewnić się, że w emiterze, w T i w rurkach używanych do łączenia fiolki z buforem osłonowym i T, nie ma dużych pęcherzyków. Odległość między otworem emitera a wejściem spektrometru mas można z grubsza oszacować, porównując ją z 1-mm średnicą zewnętrzną emitera. Napięcie natrysku zależy od wielkości emitera. W przypadku emiterów o wielkości od 20 do 40 μm wystarczy 2 - 2,2 kV. Pamiętaj, aby zawsze zachować ostrożność podczas korzystania z wysokich napięć.
    5. Wyłącz napięcie natrysku i delikatnie przeciągnij wytrawiony koniec kapilary separacyjnej przez T do emitera, aż nie będzie można go dalej popchnąć. Podczas tego procesu należy zastosować niskie ciśnienie (tj. 5 psi) na końcu iniekcji kapilary, aby upewnić się, że w kapilarze nie ma pęcherzyków.
      UWAGA: Kapilara jest połączona z T za pomocą rurki tulejowej i złączki. Dostosuj położenie wytrawionego końca kapilary w emiterze za pomocą aparatu z dokładnością do 500 μm. Odległość można z grubsza oszacować, porównując ją z 1 mm średnicą zewnętrzną emitera.
    6. Zatrzymać niskie ciśnienie na końcu iniekcji kapilary. Przepłucz nieco emiter buforem osłony. Ponownie zastosuj napięcie natrysku 2 - 2,2 kV, aby przetestować spray.
  3. Opracowanie metody CZE do wstrzykiwania próbki, separacji, płukania kapilar i wyzwalania spektrometru mas w celu uzyskania danych
    1. Wybierz opcję Nowa metoda z menu rozwijanego Plik na ekranie głównym, aby zainicjować nową metodę.
    2. Wybierz Wlot jako SV/EV, Tacę jako próbkę, Ciśnienie jako 5 psi, KV jako 0 i Czas trwania jako 95 s dla wstrzyknięcia próbki.
      UWAGA: Próbka jest wstrzykiwana do kapilary poprzez wywieranie nacisku. Objętość wtryskiwanej próbki można obliczyć na podstawie ciśnienia i czasu wtrysku przy użyciu prawa Poiseuille'a. Na przykład 5 psi dla 95-sekundowego wstrzyknięcia próbki odpowiada około 500 nL objętości załadowanej próbki dla kapilary separacyjnej o długości 1 m (średnica wewnętrzna 50 μm).
    3. Wybierz parametry separacji CZE i ustaw parametry wyzwalania akwizycji danych.
      1. Ustaw wlot jako InV, tacę jako bufor, ciśnienie jako 0 psi, KV jako 30, a czas trwania jako 4,200 s dla oddzielenia próbki standardowej mieszaniny białek. Ustaw wlot jako InV, tacę jako bufor, ciśnienie jako 0 psi, KV jako 20, a czas trwania jako 6,600 s dla oddzielenia próbki proteomu E. coli.
        UWAGA: Napięcie przyłożone do separacji można regulować w zależności od złożoności próbki. W przypadku prostych próbek białek można zastosować napięcie 30 kV, aby przyspieszyć analizę. W przypadku złożonych próbek stosuje się napięcie 20 kV, aby spowolnić separację i uzyskać więcej widm MS/MS dla identyfikatorów proteoform.
      2. Skonfiguruj parametry wyzwalania pobierania danych w obszarze Zdarzenia czasowe. Ustaw czas (s) jako 0,0 i wpisz jako przekaźnik 1 dla aktywacji w kroku 1; Ustaw Czas (s) jako 1.0 i wpisz jako Przekaźnik 1 dla Dezaktywuj w kroku 2.
    4. Wybierz Wlot jako InV, Tacę jako bufor, Ciśnienie jako 10 psi, KV jako 30 i Czas trwania jako 600 s do płukania kapilarnego.
    5. Zapisz pliki metod dla eksperymentów CZE-MS i MS/MS.
  4. Ustanowienie państwa członkowskiego i państwa członkowskiego/państwa członkowskiego
    1. Ustaw parametry MS i MS/MS do analizy nienaruszonych białek za pomocą spektrometru masowego z pułapką jonów kwadrupolowych (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Do fragmentacji stosowany jest tryb jonów dodatnich i dysocjacja kolizyjna o wyższej energii (HCD).
      1. Dostosuj ustawienia pliku strojenia: włącz tryb Intact protein i użyj ciśnienia pułapkowania 0,2. Ustaw temperaturę kapilary wymiany jonów na 320 °C, a poziom RF soczewki s na 55.
      2. Skompiluj plik metody MS i MS/MS.
        1. W przypadku pełnego stwardnienia rozsianego ustaw liczbę mikroskanów na 3, rozdzielczość na 240 000 (przy m/z 200), wartość docelową automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) na 1E6, maksymalny czas wstrzykiwania na 50 ms, a zakres skanowania na 600 - 2000 m/z.
      3. W przypadku MS/MS należy użyć akwizycji zależnej od danych (DDA) dla ośmiu najbardziej intensywnych jonów w pełnym spektrum MS. Ustaw okno izolacji na 4 m/z, a znormalizowaną energię zderzenia (NCE) na 20%. Ustaw liczbę mikroskanów na 1, rozdzielczość na 120 000 (przy m/z 200), wartość docelową AGC na 1E5, a maksymalny czas wstrzykiwania na 200 ms.
      4. Ustaw próg intensywności wyzwalania fragmentacji na 1E5 i ustaw jony o stanie naładowania wyższym niż 5, które mają być izolowane do fragmentacji. Włącz wykluczanie izotopów i ustaw wykluczenie dynamiczne na 30 s.
        UWAGA: Liczbę mikroskanów w kierunku MS/MS można zwiększyć do 3. W takim przypadku można zastosować metodę Top3 DDA w celu skrócenia czasu cyklu.
    2. Skonfiguruj połączenie przewodowe między automatycznym podajnikiem próbek CE a spektrometrem mas w celu automatycznego wyzwalania akwizycji danych. Podłącz jeden koniec przewodu do przekaźnika 1 styk A i przekaźnika 1 styk B z tyłu automatycznego podajnika próbek CE. Podłącz drugi koniec przewodu do Start In - i Start In + po stronie spektrometru mas.
  5. Doświadczenie CZE-MS/MS i analiza próbek
    1. Zastosować 30 kV za pomocą ręcznego sterowania CE na końcu wstrzykiwania próbki i 2 - 2,2 kV na fiolkę z buforem osłonowym za pomocą zewnętrznego źródła zasilania w celu przetestowania kapilary separacyjnej i elektrorozpylania.
      UWAGA: Prąd separacji w tym przypadku wynosi około 8 - 9 μA, jeśli jako BGE stosuje się 5% (v/v) kwas octowy.
    2. Skonfiguruj sekwencję akwizycji danych na komputerze spektrometru mas, wybierając nową sekwencję.
      1. Wybierz opcję Nieznany jako typ próbki i określ nazwę pliku oraz ścieżkę. Należy wskazać metodę MS, która ma być stosowana w odniesieniu do każdej serii pobierania próbek w ramach metody według przyrządu.
        UWAGA: Ze względu na to, że istnieje oddzielny komputer do sterowania automatycznym podajnikiem próbek CE, nie trzeba tutaj określać pozycji próbki.
    3. Ustaw sekwencję separacji CZE na komputerze CE, aby wskazać pozycję bufora, pozycję próbki i metodę CZE. Aby rozpocząć nową sekwencję, wybierz opcję Sekwencja z menu rozwijanego Analiza na głównej stronie instrumentu.
    4. Uruchom metodę zbierania danych na komputerze ze spektrometrem mas, wybierając opcję Uruchom sekwencję (lub Uruchom próbkę dla pojedynczych przebiegów). Następnie uruchom sekwencję CE na komputerze automatycznego podajnika próbek CE.
      UWAGA: Gdy napięcie separacji jest włączone po wstrzyknięciu próbki, sygnał jest wysyłany z automatycznego podajnika próbek CE do spektrometru mas w celu wyzwolenia akwizycji danych. Prąd separacji zmniejszy się na początku podczas separacji ze względu na dynamiczne układanie próbek w złączu pH. Następnie prąd stopniowo się regeneruje.

5. Przeszukiwanie bazy danych zebranych plików surowych za pomocą oprogramowania TopPIC

  1. Przenieś pliki .raw, w tym dane MS i MS/MS, z komputera spektrometru mas do komputera przeznaczonego do przeszukiwania baz danych.
    UWAGA: Te pliki .raw mogą być duże i wymagać wydajnego komputera w celu szybkiego przeszukiwania bazy danych.
  2. Pobierz pakiet ProteoWizard i TopPIC na komputer przeznaczony do przeszukiwania baz danych.
    UWAGA: Pakiet ProteoWizard i TopPIC są oprogramowaniem typu open source i można je znaleźć w Internecie (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; Pakiet TopPIC: http://proteomics.informatics.iupui.e., u/software/toppic/). Bazy danych UniProt służą do przeszukiwania baz danych i można je znaleźć na stronie internetowej UniProt .
  3. Konwertuj pliki .raw na pliki .mzML za pomocą msconvert, narzędzia do konwersji formatu plików MS w ProteoWizard28. W graficznym interfejsie użytkownika programu msconvert (MSConvertGUI.exe) kliknij przycisk Przeglądaj i wybierz plik .raw do konwersji. Wybierz mzML jako format wyjściowy i zachowaj wszystkie inne opcje z wartościami domyślnymi. Kliknij przycisk Start w prawym dolnym rogu graficznego interfejsu użytkownika.
  4. Przekonwertuj pliki .mzML na pliki .msalign za pomocą narzędzia TopFD w TopPIC suite29.
    1. W graficznym interfejsie użytkownika TopFD (topfd_gui.exe) kliknij przycisk Plik i wybierz plik .mzML utworzony w poprzednim kroku. Zachowaj domyślne wartości parametrów, a następnie kliknij przycisk Start w prawym dolnym rogu GUI.
      UWAGA: TopFD konwertuje klastry izotopowe prekursorów i fragmentów na masy monoizotopowe i identyfikuje możliwe cechy proteoformu w danych MS1 poprzez łączenie klastrów izotopowych prekursorów o podobnych masach monoizotopowych i bliskich czasach migracji. Z TopFD zostaną wygenerowane trzy pliki, w tym plik ms1.msalign, plik ms2.msalign i plik .feature. Pliki ms1.msalign i ms2.msalign zawierają zdekonwolucyjne masy monoizotopowe widm MS1 i MS/MS. Plik .feature zawiera możliwe cechy proteoformu.
  5. Przeszukaj bazę danych za pomocą TopPIC (wersja 1.1.3) w TopPIC suite30.
    1. W graficznym interfejsie użytkownika TopPIC (toppic_gui.exe) kliknij Plik bazy danych i wybierz odpowiednią bazę danych do wyszukiwania.
    2. Kliknij Plik Spectrum i wybierz plik ms2.msalign wygenerowany w kroku 5.4.1 jako dane wejściowe. Wybierz plik elementów MS1 i wybierz plik .feature wygenerowany w kroku 5.4.1.
    3. Ustaw cysteinę karbamidometylowanię (C57) jako stałą modyfikację spowodowaną leczeniem IAA.
      UWAGA: Plik tekstowy może być również tworzony z różnymi stałymi modyfikacjami za pomocą edytora tekstu. Następnie plik tekstowy można wybrać za pomocą przycisku Plik obok opcji Stałe modyfikacje w graficznym interfejsie użytkownika TopPIC.
    4. Wybierz funkcję Baza danych wabika i w obszarze Ustawienia odcięcia wybierz FDR (współczynnik fałszywych wykrywań) z menu rozwijanego obok pozycji Poziom widma. Ustaw FDR na 0,01 na poziomie widma i 0,05 na poziomie proteoformu.
      UWAGA: TopPIC zapewnia wiele opcji filtrowania wyników: FDR na poziomie widma, FDR na poziomie proteoformy lub oba. FDR jest oceniany na podstawie podejścia typu cel-wabik31.
    5. Pozostaw funkcję generowania niezaznaczoną i ustaw Tolerancję błędu (ppm) na 15.
    6. W obszarze Parametry zaawansowane wybierz wartość 2, aby określić maksymalną liczbę przesunięć masy w menu rozwijanym. Ustaw Maksymalne przesunięcie masy (Da) nieznanych modyfikacji na 500 Da. Pozostaw wszystkie inne parametry z ich wartościami domyślnymi i kliknij przycisk Start w prawym dolnym rogu GUI.
      UWAGA: Oprogramowanie TopPIC generuje dwa wynikowe pliki tekstowe. Plik z sufiksem . OUTPUT_TABLE zawiera listę zidentyfikowanych dopasowań spektrum proteoformu (PrSM) oraz tę z sufiksem . FORM_OUTPUT_TABLE zawiera listę zidentyfikowanych proteoform. Dla każdego PrSM oprogramowanie dostarcza ogólnych informacji na temat dopasowania, obserwowanego wzorca fragmentacji, dopasowanych jonów fragmentacyjnych i wykrytych przesunięć masy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia diagram dynamicznego systemu CZE-ESI-MS opartego na złączu pH użytego w eksperymencie. Długi korek próbki w buforze zasadowym jest wstrzykiwany do kapilary separacyjnej pokrytej LPA wypełnionej kwaśnym BGE. Po zastosowaniu wysokich napięć I i II, anality w strefie próbki zostaną zagęszczone metodą dynamicznego połączenia pH. Aby ocenić działanie systemu CZE-MS, zwykle analizuje się standardową mieszaninę białek (cytochrom c, liz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystania CZE-MS/MS do charakterystyki proteoform w wysokiej rozdzielczości w prostych próbkach białkowych oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomu. Schemat systemu CZE-ESI-MS/MS przedstawiono na rysunku 1. W protokole znajdują się cztery kluczowe kroki. Po pierwsze, niezwykle ważne jest przygotowanie wysokiej jakości powłoki LPA na wewnętrznej ścianie kapilary separacyjnej. Kapilara separacyjna pokryta ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują grupie Heedeoka Honga z Wydziału Chemii Uniwersytetu Stanowego Michigan za uprzejme dostarczenie komórek Escherichia coli do eksperymentów. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych, Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) poprzez Grant R01GM118470 (dla X. Liu) i Grant R01GM125991 (dla L. Sun i X. Liu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kapilara ze stopionej krzemionkiPolymicro Technologies106815001750 & mikro; m i.d. 360 & mikro; m o.d.
Granulki wodorotlenku soduMacron Fine Chemicals7708-10
woda klasy LC-MSFisher ScientificW6-1
Kwas solnyFisher ScientificSA48-1
metanolFisher ScientificA456-4Toksyczny, Zagrożenie dla zdrowia
Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propyluSigma-AldrichM6514Wrażliwy na wilgoć i ciepło
Kwas fluorowodorowyAcros Organics423805000Wysoce toksyczny
AkrylamidAcros Organics164855000Toksyczny, zagrożenie dla zdrowia
Nadsiarczan amonuSigma-AldrichA3678Zagrożenie dla zdrowia, Lizozym utleniacza
Sigma-AldrichL6876
Cytochrom CSigma-AldrichC7752
MioglobinaSigma-AldrichM1882
ß-kazeinaSgma-AldrichC6905
Anhydraza węglanowaSigma-AldrichC3934
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2153
MocznikAlfa Aesar36428-36
DL-DitiothreitolSigma-AldrichD0632Zagrożenie dla zdrowia
JodoacetamidFisher ScientificAC122270250Zagrożenie dla zdrowia
Kwas mrówkowyFisher ScientificA117-50, zagrażająca zdrowiu
kolumna pułapki C4Sepax Technologies110043-4001C3 i mikro; m cząstki, 300 i Aring; pory, średnica wewnętrzna 4,0 mm o długości 10 mm
AcetonitrylFisher ScientificA998SK-4Toksyczny, utleniacz
Wodorowęglan amonuSigma-Aldrich1066-33-7
Filtry szybkoprzepływowe NalgeneThermo Scientific126-00200,2 i mikro; m błona CN i
E. coliK-12 MG1655
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami DulbeccoSigma-AldrichD8537
Thermo Scientific23250
AcetonFisher ScientificA11-1
do odsalania białekAgilient1260 Infinity II
Kwas octowyFisher ScientificA38-212
Automatyczny podajnik próbek CECMP ScientificECE-001
Elektrokinetycznie pompowany interfejs przepływu w osłonieCMP Scientific
Q Exactive HF Hybrydowy kwadrupolowo-orbitrapowy spektrometr masowyThermo Fisher Scientific
Sutter płonący/brązowy ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-1000
Ultradźwiękowy zakłócacz komórek do lizy komórekBranson101063196Model S-250A
Koncentrator próżniowyThermo Fisher ScientificSPD131DDA-115
komórki o średnicy 50 mm Test BCA System HPLC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
  3. Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
  4. Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
  5. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
  6. Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
  7. Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
  8. Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
  9. Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
  10. Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
  11. Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
  12. Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
  13. Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
  14. Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
  15. Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
  16. Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
  17. Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
  18. Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
  19. Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
  20. Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
  21. Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
  22. Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
  23. Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
  24. Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
  25. Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
  26. Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  27. McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
  28. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  29. TopPIC Suite. , Available from: http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/topfd/ (2017).
  30. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
  31. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  32. Methods - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/methods/ (2018).
  33. Software - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/software/ (2018).
  34. Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
  35. Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
  36. Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
  37. Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
  38. Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Capillary Zone ElectrophoresisTop down ProteomicsProtein Isoform AnalysisElectrospray IonizationMass SpectrometryLinear Polyacrylamide CoatingDynamic pH junctionElectrokinetically Pumped Sheath FlowIon Trap Mass SpectrometerEscherichia coli Proteome

Powiązane artykuły