To jest protokół izolowania tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od wątroby. Protokół opisuje dwuetapowy proces obejmujący perfuzję kolagenazy, po której następuje różnicowe ultrawirowanie w celu wyizolowania EV tkanki wątroby.
Artykuł metodologiczny
Izolacja tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wątroby
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) mogą być uwalniane z wielu różnych typów komórek i wykrywane w większości, jeśli nie we wszystkich, płynach ustrojowych. EV mogą uczestniczyć w komunikacji międzykomórkowej poprzez transport bioaktywnych cząsteczek, takich jak RNA lub białko, z jednej komórki do drugiej. Większość badań EV przeprowadzono w modelach hodowli komórkowych lub w EV wyizolowanych z płynów ustrojowych. Rośnie zainteresowanie izolacją EV z tkanek w celu zbadania ich udziału w procesach fizjologicznych i tego, jak zmieniają się w chorobie. Izolacja EV z wystarczającą wydajnością z tkanek jest technicznie trudna ze względu na konieczność dysocjacji tkanek bez uszkodzenia komórek. Metoda ta opisuje procedurę izolacji EV z tkanki wątroby myszy. Metoda obejmuje dwuetapowy proces rozpoczynający się od trawienia kolagenazy in situ, po którym następuje różnicowe ultrawirowanie. Perfuzja tkanek za pomocą kolagenazy zapewnia przewagę nad mechanicznym cięciem lub homogenizacją tkanki wątroby ze względu na zwiększoną wydajność otrzymywanych EV. Zastosowanie tego dwuetapowego procesu do izolacji EV z wątroby będzie przydatne do badania EV w tkankach.
Wprowadzenie
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to pęcherzyki błonowe, które są uwalniane z wielu różnych typów komórek w ciele. EV zawierają ładunek cząsteczek, które obejmują RNA, DNA i białko. Postuluje się, że przenoszenie tego ładunku przez EV z jednej komórki do drugiej jest jednym z mechanizmów, za pomocą których komórki w tkankach komunikują się ze sobą1. Większość informacji na temat ładunku lub roli pojazdów elektrycznych w normalnym zdrowiu i chorobach pochodzi z badań nad pojazdami elektrycznymi uzyskanymi z komórek w hodowli lub pobranych z płynów krwiobiegowych lub innych płynów ustrojowych2. Aby zrozumieć ich fizjologiczne role in vivo, niezbędna jest solidna metoda izolacji tkanek EV, która obejmuje wszystkie populacje EV i pozwala uniknąć uszkodzenia lub zanieczyszczenia komórek3. Ogólnym celem opisanej w niniejszym dokumencie metody jest wyizolowanie tkankowych EV z wątroby myszy.
Wykazano, że większość typów komórek w wątrobie wytwarza EVs, a badania nad sygnalizacją opartą na EV pogłębiają podstawową wiedzę i zrozumienie chorób wątroby. Jednak łączny wpływ EV z różnych typów komórek w tkankach jest tylko częściowo poznany. Izolacja EV z tkanek wątroby jest konieczna, aby zrozumieć udział EV in situ w środowisku tkankowym. Opisane tutaj podejście opiera się na dwuetapowej perfuzji w celu zwiększenia dysocjacji tkanek i zminimalizowania uszkodzeń komórek. Następnie EV są izolowane ze zdysocjowanej tkanki wątroby. Podejścia wykorzystujące dwuetapową perfuzję do izolacji hepatocytów są stosowane od wczesnych lat 50. XX wieku4. Te metody izolacji hepatocytów były modyfikowane i stale ulepszane i są obecnie standardowymi podejściami do izolacji hepatocytów w hodowlach, w zawiesinach komórkowych i z tkanek5,6,7. W pierwszym etapie wątroba jest poddawana perfuzji bez recyrkulacji z buforem bezwapniowym, zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS). W drugim etapie wątroba jest perfundowana kolagenazą w celu rozpuszczenia macierzy zewnątrzkomórkowej w celu dalszego oddzielenia desmosomalnych połączeń komórka-komórka. Optymalny czas zabiegu rozpuszczania kolagenazy wynosi od 7 do 10 minut. Krótszy czas trwania leczenia spowoduje niecałkowite rozpuszczenie i utrzymanie kontaktów komórkowych w wątrobie, podczas gdy dłuższy czas trwania może spowodować uszkodzenie wątroby lub przerwanie żyły wrotnej. EV są następnie izolowane za pomocą wirowania różnicowego w celu usunięcia komórek i resztek komórkowych. Skutkuje to zbieraniem pojazdów elektrycznych w postaci wysokich plonów, które można wykorzystać do dalszych analiz lub badań.
Protokół
Wszystkie badania z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem, który został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Klinice Mayo.
1. Przygotowanie ławki rezerwowych
- Przygotować łaźnię wodną i ustawić ją na 37 °C. Pozostałe niezbędne wyposażenie i konfiguracja są pokazane w Rysunek 1.
- Odmierzyć 100 mg kolagenazy typu IV i dodać ją do kolby o pojemności 125 ml zawierającej 100 ml HBSS w łaźni wodnej (40 °C). Upewnij się, że kolagenaza została rozpuszczona przez zawirowanie płynu w kolbie, a także upewnić się, że kolba jest całkowicie zanurzona w łaźni wodnej. Aby uzyskać większą skuteczność, pozwól kolagenazie rozpuścić się przez co najmniej 30 minut, nawet jeśli może się wydawać, że rozpuszcza się natychmiast.
- Zanurzyć kolbę o pojemności 125 ml zawierającą 50 ml HBSS w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C. Zostanie to wykorzystane do wstępnego spłukiwania.
- Spryskaj powierzchnię wszystkich narzędzi, takich jak nożyczki i kleszcze, 70% etanolem. Przygotuj kilka czystych wacików.
- Wypłucz rurkę pompy, przepuszczając przez nią 70% etanolu i usuń resztki etanolu, przepłukując go dwukrotnie bieżącą wodą.
- Połóż chłonną podkładkę na stole laboratoryjnym i umieść na niej pojemnik z twardym pudełkiem. Będzie to potrzebne, aby zatrzymać nadmiar płynów podczas perfuzji myszy. Owiń podkładkę z pianki polistyrenowej folią aluminiową i umieść ją w pojemniku.
- Umieść sterylne naczynie hodowlane o średnicy 10 cm w pobliżu ławki. Zostanie on wykorzystany do utrzymania strawionej wątroby po zakończeniu perfuzji.
- Wlać wcześniej 10 ml pożywki kolagenazy (krok 1.2) do sterylnego naczynia hodowlanego.
- Korzystając ze skrzydełkowego zestawu do pobierania krwi, podłącz rozmiar 23 do wolnego końca rurki pompy (odcięcie skrzydełek od kaniuli motylkowej może prowadzić do lepszej obsługi). Przejdź, aż końcówka kaniuli pobierania krwi zostanie wypełniona.
2. Przygotowanie zwierząt
- Przed rozpoczęciem znieczulenia za pomocą izofluranu należy upewnić się, że dostępna jest odpowiednia ilość gazu zasilającego na czas zabiegu. Włączyć dopływ tlenu (O2) do komory indukcyjnej o pojemności 1-2 l, a następnie włączyć izofluran w zakresie 2-4% za pomocą przepływomierza.
- Włóż mysz do komory indukcyjnej i zamknij górne drzwiczki. Monitoruj mysz, dopóki nie zostanie leżąca.
UWAGA: Gazy w komorze będą utrzymywać myszy w stanie znieczulenia przez kilka minut. - Umieść mysz na podkładce z pianki polistyrenowej owiniętej folią aluminiową. Przełącz przepływ z komory indukcyjnej na stożek. Upewnij się, że znieczulenie jest odpowiednie. Jeśli mysz zaczęła reagować, delikatnie utrzymaj ją w stożku nosowym, aż zostanie w pełni znieczulona.
- Zapewnij znieczulenie, monitorując oddech i reakcję na stymulację podczas zabiegu. W razie potrzeby wyreguluj przepływomierz szybkości, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie. Łapy muszą nie reagować na próbę szczypania w znieczuleniu. Dodatkowe informacje można uzyskać z przewodnika laboratoryjnego dotyczącego opieki nad zwierzętami.
- Przyklej taśmą lub przypnij wszystkie cztery kończyny myszy.
- Oczyść skórę na brzuchu, spryskując ją 70% etanolem i wycierając gazą i wacikiem nasączonym alkoholem. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć zanieczyszczenia sierścią myszy.
- Wykonaj szeroko otwarte cięcie przez skórę od przodu do kości miednicy za pomocą zestawu sterylnych nożyczek. Uważaj, aby nie przeciąć żadnych narządów wewnętrznych . Przesuń jelita na lewą stronę zwierzęcia za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, aby delikatnie odsłonić żyłę wrotną (PV) i żyłę główną dolną (IVC).
3. Kaniulacja i perfuzja (0,5 h)
- Za pomocą zakrzywionych kleszczy umieść nić pod żyłą wrotną i luźno zawiąż węzeł, aby mocno przygotować zacisk po kanelulacji.
- Wprowadzić kaniulę (23G z zestawu do pobierania krwi) do żyły wrotnej 5-10 mm poniżej ligatury. Nie wkładaj kaniuli poza pierwszą gałąź wrotną, w przeciwnym razie prawy płat przedni może być nieodpowiednio ukrwiony. Kaniulę można zamocować lub przymocować za pomocą gwintu za pomocą węzła blokującego.
- Uruchom pompę, aby zainparować HBSS przy niskim natężeniu przepływu (1-2 ml/min). Gdy potwierdzimy, że kaniulacja się powiodła, wątroba zacznie blednąć.
- Przeciąć IVC, aby zmniejszyć ciśnienie i umożliwić odpływ nadmiaru płynu w wątrobie. Najlepiej jest to zrobić za pomocą drugiej ręki operatora, aby kaniula nie była poruszana.
- Powoli zwiększaj natężenie przepływu do 8 ml/min i zakończ perfuzję, wykorzystując całą objętość 50 ml HBSS przez wątrobę, w ciągu następnych 5 minut.
- Zmienić pożywkę zawierającą kolagenazę (krok 1.2) do zlewki tuż przed rozpoczęciem wyczerpywania się HBSS. Upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie są obecne i nie wpływają do wątroby podczas zmiany pożywki.
- Wywieraj przejściowy nacisk na IVC w odstępach 5 sekund, zaciskając kleszcze. Spowoduje to obrzęk wątroby i pomoże w trawieniu tkanek i dysocjacji (7-8 min). W miarę postępu trawienia wątroba puchnie i staje się biała. Wątroba może pęcznieć równomiernie do około dwukrotności swojej pierwotnej wielkości.
- Wyłącz pompę i wyjmij kaniulę po zakończeniu trawienia. Zakończenie trawienia wątroby będzie zależeć od wielkości myszy i stanu wątroby. Wgniecenie w wątrobie można zaobserwować, jeśli do delikatnego sondowania wątroby używa się aplikatora z bawełnianą końcówką.
- Usuń woreczek żółciowy z wątroby, uważając, aby go nie rozerwać . Za pomocą umytych nożyczek i kleszczy wyekstrahuj wątrobę myszy do sterylnego 10-centymetrowego naczynia hodowlanego zawierającego sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do przemywania powierzchni. Ostrożnie przenieść wątrobę do sterylnego 10-centymetrowego naczynia hodowlanego zawierającego pożywkę kolagenazę (od kroku 1.8). Jest to kluczowy krok w celu uniknięcia zanieczyszczenia krwią i żółcią myszy.
- Chwyć i rozerwij wątrobę dwoma czystymi kleszczami, delikatnie potrząsając komórkami wątroby. Gdy tak się stanie, podłoże stanie się zmętniałe. Wszystkie hepatocyty można strząsnąć, pozostawiając tkankę łączną i tkankę naczyniową.
- Roztwór komórkowy należy wielokrotnie rozcierać za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml, aż do strząśnięcia niestrawionych części wątroby. Przelej go do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z nylonowymi sitkami o średnicy 70 μm, aby przefiltrować niestrawioną tkankę łączną. Umyj naczynie HBSS, aby zebrać pozostałe komórki i napełnić stożkową probówkę o pojemności 50 ml.
- Delikatnie odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml w obracającym się wirniku kubełkowym o sile 50 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Przenieść supernatant do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
4. Izolacja EV (5 h)
- Odwirować sklarowany nad osadem przy stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
- Odwirować sklarowany nad osadem o sile 2000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek i agregatów.
- Przenieść supernatant do probówki okrągłodennej i odwirować supernatant o sile 10 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4°C.
- Zebrać supernatant i umieścić w probówce ultrawirówkowej z poliwęglanu i odwirować przy 100 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C.
- Zebrać granulki do probówki ultrawirówkowej, która jest następnie myta przez ponowne zawieszenie w PBS. Odwirować sklarowany nad osadem w temperaturze 100 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C.
- Końcowa osadka składająca się z nanopęcherzyków komórkowych może być bezpośrednio wykorzystana do eksperymentów lub ponownie zawieszona w 1000 μl PBS i przechowywana w temperaturze -80 °C.
5. Ocena jakości i wydajności izolacji
- Oceń rozkład wielkości i stężenie za pomocą analizy śledzenia nanocząstek lub przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów zgodnie z protokołami producenta urządzenia.
- Przeprowadzić dalszą izolację i oczyszczanie określonych populacji pęcherzyków za pomocą różnych podejść, takich jak dodanie gradientu sacharozy lub poduszki, techniki immunopowinowactwa lub chromatografia wykluczania wielkości, w oparciu o konkretne potrzeby eksperymentalne.
Wyniki
Aparatura niezbędna do tych izolacji obejmuje standardowy sprzęt laboratoryjny, co czyni tę metodę stosunkowo prostym i kosztowo efektywnym podejściem. Izolacje przeprowadzano u samców i samic myszy Balb/c lub FVB w wieku od dwunastu do trzydziestu tygodni. Taca, w której umieszczana jest mysz, jest wyłożona folią aluminiową i znajduje się w sztywnym pojemniku, który zbiera nadmiar płynów podczas perfuzji. Kolby zawierające HBSS lub medium z kolagenazą są zanurzone w kąpieli wodnej (40 °C), gotowe do użycia. Wykorzystuje się dwie sterylne szalki hodowlane o średnicy 10 cm. Jedna służy do płukania powierzchni PBS, a druga do oddzielania hepatocytów od składników tkanki łącznej.
W tej metodzie wątroba jest perfundowana w sposób nieciągły poprzez żyłę wrotną, co jest preferowane względem kaniulacji żyły głównej dolnej. Alternatywnym i powszechnie stosowanym podejściem do perfuzji jest przeprowadzenie perfuzji wstecznej poprzez kaniulację żyły głównej dolnej i przecięcie żyły wrotnej w celu drenażu. Jednak kaniulacja żyły wrotnej jest łatwiejsza do wykonania i wiąże się z krótkim dystansem do wątroby, ponieważ żyła wrotna prowadzi bezpośrednio do tego organu8. Wybór punktu wprowadzenia kaniuli jest kluczowy dla optymalnego sukcesu (Rysunek 2). Kaniulę umieszcza się poza odgałęzieniami żył żołądkowych i trzustkowych, ale nie poza pierwszym rozgałęzieniem wrotnym (prawą i lewą żyłą wrotną wątroby). Po zidentyfikowaniu optymalnego miejsca wprowadzenia do żyły wrotnej, za pomocą zakrzywionych kleszczyków pod żyłą wrotną umieszcza się nić i zawiązuje luźny węzeł. Igła kaniuli jest mocowana nicią za pomocą węzła stopowego, aby zapobiec jej wysunięciu się.
Rysunek 3 przedstawia ogólny schemat procesu różnicowego wirowania w celu izolacji EV z tkanki wątroby. Ultrawirowanie usuwa komórki, resztki komórkowe i inne zanieczyszczenia. Pierwsze cztery etapy wirowania (50 x g, 30 x g, 2 0 x g, 10 00 x g) są przeznaczone do sukcesywnego usuwania odpowiednio: hepatocytów, innych nienaruszonych komórek, martwych komórek lub resztek komórkowych.Rysunki 4A i 4B). Po tych etapach ponownie przeprowadza się ultrawirowanie przy 10 00 x g w celu zebrania osadu (Rycina 4C). Osad jest płukany poprzez ponowne zawieszenie w PBS, a następnie poddawany końcowej ultrawirowce przy 10 00 x g. Osad po ultrawirowaniu jest w tej procedurze wyraźnie widoczny i lepki w porównaniu z EV z warunkowanych mediów hodowlanych. Wymagane jest wielokrotne pipetowanie, aż do momentu, gdy brązowe agregaty przestaną być widoczne i zostaną całkowicie rozpuszczone. Końcowy osad zawiesza się ponownie w 1000 µL buforu PBS (Rysunek 4D). Ultrawirowanie usuwa zanieczyszczenia oraz inne rozpuszczalne kontaminanty z osocza, które mogą wpływać na funkcjonalne wyniki eksperymentu. Wirowanie należy przeprowadzić w temperaturze 4 ˚C.
W przypadku wątroby mysiej metoda ta pozwala uzyskać stężenie EV z tkanki w zakresie od 1,74 do 4,0 x 1012 przy średniej wartości 3,46 x 1012 cząsteczek na mL, co określono za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) (Rysunek 5). Średnia wielkość wyizolowanych EV z tkanki wątroby wynosiła 157,7 nm, przy wielkości modalnej 14,5 nm i zakresie wielkości EV od 10-60 nm w analizie NTA. Wydajność pozyskiwania EV będzie zależeć od czynników takich jak masa wątroby oraz straty podczas etapów perfuzji lub ultrawirowania.
Rysunek 1Przygotowanie stanowiska pracy. Materiały i ich rozmieszczenie to: (A) pompa, (B) ogrzana kolba o pojemności 125 ml zawierająca HBSS i port ssący do wody, (C) stożek nosowy połączony z waporyzatorem izofluranu, (D) wylot wody z pompy połączony z igłą, (E) taca wyłożona folią aluminiową wewnątrz sztywnego pojemnika oraz (F) 10-centymetrowa szalka hodowlana, do której wcześniej wlano podłoże z kolagenazą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2Miejsce kaniulacji. Przedstawiono anatomię jamy brzusznej myszy. Za pomocą zakrzywionych pincetek pod żyłę wrotną (PV) wprowadza się nić, którą następnie zawiązuje się luźnym węzłem. Miejsce wprowadzenia znajduje się w pobliżu wątroby, 5–10 mm poniżej podwiązania, ale nie poza pierwszą gałąź wrotną (lewą i prawą żyłę wrotną wątrobową). Kaniulę mocuje się lub przymocowuje nicią z węzłem stopowym. Węzeł ten służy jako znacznik lokalizacji żyły wrotnej w przypadku wysunięcia się kaniuli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3Schemat etapów wirowania. Celem jest usunięcie niepożądanych komórek i innych składników oraz wyizolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV). Pierwsze cztery etapy wirowania mają na celu usunięcie hepatocytów i innych komórek, martwych komórek lub szczątków komórkowych przy użyciu wirowania różnicowego. Po tych etapach przeprowadzane jest ultrawirowanie przy 10 0 x g w celu zebrania osadu EV. Osad jest płukany poprzez resuspensję w PBS, a następnie poddany końcowemu ultrawirowaniu przy 10 0 x g. Wszystkie etapy wirowania są przeprowadzane w temperaturze 4 ˚C. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rycina 4Centryfugacja różnicowa. (A) Po wirowaniu przy 50 x g przez 10 min obserwuje się osad zawierający hepatocyty. (B) Do wirowania przy 10 0 x g przez 70 min w celu usunięcia szczątków komórkowych wykorzystuje się probówkę z okrągłym dnem. (C) Do wirowania przy 10 0 x g przez 70 min wykorzystuje się poliwęglanową probówkę do ultrawirowania. Osad zbiera się do jednej probówki i przemywa poprzez ponowne zawieszenie w PBS. (D) Końcowy osad zawiesza się ponownie w 1000 µL buforu PBS. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rycina 5Reprezentatywny wynik. Wielkość i stężenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z tkanki wątroby można wyznaczyć za pomocą analizy śledzenia nanocząsteczek (NTA). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Protokół ten opisuje optymalną i powtarzalną metodę izolacji EV tkanki wątrobowej przy użyciu dwuetapowego procesu perfuzji przez żyłę wrotną, po którym następuje ultrawirowanie różnicowe. Ważnymi etapami procedury są umieszczenie kaniuli, stężenie kolagenazy i czas trawienia, prędkość przepływu pożywki, obchodzenie się z tkanką po trawieniu oraz klasyczne ultrawirowanie różnicowe.
Separację komórek uzyskuje się poprzez oddzielenie od składników tkanki łącznej po strawieniu przy użyciu kolagenazy typu IV. Stężenie kolagenazy stosowanej do perfuzji może wynosić od 0,1 do 5 mg/ml. Skuteczność kolagenazy w trawieniu tkankowym może występować między partiami. Badano stężenia kolagenazy od 0,5 do 5 mg/ml, jednak zastosowane stężenie nie miało większego wpływu na wydajność uzyskiwanych EV. Stosowanie wyższego stężenia kolagenazy spowoduje szybszy obrzęk i wybielanie wątroby. Celem jest uzyskanie zadowalającej dysocjacji komórek bez nadmiernego zanieczyszczenia lub uszkodzenia. Optymalne stężenie kolagenazy stosowanej w tych izolacjach to 1-2 mg/ml perfuzji przez 7-8 minut przy natężeniu przepływu 8 ml/min. Zbyt długa procedura perfuzji zwiększa ryzyko zniszczenia cienkiej tkanki łącznej w wątrobie, a także zwiększa ryzyko techniczne, takie jak przemieszczenie igły z żyły wrotnej lub uwięzienie powietrza w żyle.
Najtrudniejszym aspektem tego protokołu jest kaniulacja żyły wrotnej. Może to być trudne, szczególnie u myszy o wadze od 18 do 25 g. Techniki perfuzji kolagenazy zostały pierwotnie opracowane do stosowania u szczurów, a następnie przyjęte do stosowania u myszy po licznych modyfikacjach i dostosowaniach. Kaniulacja przy użyciu zestawu do pobierania krwi 23G jest łatwiejsza niż umieszczanie cewnika w naczyniach krwionośnych o małej średnicy światła. Mocowanie kaniuli za pomocą gwintu z węzłem blokującym jest zalecane, aby uniknąć przemieszczenia, a węzeł służy również jako znacznik lokalizacji żyły wrotnej w przypadku, gdy kaniula wypada z naczynia.
W przypadku dalszej analizy niezwykle ważne jest minimalne zanieczyszczenie komórek. Istnieje kilka ważnych kwestii związanych z obchodzeniem się z tkankami po trawieniu. Po pierwsze, kleszcze i nożyczki są zmieniane podczas ekstrakcji wątroby, aby uniknąć zanieczyszczenia krwi. Po drugie, bardzo ważne jest, aby woreczek żółciowy został ostrożnie usunięty z wątroby, aby uniknąć rozdarcia i niepożądanego zanieczyszczenia żółcią. Po trzecie, po usunięciu wątroby od myszy, wątroba jest bardzo delikatnie myta za pomocą PBS w celu usunięcia krwi. Minimalizacja zanieczyszczenia ogniwami powinna być traktowana priorytetowo bardziej priorytetowo niż zmniejszanie wydajności uzyskiwanych pojazdów elektrycznych.
Ultrawirowanie jest najczęściej stosowaną metodą izolacji i oczyszczania EV 8,9,10,11. Takie podejście usunie większość komórek miąższowych, takich jak hepatocyty lub cholangiocyty oraz komórki niemiąższowe, takie jak komórki Kupffera, sinusoidalne komórki śródbłonka i komórki gwiaździste, Ponadto szczątki komórkowe, agregacje komórek i martwe komórki zostaną również usunięte przez wirowanie różnicowe. Dalsze oczyszczanie i izolację określonych populacji można przeprowadzić za pomocą chromatografii wykluczania wielkości w celu usunięcia wszelkich niepęcherzykowych agregatów białkowych lub lipoprotein.
Ograniczeniem tego protokołu jest to, że może on nie uchwycić wszystkich pęcherzyków tkankowych, biorąc pod uwagę możliwość, że niektóre pęcherzyki mogą zostać usunięte w perfuzacie. Jeśli konieczna jest całościowa ocena, należy rozważyć pobranie perfuzatu i wyizolowanie pęcherzyków w obrębie perfuzatu. Kolejnym ograniczeniem jest możliwość uszkodzenia komórek. Aby monitorować potencjalny wpływ nadmiernej śmierci komórek, żywotność komórek może być monitorowana i uwzględniana w parametrach jakościowych izolacji EV tkanek. Podsumowując, procedura ta opisuje zoptymalizowany przebieg pracy przy użyciu dwuetapowej techniki perfuzji przez żyłę wrotną, po której następuje ultrawirowanie różnicowe w celu uzyskania EV tkanki wątroby z wątroby myszy z wysoką wydajnością. Te tkankowe EV nadają się do dalszych analiz, takich jak charakterystyka składu biomolekularnego i innych badań, które mają na celu scharakteryzowanie ich fizjologicznych lub patofizjologicznych ról lub potencjalnych zastosowań jako markerów choroby.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez fundusze z National Cancer Institute Grant CA-217833.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolba Erlenmeyera 125 ml | Fisher scientific | FB500125 | |
| 125 ml Kolba Erlenmeyera | Fisher scientific | FB500125 | |
| Nożyczki zakrzywione, nieząbkowane | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Kleszcze zakrzywione | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Taśma maskująca | Sklep | ||
| z artykułami domowymiFolia aluminiowa | z artykułami gospodarstwa domowego | ||
| Podkładka styropianowa | z artykułami gospodarstwa domowego | ||
| Chłonna ławka Podkład | Scientific inc. | B1623 | |
| Masterflex L/S Cyfrowa pompa Miniflex | Cole-parmer | ZX-07525-20 | |
| Łaźnia wodna | Thermo Electron Precision | 2837 | |
| Zestawy do pobierania krwi | Becton Dickinson | 367292 | |
| szalka Petriego, przezroczysta pokrywka 100x15 | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Falcon 70mm Nylonowe sitka komórkowe | Fisher scientific | 352350 | |
| Probówki stożkowe 50 ml | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Aplikatory z bawełnianą końcówką | Moore medical | 69622 | |
| 25 ml Pipeta serologiczna | Falcon | 357525 | |
| Ohmeda Isotec 4 Parownik izofluranowy | BioSurplus | 203-2751 | |
| Gaz | |||
| Izofluran | |||
| Zmotoryzowany napełniacz do pipet Levo Plus | Scilogex | 74020002 | |
| Wirówka 5804R | Sigma-aldrich | 22628048 | |
| Beckman Coulter Optima L-100 XP | Beckman | 969347 | |
| Beckman Coulter Avanti JXN-26 | Beckman | B34182 | |
| 70 Ti Rotor stałokątowy | Beckman | 337922 | |
| JA-25.50Rotor o stałym kącie nachylenia | Beckman | 363055 | |
| Nalgene Probówka okrągłodenna | Thermo Scientific | 3118-0028 | |
| Probówki ultrawirówkowe z poliwęglanu z zespołem nasadki | Beckman | 355618 | |
| Reagents | |||
| HyClone Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), wolny od Ca/Mg | Fisher scientific | SH30588.01 | |
| Kolagenaza, typ IV, proszek | Fisher scientific | 17104019 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Fisher scientific | SH30256.01 |
Bibliografia
- Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth. Hepatology. 54 (4), 1237-1248 (2011).
- Maji, S., Matsuda, A., Yan, I. K., Parasramka, M., Patel, T. Extracellular vesicles in liver diseases. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 312 (3), 194-200 (2017).
- Kogure, T., Patel, T. Isolation of extracellular nanovesicle microRNA from liver cancer cells in culture. Methods in Molecular Biology. 1024, 11-18 (2013).
- Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14. Journal of Experimental Medicine. 94 (5), 431-453 (1951).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cellular Biology. 13, 29-83 (1976).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In Vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplantation. 16 (8), 859-865 (2007).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Currents Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 (Unit 3.22) (2006).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
Przedruki i uprawnienia
