Locus coeruleus to małe skupisko neuronów biorących udział w różnych procesach fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy protokół przygotowania wycinków mózgu myszy do badań białek i metali w tym jądrze.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Lokalizacja miejsca sinawyego w mózgu myszy
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Locus coeruleus (LC) jest głównym ośrodkiem neuronów produkujących noradrenalinę, które modulują szereg funkcji fizjologicznych. Strukturalne lub funkcjonalne nieprawidłowości LC wpływają na kilka obszarów mózgu, w tym korę, hipokamp i móżdżek, i mogą przyczyniać się do depresji, choroby afektywnej dwubiegunowej, lęku, a także choroby Parkinsona i choroby Alzheimera. Zaburzenia te są często związane z nierównowagą metali, ale rola metali w LC jest tylko częściowo poznana. Potrzebne są badania morfologiczne i funkcjonalne LC, aby lepiej zrozumieć ludzkie patologie i udział metali. Myszy są szeroko stosowanym modelem eksperymentalnym, ale LC myszy jest mały (~0,3 mm średnicy) i trudny do zidentyfikowania dla laika. Tutaj opisujemy krok po kroku protokół oparty na immunohistochemii do lokalizacji LC w mózgu myszy. Dopamino-β-hydroksylaza (DBH) i alternatywnie hydroksylaza tyrozynowa (TH), oba enzymy silnie eksprymowane w LC, są stosowane jako markery immunohistochemiczne w wycinkach mózgu. Skrawki przylegające do skrawków zawierających LC mogą być wykorzystane do dalszej analizy, w tym histologii do badań morfologicznych, badań metabolicznych, a także obrazowania metali za pomocą rentgenowskiej mikroskopii fluorescencyjnej (XFM).
Wprowadzenie
Miejsce sinawe (LC) jest ważnym regionem w pniu mózgu i głównym miejscem produkcji noradrenaliny (NE)1. LC wysyła projekcje przez cały mózg2 do kory mózgowej, hipokampa i móżdżku3 i reguluje główne procesy fizjologiczne, w tym rytm okołodobowy4,5, uwaga i pamięć6, stress7, procesy poznawcze8 i emotion9,10. Dysfunkcja LC jest związana z zaburzeniami neurologicznymi i neuropsychiatrycznymi11
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Johns Hopkins University Animal Care and Use (ACUC) numer protokołu numer M017M385.
1. Cięcie mózgu
- Aby unieruchomić, znieczul myszy poprzez zastosowanie 3% izofluranu.
- Namocz wacik z kroplami izofluranu i umieść go w probówce do mikrowirówek o pojemności 15 ml. Umieść nos zwierzęcia w rurki i pozwól mu wdychać izofluran. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca .
- Połóż zwierzę na grzbiecie i unieruchamij je, przygniatając jego kończyny szpilką T, mając dostęp do brzucha.
- Przetnij zwierzę nożyczkami chir....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zaburzenia w gospodarce metali (takich jak Cu, Fe, Zn i Mn) są często obserwowane w zaburzeniach neurologicznych, w tym zmiany w jądrze zasadnym 34,35. Dlatego określenie poziomów metali w mózgu jest konieczne do zrozumienia mechanizmów choroby. Przekroje mózgu uzyskane za pomocą opisanego protokołu mogą być wykorzystane do ilościowego oznaczania poziomów Cu i innych metali w jądrze zasadnym oraz porównania ich z poziomami w obsza.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Właściwa orientacja próbki jest kluczowym krokiem w tym protokole. Ponieważ używamy cech anatomicznych grzbietowej powierzchni mózgu do zlokalizowania LC (granica między móżdżkiem a wzgórkiem dolnym), ważne jest, aby sekcje były prawidłowo wyrównane. Wymaga to ostrożności w prawidłowym ustawieniu mózgu w macierzy fragmentatora mózgu myszy. Zalecamy wycięcie ~500 μm więcej tkanki z przodu i z tyłu do LC, aby uniknąć pominięcia jądra. Najczęstszym błędem jest wycinanie zbyt małej liczby sekcji, co skutkuje całkowitym pomin.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Dziękujemy Abigael Muchenditsi za utrzymanie kolonii myszy. Wykorzystanie Zaawansowanego Źródła Fotonów w Argonne National Laboratory było wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych, na podstawie umowy o numerze: DE-AC02-06CH11357. Dziękujemy Oldze Antipovej i dr. Stefanowi Vogtowi za wsparcie i pomoc w Advanced Photon Source. Praca ta została sfinansowana z grantu Narodowego Instytutu Zdrowia 2R01GM101502 dla SL.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Matryca krajalnicy mózgu dorosłej myszy | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Przeciwciało wtórne przeciw królikowi, Alexa Fluor 488 (źródło - osioł) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Naładowane szkiełka | podstawowe Genesee | 29-107 | |
| Mikroskop konfokalny | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Ostrza tnące kriostatu | Nożyczki Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Mini, 9,5 cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Przeciwciało dopaminy i beta;-hydroksylazy (DBH) - produkcja własna (źródło - królik) | B. Eipper | - | |
| Przeciwciało przeciwko dopaminie i beta;-hydroksylazie (DBH) - dostępne w handlu (źródło - królik) | Sygnalizacja komórkowa | 8586 | |
| Probówki Falcon, 50 ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (izofluoran) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Kleszcze Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Twarde media | montażowe EM sciences | 17984-24 | |
| Mikroskop | Pascal | LSM 5 | |
| Płytki wielodołkowe, 24 dołki | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Mieszanka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyd (PFA)/ formalina 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Jednorazowe formy do zatapiania Peel-A-Way | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pędzel | |||
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Żyletki | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Szpatułki | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| Trójniki | 344615 | ||
| Mózg myszy we współrzędnych stereotaktycznych, Paxinos i Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (do przygotowania PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Przeciwciało hydroksylazy tyrozyny (TH) (źródło - królik) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene cienka folia do przygotowania próbki XRF | SPEX | 3525 | |
| Szerokokątny mikroskop fluorescencyjny | Zeiss | Axio Zoom.V16 |
Bibliografia
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 4/08/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. An author affiliation was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory
