Wykorzystanie systemów robotycznych do przetwarzania i osadzania próbek myszy okrężnicy do analiz histologicznych

Summary

Brak standaryzacji przetwarzania tkanek mysich obniża jakość analizy histopatologicznej myszy w porównaniu do próbek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania badania histopatologicznego mysich tkanek okrężnicy objętych stanem zapalnym i bez stanu zapalnego, aby wykazać wykonalność systemów robotycznych rutynowo stosowanych do przetwarzania i osadzania próbek ludzkich.

Abstract

Zrozumienie ludzkich chorób znacznie się poszerzyło dzięki badaniom na modelach zwierzęcych. Niemniej jednak ocena histopatologiczna modeli eksperymentalnych musi być równie rygorystyczna, jak w przypadku próbek ludzkich. Rzeczywiście, na wyciąganie wiarygodnych i dokładnych wniosków decydujący wpływ ma jakość przygotowania wycinków tkanek. W tym miejscu opisujemy protokół analizy histopatologicznej tkanek myszy, który realizuje kilka zautomatyzowanych kroków podczas zabiegu, od wstępnego przygotowania do zatopienia parafiny w próbkach myszy. Redukcja zmiennych metodologicznych poprzez rygorystyczną standaryzację protokołów z procedur zautomatyzowanych przyczynia się do zwiększenia ogólnej wiarygodności analizy patologicznej u myszy. W szczególności protokół ten opisuje wykorzystanie zautomatyzowanych systemów robotycznych do przetwarzania i osadzania, rutynowo stosowanych do przetwarzania tkanek i zatapiania parafiny w próbkach ludzkich, do przetwarzania mysich próbek zapalenia jelit. Stwierdzamy, że wiarygodność badania histopatologicznego tkanek myszy znacznie wzrasta po wprowadzeniu wystandaryzowanych i zautomatyzowanych technik.

Introduction

W ostatnich dziesięcioleciach opracowano kilka eksperymentalnych modeli do analizy mechanizmów patogennych prowadzących do chorób u ludzi^1,2. Aby ocenić nasilenie choroby, badacze muszą ocenić efekt leczenia i zbadać cytologiczne i histologiczne różnice architektoniczne lub ilość stanu zapalnego³. Aby przeprowadzić te badania na tych modelach eksperymentalnych, potrzebne są szczegółowe analizy histopatologiczne, często porównujące próbki mysie i ludzkie^4,5.

Dodatkowo, próbki ludzkie są powszechnie przetwarzane i oceniane przez główne placówki histopatologii i doświadczonych patologów za pomocą standardowych kryteriów i metod histopatologicznych. I odwrotnie, tkanki mysie są zwykle ustalane, osadzane i analizowane przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w protokołach histopatologicznych. Jakość i rzetelność badania histopatologicznego zaczyna się od przygotowania wysokiej jakości wycinków tkanek. Kilka czynników ma decydujący wpływ na zwiększenie lub obniżenie jakości końcowej analizy, w tym utrwalenie, makroskopowe przekroje, przetwarzanie, zatapianie parafiny i osadzanie próbek^6,7.

Wszystkie te przejścia związane z manipulacją próbką są poddawane ręcznym błędom, w tym ręcznemu osadzaniu próbek oraz, w mniejszym stopniu, ręcznemu cięciu i barwieniu mikrotomów. Obecnie cały proces przygotowania tkanek mysich do oceny histologicznej opiera się na protokołach, które różnią się w zależności od laboratorium i protokołu ręcznego. Celem tego badania jest wdrożenie ustandaryzowanych zautomatyzowanych protokołów w celu zmniejszenia błędów i zmienności w badaniu histopatologicznym na myszach.

O naszej wiedzy, opisujemy tutaj pierwsze protokoły do w pełni zautomatyzowanego przetwarzania i osadzania tkanek do oceny histologicznej tkanek mysich; są one rutynowo używane w jednostkach patologii do analiz próbek ludzkich. Jako praktyczny przykład wykonalności metody przeanalizowano mysi model zapalenia jelit, tj. model przewlekłego zapalenia jelita grubego spowodowanego wielokrotnym podawaniem siarczanu sodu dekstranu (DSS) w wodzie pitnej^8,9. To eksperymentalne ustawienie bardzo przypomina ludzkie nieswoiste zapalenie jelit (IBD)¹⁰, ponieważ zwierzęta leczone DSS wykazują oznaki zapalenia jelit, np. utratę wagi, luźny stolec lub biegunkę, skrócenie jelita grubego, a także zwłóknienie^8,9,11. Jak zaobserwowano u pacjentów z IBD, leczenie DSS generuje złożony przebieg choroby. W tym kontekście konieczne są szczegółowe oceny histologiczne, aby zrozumieć głębokie zmiany w architekturze tkanki. W związku z tym wdrożenie opisanych protokołów w celu poprawy jakości przygotowania próbek może przynieść korzyści naukowcom polegającym na interpretacji analiz histologicznych i immunohistochemicznych w warunkach eksperymentalnych na myszach. Mysie modele doświadczalne chorób człowieka obejmujące zmiany w architekturze tkanek, obecność nacieku tkanki komórkowej lub stan zapalny w różnych tkankach i narządach (jelito, mózg, wątroba, skóra) mogą wykorzystać zwiększoną jakość przygotowania próbki do badania histopatologicznego.

Protocol

Procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (Auth. 127/15, 27/13) i były zgodne z wytycznymi Europejskiego Instytutu Onkologii IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Indukcja przewlekłego zapalenia jelita grubego przez powtarzające się podawanie DSS

1. Oddzielne myszy dopasowane pod względem wieku i płci w 2 grupach (leczenie DSS vs. kontrola H₂O, co najmniej 5 miotu myszy na grupę eksperymentalną).
2. Podawać 2,5% DSS (40 kDa) w wodzie pitnej przez 7 dni grupie leczonej i wodzie grupie kontrolnej.
   nuta: Model ten wywołuje przewlekłe przezścienne zapalenie jelit⁹.
3. Po 7 dniach należy przerwać leczenie DSS i podawać wodę obu grupom przez 14 dni. Powtórz ten proces 3 razy.
   UWAGA: Powtarzające się podawanie DSS wywołuje zmiany w błonie śluzowej jelita grubego bardzo przypominające ludzkie IBD, tj. zwłóknienie⁹.
4. Myszy należy składać w ofierze zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny IACUC, tj. przez wdychanie CO₂ .
5. Otwórz brzuch myszy i otrzewną za pomocą skalpela.
   nuta: Sterylność jest zalecana, ale nie jest ściśle wymagana.
6. Oddziel okrężnicę od jelita cienkiego za pomocą kleszczy i pęsety. Wytnij okrężnicę pęsetą i kleszczami.
   nuta: Pomiar długości jelita grubego (Rysunek 1A) to metoda określania, czy zapalenie jelita grubego wystąpiło u myszy leczonych DSS.
7. Opłucz okrężnicę na szalce Petriego z 10 ml zimnego 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) i delikatnie dociśnij, aby usunąć kał.

2. Utrwalanie tkanek mysich

1. Zanurz każdą próbkę mysiej okrężnicy w 10 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF) w temperaturze pokojowej (RT).
   nuta: Sterylność jest zalecana, ale nie jest ściśle wymagana.
2. Utrwalaj tkankę przez 18–24 godziny w temperaturze pokojowej.

3. Cięcie jelita grubego i przygotowanie tkanek

1. Usuń utrwalone chusteczki z pojemnika NBF za pomocą małej pęsety i umieść je na szalce Petriego. Umieść dwukropek na płycie roboczej do krojenia za pomocą małej pęsety.
2. Dwukropki pokrój na kawałki (o długości od 0,2 cm do 0,3 cm) sterylnym skalpelem. Ta długość fragmentu jest optymalna, aby nie przekraczać grubości kasety.
3. Podnieś jeden segment dwukropka za pomocą małej pęsety (Rysunek 2A). Włóż jeden segment dwukropka do jednej z plastikowych wystających końcówek zorientowanej kasety do zatapiania parafiny za pomocą małej pęsety (Rysunek 2B).
4. Powtórz operację (3.2–3.3) z dodatkowymi 3 segmentami dwukropka na kasetę. Unikaj wkładania segmentów w sąsiednie wystające końcówki, aby zminimalizować nakładanie się tkanek
5. Szczelnie zamknij kasetę, ostrożnie dociskając cztery krawędzie (Rysunek 2C). Unikaj ściskania tkanki, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki.
6. Włóż siatkę do plastikowej ramy nośnej. Oznacz ramę nośną, aby zidentyfikować próbkę. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki biologicznej.

4. Przetwarzanie tkanek

1. Włącz automatyczny procesor, naciskając przycisk zasilania (Rysunek 3A, 3B).
2. Rozgrzej się przez 1 godzinę, aby zapewnić stopienie wosku parafinowego. Poczekaj, aż przyrząd potwierdzi, że parafina jest całkowicie stopiona, obserwując obecność dedykowanej ikony (Rysunek 3C).
3. Włóż każdą zorientowaną kasetę (zawierającą próbki tkanek) ręcznie do metalowego kosza dostarczonego przez automatyczny procesor (Rysunek 3D). Umieść kasety pionowo, ustawiając je blisko siebie, aby zoptymalizować zajętość kosza.
4. Zamknij metalowy kosz (Rysunek 3E).
5. Otwórz pokrywę retorty (Rysunek 3F). Retorta to miejsce, w którym kosz jest wkładany do maszyny. Włóż koszyk do dedykowanej obudowy procesora (Rysunek 3G). Zamknij pokrywę retorty (Rysunek 3H).
6. Użyj ekranu dotykowego na komputerze instrumentu, aby zdefiniować protokół roboczy ( Rysunek 3I). Należy wybrać sekwencję rozwiązań, czas i temperaturę, które mają zostać wdrożone, zgodnie ze schematem przedstawionym w tabeli 1.
7. Przypisz protokół, który ma zostać uruchomiony na retorcie zawierającej koszyk, klikając na dedykowaną ikonę komputera (Rysunek 3J). Uruchom protokół, klikając przycisk Start (Rysunek 3L).
8. Poczekaj, aż przyrząd potwierdzi koniec protokołu, obserwując obecność dedykowanej ikony i słysząc sygnał alarmowy dochodzący z urządzenia.
9. Otwórz pokrywę retorty. Wyjmij kosz z procesora (Rysunek 3M).

5. Osadzanie tkanek

1. Włącz automatyczne osadzanie, naciskając przycisk zasilania (Rysunek 4A).
2. Rozgrzej się przez 1 godzinę, aby zapewnić stopienie wosku parafinowego. Poczekaj, aż przyrząd potwierdzi, że parafina jest całkowicie stopiona, obserwując temperaturę kąpieli parafinowej wskazywaną przez wewnętrzny termometr przyrządu.
3. Ręcznie przenieś wszystkie przetworzone kasety z kosza procesora do stojaka do zatapiania. Każdy stojak może pomieścić do 32 kaset. (Rysunek 4B, 4C).
4. Otwórz główną pokrywę osadzacza (Rysunek 4C, 4D, 4E).
5. Użyj ekranu dotykowego na komputerze przyrządu, aby zasygnalizować systemowi robota, że stojak jest wkładany (Rysunek 4F).
6. Otwórz pokrywę obudowy wlotu powietrza (Rysunek 4G). Włóż stojak do obudowy wlotowej. Każdy moduł osadzający może zawierać do 4 stojaków jednocześnie (Rysunek 4H, 4I). Zamknij pokrywę obudowy wlotu powietrza (Rysunek 4J).
7. Użyj ekranu dotykowego na komputerze instrumentu, aby rozpocząć procedurę osadzania, zgodnie z tabelą 2 (Rysunek 4K).
   UWAGA: Osadzenie każdego stojaka z 32 kasetami zajmuje 45 minut.
8. Poczekaj, aż instrument potwierdzi koniec protokołu, obserwując obecność dedykowanej ikony ( Rysunek 4L).
9. Wyjmij stojak wylotowy (Rysunek 4M). Zamknij główną pokrywę osadzawki.
10. Wyjmij osadzone bloki (zawierające siatki orientacyjne) ze stojaka. Przenieś osadzone klocki w kartonowym pudełku do przechowywania.

6. Cięcie mikrometryczne

1. Włącz płytę chłodzącą mikrotomu. Ustaw temperaturę w zakresie od -8 do -10 °C.
2. Włączyć termostatyczną łaźnię wodną mikrotomu, zawierającą 2 l wody destylowanej. Ustawić temperaturę łaźni wodnej w zakresie 42–45 °C.
3. Umieść bloki zatopione w parafinie na płycie chłodzącej. Odczekaj co najmniej 5 minut, aby bloki ostygły.
4. Wyjmij jeden blok z płyty chłodzącej i umieść go w uchwycie bloku mikrotomu.
5. Ustaw grubość cięcia mikrotomu na 10 μm. Przytnij blok, przycinając go 6 razy o grubości 10 μm.
6. Zmień ustawienie grubości mikrotomu z 10 μm na 3 μm. Wytnij jeden odcinek 3 μm do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E).
7. Zbierz odcinek 3 μm za pomocą małej szczoteczki. Umieść odcinek 3 μm w łaźni wodnej, układając go ostrożnie na powierzchni wody, aby zmniejszyć zmarszczki tkanek. Pobrać wycinek tkanki z łaźni wodnej sterowanej termostatycznie na pojedynczym szkiełku podstawowym.
   1. W razie potrzeby wytnij dodatkowe sekcje.
8. Oznacz szkiełko szkiełkowe, wpisując dane identyfikacyjne próbki.
9. Wstaw szkiełka do piekarnika o temperaturze 37 °C na co najmniej 10 minut.
10. Szkiełka należy umieszczać w stojakach do natychmiastowych analiz lub w pudełkach do przechowywania.

7. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

1. Włącz automatyczny winiar, naciskając przycisk zasilania. Zezwól na inicjalizację ramienia robota, obserwując zmianę pręta załadowczego na monitorze przyrządów.
2. Włóż szkiełka do stojaka na witraże, wkładając pionowo do 30 szkiełek.
3. Oznacz stojak odpowiednią plastikową etykietą do identyfikacji radiowej (RFID). Znakowanie RFID to system identyfikujący prawidłowy protokół barwienia załadowany do komputera barwierki.
4. Włóż stojak do bejcy. Pozwól komputerowi automatycznie załadować i uruchomić protokół barwienia zgodnie z rozpoznaniem tagu RFID.
   nuta: Protokół barwienia H&E jest opisany w tabeli 3.

8. Barwienie immunohistochemiczne

1. Wykonaj barwienie immunohistochemiczne i trichromowe Mallory'ego, jak opisano wcześniej⁷.

Results

Eksperymentalne przewlekłe zapalenie jelita grubego wywołane wielokrotnym podawaniem DSS w wodzie pitnej to mysi model zapalenia jelit bardzo przypominający ludzki IBD8^,9. Rysunek 1 opisuje efekty leczenia DSS, w tym skrócenie jelita grubego (Rysunek 1A), szeroko stosowany parametr do oceny obecności zapalenia wywołanego przez DSS oraz ekspresji w okrężnicy genów prozapalnych, w tym CXCL...

Discussion

Wykorzystujemy różne zautomatyzowane kroki podczas przygotowania tkanek myszy do analizy histopatologicznej. Protokół ten ma na celu dostarczenie wskazówek technicznych w celu zwiększenia odtwarzalności i standaryzacji całego procesu, a tym samym poprawy ogólnej jakości końcowej oceny histopatologicznej. Wdrożyliśmy zautomatyzowane instrumenty i metody do przygotowywania i osadzania tkanek, rutynowo stosowane w podstawowych obiektach patologii do badania próbek ludzkich.

Aby wykazać potencjaln...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bezwodny etanol absolutny	Carlo Erba	414605	odczynnik
Absolute ETOH	Honeywell	02860-1L
odczynnik Aluminium Potassium Sulfate	SIGMA	A6435
Aniline Blue	Odczynnik	415049 SIGMA
Fuchsin	SIGMA	C4165
CD11b (klon M1/70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	przeciwciało
CD20 IHC (klon SA275A11)	Przeciwciało 150403 Biolegend
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	przeciwciało
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	przeciwciało
CD45.2 (klon 104)	Przeciwciało 109837 BioLegend
CD8 (53-6,7)	BD Biosciences	553031	przeciwciało
Bufor cytrynianowy pH 6 10x	odczynnik SIGMA	C9999
Odczynnik	Dab	Vector Laboratories	SK-4100
DPBS 1x	Microgem	L0615-500	odczynnik
DSS	TdB Consultancy	Odczynnik
EDTA	SIGMA	E9884
EnVision Flex Odczynnik blokujący peroksydazę	DAKO		compreso w GV80011-2
EnVision Flex Substrate	DAKO		compreso w GV80011-2
EnVision Flex/HRP	DAKO		compreso w GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	DAKO		compreso w GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	odczynnik
F4/80 (klon BM8)	Przeciwciało BioLegend	123108
Formalina	PanReac	2,529,311,215	odczynnik
Lodowaty kwas octowy	SIGMA	71251	Przeciwciało
Kozioł-anty-Szczur-HRP	Przeciwciało Agilent DAKO	P0448
	Odczynnik	DIAPATH	C0303
Mikrotom obrotowy LEICA (RM2255)	Leica	RM2255	sprzęt
Ly6g (klon 1A8)	Przeciwciało 551459 BD Biosciences
Odczynnik	203793	Mercury II Oxide	SIGMA
Omnis Clearify Clearing Agent	DAKO	CACLEGAL
Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	odczynnik
Orange G	SIGMA	O3756
Parafina	Odczynnik Sakura	7052
Peloris	Sprzęt LEICA
Odczynnik Percoll	SIGMA	P4937
RPMI 1640 bez L-Glutaminy	Microgem	L0501-500	odczynnik
STS020	Sprzęt Leica
Tissue-Teck Paraform Sectionable Kaseta	SAKURA	7022	sprzęt
Tissue-Tek Zautomatyzowany zatapiacz parafiny	Sprzęt Sakura
Odczynnik Xylene	J.T.Baker	8080.1000