Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zewnątrzkomórkowe i krążące RNA (exRNA) są wytwarzane przez wiele typów komórek ciała i występują w wielu płynach ustrojowych, takich jak ślina, osocze, surowica, mleko i mocz. Jednym z podzbiorów tych RNA są regulatory posttranskrypcyjne – mikroRNA (miRNA). Aby wyznaczyć miRNA wytwarzane przez określone typy komórek, można zastosować systemy hodowli in vitro do zbierania i profilowania exRNA pochodzących z jednego podzbioru komórek. Czynniki wydzielane przez mezenchymalne komórki macierzyste biorą udział w łagodzeniu wielu chorób i są tutaj wykorzystywane jako system modelowy in vitro. W artykule opisano proces pobierania, oczyszczania małych RNA i generowania biblioteki w celu sekwencjonowania zewnątrzkomórkowych miRNA. ExRNA z pożywek hodowlanych różnią się od komórkowego RNA tym, że są próbkami wejściowymi o niskiej zawartości RNA, co wymaga zoptymalizowanych procedur. Protokół ten stanowi kompleksowy przewodnik po sekwencjonowaniu małych exRNA z pożywek hodowlanych, pokazując punkty kontrolne kontroli jakości na każdym etapie oczyszczania i sekwencjonowania exRNA.
Wprowadzenie
Zewnątrzkomórkowe i krążące RNA (exRNA) są obecne w różnych płynach ustrojowych i są odporne na RNazy1,2. Ich duża liczebność, stabilność i łatwość dostępności są atrakcyjne dla oceny klinicznej jako markery diagnostyczne i prognostyczne 3. Sposób transportu exRNA obejmuje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), asocjację z lipoproteinami (takimi jak lipoproteiny o dużej gęstości; HDL) i kompleksy rybonukleoproteinowe (np. z kompleksami Argonaute2)4.
Podzbiór exRNA to mikroRNA (miRNA), które są małymi niekodującymi RNA o wielkości około 22 ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Pożywka do hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych (pożywka MSC) jest przygotowywana wcześniej, jak wskazano w Tabeli Materiałów.
1. Hodowla komórkowa
UWAGA: Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste można uzyskać ze szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej lub z innych źródeł11. Alternatywnie, hMSC można kupić za pośrednictwem dostawcy. BMSC użyte w tym protokole pochodziły ze szpiku kostnego pacjentów i zostały zakupione od firmy.
- Rozmrozić 1 x 106 BMSC w kolbie T175 zawierającej 20 ml pożywki MSC. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Metoda opisana w niniejszym protokole została zoptymalizowana pod kątem izolacji exRNA z hodowli MSC do sekwencjonowania nowej generacji. Ogólny schemat procesu przedstawiono na Rysunku 1 po lewej stronie, natomiast odpowiadające mu punkty kontroli jakości znajdują się po prawej stronie.
Przedstawiono morfologię komórek w dniu zbioru dla komórek niezróżnicowanych (Rycina 3A
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu opisujemy protokół sekwencjonowania exRNA nowej generacji, który umożliwia różnicową analizę ekspresji z próbek o niskiej wartości wejściowej. Przestrzeganie określonego protokołu izolacji EV i exRNA jest ważne, ponieważ nawet niewielkie zmiany (tj. etap ultrawirowania lub zmiana typu wirnika) mogą wpływać na transkryptom i poziomy miRNA13,14. Tak więc, niezależnie od tego, w jaki sposób exRNA jest izolowane, ważne jest, aby zastosować tę samą proce.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Panu Clausowi Busowi i Pani Ricie Rosendahl z iNANO za ich pomoc techniczną. Specjalne podziękowania dla dr Daniela Otzena za umożliwienie nam częstego korzystania z jego ultrawirówki. Badanie to było wspierane przez Duński Fundusz Innowacyjny (projekt MUSTER).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego | ATCC | PCS-500-012 | Komórki użyte w tym protokole zostały zakupione od ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Określany jako mezenchymalne podłoże wzrostu komórek macierzystych (pożywka MSC) |
| Zubożone w egzosomy FBS | Gibco | A2720801 | |
| Pożywka zbierająca ExRNA: MSCGM, ale z FBS zastąpionym przez FBS zubożony w egzosomy FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Kolba | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140122 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem | Sigma | 806552 | |
| Ultrawirówka | Beckman Coulter | ||
| Butelka z poliwęglanu z zespołem nakrętki | Beckman Redlica | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Zastosowany tutaj | ||
| rotor NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Licznik komórek |
| beta;-glicerofosforan | Calbiochem | 35675 | Składniki pożywki różnicującej osteogennej |
| Deksametazon | Sigma | D4902-25MG | Składniki pożywki różnicowania osteogennego |
| 2-fosfo-L-askorbinowy kwasowa sól trisodowa | Sigma | 49752-10G | Składniki osteogennej pożywki różnicującej |
| 1&alfa;,25-Dihydroksywitamina D3 | Sigma | D1530-1MG | Składniki pożywki do różnicowania osteogennego |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | zestaw do oczyszczania miRNA i całkowitego RNA dla kroku 4.8 |
| Zestaw Agilent RNA 6000 Pico | Agilent Technologies | 5067-1514 | Maszyna do elektroforezy kapilarnej na bazie chipów i chipy do analizy RNA i DNA |
| Bioanalizator Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939BA | Maszyna do elektroforezy kapilarnej na bazie chipów i chipy do analizy RNA i DNA |
| Zestaw DNA Agilent o wysokiej czułości | Agilent Technologies | 5067-4626 | Maszyna do elektroforezy kapilarnej na bazie chipów i chipy do analizy RNA i DNA |
| Zestawy kwantyfikacyjne biblioteki KAPA | Roche | KK4824 | Zestaw do kwantyfikacji biblioteki |
| TruSeq Small RNA Zestaw do przygotowania biblioteki -Zestaw A (24 rxns) (Zestaw A: indeksy 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Mały zestaw preparacyjny biblioteki RNA używany w tym protokole - używany w kroku 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automatyczny ekstraktor żelu DNA używany w tym protokole; można również przeprowadzić ekstrakcję ręczną | |
| Zestaw do oczyszczania PCR MinElute Oczyszczanie | Qiagen | 28004 | w kroku 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Laboratorium | Przycinanie odczytów niskiej jakości w kroku 6 | |
| cutadapt | Demontaż adaptera w kroku 6 | ||
| Mapowanie muszki | czystych odczytów w kroku 6 | ||
| Samtools | Aby utworzyć profil wyrażenia w kroku 6 | ||
| Bedtools | Aby utworzyć profil wyrażenia w kroku 6 |
Bibliografia
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circul....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
