Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie bezkomórkowych rusztowań matrycowych pochodzących z chrząstki

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58656

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, University Medical Center Utrecht, The Netherlands, 2Department of Veterinary Medicine, Equine Surgery, University of Utrecht, The Netherlands

W tym artykule

Podsumowanie

Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z chrząstki mogą być używane jako rusztowanie do naprawy chrząstki i jako środek do regeneracji tkanki kostno-chrzęstnej. W artykule szczegółowo opisano proces decelularyzacji i przedstawiono sugestie dotyczące wykorzystania tych rusztowań w warunkach in vitro.

Streszczenie

Ubytki kostno-chrzęstne nie mają wystarczającej wewnętrznej zdolności naprawczej, aby zregenerować funkcjonalnie zdrową tkankę kostną i chrzęstną. W tym zakresie badania nad chrząstkami skupiły się na rozwoju rusztowań regeneracyjnych. W artykule opisano rozwój rusztowań, które w całości pochodzą z naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki, pochodzącej od dawcy koniowatych. Potencjalne zastosowania rusztowań obejmują produkcję przeszczepów allogenicznych do naprawy chrząstki, służenie jako rusztowanie dla inżynierii tkanki kostno-chrzęstnej oraz dostarczanie modeli in vitro do badania powstawania tkanek. Poprzez decellularizację tkanki komórki dawcy są usuwane, ale uważa się, że wiele naturalnych sygnałów bioaktywnych zostaje zachowanych. Główną zaletą stosowania takiego naturalnego rusztowania w porównaniu z rusztowaniem wytwarzanym syntetycznie jest to, że nie jest wymagana dalsza funkcjonalizacja polimerów w celu napędzania regeneracji tkanki kostno-chrzęstnej. Rusztowania matrycowe pochodzące z chrząstki mogą być stosowane do regeneracji tkanki kostnej i chrzęstnej zarówno in vivo, jak i in vitro.

Wprowadzenie

Ubytki chrząstki stawowej w kolanie spowodowane traumatycznymi wydarzeniami mogą prowadzić do dyskomfortu, a przede wszystkim mogą mieć duży wpływ na życie młodej i aktywnej populacji1,2,3. Co więcej, uszkodzenie chrząstki w młodym wieku może prowadzić do szybszego wystąpienia choroby zwyrodnieniowej stawów w późniejszym życiu4. Obecnie jedyną terapią ratunkową w przypadku uogólnionej choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego jest operacja wymiany stawu. Ponieważ chrząstka jest tkanką hipokomórkową, tętniakową i beznaczyniową, jej zdolność regeneracyjna jest poważnie ograniczona. Dlatego poszukiwane są podejścia medycyny regeneracyjnej, aby wspomóc i stymulować zdolność regeneracyjną tkanki natywnej. W tym celu rusztowania są projektowane i używane albo jako nośnik komórek, albo jako materiał indukcyjny, który pobudza różnicowanie i regenerację tkanek przez natywne komórki organizmu5.

Rusztowania bezkomórkowe były szeroko badane w medycynie regeneracyjnej6. Odniosła pewne sukcesy, na przykład we wspomaganiu regeneracji skóry7, struktur brzucha8 i ścięgien9. Zaletą stosowania rusztowań bezkomórkowych jest ich naturalne pochodzenie i zdolność do zatrzymywania bioaktywnych sygnałów, które zarówno przyciągają, jak i indukują różnicowanie komórek w odpowiednią linię wymaganą do naprawy tkanek6,10. Co więcej, ponieważ macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest naturalnym biomateriałem, a decelularyzacja zapobiega potencjalnej odpowiedzi immunologicznej poprzez usunięcie zawartości komórkowej lub genetycznej, problemy dotyczące biokompatybilności i biodegradowalności zostają przezwyciężone.

Rusztowania macierzy pochodzącej z chrząstki (CDM) wykazały duży potencjał chondrogenny w eksperymentach in vitro, gdy zostały obsiane mezenchymalnymi komórkami zrębu11. Ponadto rusztowania te wykazały potencjał do tworzenia tkanki kostnej poprzez kostnienie śródchrzęstne w miejscach ektopowych w warunkach in vivo12. Ponieważ rusztowania CDM kierują tworzeniem zarówno tkanki kostnej, jak i chrzęstnej, rusztowania te mogą mieć potencjał do naprawy ubytków kostno-chrzęstnych oprócz naprawy chrząstki.

Ten artykuł opisuje protokół zaadaptowany z Yang et al. (2010)13 do produkcji bezkomórkowych rusztowań CDM z chrząstki kolanowej koni. Rusztowania te są bogate w kolagen typu II i pozbawione komórek, a po decelularyzacji nie zawierają glikozaminoglikanów (GAG). Za pomocą tych rusztowań można przeprowadzać zarówno eksperymenty in vitro, jak i in vivo dotyczące naprawy ubytków (kostno)chrzęstnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Dla tego protokołu, chrząstka kolanowa koni została uzyskana od koni, które padły z innych przyczyn niż choroba zwyrodnieniowa stawów. Tkanka została pozyskana za zgodą właścicieli, zgodnie z instytucjonalnymi regulacjami etycznymi.

UWAGA: Ten protokół opisuje wytwarzanie rusztowań z bezkomórkowego chrząstki koniowatych, które mogą być używane do zastosowań takich jak platformy do hodowli tkanek in vitro lub do implantacji in vivo w strategiach medycyny regeneracyjnej. Etapy obróbki enzymatycznej muszą być wykonywane w opisanej kolejności chronologicznej.

1. Pobieranie chrząstki stawowej ze stawów dawcy (zwłok)

  1. Przed etapem zbioru należy przygotować 1 l roztworu do przemywania chrząstek, składającego się ze sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami (PBS), uzupełnionego 100 j./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 1% (v/v) amfoterycyny B.
  2. Podczas całej procedury pobierania należy nosić rękawice i fartuch laboratoryjny, ponieważ dawca może być nosicielem patogenów.
  3. Uzyskać nienaruszony (martwy) staw do izolacji chrząstki.
    UWAGA: W tym momencie skóra wokół stawu jest nadal nienaruszona. W tym protokole wykorzystano chrząstkę kolanową koni uzyskaną z konia, ale można również wykorzystać inne stawy innych gatunków.
  4. Usuń skórę znajdującą się wokół interesującego Cię obszaru stawu za pomocą skalpela i pęsety chirurgicznej. Ponadto w razie potrzeby usuń nadmiar tkanki tłuszczowej i mięśniowej, nie uszkadzając leżącego poniżej stawu. Opcjonalnie należy przenieść przygotowane zwłoki do komory bezpieczeństwa biologicznego.
  5. Aby wykonać artrotomię, czyli oddzielenie stawu, najpierw określ miejsce, w którym staw się łączy, wykonując wyprost i zgięcie stawu.
  6. Ostrożnie usuń więcej warstw tłuszczu, mięśni i ścięgien za pomocą skalpela i pęsety chirurgicznej, aby otworzyć obszar stawu.
  7. Wykonaj nacięcie, aby dotrzeć do jamy stawowej.
    UWAGA: Jama stawowa jest wypełniona płynem maziowym, który może kapać z jamy podczas wykonywania prawidłowego nacięcia.
  8. Kontynuuj całkowite otwieranie stawu, przecinając ścięgna, które utrzymują staw razem.
  9. Sprawdź chrząstkę pod kątem uszkodzeń makroskopowych.
    UWAGA: Jeśli chrząstka stawowa nie ma błyszczącego i gładkiego wyglądu lub jeśli występują widoczne pęcherze, rozszczepy lub defekty, wyrzuć chrząstkę.
  10. Użyj sterylnego skalpela, aby usunąć chrząstkę z kości podchrzęstnej. Przyciąć aż do kości podchrzęstnej, aby usunąć również głęboką strefę chrząstki (Rysunek 1). Aby zapobiec wysychaniu chrząstki, regularnie kap roztwór do mycia chrząstki na chrząstkę.
    UWAGA: W tej chwili wielkość plastrów chrząstki nie ma znaczenia.
  11. Zbierz plastry chrząstki do probówek o pojemności 50 ml zawierających wcześniej przygotowany roztwór do przemywania chrząstki (Rysunek 2A).
  12. Po pobraniu chrząstki ze wszystkich obszarów zainteresowania, należy zamrozić plastry chrząstki w ciekłym azocie na 5 minut.
  13. Przenieś plastry chrząstki do probówek o pojemności 50 ml i natychmiast liofilizuj plastry chrząstki przez 24 godziny w liofilizatorze. Ustaw liofilizator na około 0,090 mbar, podczas gdy skraplacz lodu ma temperaturę -51 °C (Rysunek 2B).
  14. Przechowuj plastry chrząstki w suchym miejscu w temperaturze pokojowej do dalszego użycia.
    UWAGA: Aż do momentu powstania rusztowania roztwory i chrząstki nie muszą być przygotowywane i traktowane w sposób sterylny.

2. Tworzenie bezkomórkowych cząstek chrząstki

  1. Zanurz liofilizowane plastry chrząstki w ciekłym azocie.
  2. Próbki należy mielić bezpośrednio, ręcznie lub za pomocą frezarki. Podczas ręcznego mielenia plastrów chrząstki użyj moździerza i tłuczka i miel plastry przez około 45 minut, aż zostaną sproszkowane (Rysunek 2C i 2D). Podczas mielenia automatycznego używaj frezarki z ustawioną prędkością przez kilka sekund do minuty, aż zamrożone plastry chrząstki zostaną sproszkowane.
    UWAGA: Wstępnie schłodzić zaprawę lub komorę mielenia frezarki, dodając ciekły azot. Podczas korzystania z frezarki upewnij się, że wszystkie cząstki są zmielone i że żadne cząstki nie pozostają na dnie komory mielenia.
  3. Przesiej cząstki chrząstki, aby pozbyć się większych części, za pomocą sita o rozmiarze oczek 0,71 mm.
  4. Przechowuj cząstki w suchym miejscu w temperaturze pokojowej.

3. Decelularyzacja enzymatyczna za pomocą trypsyny 0,25%-EDTA

  1. Przygotować roztwór wytrawiający składający się z 0,25% trypsyny z EDTA uzupełnionej 100 j./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 1% (v/v) amfoterycyny B. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Trypina to proteaza, która degraduje białka znajdujące się w tkance chrzęstnej. Ten enzymatyczny krok otworzy gęstą strukturę chrząstki.
  2. Napełnij probówki o pojemności 50 ml sproszkowanymi cząstkami chrząstki do objętości około 7,5 ml na probówkę.
  3. Cząstki chrząstki inkubować w przygotowanym roztworze wytrawiającym w temperaturze 37 °C łącznie przez 24 godziny, odświeżając roztwór do wytrawiania co 4 godziny.
    1. Najpierw dodaj 30 ml roztworu wytrawiającego do każdej 50 ml probówki zawierającej cząsteczki chrząstki.
    2. Następnie ponownie zawiesić cząstki za pomocą wiru lub pipety, tak aby wszystkie cząstki zostały wystawione na działanie roztworu enzymatycznego.
    3. Inkubować próbki przez 4 godziny w temperaturze 37 °C na walcu.
    4. Aby odświeżyć roztwór wytrawiający, należy odwirować probówki przez 20 minut przy stężeniu 3113 x g, aby spowodować sedymentację cząstek chrząstki. Odrzucić supernatant.
      UWAGA: Supernatant będzie stawał się coraz bardziej klarowny z każdym okresem inkubacji trypsyny.
    5. Powtarzać kroki 3.3.1–3.3.4 aż do momentu, gdy cząstki będą inkubowane z roztworem wytrawiającym przez 6 cykli po 4 godziny.
  4. Po ostatnim cyklu, po odwirowaniu, usunąć sklarowany osad i dwukrotnie przemyć cząstki w 30 ml roztworu do przemywania chrząstek. Odwirowywać cząstki przez 20 minut przy ciśnieniu 3113 x g między każdym z płukań.

4. Decelularyzacja enzymatyczna z leczeniem nukleazą

  1. Przygotuj 10 mM roztwór Tris-HCl o pH 7,5 w wodzie dejonizowanej.
  2. Dodać 50 U/ml dezoksyrybonukleazy i 1 U/ml rybonukleazy A do buforu Tris-HCl, aby otrzymać roztwór nukleazy.
    UWAGA: Ten etap jest wykonywany w celu specyficznej degradacji dezoksyrybonukleaz i rybonukleaz.
  3. W celu usunięcia roztworu do przemywania chrząstki z cząstek chrząstki (krok 3.4), odwirować przez 20 minut przy stężeniu 3,113 x g i usunąć supernatant.
  4. Dodaj 30 ml roztworu nukleazy do cząstek chrząstki i wymieszaj cząstki przez roztwór, upewniając się, że wszystkie cząstki są wystawione na działanie roztworu nukleazy.
  5. Próbki inkubować na walce przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  6. Usunąć roztwór nukleazy przez odwirowanie cząstek chrząstki przez 20 minut przy stężeniu 3,113 x g i odrzucić supernatant.
  7. Przemyć próbki, dodając 30 ml 10 mM roztworu Tris-HCl bez dezoksyrybonukleazy i rybonukleazy A do cząstek chrząstki. Ponownie zawiesić cząstki i pozostawić próbki na walce na 20 godzin w temperaturze pokojowej.

5. Decelularyzacja detergentu

  1. Przygotuj roztwór detergentu, rozpuszczając 1% (v/v) okoksynol-1 w PBS.
  2. Usunąć roztwór Tris-HCl z cząstek chrząstki przez odwirowanie przez 20 minut przy stężeniu 3,113 x g i wyrzucić supernatant.
  3. Do cząsteczek chrząstki dodać 30 ml przygotowanego 1% roztworu detergentu. Delikatnie zawiesić cząsteczki chrząstki, aby uniknąć pienienia się roztworu.
    UWAGA: Ten krok rozbija błony komórkowe.
  4. Próbki inkubować na walcu przez 24 godziny w temperaturze pokojowej na walcu.
  5. Usunąć roztwór detergentu przez odwirowanie przez 20 minut przy 3,113 x g i wyrzucić supernatant.
  6. Aby usunąć wszystkie pozostałości roztworów decelularyzacyjnych, przemyj cząsteczki chrząstki w 6 cyklach po 8 godzin w 30 ml roztworu do przemywania chrząstki. Pranie wykonuj na wałku w temperaturze pokojowej.
    1. Aby przejść do następnego przemycia, odwirować zawiesinę przez 20 minut przy 3,113 x g, odrzucić supernatant i dodać świeży roztwór do przemywania chrząstek.
  7. Pozostaw ostatnie płukanie w probówkach i przechowuj pozbawione komórek cząstki chrząstki w temperaturze -80 °C.

6. Tworzenie rusztowań z cząstek pozbawionych komórek

  1. Jeśli cząstki były przechowywane w temperaturze -80 °C, przed utworzeniem rusztowań należy rozmrozić zamknięte rurki zawierające cząstki chrząstki w ciepłej wodzie.
  2. Przenieś cząstki chrząstki małą chochlą do cylindrycznej formy, na przykład plastikowej fiolki o średnicy 8 mm i wysokości 2 cm.
  3. Umieszczając cząstki chrząstki w plastikowej formie, wyciśnij wszystkie pęcherzyki powietrza, aby uniknąć ubytków w rusztowaniu, i wypełnij formę aż do krawędzi.
    UWAGA: Trudniej będzie wyjąć rusztowania z metalowej formy po uformowaniu rusztowania, co może prowadzić do pęknięć rusztowania.
  4. Zamrozić foremki z cząstkami chrząstki na 10 minut w temperaturze -20 °C.
  5. Liofilizuj rusztowania chrząstki w ich formach przez 24 godziny w liofilizatorze.
  6. Po liofilizacji wyjmij rusztowanie z formy (Rysunek 3) i usieciuj je światłem ultrafioletowym (UV) w odległości 30 cm i 365 nm przez noc.
  7. Aby wykorzystać rusztowania do hodowli komórkowych in vitro lub implantacji in vivo, należy wysterylizować rusztowania np. gazem tlenek etylenu (EtO).
    UWAGA: Sterylizacja EtO jest wykonywana przez podmiot zewnętrzny.

7. Charakterystyka rusztowań bezkomórkowych z barwieniami histologicznymi

UWAGA: Aby zapewnić całkowitą decelularyzację i uwidocznić pozostały naturalny charakter chrząstki, wykonaj kilka barwień histologicznych przed użyciem rusztowań w jakimkolwiek eksperymencie, w tym barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu zapewnienia decelularyzacji, barwienie Safraniną-O w celu wizualizacji resztkowej obecności GAG, immunohistochemia kolagenu typu I w celu rozróżnienia między zawartością kolagenu a kolagenem typu II immunohistochemia w celu rozróżnienia zawartości kolagenu.

  1. Pokrój rusztowania w cienkie plasterki o grubości około 3 mm za pomocą skalpela.
    UWAGA: Jeśli rusztowania są cięte w większych lub mniejszych rozmiarach, należy dostosować czas trwania cykli odwadniania.
  2. Osadź rusztowania w kropli 4% (w/v) alginianu i wywołaj sieciowanie, dodając podobną objętość 3,7% niebuforowanej formaliny, która zawiera 20 mM CaCl2,
    UWAGA: Osadzanie alginianu sprawia, że plastry rusztowania są sztywniejsze w porównaniu z etapami mycia przed zatopieniem parafiny. W przypadku, gdy rusztowania zostały wysiane komórkami lub wszczepione in vivo, osadzanie alginianów nie jest konieczne, ponieważ skład rusztowań będzie wystarczająco odporny ze względu na włączenie ECM przez komórki.
  3. Odwodnić próbki, umieszczając je w serii stopniowanego etanolu, rozpoczynając od jednogodzinnych cykli 70%, 96%, 96%, 100% i 100% etanolu, następnie dwóch 1-godzinnych cykli ksylenu, a kończąc na dwóch 1-godzinnych cyklach parafiny w temperaturze 60 °C.
  4. Po odwodnieniu próbki należy zatopić parafiną w formie i schłodzić próbki.
  5. Pokrój próbki za pomocą mikrotomu na plastry o grubości 5 μm.
  6. Przed barwieniem należy ponownie uwodnić próbki, umieszczając je w zwróconej serii sortowanego etanolu. Zacznij od dwóch prań ksylenu przez 5 minut, a następnie 2 prania 100%, 95% i 70% etanolu przez 3 minuty na pranie. Na koniec umyj próbki 3 razy w wodzie przez 2 min.
    UWAGA: W przypadku stosowania alginianu do przetwarzania próbek do zatapiania parafiny, należy pamiętać o zmyciu alginianu 10 mM kwasem cytrynowym przed ponownym uwodnieniem skrawków parafiny.
  7. Wybarwić próbki hematoksyliną i eozyną, Safraniną-O, kolagenem I i kolagenem II, jak opisano wcześniej11.

8. Charakterystyka rusztowań bezkomórkowych za pomocą analiz ilościowych

  1. Uzyskaj trawienia papainy rusztowań, jak opisano wcześniej11.
  2. Wykonaj test za pomocą zestawu do kwantyfikacji DNA opartego na fluorescencji, aby zmierzyć zawartość dwuniciowego DNA w rusztowaniach, aby zapewnić całkowitą decelularyzację. Postępuj zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Wyrazić ilość DNA na suchą masę rusztowania.
  3. Wykonaj test błękitu dimetylometylenowego, aby określić ilościowo pozostałą część GAG w rusztowaniu, jak opisano wcześniej11. Wyraź ilość w GAG na DNA.

9. Zasiewanie rusztowań zdecelularyzowanych

  1. Wysterylizowane rusztowania z kroku 6.7 pokrój w plastry o grubości 3 mm.
  2. Przenieś rusztowania do oddzielnych studzienek z 6-dołkowej płyty.
  3. Ponownie uwodnić rusztowania za pomocą pożywki do hodowli komórkowych, pipetując 1 ml pożywki na rusztowanie i pozostawić do namoczenia przez 30 minut. Użyj pożywki do ekspandowania chondrocytów lub mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC).
    Uwaga: Do ponownego nawodnienia rusztowania należy użyć tego samego podłoża, co do hodowli komórkowych komórek, które zostaną wysiane. Pożywka do ekspandacji chondrocytów składa się ze zmodyfikowanej pożywki Dulbecco (DMEM) z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny i 10 ng / ml czynnika wzrostu fibroblastów-2 (FGF-2). Pożywka ekspandująca MSC składa się z minimalnej niezbędnej pożywki alfa (a-MEM) z 10% inaktywowanym termicznie FBS, 0,2 mM 2-fosforanu L-askorbinowego, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10 ng/ml FGF-2.
  4. Przygotować 3 x 106 komórek w 100 μl podłoża, co stanowi wymaganą objętość dla każdego rusztowania o średnicy 8 mm i wysokości 3 mm.
    UWAGA: Do wysiewu można użyć wielu typów komórek z różnych gatunków. W przypadku korzystania z chondrocytów lub mezenchymalnych komórek zrębu należy je wyizolować zgodnie z wcześniejszym opisem11. Podczas korzystania z chondrocytów upewnij się, że nie zostały one rozszerzone poza pasaż P1, aby zminimalizować liczbę odróżnicowanych chondrocytów. W przypadku korzystania z mezenchymalnych komórek zrębowych, muszą one zostać przetestowane pod kątem ich zdolności do różnicowania wieloliniowego, jak opisano wcześniej14.
  5. Odmierzyć pipetą 50 μl przygotowanej zawiesiny komórkowej na wierzch wstępnie namoczonego rusztowania i inkubować rusztowanie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  6. Ostrożnie obrócić rusztowanie do góry dnem, odpipetować pozostałe 50 μl zawiesiny komórkowej po tej stronie rusztowania i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  7. Po inkubacji dodać 3 ml pożywki do studzienek i wyhodować rusztowania z nasionami komórek w temperaturze 37 °C. Z płytką hodowlaną obchodzić się delikatnie, aby uniknąć oderwania komórek.
  8. Hoduj rusztowania przez czas wymagany do eksperymentu i zmieniaj pożywkę 2-3 razy w tygodniu. Pigazuj powoli i jak najdalej od rusztowania.
  9. Po wyhodowaniu rusztowania wysiewanego przez komórki, należy przeciąć rusztowania na pół i przetworzyć je zarówno do analiz histologicznych, jak i biochemicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Decelularyzację rusztowań CDM należy zawsze potwierdzić za pomocą barwień histologicznych oraz ilościowego oznaczania DNA w celu zmierzenia ilości pozostałości DNA. Niewystarczająca decelularyzacja może prowadzić do niepożądanych odpowiedzi immunologicznych, które wpływają na wyniki w warunkach in vivo15,16,17. W przypadku tej konkretnej metody decelularyzacji poziom DNA znajdował się poniżej zak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

ECM chrząstki stawowej jest bardzo gęsty i dość odporny na różne zabiegi enzymatyczne. Wieloetapowy protokół decelularyzacji opisany w tym artykule rozwiązuje taką oporność i z powodzeniem generuje matryce bezkomórkowe. Aby to osiągnąć, proces ten trwa kilka dni. Zaproponowano wiele procesów decelularyzacji dla różnych typów tkanek18, a w tym artykule opisano protokół odpowiedni do decelularyzacji chrząstki. W tym protokole konieczne jest jednak przestrzeganie etapów leczenia enzymatycznego deterg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują W. Bootowi za pomoc w produkcji rusztowań. K.E.M. Benders jest wspierany przez Alexandre Suerman Stipendium z Uniwersyteckiego Centrum Medycznego. R. Levato i J. Malda są wspierani przez Holenderską Fundację Zapalenia Stawów (umowy o grant odpowiednio CO-14-1-001 i LLP-12).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
StawMożna go uzyskać jako materiał resztkowy od lokalnego rzeźnika lub centrum weterynaryjnego.
Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
Penicylina-StreptomycynaGibco15140
Amfoterycyna BThermo Fischer Scientific15290026
Ciekły azot
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermo Fischer Scientific25200072
Tris-HCl pH 7,5
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcejSigma-AldrichDN25
Rybonukleaza A z trzustki bydlęcejSigma-AldrichR6513
Triton X-100 (oktoksynol-1)Sigma-AldrichX100
PapainaSigma-AldrichP3125
Cytrynian trisodowy dwuwodnySigma-AldrichS4641
AlginianSigma-Aldrich180947
Formalina
CaCl2
Etanol
Ksylen-parafina
Sterylizacja tlenkiem etylenuSynergy Health, Venlo, Holandia
Multipotencjalne komórki/chondrocyty zrębu od dawców koniMSC i chondrocyty można wyizolować ze stawów dawcy, które są materiałem spoczynkowym, pochodzącym z lokalnego rzeźnika lub centrum weterynaryjnego.
MEM alphaThermo Fischer Scientific22561
2-fosforan kwasu L-askorbinowegoSigma-AldrichA8960
DMEMThermo Fischer Scientific41965
Inaktywowana termicznie albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich10735086001
Czynnik wzrostu fibroblastów-2 (FGF-2)R & Zestaw233-FB
(Quant-iT PicoGreen odczynnik dsDNA)Thermo Fischer ScientificP7581
1,9-dimetylo-metylenowy niebieski chlorek podwójna sólSigma-Aldrich341088
LiofilizatorSALMENKIPPALPHA 1-2 LD plus
Młyn analitycznyIKAA 11 podstawowy
moździerz/tłuczekHaldenwanger 55/0A
Płyta rolkowaWirówka CATRM5
(do probówek 50 ml)Eppendorf5810R
Kapsułka (forma cylindryczna)TAAB8 mm płaska
Superlite S UVLumatec2001AV
Inkubator
Microtome
Sito (rozmiar oczka 0,71 mm)VWR34111229
Skalpel
Uchwyt
Mała chochla
ze zwłok do oznaczania ilościowego DNA D Systems na skalpel

Bibliografia

  1. Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
  2. Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
  3. Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
  4. Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
  5. Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
  6. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  7. Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
  8. Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
  9. Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
  10. Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
  11. Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
  12. Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
  13. Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
  14. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  15. Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
  16. Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
  17. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  18. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  19. Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683(2013).
  20. Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
  21. Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
  22. Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Decelularyzowane rusztowanie chrz stneizolacja chrz stkidecelularyzacja tkanekwytwarzanie rusztowaniaregeneracja chrz stkisieciowanie rusztowaniarehydratacja rusztowaniazasiew kom rekcharakterystyka rusztowaniaanaliza biochemiczna
Wytwarzanie bezkomórkowych rusztowań matrycowych pochodzących z chrząstki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.