Artykuł metodologiczny

Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych za pomocą jednoetapowej obróbki zimną plazmą atmosferyczną in vitro

DOI:

10.3791/58663

⸱

11 stycznia 2019

 ,  , 
1State Key Laboratory of Advanced Electromagnetic Engineering and Technology, Huazhong University of Science and Technology, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych etapów eksperymentalnych leczenia komórkami macierzystymi układu nerwowego zimną plazmą atmosferyczną oraz wykrywania immunofluorescencji w celu poprawy różnicowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z rozwojem technologii plazmy fizycznej, plazmy zimnej atmosfery (CAP) były szeroko badane w procesie dekontaminacji, leczenia raka, gojenia się ran, leczenia kanałowego itp., tworząc nową dziedzinę badań o nazwie medycyna plazmowa. Będąc mieszaniną elektrycznie, chemicznie i biologicznie reaktywnych, CAP wykazały swoje zdolności do zwiększania różnicowania nerwowych komórek macierzystych zarówno in vitro, jak i in vivo i stają się obiecującym sposobem leczenia chorób neurologicznych w przyszłości. O wiele bardziej ekscytującą wiadomością jest to, że zastosowanie CAP może umożliwić jednoetapowe i bezpiecznie ukierunkowane różnicowanie nerwowych komórek macierzystych (NSC) do transportu tkanek. Pokazujemy tutaj szczegółowy protokół eksperymentalny polegający na użyciu samodzielnie wykonanego urządzenia strumieniowego CAP w celu zwiększenia różnicowania NSC w C17.2-NSC i pierwotnych nerwowych komórkach macierzystych szczura, a także obserwacji losu komórek za pomocą mikroskopii odwróconej i fluorescencyjnej. Za pomocą technologii barwienia immunofluorescencyjnego stwierdziliśmy, że oba NSC wykazywały przyspieszoną różnicę niż grupa nieleczona, a ~ 75% NSC selektywnie różnicowało się w neurony, które są głównie neuronami dojrzałymi, cholinergicznymi i ruchowymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukierunkowane różnicowanie NSC w pewną linię transportu tkanek jest uważane za jedną z najbardziej obiecujących terapii chorób neurodegeneracyjnych i neurotraumatycznych1. Na przykład katecholaminergiczne neurony dopaminergiczne są szczególnie pożądane w leczeniu choroby Parkinsona (PD). Jednak tradycyjne metody przygotowania pożądanych komórek do transportu mają wiele wad, takich jak toksyczność chemiczna, tworzenie się blizn lub inne, co w dużej mierze utrudnia zastosowanie NSC w medycynie regeneracyjnej2. Dlatego bardzo ważne jest znalezienie nowatorskiego i bezpiecznego sposobu różnicowania NSC.

Plazma jest czwartym stanem materii, po stałym, ciekłym i gazowym, i stanowi ponad 95% materii w całym wszechświecie. Plazma jest elektrycznie obojętna z niezwiązanymi cząstkami dodatnimi/ujemnymi i obojętnymi i jest zwykle generowana przez wyładowanie wysokonapięciowe w laboratorium. W ciągu ostatnich dwóch dekad zastosowanie plazmy w biomedycynie przyciągnęło ogromną uwagę na całym świecie wraz z rozwojem technologii plazmy pod zimnym ciśnieniem atmosferycznym. Dzięki tej technice, stabilna plazma niskotemperaturowa może być generowana w otaczającym powietrzu w atmosferze bez tworzenia łuku i składa się z różnych reaktywnych form, takich jak reaktywne formy azotu (RNS), reaktywne formy tlenu (ROS), promieniowanie ultrafioletowe (UV), elektrony, jony i pole elektryczne3. Płytki o wysokiej odporności na mikroorganizmy mają wyjątkowe zalety w zakresie inaktywacji mikroorganizmów, terapii nowotworów, gojenia się ran, leczenia chorób skóry, proliferacji komórek i różnicowania komórek4,5,6,7. W poprzednich pracach wykazaliśmy, że strumień plazmy z zimnej atmosfery może zwiększyć różnicowanie NSC zarówno w mysich nerwowych komórkach macierzystych C17.2 (C17.2-NSC), jak i pierwotnych nerwowych komórkach macierzystych szczurów, wykazując ogromny potencjał, aby stać się potężnym narzędziem do ukierunkowanego różnicowania NSCs8. Chociaż mechanizm wzmacniania zróżnicowania NSC w ramach WPR nie jest jeszcze w pełni poznany, udowodniono, że NO generowany przez CAP jest kluczowym czynnikiem w tym procesie. W tej pracy staramy się przedstawić szczegółowy protokół eksperymentalny wykorzystania strumienia plazmy helowo-tlenowej pod ciśnieniem atmosferycznym do leczenia NSC in vitro, przygotowania i wstępnego leczenia komórek, obserwacji morfologii za pomocą mikroskopu odwróconego oraz obserwacji barwienia immunofluorescencyjnego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowle komórkowe i predyferencjacja

  1. Hodowla nerwowych komórek macierzystych i preróżnicowanie
    1. Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną. Umieścić sterylne szkiełko nakrywkowe (o średnicy 20 mm) na płytkę 12-dołkową. Pokryj szkło nakrywkowe poli-D-lizyną, 0,1% w/v, w wodzie (tabela materiałów), aby uzyskać lepszą przyczepność komórek do szkiełek nakrywkowych, wykonując następujące czynności.
      UWAGA: Dla każdej linii komórkowej i aplikacji należy określić optymalne warunki.
      1. Aseptycznie pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego poli-D-lizyną o stężeniu 0,1% w/v w wodzie. Kołysz delikatnie, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni szkiełka nakrywkowego.
      2. Po nocnym hodowli (~12 h) w temperaturze 37 °C usunąć roztwór poli-D-lizyny i spłukać powierzchnię 3x 1 ml sterylnej wody.
      3. Wysuszyć komórki co najmniej 30 minut przed ich wysiewem.
  2. Hodowla mysich nerwowych komórek macierzystych C17.2 (C17.2-NSC) i preróżnicowanie
    1. Inkubować C17.2-NSC w kolbie o średnicy 25cm2 w zmodyfikowanym podłożu Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 5% surowicą końską (HS) i 1% penicyliną/streptomycyną w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez ~ 2 - 3 dni.
    2. Gdy komórki osiągną 85% zbieżności, usuń pożywkę, przemyj komórki 1 ml PBS i dodaj 1 ml świeżej trypsyny (0,25%) do kolby. Pozostaw na 1 minutę; Następnie dodać 1 ml pożywki hodowlanej do kolby i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
    3. Policz gęstość komórek w zawiesinie za pomocą hemocytometru. Obliczyć wymaganą objętość zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 2 x 104 komórek/ml.
    4. Wysiewać C17.2-NSC na powlekanych szkiełkach nakrywkowych w 12-dołkowej płytce o gęstości ~2 x 104 komórek na studzienkę. Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem.
      UWAGA: Aby uzyskać lepszy wynik, przed eksperymentem immunofluorescencyjnym należy określić optymalną gęstość komórek.
    5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym przez 12 godzin, aby umożliwić przyłączenie.
    6. Po przyłączeniu przemyć komórki 2x 1 ml PBS i hodować komórki z pożywką różnicującą składającą się z DMEM/F12 z 1% suplementem N2 przez 48 godzin przed obróbką osocza.
  3. Pierwotna hodowla nerwowych komórek macierzystych szczura i preróżnicowanie
    1. Hodowla pierwotnej zawiesiny NSC szczura w pożywce wzrostowej NSC szczura w niepowlekanych kolbach T25 o gęstości 5 x 105 komórek.
      UWAGA: Pierwotne szczurze NSC zostały wyizolowane zgodnie z protokołem Xie i wsp.9.
    2. Sprawdź powstawanie neurosfer pod odwróconym mikroskopem. Upewnij się, że morfologia neurosfer wykazuje kuliste i przezroczyste kompleksy wielokomórkowe.
    3. Gdy neurosfery osiągną średnicę 3 mm lub większą, przenieś zawiesinę neurosfery do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie.
    4. Ostrożnie usunąć supernatant, aby pozostawić neurosfery w minimalnej objętości pożywki.
    5. Przepłucz neurosfery 1x 5 ml PBS i pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie. Usunąć supernatant, aby pozostawić minimalną objętość PBS.
    6. Dodaj odpowiednią objętość pożywki różnicującej, aby dostosować gęstość komórek do ~12 - 15 neurosfer na mililitr. Pożywka różnicująca dla pierwotnych NSC szczurów składa się z DMEM/F12, 2% B27 i 1% FBS.
    7. Umieść 1 ml zawiesiny neurosfery na każdym powlekanym szkiełku nakrywkowym na płytce 12-dołkowej.
      UWAGA: Delikatnie potrząśnij płytką, aby upewnić się, że neurosfery są równomiernie rozłożone. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania lepszego wyniku immunofluorescencji.
    8. Umieścić płytkę w inkubatorze i pozostawić do wstępnego różnicowania przez 24 godziny przed obróbką plazmową.

2. Przygotowanie dysz plazmowych

  1. Wybierz półotwartą rurkę kwarcową o średnicy wewnętrznej 2 mm i średnicy zewnętrznej 4 mm. Włóż do rurki przewód wysokiego napięcia o średnicy 2 mm.
  2. Włóż rurkę kwarcową z przewodem wysokiego napięcia do strzykawki o pojemności 5 ml i użyj uchwytu, aby zamontować ją wewnątrz środka strzykawki. Ustaw odległość między uszczelnionym końcem rurki kwarcowej a końcówką strzykawki na 1 cm.
  3. Podłączyć rurkę z gumy silikonowej o długości 1 m (o średnicy wewnętrznej 12 mm) do otwartego końca strzykawki, a następnie podłączyć ją kolejno do przepływomierza i zaworu gazowego.

3. Przejęcie Jets

  1. Podłącz obwód, jak pokazano na Rysunek 1. Podłącz przewód wyjściowy zasilacza do urządzenia do strumienia plazmy, a następnie połącz końcówkę sondy wysokonapięciowej z przewodem wyjściowym, aby wykryć napięcie. Podłącz drugi koniec sondy wysokonapięciowej do oscyloskopu, aby zarejestrować informacje o napięciu wyjściowym. Sprawdź cały obwód i upewnij się, że zasilacz, oscyloskop i sonda wysokiego napięcia są uziemione.
  2. Sprawdź przewód gazowy. Upewnij się, że rura gazowa została podłączona do urządzenia do strumienia plazmy; następnie otwórz zawór gazowy helu (ułamek objętościowy, 99,999%) i tlenu (ułamek objętościowy, 99,999%) i ustaw przepływ gazu na 1 L: 0,01 l / min (He: O2).
    UWAGA: Pozwól gazowi płynąć przez kilka minut przed pierwszym włączeniem zasilania.
  3. Ustaw amplitudę, częstotliwość i szerokość impulsu odpowiednio na 8 kV, 8 kHz i 1600 ns. Sprawdź ponownie obwód, a następnie włącz przycisk wyjścia, aby utworzyć strumień plazmy.
    UWAGA: Nigdy nie dotykaj przewodu wysokiego napięcia.

4. Plazmowe leczenie nerwowych komórek macierzystych

  1. Ustaw odległość między dyszą strzykawki a otworem w komorze na 15 mm.
    UWAGA: Odległość jest mierzona od dołu platformy, na której umieszczona jest płytka 12-dołkowa.
  2. Wyjąć 12-dołkową płytkę z inkubatora i zmienić pożywkę z wstępnie zróżnicowanych komórek na 800 μl świeżej pożywki różnicującej.
  3. Podziel komórki na trzy grupy: nieleczoną grupę kontrolną, grupę leczoną przepływem gazu He-and-O2 (1%) przez 60 s i grupę leczoną osoczem 60 s.
    UWAGA: Nie ma oczywistej utraty płynów w warunkach zabiegu.
  4. Umieść 12-dołkową płytkę pod dyszami plazmy, upewnij się, że dysza strzykawki jest zamocowana na środku każdego otworu i poddaj odpowiednią obróbkę różnym grupom wymienionym w kroku 4.3.
    UWAGA: Niepoddane działaniu substancji kontrolnej trzymano w pożywce różnicującej w temperaturze pokojowej podczas procedury eksperymentalnej, aby zapewnić jednolite warunki leczenia. Grupa leczona przepływem gazu He-and-O2 (1%) była traktowana tylko przepływem gazu He i O2 (1%), bez wytwarzania plazmy. Wszystkie zabiegi należy wykonać w trzech egzemplarzach.

5. Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych

  1. Po poddaniu działaniu substancji należy usunąć oryginalną kulturę i dodać 1 ml nowej pożywki różnicującej do każdej studzienki.
  2. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 dni. Zmieniać podłoże co drugi dzień.
  3. Codziennie sprawdzaj stan różnicowania różnych grup pod mikroskopem światła z odwróconym kontrastem fazowym. Losowo wybierz co najmniej 12 pól i zrób zdjęcia, aby zarejestrować zmiany morfologiczne.

6. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Płukania
    1. Wyjąć próbki z inkubatora komórkowego i usunąć pożywkę przez aspirację. Przepłukać komórki 1x 1 ml PBS.
      UWAGA: Po różnicowaniu komórki łatwo się odłączają. Konieczne jest dodanie PBS od strony studzienek hodowlanych, aby uniknąć zmywania komórek.
  2. Utrwalenie
    1. Utrwal komórki za pomocą 500 μl 4% paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu delikatnie spłucz komórki 3x 1 ml PBS po 5 minut każda, aby usunąć resztki 4% paraformaldehydu.
      UWAGA: Optymalny punkt czasowy dla utrwalenia komórek należy określić w zależności od typów komórek. Po utrwaleniu dodać 1 ml PBS od strony studzienek hodowlanych i pozostawić próbkę na stole na 5 minut. Nie używaj wytrząsarki laboratoryjnej, aby zapewnić minimalną utratę komórek.
  3. Przepuszczalność
    1. Próbki należy przepuszczać 0,2% TritonX-100 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po przepuszczalności delikatnie przepłukać komórki 1 ml PBS trzy razy po 5 minut każda.
      UWAGA: Optymalny punkt czasowy przenikania komórek należy określić w zależności od typu komórek. Po przepuszczalności dodać 1 ml PBS od strony studzienek hodowlanych, pozostawić próbkę na stole na 5 minut. Nie używaj wytrząsarki laboratoryjnej, aby zapewnić minimalną utratę komórek.
  4. Blokowanie
    1. Do każdej próbki dodać 1 ml 10% surowicy koziej w PBS i pozostawić próbkę na stole na 1 godzinę, aby zablokować wszelkie niespecyficzne interakcje.
      UWAGA: Nie używaj wytrząsarki laboratoryjnej, aby zapobiec odłączeniu się komórek od szkiełka. Na tym etapie płukanie nie jest konieczne.
  5. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
    1. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe za pomocą buforu do rozcieńczania przeciwciał pierwszorzędowych.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, ostateczny stosunek rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego należy określić za pomocą testu wstępnego. Proporcje rozcieńczenia anty-Nestin (dla niezróżnicowanych komórek macierzystych), anty-β-tubuliny III (dla neuronów), anty-O4 (dla oligodendrocytów), anty-NF200 (dla dojrzałych neuronów), anty-ChAT (dla neuronów cholinergicznych), anty-LHX3 (dla neuronów ruchowych), anty-GABA (dla neuronów GABA-ergicznych), anty-serotoniny (dla neuronów serotoninergicznych) i anty-TH (dla neuronów dopaminergicznych) wynoszą odpowiednio 1:80, 1:200, 1:100, 1:100, 1:100, 1:200 i 1:100.
    2. Zastosować 300 μl rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych do różnych próbek.
    3. Próbki komórek inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Zaleca się inkubację przeciwciał pierwszorzędowych w temperaturze 4 °C w celu zmniejszenia tła i barwienia niespecyficznego.
    4. Usuń przeciwciała pierwszorzędowe i delikatnie przepłucz komórki 3x 1 ml PBS.
  6. Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym
    1. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Cy3 lub Alexa Fluor 488 za pomocą 3% surowicy koziej w PBS.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, ostateczny stosunek rozcieńczenia przeciwciała drugorzędowego należy określić za pomocą testu wstępnego.
    2. Zastosuj 300 μl odpowiednich przeciwciał drugorzędowych, aby wykryć każde przeciwciało pierwszorzędowe.
      UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w ciemności, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji.
    3. Inkubować próbkę komórek w ciemności przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    4. Usuń przeciwciała drugorzędowe i delikatnie przepłucz komórki 1 ml PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Barwienie jądrowe
    1. Zastosować 500 μl roztworu roboczego Hoechst 33258, aby zanurzyć próbkę komórki.
    2. Inkubować próbkę komórkową w ciemności przez 8 minut w temperaturze pokojowej, aby oznaczyć jądra.
    3. Delikatnie spłucz komórki 3x 1 ml PBS po 10 minut każda, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Aby zminimalizować utratę komórek, optymalny stan prania należy określić empirycznie.
  8. Montażu
    1. Umieść jedną kroplę medium montażowego na środku mikroszkiełka.
    2. Wyjmij szkiełka nakrywkowe (z próbkami) za pomocą pęsety i ostrożnie umieść próbkę na podłożu mocującym. Unikaj pęcherzyków powietrza.
    3. Usuń nadmiar nośnika montażowego za pomocą chłonnego papieru.
  9. Obserwacja pod mikroskopem fluorescencyjnym
    1. Obserwuj próbki pod mikroskopią fluorescencyjną wyposażoną w filtry do Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 i Cy3. Dla każdej próbki wybierz losowo co najmniej 8 - 12 pól i zarejestruj obrazy za pomocą kamery.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morfologia komórek była obserwowana pod mikroskopem odwróconym każdego dnia po leczeniu CAP. Rysunek 2 pokazuje zwykłe obrazy z mikroskopu światła z odwróconym kontrastem fazowym, przedstawiające różnicowanie komórek w obu liniach komórkowych. Grupa traktowana osoczem wykazuje przyspieszone tempo różnicowania i wysoki współczynnik różnicowania w porównaniu z grupą kontrolną i przepływem gazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C17.2-NSC to rodzaj unieśmiertelnionej linii nerwowych komórek macierzystych z komórek ziarnistej warstwy móżdżku noworodków myszy, opracowanej przez Snydera i innych 10,11. C17.2-NSC mogą różnicować się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty i są szeroko stosowane w neurobiologii12. W naszym poprzednim badaniu CAP mogą zwiększyć różnicowanie C17.2-NSC w neurony. Przeprowadzono również badanie potwierdzające słuszność zasady przy użyciu pi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Huazhong Scholar Program, Niezależny Fundusz Innowacji Uniwersytetu Nauki i Technologii Huazhong (nr 2018KFYYXJJ071) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31501099 i 51707012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełko nakrywkoweNEST801008
Poli-D-lizynaBeyotimeP0128
DMEM podłożeHyCloneSH30022.01Bprzechowywane w temperaturze 4 & stopni; C
DMEM/F12 średniHyCloneSH30023.01Bprzechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
N2 suplementGibco17502048przechowywany w temperaturze -20 stopni; C i chronić przed światłem
Suplement B27Gibco17504044przechowywany w temperaturze -20 stopni; C i chronić przed światłem
Płodowa surowica bydlęcaHyCloneSH30084.03przechowywana w temperaturze -20 & deg; C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
Surowicy konia dawcyHyCloneSH30074.03rozdartej w temperaturze -20 & stopni; C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
Hyklonupenicyliny/StreptomycynySV30010przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
HyClonetrypsyny25300054przechowywany w temperaturze 4 stopni C
Roztwór PBSHyCloneSH30256.01Bprzechowywany w temperaturze 4 & st.; C
4% paraformaldehydBeyotimeP0098przechowywany w temperaturze -20 & deg; C
TritonX-100SigmaT8787
Normalny roztwór blokujący surowicę koziąVector LaboratoriesS-1000-20przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
anty-NestinBeyotimeAF2215przechowywany w temperaturze -20 & deg; C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
anty-β-Tubulin IIISigma AldrichT2200przechowywanego w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
anty-O4R & Systemy DMAB1326przechowywane w temperaturze -20 ° C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
anty-NF200Sigmaprzechowywanej w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
anty-ChATSigmaprzechowywanej w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
anty-LHX3Sigmaprzechowywanego w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
anty-GABASigmaprzechowywanej w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
anty-serotoninyAbcam, Cambridge, MAprzechowywanego w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
anty-THAbcam, Cambridge, MAprzechowywanego w temperaturze -20 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
Immunol Staining Primary Antibody Dibution BufferBeyotimeP0103przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Cy3 Znakowany kozią anty-króliczą IgGBeyotimeA0516przechowywany w temperaturze -20 & deg; C i chronić przed światłem
Alexa Fluor 488- Oznakowany GoatBeyotimeA0428przechowywany w temperaturze -20 & deg; C i chronić przed światłem
Anti-Mouse IgG 
Płytka 12-dołkowacorning3512
Kolba 25 cm2Corning430639
Hoechst 33258BeyotimeC1018przechowywana w temperaturze -20 & deg; C i chronić przed światłem
Podłoże montażoweBeyotimeP0128przechowywane w temperaturze -20 & deg; C i chronić przed światłem
Mikroskop świetlnyNanjing Jiangnan Novel Optics CompanyXD-202
Mikroskopia fluorescencyjnaNikon80i
Wysoko– napięcie Wzmacniacz mocyEnergia ukierunkowanaPVX-4110
Zasilacz prądu stałegoSpellmanSL1200
Aligent 33521A
OscyloskopTektronixDPO3034
Sonda wysokonapięciowaTektronixP6015A
Generator funkcyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
  2. Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
  3. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001(2012).
  4. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031(2017).
  5. Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
  6. Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
  7. Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
  8. Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
  9. Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
  10. Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
  11. Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
  12. Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neuronalne kom rki macierzystebarwienie immunofluorescencyjnemikroskopia fluorescencyjnaurz dzenie do generowania strumienia plazmybeta tubulina IIIekspresja nestynyneurony cholinergicznemotoneurony

Powiązane artykuły