Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Profilowanie mikroRNA płuc w cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58664

⸱

7 stycznia 2019

 , 
1Pulmonary, Immunology and Physiology Laboratory, Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę oceny ekspresji miRNA w płucach, które zgodnie z przewidywaniami regulują geny zapalne, używając myszy wystawionych na działanie ozonu lub przefiltrowanego powietrza na różnych etapach cyklu rujowego.

Streszczenie

Profilowanie mikroRNA (miRNA) stało się przedmiotem zainteresowania badaczy zajmujących się różnymi obszarami badawczymi biologii i medycyny. Obecne badania wskazują na obiecującą przyszłość wykorzystania miRNA w diagnostyce i leczeniu chorób płuc. W tym miejscu definiujemy protokół profilowania miRNA w celu zmierzenia względnej obfitości grupy miRNA, które zgodnie z przewidywaniami regulują geny zapalne w tkance płucnej z mysiego modelu zapalenia dróg oddechowych wywołanego ozonem. Ponieważ wykazano, że poziomy krążących hormonów płciowych mogą wpływać na regulację wrodzonej odporności płuc u samic, celem tej metody jest opisanie protokołu profilowania zapalnego miRNA u samic myszy, biorąc pod uwagę etap cyklu rujowego każdego zwierzęcia w momencie ekspozycji na ozon. Zajmujemy się również odpowiednimi podejściami bioinformatycznymi do odkrywania miRNA i metod identyfikacji celów przy użyciu limma, oprogramowania R/Bioconductor i oprogramowania do analizy funkcjonalnej, aby zrozumieć kontekst biologiczny i szlaki związane z różnicową ekspresją miRNA.

Wprowadzenie

mikroRNA (miRNA) to krótkie (od 19 do 25 nukleotydów), naturalnie występujące, niekodujące cząsteczki RNA. Sekwencje miRNA są ewolucyjnie konserwatywne u różnych gatunków, co sugeruje znaczenie miRNA w regulacji funkcji fizjologicznych1. Udowodniono, że profilowanie ekspresji mikroRNA jest pomocne w identyfikacji miRNA, które są ważne w regulacji różnych procesów, w tym odpowiedzi immunologicznej, różnicowania komórek, procesów rozwojowych i apoptozy2. Niedawno miRNA zostały docenione ze względu na ich potencjalne zastosowanie w diagnostyce i terapii chorób. Dla naukowców badających mechanizmy regulacji genów, pomiar ekspresji miRNA może oświecić modele procesów regulacyjnych na poziomie systemu, zwłaszcza gdy informacje o miRNA są łączone z profilowaniem mRNA i innymi danymi w skali genomu3. Z drugiej strony, wykazano również, że miRNA są bardziej stabilne niż mRNA w wielu typach próbek, a także są mierzalne z większą czułością niż białka4. Doprowadziło to do znacznego zainteresowania rozwojem miRNA jako biomarkerów do różnych zastosowań w diagnostyce molekularnej, w tym w chorobach płuc.

W płucach miRNA odgrywają ważną rolę w procesach rozwojowych i utrzymaniu homeostazy. Co więcej, ich nieprawidłowa ekspresja została związana z rozwojem i progresją różnych chorób płuc5. Zapalna choroba płuc wywołana zanieczyszczeniem powietrza wykazała większe nasilenie i gorsze rokowanie u kobiet, co wskazuje, że hormony i cykl rujowy mogą regulować wrodzoną odporność płuc i ekspresję miRNA w odpowiedzi na wyzwania środowiskowe6. W tym protokole wykorzystujemy ekspozycję na ozon, który jest głównym składnikiem zanieczyszczenia powietrza, w celu wywołania formy zapalenia płuc u samic myszy, która występuje przy braku odporności nabytej. Stosując ozon, indukujemy rozwój nadreaktywności dróg oddechowych, która jest związana z uszkodzeniem komórek nabłonka dróg oddechowych oraz wzrostem liczby neutrofili i mediatorów stanu zapalnego w bliższych drogach oddechowych7. Obecnie nie ma dobrze opisanych protokołów charakteryzujących i analizujących miRNA w całym cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu.

Poniżej opisujemy prostą metodę identyfikacji etapów cyklu rujowego i ekspresji miRNA w tkance płucnej samic myszy narażonych na działanie ozonu. Zajmujemy się również skutecznymi podejściami bioinformatycznymi do odkrywania miRNA i identyfikacji celów, z naciskiem na biologię obliczeniową. Analizujemy dane z mikromacierzy za pomocą limma, oprogramowania R/Bioconductor, które zapewnia zintegrowane rozwiązanie do analizy danych z eksperymentów z ekspresją genów8. Analiza danych z macierzy PCR z limma ma przewagę pod względem mocy nad procedurami opartymi na teście t przy użyciu niewielkiej liczby macierzy/próbek do porównania ekspresji. Aby zrozumieć biologiczny kontekst wyników ekspresji miRNA, użyliśmy oprogramowania do analizy funkcjonalnej. Aby zrozumieć mechanizmy regulujące zmiany transkrypcyjne i przewidzieć prawdopodobne wyniki, oprogramowanie łączy zestawy danych dotyczące ekspresji miRNA i wiedzę z literatury9. Jest to zaleta w porównaniu z oprogramowaniem, które po prostu szuka wzbogacenia statystycznego w nakładaniu się na zestawy miRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego w Pennsylwanii.

1. Ocena etapu cyklu rujowego

  1. Prawidłowo unieruchom, którą samica myszy C57BL/6 (w wieku 8–9 tygodni) ma za pomocą techniki krępowania jedną ręką opisanej w Machholz et al.10.
  2. Napełnij sterylną plastikową pipetę 10 μl ultraczystej wody.
  3. Wprowadź końcówkę plastikowej pipety do pochwy.
  4. Delikatnie przepłucz płyn 4–5 razy, aby pobrać próbkę.
  5. Umieść końcowe płukanie zawierające płyn dopochwowy na szklanym szkiełku.
  6. Obserwuj niezabarwione płukanie pochwy pod mikroskopem świetlnym za pomocą obiektywu 20x.
    nuta: Zwierzęta, które nie wykazują regularnych cykli z powodu ciąży rzekomej lub innych przyczyn, muszą zostać wykluczone z eksperymentu. Zaleca się wykonywanie codziennej wydzieliny z pochwy przez co najmniej trzy kolejne cykle w celu potwierdzenia cykliczności.

2. Narażenie na ozon

  1. Umieść maksymalnie 4 myszy w dwóch szklanych pojemnikach o pojemności 1,2 l z pokrywkami z siatki drucianej i wodą ad libitum.
  2. Umieść jeden szklany pojemnik w komorze ozonowej, a drugi w komorze naświetlania przefiltrowanego powietrza.
  3. Dostosować stężenie ozonu do 2 ppm i regularnie monitorować poziom ozonu.
    nuta: Aparat ozonowy zapewnia regulowany przepływ powietrza (>30 wymian powietrza/h) z kontrolowaną temperaturą (25 °C) i wilgotnością względną (50%). System wytwarza ozon za pomocą ozonizatora elektroerozyjnego, który jest monitorowany i kontrolowany przez analizator ozonu ultrafioletowego i kontrolery przepływu masowego, jak opisano wcześniej11.
  4. Wyjmij szklane pojemniki po 3 godzinach ekspozycji na ozon/przefiltrowane powietrze. Umieść zwierzęta w klatce z ściółką, jedzeniem i wodą ad libitum.

3. Zbieranie płuc

  1. 4 godziny po ekspozycji znieczulić zwierzęta wstrzyknięciem dootrzewnowym koktajlu ketamina/ksylazyna (90 mg/kg ketaminy, 10 mg/kg ksylazyny).
    nuta: Aby potwierdzić prawidłowy poziom znieczulenia, sprawdź, czy w myszy nie ma odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca) i w razie potrzeby dostosuj znieczulenie.
  2. Zwilż skórę myszy 70% etanolem.
  3. Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek operacyjnych i pęsety chirurgicznej, aby odsłonić żyłę główną.
  4. Ofiaruj myszy przez przecięcie żyły głównej i aorty. W razie potrzeby wprowadzić igłę o rozmiarze 21 G do żyły głównej powyżej żył nerkowych, aby pobrać krew przed wykrwawieniem. Alternatywnie, pobierz krew przez nakłucie serca zgodnie ze standardowymi protokołami.
  5. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby rozciąć jamę brzuszną i usunąć skórę/górny mięsień, przesuwając się w górę w kierunku żeber.
  6. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przebić przeponę.
    nuta: Płuca zapadną się z dala od przepony.
  7. Odetnij klatkę piersiową za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić serce i płuca.
  8. Za pomocą kleszczy weź 1,5 ml probówki do mikrowirówki bez RNaz i zanurz ją w ciekłym azocie, aby napełnić probówkę.
    nuta: Używaj okularów i rękawic ochronnych do obchodzenia się z ciekłym azotem.
  9. Wyjmij płuca, umieść je w probówkach o pojemności 1,5 ml wypełnionych ciekłym azotem do mikrowirówki bez RNaz w celu natychmiastowego zamrożenia tkanki i odczekaj kilka sekund, aż płyn odparuje.
  10. Zamknij pokrywę probówki i przechowuj chusteczkę w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

4. Przygotowanie RNA

  1. Sproszkować całe płuca za pomocą rozdrabniacza do tkanek ze stali nierdzewnej.
    nuta: Rozdrabniacz do tkanek należy przed użyciem umieścić w ciekłym azocie. Czyścić rozpylacz po każdym użyciu roztworem RNAzy.
  2. Podziel sproszkowane płuca i umieść je w dwóch probówkach o pojemności 1,5 ml (po połowie płuca każda).
  3. Dodać 500 μl tiocyjanianu guanidyny na probówkę z próbką i wymieszać. Homogenizować każdą próbkę za pomocą igieł o sile odpowiednio 18 G, 21 G i 23 G.
    nuta: Próbki można wzbogacić 5,6 x 108 kopiami małej kontroli kolca RNA (z innego gatunku) przed przystąpieniem do ekstrakcji.
  4. Dodać 500 μl etanolu do każdej próbki i wirować przez 15 sekund.
  5. Załadować mieszaninę do kolumny wirowej do probówki zbiorczej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.
  6. Do leczenia DNazą I (w kolumnie);
    1. Dodać 400 μl buforu płuczącego RNA i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min.
    2. W probówce wolnej od RNaz dodać 5 μl DNazy I i 75 μl 1x buforu do trawienia DNA i wymieszać. Dodaj mieszankę bezpośrednio do matrycy kolumnowej.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  7. Dodać 400 μl roztworu do płukania wstępnego RNA do kolumny i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min. Odrzucić przepływ i powtórzyć ten krok.
  8. Dodać 700 μl buforu do płukania RNA do kolumny i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min. Odrzucić przepływ.
  9. Wirować przy 12 000 x g przez 2 minuty w celu usunięcia pozostałego buforu. Przenieść kolumnę do probówki wolnej od RNaz.
  10. Aby wymyć RNA, dodaj 35 μl wody wolnej od DNaz/RNaz bezpośrednio do matrycy kolumny i odwiruj przy 12 000 x g przez 1,5 minuty.
  11. Zmierzyć całkowite stężenie RNA (260 nm) i czystość za pomocą spektrofotometru. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby przeprowadzić kwantyfikację RNA w podwielokrotności próbki o objętości 1,5 μl. Opróżnij przyrząd wodą wolną od DNaz/RNaz używaną do elucji.
    nuta: Stosunek 260/280 wynoszący ~2,0 jest ogólnie akceptowany jako "czysty" dla RNA. Typowe stężenie RNA zwykle waha się od 750 do 2 500 ng/μl.
  12. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Profilowanie miRNA

  1. Aby dokonać transkrypcji retro-małych RNA, użyj 200 ng całkowitego RNA.
    1. Przygotować mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji na lodzie (całkowita objętość na reakcję wynosi 20 μl). Do każdej reakcji dodać 4 μl 5x buforu, 2 μl mieszanki 10x nukleotydów, 2 μl odwrotnej transkryptazy i 2 μl wody wolnej od RNaz. Wymieszać wszystkie składniki i podwielokrotność w 600 μl plastikowych probówkach bez RNAse (10 μl mieszaniny na reakcję).
      nuta: Główna mieszanina odwrotnej transkrypcji zawiera wszystkie składniki wymagane do syntezy pierwszej nici cDNA z wyjątkiem matrycy RNA.
      nuta: Oblicz nadmiar objętości (10%) podczas przygotowywania mieszanki głównej.
    2. Dodać matrycę RNA (200 ng w 10 μl) do każdej probówki zawierającej główną mieszankę odwrotnej transkrypcji. Wymieszaj, odwiruj przez 15 s przy 1,000 x g i przechowuj je na lodzie do momentu umieszczenia w termocyklerze lub suchym bloku.
    3. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C i umieścić probówki na lodzie.
    5. Rozcieńczyć cDNA, dodając 200 μl wody wolnej od RNaz do każdych 20 μl reakcji odwrotnej transkrypcji.
  2. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu macierzy miRNA PCR myszy z odpowiedzią zapalną i autoimmunizacją.
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną (całkowita objętość 1100 μL): Do każdej reakcji dodać 550 μL 2x głównej mieszanki PCR, 110 μL 10x uniwersalnej mieszaniny starterów, 340 μl wody wolnej od RNaz i 340 μL matrycy cDNA (rozcieńczona reakcja z kroku 5.1.5).
    2. Dodać 10 μl mieszaniny reakcyjnej do każdej studzienki wstępnie załadowanej macierzy miRNA PCR za pomocą pipetora wielokanałowego.
    3. Uszczelnij płytkę miRNA PCR Array optyczną folią samoprzylepną.
    4. Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków.
    5. Zaprogramuj cykler w czasie rzeczywistym, etap początkowej aktywacji PCR przez 15 minut w temperaturze 95 °C, 3-etapowy cykl zawierający denaturację przez 15 s w temperaturze 94 °C, wyżarzanie przez 30 s w temperaturze 55 °C i przedłużenie przez 30 s w temperaturze 70 °C przez 40 cykli liczba.
      nuta: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi warunków jazdy na rowerze, aby skonfigurować cykler w czasie rzeczywistym. Wykonaj krok krzywej dysocjacji wbudowany w oprogramowanie cyklera w czasie rzeczywistym.
    6. Przeprowadzanie analizy danych.

6. Analiza danych

  1. Wyodrębnij wartości Ct z oprogramowania do PCR w czasie rzeczywistym dla każdej próbki do oprogramowania analitycznego.
    nuta: Wartość Ct wynosząca 34 jest uważana za wartość odcięcia. Jeśli próbki zawierają kontrolę skoków (np. cel-mir-39), należy znormalizować wartości Ct do wartości skoku w kontroli dla każdej próbki. Może być konieczne ręczne ustawienie wartości progowych. Wartości linii bazowej są ustawiane automatycznie.
  2. Znormalizuj wartości Ct do średniej Ct z sześciu kontrolnych porządków miRNA: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, używając następującego równania:
    ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
  3. W przypadku obliczeń zmiany krotności należy obliczyć wartości ΔΔCt, używając określonej próbki jako kontroli, używając równania wyrażenia względnego12:
    Względna ekspresja miRNA:
    2-∆∆Ct, gdzie - ∆∆Ct = -[∆Ct test - ∆Ct kontrola]
    nuta: Zmiana krotności o 200 jest uważana za odcięcie.
  4. Eksportuj wartości wyrażeń zmiany krotności, aby przeprowadzić analizę statystyczną na R przy użyciu pakietu limma w Bioconductor8.
  5. Popraw dla wielokrotnych porównań przy użyciu metody Benjaminiego-Hochberga13.
    UWAGA: Kopia skryptu języka R jest dostępna pod adresem: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Zestawy danych i przeanalizowane dane są również dostępne w Gene Expression Omnibus pod numerem GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. Analiza danych: Oprogramowanie do analizy funkcjonalnej

  1. Rozmieść zestaw danych. Uwzględnij miRNA wraz z ich odpowiednimi stosunkami logarytmu ekspresji i wartościami p. Zobacz Tabela 1, aby zapoznać się z określonym formatowaniem zestawu danych.
  2. Otwórz oprogramowanie do analizy funkcjonalnej (wersja 01-10).
  3. Przekaż zestaw danych przy użyciu następującego formatu: Format pliku: "Format elastyczny", Zawiera nagłówek kolumny: "Tak", Wybierz typ identyfikatora: "miRBase (dojrzałe)", Platforma tablicy używana do eksperymentów: wybierz platformę tablicy.
    nuta: Akceptowane formaty plików to .txt (pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami), .xls (pliki Excela) i .diff (pliki cuffdiff).
  4. Wybierz opcję "Wnioskuj obserwacje" i sprawdź, czy etykietowanie grupy eksperymentalnej jest poprawne.
  5. Przejdź do "Podsumowanie zestawu danych", aby zmienić całkowitą ilość zmapowanych i niezmapowanych miRNA.
  6. Kliknij przycisk "nowy" w lewym górnym rogu programu. Wybierz "Nowy filtr docelowy mikroRNA" i prześlij zestaw danych mikroRNA.
    1. Ustaw źródło na: TarBase, Ingenuity Experts Findings, miRecords.
    2. Ustaw Ufność na: Zaobserwowane eksperymentalnie lub Wysokie (przewidywane).
    3. Wybierz opcję "Dodaj kolumny", aby uwzględnić różne informacje biologiczne o obiektach, takie jak gatunki, choroby, tkanki, szlaki i inne.
    4. Aby skupić się na obiektach docelowych, które zmieniły ekspresję w eksperymencie, wybierz opcję "Dodaj/zamień zestaw danych mRNA". Użyj "Parowania wyrażeń", aby zlokalizować mikroRNA o tych samych lub różnych poziomach ekspresji.
      nuta: Analiza filtra dostarczy nazw i symboli mikroRNA, celów mRNA, źródła opisującego związek docelowy oraz poziomu ufności przewidywanego związku (Rysunek 2).
  7. Kliknij "Dodaj do mojej ścieżki", aby wysłać przefiltrowany zestaw danych do płótna ścieżki i zbadać więcej relacji biologicznych.
  8. Użyj narzędzia Path Designer, aby utworzyć model efektów mikroRNA o jakości publikacji.
  9. Alternatywną opcją jest utworzenie analizy podstawowej.
    1. Jako typ analizy podstawowej wybierz "Analiza wyrażeń".
    2. Jako typ pomiaru wybierz "Expr Log Ratio".
    3. Podsumowanie filtra analizy: weź pod uwagę tylko cząsteczki i/lub relacje, gdzie: (gatunek = mysz) AND (pewność = zaobserwowane eksperymentalnie) AND (źródła danych = "Ingenuity Expert Findings", "Ingenuity ExpertAssist Findings", "miRecords", "TarBase", OR "TargetScan Human").
    4. Wybierz wartość odcięcia wartości p = 0,05.
    5. Uruchom plik analysis.
      nuta: Raport będzie zawierał: szlaki kanoniczne, analizę regulatorów wyższego szczebla, choroby i funkcje, efekty regulatorów, sieci, cząsteczki i inne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Różne typy komórek obserwowane w mazidłach służą do identyfikacji fazy cyklu rujowego u myszy (Rysunek 1). Są one rozpoznawane na podstawie morfologii komórek. Podczas proestrusy komórki stanowią niemal wyłącznie skupiska okrągłych, dobrze uformowanych jądrowych komórek nabłonkowych (Rysunek 1A). Gdy mysz znajduje się w fazie estrusu, komórki są zrogowaciałymi komórkami nabłonka płaskiego, występującymi w gęstych skupiskach (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Profilowanie mikroRNA jest korzystną techniką zarówno w diagnostyce chorób, jak i badaniach mechanistycznych. W tym manuskrypcie zdefiniowaliśmy protokół oceny ekspresji miRNA, które zgodnie z przewidywaniami regulują geny zapalne w płucach samic myszy narażonych na działanie ozonu w różnych etapach cyklu rujowego. Opisano metody określania cyklu rujowego, takie jak metoda detekcji wzrokowej16. Opierają się one jednak na jednorazowych pomiarach, a zatem są niewiarygodne. Aby dokładnie zidentyfikow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z NIH K01HL133520 (PS) i K12HD055882 (PS). Autorzy dziękują dr Joannie Floros za pomoc w eksperymentach z ekspozycją na ozon

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy C57BL/6JLaboratorium Jacksona0006648 tygodni
UltraPure WaterThermo Fisher Scientific10813012
Sterylna plastikowa pipetaFisher Scientific13-711-25Pojemność: 1,7 ml
Matowe szkiełka mikroskopoweThermo Fisher Scientific2951TS
Mikroskop świetlnyŚwiatMW3-H510x i 20x obiektyw
Ketathesia- Ketamina HCl Injection USPHenry Schein Animal Health5585390 mg / kg. Kontrolowany lek.
Sterylny roztwór ksylazynyLloyd Laboratories139-23610 mg / kg. Kontrolowany lek.
EtanolFisher ScientificBP2818100Rozcieńczyć wodą do 70% etanolu.
Igła o rozmiarze 21 GBD Biosciences305165
StrzykawkaFisher Scientific3296541 mL
Nożyczki operacyjneWorld Precision Instruments501221, 50461314 cm, ostre/, zakrzywione i 9 cm, proste, cienkie zestaw pęsety z ostrą końcówką
World Precision Instruments504616
Spectrum  Rozdrabniacze do tkanek BessmanFisher Scientific08-418-1Pojemność: od 10 do 50 mg
probówek do mikrofug bez RNazThermo Fisher ScientificAM124001,5 ml
odczynnika TRIzolThermo Fisher Scientific15596026
Direct-zol RNA MiniPrep PlusZymo ResearchR2071
NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-W
Zestaw miScript II RTQiagen218161
Reakcja zapalna myszy & Autoimmunizacja miRNA PCR ArrayQiagenMIMM-105Z
Cienkościenne, wolne od DNaz i RNaz probówki do PCRThermo Fisher ScientificAM12225 dla 20 μ L reakcje
miRNeasy Surowica/Plazma Kontrola skokówQiagen219610
Microsoft ExcelMicrosoft Corporationhttps://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Analiza ścieżekQiagenhttps://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R OprogramowanieFundacja Rhttps://www.r-project.org/
Termocykler lub blok chłodząco-grzewczyOgólny dostawca
MikrowirówkaOgólny dostawca
Cykler do PCR w czasie rzeczywistymOgólny dostawca laboratoryjny Pipeta
wielokanałowaOgólny dostawca laboratoryjny Bufor
do płukania RNAZymo ResearchR1003-3-4848 mL
bufor do trawienia DNAZymo ResearchE1010-1-44 ml
RNA bufor do płukania wstępnegoZymo ResearchR1020-2-2525 ml
Analizator ozonu ultrafioletowegoTeledyne APIModel T400http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Kontrolery przepływu masowegoSierra Instruments IncFlobox 951/954http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html
laboratoryjnylaboratoryjny

Bibliografia

  1. Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
  2. Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
  3. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
  4. Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
  5. Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
  6. Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18(2018).
  7. Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
  8. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).
  9. Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
  10. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  11. Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
  14. Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
  15. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  16. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538(2012).
  17. Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
  18. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
  19. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  20. Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
  21. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
  22. Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
  23. Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
  24. Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
  25. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005(2015).
  26. Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
  27. Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspozycja na ozontkanka płucnaekstrakcja RNAodwrotna transkrypcjatablica PCRanaliza limmaanaliza funkcjonalnacytologia pochwy
Profilowanie mikroRNA płuc w cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.