Zoptymalizowany protokół Rhizobox do wizualizacji wzrostu korzeni i reakcji na zlokalizowane składniki odżywcze

Chociaż często pomijane w porównaniu do swoich naziemnych odpowiedników, korzenie odgrywają kluczową rolę w pozyskiwaniu składników odżywczych dla roślin. Biorąc pod uwagę znaczne koszty emisji dwutlenku węgla związane z budową i utrzymaniem korzeni, rośliny wykształciły mechanizmy umożliwiające rozwój korzeni tylko tam, gdzie żerowanie jest warte inwestycji. Systemy korzeniowe mogą zatem efektywnie i dynamicznie eksploatować plamy zasobów, rozmnażając się w gorących punktach, zwiększając tempo pobierania i szybko przenosząc składniki odżywcze do łyka w celu dalszego transportu¹. Reakcje plastyczności mogą się znacznie różnić w zależności od gatunku rośliny lub genotypu^2,3 i w zależności od formy chemicznej danego składnika odżywczego^4,5. Należy dalej badać różnice w plastyczności korzeni, ponieważ zrozumienie złożonych reakcji korzeni na niejednorodne zasoby glebowe może dostarczyć informacji na temat strategii hodowli i zarządzania w celu zwiększenia efektywności wykorzystania składników odżywczych w rolnictwie.

Pomimo swojej konieczności i znaczenia dla zrozumienia systemów roślinnych, wizualizacja i ilościowe określenie plastyczności korzeni w odpowiednich skalach stanowi wyzwanie techniczne. Wykopywanie korony korzeniowej z gleby ("shovelomics"⁶) jest powszechną metodą, ale drobne korzenie wykorzystują małe pory między agregatami glebowymi, a wykopy nieuchronnie prowadzą do pewnego stopnia utraty tych delikatnych korzeni. Co więcej, destrukcyjne zbiory uniemożliwiają śledzenie zmian w jednym systemie korzeniowym w czasie. Metody obrazowania in situ, takie jak rentgenowska tomografia komputerowa, umożliwiają bezpośrednią wizualizację korzeni i zasobów glebowych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej⁷, ale są drogie i wymagają specjalistycznego sprzętu. Eksperymenty hydroponiczne pozwalają uniknąć ograniczeń związanych z wydobywaniem korzeni z gleby, ale morfologia i architektura korzeni różnią się w środowisku wodnym w porównaniu z ograniczeniami mechanicznymi i złożonością biofizyczną gleb^8,9. Wreszcie, procesy i funkcje ryzosfery nie mogą być zintegrowane z plastycznością rozwojową w tych sztucznych pożywkach.

Przedstawiamy protokół budowy i użytkowania rhizoboxów (wąskich, prostokątnych pojemników o przezroczystych ściankach) jako tanią, konfigurowalną metodę charakteryzowania wzrostu korzeni w glebie w czasie. Specjalnie zaprojektowane ramki zachęcają korzenie do wzrostu preferencyjnie w stosunku do tylnego panelu ze względu na grawitropizm, zwiększając dokładność pomiarów długości korzeni. Rhizoboxy są powszechnie używane do badania wzrostu korzeni i interakcji ryzosfery^10,11,12, ale przedstawiona tutaj metoda oferuje przewagę w prostocie dzięki jednokomorowej konstrukcji i niedrogim materiałom i jest przeznaczona do badania reakcji korzeni na zlokalizowane składniki odżywcze. Metodę tę można jednak również zaadaptować do badania szeregu innych procesów zachodzących w korzeniach i ryzosferach, takich jak konkurencja wewnątrzgatunkowa i międzygatunkowa, przestrzenne rozmieszczenie związków chemicznych, drobnoustrojów czy aktywność enzymów. W tym miejscu badamy różnice genotypowe między mieszańcami kukurydzy w odpowiedzi na plamy ¹⁵pozostałości roślin strączkowych znakowanych N i podkreślamy reprezentatywne wyniki w celu walidacji metody ryzoboksowej.

1. Przygotowanie przednich i tylnych paneli oraz przekładek

1. Przygotuj przedni i tylny panel.
   1. Wytnij dwa kawałki przezroczystego akrylu o grubości 0,635 cm do 40,5 cm szerokości i 61 cm długości w pudełku lub kup wstępnie przycięte kawałki (patrz tabela materiałów).
   2. Za pomocą wiertła przeznaczonego do akrylu wywierć otwory o średnicy 0,635 cm w odległości 1,3 cm od bocznych krawędzi w odległości 2,5, 19, 38 i 53,3 cm od góry. Wywierć otwory w odległości 1,3 cm od dolnej krawędzi w odległości 2,5, 20,3 i 38 cm od lewej strony (Rysunek 1).
      UWAGA: Najbardziej efektywne jest użycie wiertarki do stosu od sześciu do dziesięciu arkuszy na raz, ale można również użyć wiertarki ręcznej.
   3. Usuń wszelkie pokrycia ochronne z akrylu i delikatnie wyczyść oba panele przed montażem pudełek.

Rysunek 1: Układ wierconych otworów. Otwory wierci się w odległości 1,3 cm od krawędzi bocznych w odległości 2,5, 19, 38 i 53,3 cm od góry oraz 1,3 cm od dolnej krawędzi w odległości 2,5, 20,3 i 38 cm od lewego marginesu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotuj boczne i dolne przekładki.
   1. Wytnij trzy przekładki w pudełku z polietylenu o dużej gęstości (HDPE) lub kup dwie wstępnie przycięte boczne przekładki (0,635 cm grubości, 2,5 cm szerokości, 57 cm długości) i jedną wstępnie przyciętą dolną przekładkę (0,635 cm grubości, 2,5 cm szerokości, 40,5 cm długości). Zobacz tabelę materiałów.
   2. Dopasuj przekładki między przednim i tylnym panelem wzdłuż boków i spodu pudełka. Za pomocą wiertarki ręcznej lub wiertarki przewierć istniejące otwory z przodu iz tyłu, aby otwory czysto przechodziły przez wszystkie trzy warstwy.
   3. Przytrzymaj warstwy za pomocą zacisków lub instalując kombinację, nakrętek i podkładek w każdym nowo wywierconym otworze (patrz krok 3.1).

2. Instalacja paska poliestrowej mrugnięcia na dole pudełka

UWAGA: To zapobiegnie przeciekaniu gleby i wody przez spoiny między przekładkami.

1. Pokrój matę poliestrową na paski o szerokości 2,5 cm i długości 40,5 cm (patrz tabela materiałów).
2. Gdy tylny panel leży płasko, a przekładki na nim, połóż mrugnięcie bezpośrednio nad dolną przekładką i przytrzymaj ją na miejscu za pomocą górnego panelu (Rysunek 2).

Rysunek 2: Zmontowany pojemnik na ryzobox z mrugnięciem. Wąski pasek mrugnięcia na dnie kłącza zapobiega wyciekaniu ziemi i piasku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Montaż Rhizoboxów

1. Zamontuj ryzoboxy za pomocą z gwintem 20 (3.2 cm długości i 0.635 cm średnicy), podkładek (średnica wewnętrzna 0.635 cm) i nakrętek sześciokątnych (dopasowanych do, patrz Tabela materiałów.
2. Dokręć każdą przez podkładkę, panel przedni, przekładkę, panel tylny, podkładkę i nakrętkę sześciokątną. Upewnij się, że są bardzo dokręcone; Jeśli skrzynka jest luźno zmontowana, ziemia wysypie się przez szczeliny między panelami a bocznymi przekładkami.
   UWAGA: Akryl łatwo się rysuje, a zadrapania mogą zakłócać pomiary korzeni, dlatego należy obchodzić się ze zmontowanymi pudełkami ostrożnie. Unikaj układania pudełek w stosy, chyba że między nimi znajduje się materiał ochronny.
3. Przygotuj dwie przekładki do plastrów (przekładki, które będą używane do tworzenia plastrów leczniczych i kontrolnych) w każdym pudełku. Wytnij przekładki z arkuszy polietylenu o dużej gęstości (HDPE) lub kup je wstępnie przycięte (0,635 cm grubości, 3,8 cm szerokości, 28 cm długości; patrz tabela materiałów). Wywierć jeden otwór o średnicy 0,635 cm w każdym przekładce, 2 cm od góry wzdłuż linii środkowej (Rysunek 3).

Rysunek 3: Przekładki krosowe. wkręcone przez środek pasków HDPE zapobiegają ich wpadnięciu do pudełka. Ryzobox wypełnia się ziemią wokół przekładek, gleba jest zwilżana, a przekładki są usuwane w celu pozostawienia pustych łat zabiegowych i kontrolnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Dokręć przez każdy otwór nakrętką, tak aby przekładka mogła być częściowo włożona do kłącza, aż śruba uniemożliwi jej dalsze przesuwanie się (Rysunek 3).
   UWAGA: Gdy gleba zostanie zwilżona wokół przekładek i podkładki dystansowe zostaną usunięte, pozostaną dwie puste przestrzenie, które można wypełnić odpowiednimi substratami dla plastra do zabiegu zawierającego azot i łaty kontrolnej.

4. Budowanie ram z PCV do podparcia ryzoboxów pod kątem

UWAGA: Gdy pudełko zostanie ustawione pod kątem, grawitropizm zachęci korzenie do wzrostu na tylnym panelu, tak że wszystkie korzenie będą widoczne do śledzenia. Wymiary polichlorku winylu (PVC) w Rysunek 4 dają ramę, która utrzymuje ryzobox pod kątem około 55° do stołu.

1. Wytnij 13 kawałków PVC o średnicy 1,3 cm w pudełku: 2× długości 44 cm, długości 3× 42 cm, długości 2× 36,3 cm, długości 2× 25,4 cm i długości 4× 3,8 cm (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Piła do cięcia jest wysoce zalecana ze względu na wydajność i równe cięcia.
2. Użyj 4× kolanek 2-kierunkowych, 2× kolanek 3-drogowych i 4 trójników (patrz tabela materiałów), aby zmontować skrzynkę, jak pokazano w Rysunek 4.
   UWAGA: Ramy powinny być stabilne bez dodatkowego kleju, ale w razie potrzeby można użyć kleju PVC.

Rysunek 4: Rama do podparcia kłączowców. Lekka rama jest wykonana z PCV przyciętego na określone długości i połączonego za pomocą wskazanych typów połączeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Szycie etui ochronnych odbijających światło i ciepło

UWAGA: Korzenie unikają światła, więc te przypadki wykluczają światło, aby upewnić się, że obserwowane reakcje plastyczności korzeni są napędzane przez źródło składników odżywczych w łatach, a nie przez unikanie światła. Tkanina pozbawiająca światło obniża również temperaturę wewnątrz kizoboxów, pomagając uniknąć stresu cieplnego.

1. Pokrój tkaninę przeciw deprywacji światła (specjalistyczny materiał, który jest biały z jednej strony i z drugiej) na kawałki o szerokości około 95 cm i długości 69 cm (patrz tabela materiałów). Wymagana jest jedna sztuka w pudełku.
2. Złóż każdy kawałek na pół wzdłuż długiej krawędzi, aby utworzyć rękaw o długości 47,5 cm × 69 cm. Używając igły do maszyny do szycia przeznaczonej do dżinsu, wytrzymałej nici do pikowania i wąskiego szwu, zszyj wzdłuż dołu i 3/4 długości z boku każdego rękawa. Przypnij górne rogi razem za pomocą agrafki.

6. Przygotowanie gleby 1:1 (V/V): podłoże piaskowe do wypełnienia kłączoboxów

1. Zbierz około 1,000^cm3 ziemi polowej (z miejsca zainteresowania) w pudełku. Wysuszyć glebę do stałej masy w płytkich tacach w temperaturze 60 °C.
   UWAGA: Gleba do tego eksperymentu została zebrana bezpośrednio po zbiorach na ekologicznie zarządzanym polu kukurydzy z głębokości 0–10 cm.
2. Zmiel glebę za pomocą moździerza i tłuczka, aby przeszła przez sito o średnicy 2 mm. Zmierz gęstość nasypową gleby, ważąc znaną objętość gleby.
3. Zaopatrz się w piasek (taki jak piasek do zabawy, który można niedrogo kupić w sklepie z narzędziami; patrz Tabela materiałów) i zmierz gęstość nasypową.
4. Odmierz równe objętości piasku i ziemi do wiadra i dokładnie wymieszaj. Za pomocą lejka powoli i równomiernie napełniaj pudełko do 2,5 cm od góry, nie potrząsając pudełkiem, aby spowodować osiadanie podłoża. Zmierz tę objętość substratu; Powinien wynosić około 1 272 cm³.
5. Pomnóż gęstość nasypową piasku przez połowę tej objętości, aby uzyskać masę piasku potrzebną do każdej skrzynki. Zrób to samo z gęstością nasypową gleby, aby uzyskać masę gleby potrzebną dla każdej skrzynki.
   UWAGA: W przypadku gleby polowej i piasku użytego w tym eksperymencie było to 976 g piasku i 774 g gleby, ale ilości te będą się różnić w zależności od gęstości nasypowej użytej gleby.
6. Oznacz jedną dużą plastikową torbę z zamkiem błyskawicznym na każde pudełko ryzoowe, zważ odpowiednie masy piasku i ziemi do torby i dokładnie homogenizuj.
7. Przeanalizuj tę glebę i podłoże w stosunku 1:1 pod kątem zawartości składników odżywczych i naturalnej obfitości ¹⁵N (δ¹⁵N).

7. Przygotowanie podłoża do plastrów do zabiegu i kontroli

1. Oznacz dwie małe plastikowe torebki z zamkiem błyskawicznym na każde pudełko z kłączem, jedną na plaster leczniczy, a drugą na plaster kontrolny. Odważyć 30 g podłoża glebowego: piasku z każdego dużego worka (krok 6.6) do dwóch odpowiadających mu małych worków.
2. Wymieszać podłoże ze źródłem azotu znakowanym ^{izotopem 15}N dla plastra zabiegowego. W tym celu odważ 1 g ¹⁵resztek roślinnych znakowanych N lub innego źródła N (ilość można dostosować według potrzeb) do każdej torebki zabiegowej (mała torebka z zamkiem błyskawicznym) i dokładnie wymieszaj.
   UWAGA: W tym eksperymencie użyto mieszaniny ¹⁵pozostałości koniczyny i wyki znakowanej znakiem N. Nasiona koniczyny i wyki posadzono w mieszance wermikulitu i piasku w stosunku 1:1 i uprawiano w warunkach szklarniowych. Rośliny podlewano codziennie wodą dejonizowaną i dwa razy w tygodniu roztworem Long-Ashton o stężeniu 1/100¹³ zawierającym ¹⁵źródeł azotu znakowanych N. Cała biomasa nadziemna została zebrana cztery tygodnie po posadzeniu, wysuszona i zmielona, aby przeszła przez sito o średnicy 2 mm. W przypadku wybrania innego składnika odżywczego, zwłaszcza jeśli pierwiastek ten jest ruchliwy w glebie, zachęca się do przeprowadzania eksperymentów pilotażowych w celu zbadania wymywania. W razie potrzeby można zastosować formy składników odżywczych o powolnym uwalnianiu lub wybrać inny projekt ryzoboxa, aby ograniczyć wymywanie (np. przez oddzielne komory¹⁰).

8. Ładowanie Rhizobox substratem i ustalanie plastrów do leczenia i kontroli

1. Zważ każde puste pudełko ryzowe i zapisz masy do późniejszego wykorzystania.
2. Włóż dwie podkładki dystansowe (patrz krok 3.2) do jednego pojemnika na kłącza, aż śruba uniemożliwi ich dalsze przesuwanie. Zaznacz głębokość dolnej krawędzi za pomocą lekkiego znaku z boku ryzoboxa (Rysunek 3) i usuń podkładki dystansowe.
3. Za pomocą lejka z otworem na łodygę, który jest tak wąski jak otwór w kizoboxie, napełnij ryzobox z odpowiedniego dużego worka z substratem na zaznaczoną głębokość. Przesuwaj lejek do przodu i do tyłu powoli i równomiernie, aby podłoże wypełniało się równomiernie i nie tworzyło preferencyjnych kanałów przepływu.
4. Gdy poziom podłoża osiągnie oznaczoną głębokość, umieść przekładki z powrotem w odległości 5 cm z każdej strony pudełka. Kontynuuj napełnianie pudełka, aż poziom podłoża znajdzie się około 5 cm od górnej części pudełka (w worku powinno pozostać podłoże
).
5. Dokładnie zwilż okolice każdej przekładki.
   UWAGA: W tym eksperymencie osiągnięto to poprzez dostarczenie 50 ml wody przez emitery kroplowe umieszczone między zewnętrzną krawędzią każdej przekładki a bokiem ryzoboxa i równomierne wlanie 50 ml wody między dwie przekładki. Powolne nawadnianie jest konieczne do równomiernego zwilżania.
6. Usuń przekładki, gdy gleba jest mokra, pozostawiając pustą wnękę na łaty.
7. Przyklej przezroczystą folię na zewnątrz każdego kłącza (patrz Tabela materiałów). Oznacz jedną stronę jako leczenie, a drugą jako kontrolę, a następnie napełnij plastry z odpowiednich torebek za pomocą lejka. Obrysuj granice każdej plamy na przezroczystości za pomocą markera permanentnego.
8. Wypełnij kłączobox równomiernie pozostałym podłożem. Obrysuj górną część podłoża na przezroczystości
.
9. Powtórz dla pozostałych kłączowców. Zachowaj wszystkie worki do zbioru.

9. Równomierne podlewanie do 60% zdolności zatrzymywania wody

UWAGA: Stwierdzono, że taka ilość wilgoci w glebie zapobiega stresowi spowodowanemu suszą, jednocześnie zapobiegając rozwojowi warunków beztlenowych lub wzrostowi glonów.

1. Zmierz zdolność zatrzymywania wody (WHC) podłoża¹⁴.
2. Oblicz idealną wagę każdego pudełka; tutaj zdefiniowaną jako suma masy pustego pojemnika na kłącze z wagą podłoża przy 60% zdolności zatrzymywania wody.
3. Pomnóż WHC (gramy wody / gramy suchego podłoża) przez 0,6, aby uzyskać masę wody zatrzymanej w podłożu na poziomie 60% WHC. Dodać tę masę do masy suchego podłoża i masy źródła ¹⁵N.
4. Dodaj pustą masę każdego pudełka do liczby uzyskanej powyżej.
5. Zważ pudełka po ich napełnieniu. W tym momencie odejmij wagę każdego pudełka (w g) od jego idealnej wagi (w g) obliczonej w kroku 9.2. Podlewaj o tej objętości (w ml) wody dejonizowanej (DI) powoli i równomiernie.
   UWAGA: Ten krok można wykonać za pomocą nawadniania kropelkowego lub podlewania ręcznego. W przypadku podlewania ręcznego poczekaj, aż woda całkowicie przesiąknie przed dodaniem więcej, aby uniknąć niejednorodnych warunków wilgotności gleby i preferencyjnych kanałów przepływu.

10. Kiełkowanie i przesadzanie nasion

1. Jeśli używasz nieposadzonych kontrolek, odłóż te kłącza na bok.
2. Nasiona kukurydzy wysterylizować powierzchniowo, mieszając przez 1 minutę w 5% NaOCl, a następnie dokładnie spłukać w wodzie DI.
   UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano nasiona sześciu różnych genotypów kukurydzy w celu zbadania genotypowych różnic w plastyczności korzeni.
3. Wysterylizowane nasiona należy wykiełkować, umieszczając je na mokrej tkance laboratoryjnej (np. Kimwipe) wewnątrz szalek Petriego i przykrywając inną wilgotną tkanką. Nie powinno być żadnej stojącej wody. Umieść szalki Petriego w ciemnym miejscu na 48-72 h, aż korzonek zacznie się wyłaniać.
4. Użyj wąskiej szpatułki, aby wykopać dziurę na głębokość 2,5 cm w środku każdego kłącza. Przeszczep kiełkujące ziarno do dołka, upewniając się, że korzonek jest skierowany bezpośrednio w dół.
   UWAGA: Jeśli korzonek jest ustawiony pod kątem w kierunku którejkolwiek z łat, porównanie szybkości wzrostu korzeni będzie stronnicze.
5. Prześledź położenie nasion na przezroczystości.
6. Przykryj nasiona i wodę do 50 ml wody demineralizowanej.

11. Wzrost roślin

1. Uprawiaj rośliny przez 25 dni (lub tak długo, jak chcesz), utrzymując 60% WHC przez cały okres wegetacji. Monitoruj wzrost korzeni, śledząc korzenie.
2. Waż każde pudełko co 3-4 dni i podlewaj, aż znajdzie się w granicach 5 g swojej idealnej wagi. Przestań podlewać kłączoboxy na cztery dni przed zbiorem, aby ułatwić oddzielenie paneli. Często usuwaj chwasty ręcznie, aby obecne były tylko interesujące korzenie roślin.
3. Śledź widoczne korzenie co 3\u20124 dni za pomocą markera permanentnego z wyraźnie rozróżniającymi kolorami dla każdego dnia obserwacji.
   UWAGA: W razie potrzeby można użyć znaczników o różnej średnicy dla korzeni pierwotnych i bocznych. Przydatne może być określenie kryteriów śledzenia korzeni na samym początku, ponieważ w grę wchodzi pewien stopień subiektywności, zwłaszcza jeśli wielu badaczy będzie śledzić korzenie lub jeśli korzenie o różnych rzędach lub średnicy mają być rozróżniane za pomocą różnych markerów. W tym eksperymencie przetestowano dokładność śledzenia widocznych korzeni tylko po jednej stronie pudełka, śledząc widoczne korzenie po obu stronach i porównując całkowitą długość korzeni zmierzoną na zeskanowanych foliach z całkowitą długością korzenia zmierzoną przez mycie i skanowanie korzeni. Korelacja między śledzoną a zeskanowaną długością korzenia była istotna niezależnie od tego, czy użyto tylko tylnej przezroczystości, czy obu folii. Dzięki temu możliwe jest po prostu prześledzenie widocznych korzeni na tylnym panelu.

12. Zbieranie pędów oraz pobieranie próbek korzeni i gleby do analizy

1. Połóż pierwszy ryzobox płasko i wykręć wszystkie.
2. Zbierz próbki pędów. Przyciąć pędy u podstawy, spłukać glebę wodą demineralizowaną i wysuszyć w temperaturze 60 °C. Zmielić pędy moździerzem i tłuczkiem, aby przeszły przez sito o średnicy 2 mm i zważyć podpróbki do cynowych kapsułek w celu analizy izotopowej (patrz sekcja 14).
3. Używając przezroczystości jako przewodnika, odetnij plastry po leczeniu i kontroli za pomocą brzytwy. Za pomocą łyżki lub szpatułki zgarnij korzenie i przylegającą do nich ziemię ryzosferową do odpowiedniego worka zabiegowego lub kontrolnego.
   UWAGA: Chociaż istnieje wiele metod oddzielania gleby ryzosfery, gleby pod wpływem korzeni roślin¹⁵, a ryzosferę można uznać za gradient, a nie ściśle wyznaczoną strefę¹⁶, ta metoda jest zgodna z powszechnie stosowaną definicją gleby, która przylega do korzeni roślin po wstrząsnięciu¹⁷.
4. Zgarnij pozostałe korzenie i ziemię do trzeciej torby.
5. Przełóż próbki poddawane zabiegowi, kontrolne i zbiorcze przez sito o średnicy 2 mm, aby oddzielić korzenie od podłoża, usuwając wszelkie widoczne korzenie lub fragmenty o długości >1 cm za pomocą cienkiej pęsety. Próbki te należy przechowywać oddzielnie, aby uzyskać łącznie trzy próbki korzeni i trzy próbki podłoża.

13. Walidacja śledzenia i szacowanie względnego tempa wzrostu korzeni

1. Skanuj próbki zabiegowe, kontrolne i zbiorcze i oblicz długość korzenia.
   1. Pracując z jedną próbką na raz, ostrożnie spłucz korzenie wodą demineralizowaną, aby usunąć wszelkie pozostałe podłoże. Ułóż próbki na przezroczystej tacy, tak aby korzenie nie zachodziły na siebie.
   2. Skanuj próbki za pomocą skanera kompatybilnego z oprogramowaniem do analizy rootów (np. WinRhizo). Upewnij się, że oprogramowanie jest skalibrowane tak, aby niezawodnie odróżniać korzenie od tła obrazu.
   3. Użyj oprogramowania, aby zmierzyć całkowitą długość korzenia i długość korzenia w interesujących klasach średnic (np. <0,2 mm, 0,2\u20120,4 mm, 0,4\u20120,8 mm, 0,8\u20121,6 mm, >1,6 mm).
2. Obliczyć gęstość długości korzeni (RLD) dla plastrów do zabiegu i kontroli oraz dla każdego ryzoboxa jako całości.
   1. Obliczyć objętość plastrów poddanych zabiegowi i kontroli, mnożąc obszar zaznaczony na każdej przezroczystości (patrz krok 8.1) przez 0,635 cm, czyli głębokość pudełka. Użyj tych objętości do obliczenia gęstości długości korzeni w plastrach poddanych działaniu środka i kontrolnych, używając całkowitej długości korzenia w każdym plastrze (patrz krok 13.1.3).
      
   2. Obliczyć objętość substratu w każdym kłączu, mnożąc powierzchnię narysowaną na przezroczystości (patrz krok 8.1) przez 0,635 cm. Obliczyć RLD jak dla plastrów do zabiegu i kontroli.
      
3. Sprawdź poprawność metody śledzenia rootów, porównując zeskanowane systemy główne i śledzone obrazy.
   1. Zeskanuj każdą przezroczystość i oblicz całkowitą długość korzenia za pomocą oprogramowania. Zapisz zeskanowany obraz do obliczeń szybkości wzrostu.
   2. Zsumować całkowite pomiary długości korzeni próbek poddanych zabiegowi, kontrolnych i zbiorczych dla każdego pudełka (patrz krok 13.1.3).
   3. Przetestuj zeskanowane i prześledzone pomiary całkowitej długości korzenia, aby sprawdzić, czy korelacja jest statystycznie istotna.
      UWAGA: Jeśli tak, metoda śledzenia jest walidowana, a względne tempo wzrostu można obliczyć w każdym punkcie czasowym. Jeśli nie, tylko zeskanowane dane systemu korzeniowego zapewniają dokładne wskazanie wzrostu korzeni. Może tak być na przykład w przypadku, gdy metodyka śledzenia jest niespójna lub jeśli korzenie nie są jednakowo widoczne dla wszystkich genotypów.
4. Jeśli metoda śledzenia została zwalidowana, oblicz względne tempo wzrostu korzeni dla każdego ryzoboxa.
   1. Użyj oprogramowania do analizy korzeni skalibrowanego w celu rozróżnienia wybranych kolorów śledzenia, aby zmierzyć całkowitą długość korzenia w próbkach poddanych zabiegowi, kontrolnych i zbiorczych w każdym punkcie czasowym. Oblicz skumulowaną całkowitą długość korzenia w każdym punkcie czasowym.
   2. Obliczyć względne tempo wzrostu korzeni (_korzeń RGR) dla każdego kłącza, jak również dla plastrów zabiegowych i kontrolnych dla każdego przedziału czasu t_{1-t 2} w następujący sposób.
      
      UWAGA: Tutaj L₁ to całkowita długość korzenia w plastrze (skumulowana suma z 11,3) w t₁ dniu po przesadzeniu (DAT), a L₂ to całkowita długość korzenia w łatce w t₂ DAT.

14. Analiza podziału ¹⁵N między próbkami korzeni, pędów i gleby traktowanej

1. Wysuszyć korzenie w temperaturze 60 °C, zważyć biomasę i zmielić na sitko o średnicy 2 mm.
2. Suche podpróbki gleby poddanej działaniu środka w temperaturze 60 °C.
3. Umieść korzenie i leczenie w blaszanych kapsułkach, tak jak w przypadku pędów.
   UWAGA: Idealną masę próbki na kapsułkę należy obliczać oddzielnie dla pędów, korzeni i gleby w oparciu o szacowany stosunek C/N materiału, aby osiągnąć docelową ilość całkowitego N do analizy. Aby uzyskać więcej informacji, skontaktuj się z zakładem zajmującym się izotopami stabilnymi, w którym mają zostać dostarczone próbki. W tym eksperymencie postępowano zgodnie z instrukcjami przygotowania próbki i kalkulatorem masy próbki dostarczonymi przez UC Davis Stable Isotope Facility¹⁸.
   UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby równomiernie wymieszać próbki przed zapakowaniem do kapsułek i przygotować wiele kapsułek na próbkę. Jeżeli próbki nie są równomiernie wymieszane, pozorny odzysk ¹⁵N może przekroczyć ilość pierwotnie występującą.
4. Przeanalizuj całkowitą zawartość N, δ15 i ¹⁵N w każdym pędzie, korzeniu i próbce gleby poddanej zabiegowi.
   UWAGA: W tym eksperymencie próbki roślinne analizowano poprzez spalanie za pomocą analizatora elementarnego PDZ Europa ANCA-GSL połączonego ze spektrometrem mas o stosunku izotopów PDZ Europa 20-20 w UC Davis Stable Isotope Facility (UCD SIF). Próbki gleby analizowano za pomocą analizatora elementarnego Elementar Vario EL Cube połączonego ze spektrometrem mas o stosunku izotopów PDZ Europa 20-20 w UCD SIF.
5. Obliczyć ilość ¹⁵N uzyskaną z etykiety w próbkach pędów i korzeni roślin.
   1. Najpierw oblicz ilość ¹⁵N przekraczającą ¹⁵N atmosferyczną w każdym basenie, ¹⁵P*:
      
      gdzie ¹⁵P jest zawartością ¹⁵N w atomowym % puli będącej przedmiotem zainteresowania.
   2. Po drugie, oblicz ilość ¹⁵N przekraczającą ¹⁵N w atmosferze na etykiecie, ¹⁵L*:
      
      gdzie ¹⁵L oznacza ^{zawartość 15}N w atomowym % znakowanego źródła N.
   3. Po trzecie, oblicz ilość całkowitego N w każdej puli, N_p:
      
      gdzie m_p jest masą puli (np. całkowita biomasa suchych pędów lub korzeni), a %_p jest procentem N w tej puli.
   4. Na koniec użyj wyników 14.5.1\u201214.5.3 w równaniu Ndff¹⁹, aby obliczyć ilość N uzyskaną z etykiety, N_l:
      
      UWAGA: Równanie Ndff służy do określania ilości N z oznakowanego źródła, która jest odzyskiwana przez rośliny. Zakłada ona, że podczas pobierania N przez roślinę nie występuje dyskryminacja izotopowa i jest ogólnie obowiązująca dla źródeł N wzbogaconych ~1\u201210%¹⁹.

Korzenie rosły preferencyjnie na grzbiecie pudełka, zgodnie z przewidywaniami. Całkowita długość korzeni z tyłu pudełka wahała się od 400 do 1 956 cm, w porównaniu do 93-758 cm z przodu pudełka. Pary współczynników korelacji Pearsona obliczono między zeskanowaną długością korzenia a prześledzoną długością korzenia z przodu pudełka, z tyłu pudełka, a suma przodu i tyłu została wykorzystana do określenia, czy śledzenie dokładnie odzwierciedla całkowitą długość korzenia (n = 23, ponieważ roślina w jednym pudełku umarła podczas eksperymentu). Zeskanowana całkowita długość korzenia była istotnie skorelowana ze śledzoną długością korzenia z tyłu pudełka (Rysunek 5A, p = 0,0059), przód pudełka (Rysunek 5B, p = 0,022) oraz sumą tyłu i przodu (Rysunek 5C, p = 0,0036). W związku z tym uznaje się, że śledzenie tylko tylnej części pudełka zapewnia reprezentatywną miarę wzrostu korzeni, jednocześnie skracając o połowę czas potrzebny na śledzenie korzeni. Należy jednak zauważyć, że śledzenie obejmuje tylko 21,6-54,6% całkowitej długości korzeni. Podczas gdy korzenie rosną preferencyjnie na powierzchni kłącza, w szczególności drobne korzenie boczne mogą nie być widoczne do śledzenia. Śledzenie dobrze nadaje się do względnych porównań długości korzeni w czasie, zwłaszcza na wczesnym etapie rozwoju, ale zbiór i skanowanie systemów korzeniowych jest preferowane, jeśli celem jest dokładne ilościowe określenie całkowitej długości korzeni.

Rysunek 5: Korelacje między śledzonymi i zeskanowanymi danymi dotyczącymi długości korzeni. A) Śledzona długość korzenia była istotnie skorelowana z zeskanowaną długością korzenia, gdy śledzono tylko przód pudełka. B) Śledzenie korzeni z tyłu pudełka, gdzie większość korzeni była widoczna, poprawiło wartość R2 regresji w stosunku do zeskanowanej długości korzenia w porównaniu ze śledzeniem przodu pudełka; Korelacja była ponownie znacząca. C) Najdokładniejszą metodą jest śledzenie korzeni po obu stronach pudełka, o czym świadczy najwyższa wartość R2 z trzech metod i znacząca korelacja z zeskanowaną długością korzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tempo wzrostu korzeni w czasie było podobne wśród pól, co pokazują spójne nachylenia podczas wykreślania naturalnego logarytmu całkowitej długości korzenia w czasie (Rysunek 6). Chociaż należy spodziewać się niewielkiej zmienności, spójne tempo wzrostu wskazuje, że warunki eksperymentalne były jednakowe dla wszystkich skrzynek. Dramatycznie różne nachylenia wskazywałyby, że rośliny rosły w różnym tempie, co sugeruje potrzebę sprawdzenia różnic w zmiennych, takich jak temperatura lub wilgotność.

Rysunek 6: Tempo wzrostu korzeni w czasie. Podobne nachylenia długości korzeni w stosunku do czasu wśród kłączoboksów wskazują, że korzenie rosły w równym tempie. Niejednorodne nachylenia mogą wskazywać, że warunki eksperymentalne różnią się między ryzoboksami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Korzenie wszystkich genotypów kukurydzy rozmnożyły się w grządkach zawierających 15N znakowanych resztek pożniwnych. Dwukierunkowa ANOVA z typem łaty i genotypem jako stałymi czynnikami (n = 23) ujawniła, że gęstość długości korzeni była wyższa w leczeniu niż w kontrolnych łatach przy użyciu zeskanowanych danych korzeniowych (Rysunek 7a, p = 0,013), a także śledzonych danych korzeniowych (Figura 7b, p = 0,005). W żadnym z tych przypadków RLD nie różnił się istotnie między genotypami.

Rysunek 7: Gęstość długości korzenia według genotypu i typu danych korzenia. a) Zeskanowane dane korzeniowe wykazały, że wszystkie genotypy (A-F) namnażały się w plastrze leczonym (T), a różnice genotypowe nie były znaczące. b) Zebrane i zeskanowane dane dotyczące korzeni potwierdziły istotny wpływ pozostałości roślin strączkowych, ale nie genotypu (A-F), na gęstość długości korzeni w płatach. Litery A-F reprezentują sześć różnych genotypów, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy. C: kontrola; T: leczenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Średnica pierwiastka może być wykorzystana do wnioskowania o funkcji pierwiastka i obrocie. Drobne korzenie są częściej korzeniami bocznymi, które szybko rozwijają się i rozmnażają w odpowiedzi na gorące punkty zasobów, podczas gdy większe grube korzenie są częściej długowiecznymi, wolno reagującymi korzeniami osiowymi. Skanowane systemy korzeniowe analizowano pod kątem proporcji korzeni w każdej klasie średnicy: <0,2 mm, 0,2-0,4 mm, 0,4-0,8 mm, 0,8-1,6 mm i >1,6 mm, a każdą klasę wielkości przebadano pod kątem różnic genotypowych. Genotypy z drobniejszymi korzeniami w plastrach terapeutycznych mogą wskazywać na skuteczniejszą odpowiedź proliferacyjną. Jednoczynnikowa ANOVA z genotypem jako stałym czynnikiem (n = 23) ujawniła, że genotypy nie różniły się długością korzeni w każdej klasie wielkości dla całego systemu korzeniowego (Rysunek 8a), plastrów zabiegowych ( Figura 8b) lub łat kontrolnych (Figura 8c). Większość korzeni stanowiły korzenie drobne (<0,2 mm).

Rysunek 8: Proporcje korzeni w różnych klasach średnic według genotypu i lokalizacji. a) W każdym kłączpudełku (z wyłączeniem plastrów zabiegowych i kontrolnych) większość korzeni była drobna (<0,2 mm średnicy). Genotypy nie różniły się proporcjami korzeni w każdej klasie średnicy. b) W przypadku plastrów do leczenia długość korzeni na klasę wielkości również zmniejszała się wraz ze wzrostem średnicy we wszystkich genotypach. c) Plastry kontrolne charakteryzowały się tymi samymi wzorami. Litery A-F reprezentują sześć różnych genotypów, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Etykieta N była wyższa w próbkach pędów niż korzeni we wszystkich genotypach zgodnie z dwukierunkową ANOVA z typem próbki i genotypem jako stałymi czynnikami (n = 23, Rysunek 9), pokazując, że 77-81% N pobranego z plastra do leczenia zostało przemieszczone z korzeni do pędów podczas eksperymentu. Jednoczynnikowa ANOVA (n = 23) wykazała, żeδ 15N próbek korzeni i pędów nie różniło się w zależności od genotypu.

Rysunek 9: Azot uzyskany z pozostałości roślin strączkowych w korzeniach i pędach podczas zbioru. Wszystkie genotypy były jednakowo skuteczne w pobieraniu N z plastra zawierającego 15pozostałości roślin strączkowych znakowanych N. Większość N pobranego z grządki została przemieszczona z korzeni do pędów. Litery A-F reprezentują sześć różnych genotypów, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.