Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany protokół Rhizobox do wizualizacji wzrostu korzeni i reakcji na zlokalizowane składniki odżywcze

16.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58674

⸱

22 października 2018

 ,  , 
1Department of Plant Sciences, University of California at Davis, 2Department of Natural Resources and the Environment, University of New Hampshire

W tym artykule

Podsumowanie

Wizualizacja i pomiar wzrostu korzeni in situ jest niezwykle trudne. Przedstawiamy konfigurowalną metodę rhizobox do śledzenia rozwoju i proliferacji korzeni w czasie w odpowiedzi na wzbogacenie w składniki odżywcze. Metoda ta służy do analizy różnic genotypowych w plastyczności korzeni kukurydzy w odpowiedzi na organiczne źródło azotu.

Streszczenie

Korzenie są niezwykle trudne do zbadania. Gleba stanowi zarówno wizualną, jak i mechaniczną barierę, co utrudnia śledzenie korzeni in situ bez destrukcyjnych zbiorów lub drogiego sprzętu. Przedstawiamy konfigurowalną i niedrogą metodę rhizobox, która pozwala na nieniszczącą wizualizację wzrostu korzeni w czasie i jest szczególnie dobrze przystosowana do badania plastyczności korzeni w odpowiedzi na zlokalizowane plamy zasobów. Metodę zwalidowano, oceniając zmienność genotypową kukurydzy w reakcjach plastyczności na plastry zawierające 15pozostałości roślin strączkowych znakowanych N. Opisano metody pozwalające na uzyskanie reprezentatywnych pomiarów rozwojowych w czasie, pomiar gęstości długości korzeni w łatach zawierających zasoby i kontrolnych, obliczanie tempa wzrostu korzeni oraz określanie odzyskiwania 15N przez korzenie i pędy roślin. Omówiono również zalety, zastrzeżenia i potencjalne przyszłe zastosowania metody. Chociaż należy dołożyć starań, aby zapewnić, że warunki eksperymentalne nie zniekształcą danych dotyczących wzrostu korzeni, przedstawiony tutaj protokół rhizobox daje wiarygodne wyniki, jeśli zostanie przeprowadzony z wystarczającą dbałością o szczegóły.

Wprowadzenie

Chociaż często pomijane w porównaniu do swoich naziemnych odpowiedników, korzenie odgrywają kluczową rolę w pozyskiwaniu składników odżywczych dla roślin. Biorąc pod uwagę znaczne koszty emisji dwutlenku węgla związane z budową i utrzymaniem korzeni, rośliny wykształciły mechanizmy umożliwiające rozwój korzeni tylko tam, gdzie żerowanie jest warte inwestycji. Systemy korzeniowe mogą zatem efektywnie i dynamicznie eksploatować plamy zasobów, rozmnażając się w gorących punktach, zwiększając tempo pobierania i szybko przenosząc składniki odżywcze do łyka w celu dalszego transportu1. Reakcje plastyczności mogą się znacznie różnić w zależności od gatunku rośliny lub genotypu2,3 i w zależności od formy chemicznej danego składnika odżywczego4,5. Należy dalej badać różnice w plastyczności korzeni, ponieważ zrozumienie złożonych reakcji korzeni na niejednorodne zasoby glebowe może dostarczyć informacji na temat strategii hodowli i zarządzania w celu zwiększenia efektywności wykorzystania składników odżywczych w rolnictwie.

Pomimo swojej konieczności i znaczenia dla zrozumienia systemów roślinnych, wizualizacja i ilościowe określenie plastyczności korzeni w odpowiednich skalach stanowi wyzwanie techniczne. Wykopywanie korony korzeniowej z gleby ("shovelomics"6) jest powszechną metodą, ale drobne korzenie wykorzystują małe pory między agregatami glebowymi, a wykopy nieuchronnie prowadzą do pewnego stopnia utraty tych delikatnych korzeni. Co więcej, destrukcyjne zbiory uniemożliwiają śledzenie zmian w jednym systemie korzeniowym w czasie. Metody obrazowania in situ, takie jak rentgenowska tomografia komputerowa, umożliwiają bezpośrednią wizualizację korzeni i zasobów glebowych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej7, ale są drogie i wymagają specjalistycznego sprzętu. Eksperymenty hydroponiczne pozwalają uniknąć ograniczeń związanych z wydobywaniem korzeni z gleby, ale morfologia i architektura korzeni różnią się w środowisku wodnym w porównaniu z ograniczeniami mechanicznymi i złożonością biofizyczną gleb8,9. Wreszcie, procesy i funkcje ryzosfery nie mogą być zintegrowane z plastycznością rozwojową w tych sztucznych pożywkach.

Przedstawiamy protokół budowy i użytkowania rhizoboxów (wąskich, prostokątnych pojemników o przezroczystych ściankach) jako tanią, konfigurowalną metodę charakteryzowania wzrostu korzeni w glebie w czasie. Specjalnie zaprojektowane ramki zachęcają korzenie do wzrostu preferencyjnie w stosunku do tylnego panelu ze względu na grawitropizm, zwiększając dokładność pomiarów długości korzeni. Rhizoboxy są powszechnie używane do badania wzrostu korzeni i interakcji ryzosfery10,11,12, ale przedstawiona tutaj metoda oferuje przewagę w prostocie dzięki jednokomorowej konstrukcji i niedrogim materiałom i jest przeznaczona do badania reakcji korzeni na zlokalizowane składniki odżywcze. Metodę tę można jednak również zaadaptować do badania szeregu innych procesów zachodzących w korzeniach i ryzosferach, takich jak konkurencja wewnątrzgatunkowa i międzygatunkowa, przestrzenne rozmieszczenie związków chemicznych, drobnoustrojów czy aktywność enzymów. W tym miejscu badamy różnice genotypowe między mieszańcami kukurydzy w odpowiedzi na plamy 15pozostałości roślin strączkowych znakowanych N i podkreślamy reprezentatywne wyniki w celu walidacji metody ryzoboksowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie paneli przedniego i tylnego oraz przekładek

  1. Przygotuj panele przednie i tylne.
    1. Wytnij dwa kawałki przezroczystego akrylu o grubości 0.635 cm o wymiarach 40.5 cm szerokości na 61 cm długości na każdy pojemnik lub kup docięte elementy (patrz Tabela materiałów).
    2. Używając wiertła przeznaczonego do akrylu, wywierć otwory o średnicy 0.635 cm w odległości 1.3 cm od bocznych krawędzi, w punktach 2.5, 19, 38 i 53.3 cm od góry. Wywierć otwory w odległości 1.3 cm od dolnej krawędzi, w punktach 2.5, 20.3 i 38 cm od lewej strony (Rycina 1).
      UWAGA: Najbardziej wydajne jest użycie wiertarki stołowej dla stosu od sześciu do dziesięciu arkuszy jednocześnie, ale można również użyć wiertarki ręcznej.
    3. Usuń wszelkie folie ochronne z akrylu i delikatnie oczyść oba panele przed montażem pojemników.

Diagram równowagi statycznej; ΣFx=0; oznaczone wymiary; edukacyjna ilustracja fizyczna.
Rycina 1: Rozmieszczenie wywierconych otworów. Otwory są wiercone 1.3 cm od krawędzi bocznych w odległościach 2.5, 19, 38 i 53.3 cm od góry oraz 1.3 cm od krawędzi dolnej w odległościach 2.5, 20.3 i 38 cm od lewego marginesu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotuj przekładki boczne i dolną.
    1. Wytnij trzy przekładki na każde pudełko z polietylenu o wysokiej gęstości (HDPE) lub kup dwie docięte przekładki boczne (grubość 0.635 cm, szerokość 2.5 cm, długość 57 cm) oraz jedną dociętą przekładkę dolną (grubość 0.635 cm, szerokość 2.5 cm, długość 40.5 cm). Patrz Tabela materiałów.
    2. Ustaw przekładki pomiędzy przednim a tylnym panelem wzdłuż boków i dna pudełka. Za pomocą wiertarki ręcznej lub wiertarki stołowej ponownie wywierć otwory przez istniejące otwory w panelach przednim i tylnym, tak aby otwory przechodziły czysto przez wszystkie trzy warstwy.
    3. Utrzymaj warstwy w miejscu za pomocą zacisków lub instalując zestaw śrub, nakrętek i podkładek w każdym nowo wywierconym otworze (patrz krok 3.1).

2. Instalacja paska wypełnienia poliestrowego na dnie pudełka

UWAGA: Zapobiegnie to wyciekaniu gleby i wody przez łączenia między odstępnikami.

  1. Potnij wypełnienie poliestrowe na paski o szerokości 2,5 cm i długości 40,5 cm (patrz na Tabela materiałów).
  2. Kładąc panel tylny płasko z dystansami umieszczonymi na nim, ułóż wypełnienie bezpośrednio nad dolnym dystansem i przytrzymaj je na miejscu za pomocą panelu górnego (Rycina 2).

Schemat montażu kołdry z pomiarami szycia i rozmieszczeniem łatek do instrukcji wykonania.
Rysunek 2: Zmontowany rhizobox z wypełnieniem watowym. Wąski pasek wypełnienia watowego na dnie rhizoboxu zapobiega wyciekaniu gleby i piasku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Montaż ryzoboksów

  1. Zmontować rizoboksy, używając śrub z 20 gwintami (długość 3,2 cm, średnica 0,635 cm), podkładek (średnica wewnętrzna 0,635 cm) i nakrętek sześciokątnych (dobranych do śrub, patrz Tabela materiałów).
  2. Dokręcić każdą śrubę przez podkładkę, przedni panel, dystans, tylny panel, podkładkę i nakrętkę sześciokątną. Należy upewnić się, że śruby są bardzo mocno dokręcone; jeśli skrzynka zostanie złożona zbyt luźno, gleba będzie wysypywać się przez szczeliny między panelami a bocznymi dystansami.
    UWAGA: Akryl łatwo się rysuje, a zarysowania mogą zakłócać pomiary korzeni, dlatego należy ostrożnie obchodzić się z zmontowanymi skrzynkami. Unikać układania skrzynek w stosach, chyba że pomiędzy nimi zostanie umieszczony materiał ochronny.
  3. Przygotować dwa dystanse obszarowe (dystanse, które posłużą do stworzenia obszarów badawczych i kontrolnych) na każdą skrzynkę. Wyciąć dystanse z arkuszy polietylenu o wysokiej gęstości (HDPE) lub zakupić gotowe elementy (grubość 0,635 cm, szerokość 3,8 cm, długość 28 cm; patrz Tabela materiałów). Wywiercić w każdym dystansie jeden otwór o średnicy 0,635 cm, w odległości 2 cm od górnej krawędzi wzdłuż linii środkowej (Rysunek 3).

Schemat równowagi statycznej; układ mocowania z wkrętami, dystansami do łatek; wymiary 28cm, 3,8cm, 2cm.
Rycina 3: Dystanse do łatek. Wkręty włożone przez środek pasków z HDPE zapobiegają ich wpadnięciu do skrzynki. Rizoboks wypełnia się glebą wokół dystansów, zwilża glebę, a następnie usuwa dystanse, aby pozostawić puste łatki badawcze i kontrolne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Zabezpiecz śrubę w każdym otworze za pomocą nakrętki w taki sposób, aby dystans mógł zostać częściowo włożony do rizoboksu, aż śruba zablokuje jego dalsze przesuwanie (Rysunek 3).
    UWAGA: Po zwilżeniu gleby wokół dystansów i ich usunięciu pozostaną dwie puste przestrzenie, które można wypełnić odpowiednimi substratami dla obszaru zabiegowego zawierającego azot oraz obszaru kontrolnego.

4. Budowa ram z PVC do podtrzymywania rizoboksów pod kątem

UWAGA: Gdy pudełko jest ustawione pod kątem, gravitropizm będzie stymulował korzenie do wzrostu wzdłuż tylnego panelu, dzięki czemu wszystkie korzenie będą widoczne podczas śledzenia. Wymiary polichlorku winylu (PVC) przedstawione na Rysunku 4 pozwalają na stworzenie ramy, która utrzymuje rhizobox pod kątem około 55° względem blatu.

  1. Dla każdego pudełka dotnij 13 kawałków PVC o średnicy 1,3 cm: 2 odcinki o długości 44 cm, 3 odcinki o długości 42 cm, 2 odcinki o długości 36,3 cm, 2 odcinki o długości 25,4 cm oraz 4 odcinki o długości 3,8 cm (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: W celu zwiększenia wydajności i uzyskania równych cięć wysoce zaleca się stosowanie przecinarki do metalu.
  2. Użyj 4 kolanek dwudrożnych, 2 kolanek trójdrożnych oraz 4 trójników (patrz Tabela materiałów) aby złożyć pudełko zgodnie z rysunkiem w Rysunek 4.
    UWAGA: Ramki powinny być stabilne bez użycia dodatkowego kleju, jednak w razie potrzeby można zastosować klej do PVC.

Schemat ramy z rur PVC z wymiarami i połączeniami kolankowymi; ilustruje geometrię konstrukcji.
Rycina 4: Rama do podparcia rizoboksów. Lekka rama jest wykonana z rur PVC dociętych do określonych długości i połączonych za pomocą wskazanych typów złączy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Szycie osłon ochronnych odbijających światło i ciepło

UWAGA: Korzenie unikają światła, dlatego w tych przypadkach wyklucza się dostęp światła, aby upewnić się, że obserwowane odpowiedzi plastyczności korzeni są wywołane źródłem składników odżywczych w plamkach, a nie unikaniem światła. Tkanina odcinająca światło obniża również temperaturę wewnątrz rizoboksów, co pomaga uniknąć stresu cieplnego.

  1. Potnij tkaninę do odcinania światła (specjalistyczny materiał, który z jednej strony jest biały, a z drugiej czarny) na kawałki o szerokości około 95 cm i długości 69 cm (patrz Tabela materiałów). Wymagany jest jeden kawałek na pudełko.
  2. Złóż każdy kawałek na pół wzdłuż dłuższego boku, aby utworzyć tuleję o wymiarach 47,5 cm × 69 cm. Używając igły do maszyny do szycia przeznaczonej do denimu, mocnych nici do quiltingu oraz wąskiego szwu, zszyj dół i ¾ boku każdej tulei. Zepnij górne rogi za pomocą agrafki.

6. Przygotowanie podłoża z gleby i piasku w stosunku 1:1 (V/V) do wypełnienia ryzoboksów

  1. Zebrać około 1 000 cm3 gleby polowej (z badanego obszaru) na każde pudełko. Suszyć glebę do stałej masy w płytkich tackach w temperaturze 60 °C.
    UWAGA: Gleba do tego eksperymentu została pobrana bezpośrednio po zbiorach z pola kukurydzy prowadzonego w systemie rolnictwa ekologicznego, z głębokości 0‒10 cm.
  2. Zmielić glebę w moździerzu tak, aby przeszła przez sito o oczkach 2 mm. Zmierzyć gęstość objętościową gleby poprzez zważenie znanej objętości materiału.
  3. Przygotować piasek (np. piasek zabawowy, który można tanio nabyć w sklepie budowlanym; patrz Tabela materiałów) i zmierzyć jego gęstość objętościową.
  4. Odmierzyć równe objętości piasku i gleby do wiadra i dokładnie wymieszać. Za pomocą lejka powoli i równomiernie wypełnić pudełko do poziomu 2,5 cm od górnej krawędzi, nie potrząsając pudełkiem, aby nie doprowadzić do osiadania podłoża. Zmierzyć tę objętość podłoża; powinna ona wynosić około 1 272 cm3.
  5. Pomnożyć gęstość objętościową piasku przez połowę tej objętości, aby uzyskać masę piasku potrzebną do każdego pudełka. Postąpić analogicznie z gęstością objętościową gleby, aby uzyskać masę gleby potrzebną do każdego pudełka.
    UWAGA: W przypadku gleby polowej i piasku użytych w tym eksperymencie wartości te wynosiły 976 g piasku i 774 g gleby, jednak ilości te będą się różnić w zależności od gęstości objętościowej zastosowanej gleby.
  6. Oznaczyć jeden duży plastikowy worek strunowy na każdy rhizobox, odważyć do worka odpowiednie masy piasku i gleby, a następnie dokładnie zhomogenizować.
  7. Przeanalizować tak przygotowane podłoże glebowe w proporcji 1:1 pod kątem zawartości składników odżywczych oraz naturalnej obfitości 15N (δ15N).

7. Przygotowanie podłoża dla plastrów traktowanych i kontrolnych

  1. Oznaczyć dwa małe plastikowe woreczki strunowe na każdą ryzoboks: jeden dla obszaru traktowanego i jeden dla obszaru kontrolnego. Odważyć 30 g substratu gleba : piasek z każdego dużego worka (krok 6.6) do dwóch odpowiadających im małych woreczków.
  2. Wymieszać substrat ze źródłem azotu znakowanym 15N dla obszaru traktowanego. W tym celu odważyć 1 g pozostałości roślinnych znakowanych 15N lub innego źródła N (ilość można dostosować według uznania) do każdego woreczka traktowanego (mały woreczek strunowy) i dokładnie wymieszać.
    UWAGA: W tym eksperymencie zastosowano mieszankę pozostałości koniczyny i wikiny znakowanych 15N. Nasiona koniczyny i wikiny wysiano w mieszaninie wermikulitu i piasku w stosunku 1:1 i hodowano w warunkach szklarniowych. Rośliny podlewano codziennie wodą dejonizowaną oraz dwa razy w tygodniu 1/100 stężeniem roztworu Long-Ashton13 zawierającego źródła azotu znakowane 15N. Całą biomasę nadziemną zebrano cztery tygodnie po wysiewie, wysuszono i zmielono tak, aby przeszła przez sito o oczkach 2 mm. W przypadku wyboru innego składnika odżywczego, szczególnie jeśli pierwiastek ten jest mobilny w glebie, zaleca się przeprowadzenie eksperymentów pilotażowych w celu sprawdzenia wymywania. W razie potrzeby można zastosować formy składników odżywczych o powolnym uwalnianiu lub wybrać inną konstrukcję ryzoboksu w celu ograniczenia wymywania (np. poprzez oddzielne komory10).

8. Wypełnianie ryzoboksu podłożem oraz wyznaczanie obszarów badawczych i kontrolnych

  1. Zważ każdy pusty ryzoboks i zapisz wartości wag do późniejszego wykorzystania.
  2. Włóż dwa dystansory do jednej komory (patrz krok 3.2) do ryzoboksu, aż śruba uniemożliwi dalsze przesuwanie. Zaznacz głębokość dolnej krawędzi lekkim znakiem na boku ryzoboksu (Rysunek 3), a następnie wyjmij dystansory.
  3. Używając lejka z otworem trzonka o szerokości zbliżonej do otworu ryzoboksu, wypełnij ryzoboks odpowiednim podłożem z dużego worka do zaznaczonej głębokości. Poruszaj lejkiem powoli i równomiernie w przód i w tył, aby podłoże wypełniało przestrzeń jednorodnie i nie tworzyło preferencyjnych kanałów przepływu.
  4. Gdy poziom podłoża osiągnie zaznaczoną głębokość, ponownie włóż dystansory w odległości 5 cm od każdej krawędzi pudełka. Kontynuuj wypełnianie pudełka, aż poziom podłoża znajdzie się około 5 cm od górnej krawędzi ryzoboksu (w worku powinno pozostać podłoże).
  5. Dokładnie nawilż obszar wokół każdego dystansora.
    UWAGA: W tym eksperymencie osiągnięto to poprzez podanie 50 mL wody za pomocą emiterów kroplujących wstawionych między zewnętrzną krawędź każdego dystansora a ściankę ryzoboksu oraz równomierne wlanie 50 mL wody pomiędzy dwa dystansory. Powolne nawadnianie jest niezbędne dla uzyskania jednorodnego zawilgocenia.
  6. Wyjmij dystansory, gdy gleba jest jeszcze mokra, pozostawiając pustą przestrzeń na łaty podłoża.
  7. Przyklej folię przezroczystą do zewnętrznej strony każdego ryzoboksu (patrz Tabela materiałów). Oznacz jedną stronę jako próbę, a drugą jako kontrolę, a następnie wypełnij łaty odpowiednim materiałem z worków, używając lejka. Obrysuj granice każdej łaty na folii za pomocą niezmywalnego markera.
  8. Wypełnij równomiernie ryzoboks pozostałym podłożem. Obrysuj górną krawędź podłoża na folii.
  9. Powtórz czynności dla pozostałych ryzoboksów. Zachowaj wszystkie worki do etapu zbiorów.

9. Równomierne podlewanie do 60% pojemności wodnej

UWAGA: Ustalono, że taka ilość wilgoci w glebie zapobiega występowaniu stresu suszy u roślin, jednocześnie przeciwdziałając powstawaniu warunków anoksycznych lub wzrostowi alg.

  1. Zmierz pojemność wodną (WHC) podłoża14.
  2. Oblicz idealną wagę każdego pojemnika; zdefiniowaną tutaj jako sumę wagi pustego rizoboksu oraz wagi podłoża przy 60% pojemności wodnej.
  3. Pomnóż WHC (gramy wody / gramy suchego podłoża) przez 0,6, aby uzyskać masę wody zawartej w podłożu przy 60% WHC. Dodaj tę masę do masy suchego podłoża oraz masy źródła 15N.
  4. Do otrzymanej powyżej wartości dodaj wagę pustego pojemnika.
  5. Zważ pojemniki po ich napełnieniu. Odejmij aktualną wagę każdego pojemnika (w g) od jego idealnej wagi (w g) obliczonej w kroku 9.2. Podlej powoli i równomiernie taką objętością (w mL) wody dejonizowanej (DI).
    UWAGA: Krok ten można wykonać za pomocą nawadniania kropelkowego lub ręcznego podlewania. W przypadku podlewania ręcznego należy poczekać do całkowitego przesiąknięcia wody, zanim doda się kolejną porcję, aby uniknąć niejednorodnej wilgotności gleby i powstania preferencyjnych kanałów przepływu.

10. Kiełkowanie nasion i przesadzanie

  1. W przypadku stosowania kontroli nieobsianych, należy odstawić odpowiednie ryzoboksy na bok.
  2. Nasiona kukurydzy należy wysterylizować powierzchniowo, mieszając przez 1 min w 5% NaOCl, a następnie dokładnie wypłukać w wodzie DI.
    UWAGA: W tym doświadczeniu wykorzystano nasiona sześciu różnych genotypów kukurydzy, aby zbadać genotypowe różnice w plastyczności korzeni.
  3. Wykiełkować wysterylizowane nasiona, umieszczając je na mokrej chusteczce laboratoryjnej (np. Kimwipe) w szalkach Petriego i przykrywając drugą wilgotną chusteczką. Nie powinno być wolnej wody. Szalki Petriego należy umieścić w ciemnym miejscu na 48‒72 h, aż do momentu, gdy korzeń zakiełkowy zacznie się wyłaniać.
  4. Za pomocą wąskiej szpatułki wykonać otwór o głębokości 2,5 cm w centrum każdego ryzoboksu. Przesadzić wykiełkowane nasiono do otworu, upewniając się, że korzeń zakiełkowy jest skierowany bezpośrednio w dół.
    UWAGA: Jeśli korzeń zakiełkowy będzie skierowany pod kątem w stronę którejkolwiek z łat, porównanie tempa wzrostu korzeni będzie obarczone błędem.
  5. Zaznaczyć położenie nasiona na folii przezroczystej.
  6. Przykryć nasiono i podlać ilością do 50 mL wody DI.

11. Wzrost roślin

  1. Hodować rośliny przez 25 dni (lub przez wybrany czas), utrzymując 60% WHC przez cały okres wzrostu. Monitorować wzrost korzeni poprzez ich obrysowywanie.
  2. Ważć każdą skrzynkę co 3‒4 dni i podlewać do momentu, aż waga znajdzie się w granicach 5 g od wagi idealnej. Przerwać podlewanie ryzoboksów na cztery dni przed zbiorem, aby ułatwić oddzielenie paneli. Często usuwać chwasty ręcznie, tak aby obecne były jedynie korzenie badanych roślin.
  3. Obrysowywać widoczne korzenie co 3‒4 dni za pomocą markerów permanentnych w kolorach wyraźnie odróżnialnych dla każdego dnia obrysowywania.
    UWAGA: Jeśli zajdzie taka potrzeba, do korzeni głównych i bocznych można używać markerów o różnych średnicach. Może być przydatne zdefiniowanie kryteriów obrysowywania korzeni na początku procesu, ponieważ wiąże się on z pewnym stopniem subiektywizmu, szczególnie gdy korzenie obrysowuje wielu badaczy lub gdy należy odróżnić korzenie różnych rzędów lub średnic za pomocą różnych markerów. W tym doświadczeniu dokładność obrysowywania widocznych korzeni tylko z jednej strony skrzynki została sprawdzona poprzez obrysowanie widocznych korzeni z obu stron i porównanie całkowitej długości korzeni zmierzonej na zeskanowanych przezroczystościach z całkowitą długą korzeni zmierzoną po wypłukaniu i zeskanowaniu korzeni. Korelacja między obrysowaną a zeskanowaną długością korzeni była istotna, niezależnie od tego, czy użyto tylko tylnej przezroczystości, czy obu przezroczystości. Zatem możliwe jest obrysowywanie widocznych korzeni wyłącznie na tylnym panelu.

12. Zbiór pędów oraz pobieranie próbek korzeni i gleby do analizy

  1. Położyć pierwszą ryzoboks płasko i wykręcić wszystkie śruby.
  2. Zebrać próbki pędów. Odciąć pędy u podstawy, spłukać resztki gleby wodą dejonizowaną (DI water) i wysuszyć w temperaturze 60 °C. Rozetrzeć pędy w moździerzu z tłuczkiem, aby przeszły przez sito o oczkach 2 mm, a następnie odważyć podpróbki do kapsułek cynowych w celu analizy izotopowej (patrz sekcja 14).
  3. Kierując się folią przezroczystą, wyciąć brzytwą obszary traktowane i kontrolne. Za pomocą łyżki lub szpatułki zebrać korzenie wraz z przylegającą glebą ryzosferyczną do odpowiedniego worka z próbką traktowaną lub kontrolną.
    UWAGA: Choć istnieje wiele metod oddzielania gleby ryzosferycznej — gleby znajdującej się pod wpływem korzeni roślin15, a ryzosferę można uznać za gradient, a nie za ściśle wyznaczoną strefę16 — niniejsza metoda opiera się na powszechnie stosowanej definicji gleby, która przylega do korzeni roślin po wstrząśnięciu17.
  4. Pozostałe korzenie i glebę zebrać do trzeciego worka.
  5. Przesiać próbki traktowane, kontrolne i zbiorcze przez sito o oczkach 2 mm, aby oddzielić korzenie od podłoża, usuwając pęsetą wszelkie widoczne korzenie lub fragmenty o długości >1 cm. Przechowywać te próbki osobno, co w sumie daje trzy próbki korzeni i trzy próbki podłoża.

13. Walidacja śledzenia i szacowanie względnych tempa wzrostu korzeni

  1. Zeskanuj próbki z grupy badanej, kontrolnej oraz próbki objętościowe i oblicz długość korzeni.
    1. Pracując z jedną próbką na raz, ostrożnie wypłucz korzenie wodą dejonizowaną (DI), aby usunąć pozostałości podłoża. Rozmieść próbki w przezroczystej tacy w taki sposób, aby korzenie na siebie nie nachodziły.
    2. Zeskanuj próbki za pomocą skanera kompatybilnego z oprogramowaniem do analizy korzeni (np. WinRhizo). Upewnij się, że oprogramowanie jest skalibrowane tak, aby rzetelnie odróżniać korzenie od tła obrazu.
    3. Użyj oprogramowania do pomiaru całkowitej długości korzeni oraz długości korzeni w interesujących klasach średnic (np. <0.2 mm, 0.2‒0.4 mm, 0.4‒0.8 mm, 0.8‒1.6 mm, >1.6 mm).
  2. Oblicz gęstość długości korzeni (RLD) dla obszarów badanych i kontrolnych oraz dla każdego rhizoboxu jako całości.
    1. Oblicz objętość obszarów badanych i kontrolnych, mnożąc powierzchnię odrysowaną na każdej folii (patrz krok 8.1) przez 0.635 cm, czyli głębokość pudełka. Wykorzystaj te objętości do obliczenia gęstości długości korzeni w obszarach badanych i kontrolnych, używając całkowitej długości korzeni w każdym obszarze (patrz krok 13.1.3).
      Wzór na gęstość długości korzeni, równanie RLD\(_{patch}\) dla analizy pomiaru korzeni.
    2. Oblicz objętość podłoża w każdym rhizoboxie, mnożąc powierzchnię odrysowaną na folii (patrz krok 8.1) przez 0.635 cm. Oblicz RLD analogicznie jak dla obszarów badanych i kontrolnych.
      Równanie gęstości długości korzeni, RLD_rhizobox wiąże całkowitą długość korzeni z objętością podłoża w cm.
  3. Zwaliduj metodę odrysowywania korzeni poprzez porównanie zeskanowanych systemów korzeniowych z odrysowanymi obrazami.
    1. Zeskanuj każdą folię i oblicz całkowitą długość korzeni za pomocą oprogramowania. Zapisz zeskanowany obraz do obliczeń tempa wzrostu.
    2. Zsumuj pomiary całkowitej długości korzeni dla próbek badanych, kontrolnych i objętościowych dla każdego pudełka (patrz krok 13.1.3).
    3. Przetestuj pomiary całkowitej długości korzeni uzyskane metodą skanowania i odrysowywania, aby sprawdzić, czy korelacja jest istotna statystycznie.
      UWAGA: Jeśli tak, metoda odrysowywania jest zwalidowana i można obliczyć względne tempo wzrostu dla każdego punktu czasowego. W przeciwnym razie tylko dane z zeskanowanego systemu korzeniowego stanowią dokładny wskaźnik wzrostu korzeni. Może to mieć miejsce na przykład wtedy, gdy metodologia odrysowywania była niespójna lub gdy korzenie nie były jednakowo widoczne dla wszystkich genotypów.
  4. Jeśli metoda odrysowywania została zwalidowana, oblicz względne tempo wzrostu korzeni dla każdego rhizoboxu.
    1. Użyj oprogramowania do analizy korzeni, skalibrowanego do rozróżniania wybranych kolorów odrysowywania, aby zmierzyć całkowitą długość korzeni w próbkach badanych, kontrolnych i objętościowych w każdym punkcie czasowym. Oblicz skumulowaną całkowitą długość korzeni dla każdego punktu czasowego.
    2. Oblicz względne tempo wzrostu korzeni (RGRroot) dla każdego rhizoboxu, a także dla obszarów badanych i kontrolnych dla każdego przedziału czasowego t1-t2 w następujący sposób:
      Schemat równania względnego tempa wzrostu, obliczanie RGR, analiza logarytmiczna, badanie wzrostu roślin.
      UWAGA: Tutaj L1 to całkowita długość korzeni w obszarze (suma skumulowana z punktu 11.3) w t1 dni po przesadzeniu (DAT), a L2 to całkowita długość korzeni w obszarze w t2 DAT.

14. Analiza rozkładu 15N pomiędzy próbkami korzeni, pędów i gleby z traktowania

  1. Wysuszyć korzenie w temperaturze 60 °C, zważyć biomasę i zmielić tak, aby przeszła przez sito o oczkach 2 mm.
  2. Wysuszyć podpróbki gleby z zabiegów w temperaturze 60 °C.
  3. Umieścić korzenie i próbki gleby w kapsułkach cynowych, analogicznie do pędów.
    UWAGA: Idealną masę próbki na kapsułkę należy obliczyć oddzielnie dla pędów, korzeni i gleby na podstawie szacowanego stosunku C/N materiału, aby uzyskać docelową ilość całkowitego N do analizy. Więcej informacji można uzyskać w laboratorium izotopów trwałych, do którego przekazywane są próbki. W tym doświadczeniu zastosowano instrukcje przygotowania próbek oraz Kalkulator Masy Próbek (Sample Weight Calculator) dostarczone przez UC Davis Stable Isotope Facility18.
    OSTROŻNIE: Należy zwrócić szczególną uwagę na równomierne wymieszanie próbek przed umieszczeniem ich w kapsułkach oraz przygotować kilka kapsułek dla każdej próbki. Jeśli próbki nie zostaną wymieszane równomiernie, pozorne odzyskanie 15N może przekroczyć ilość pierwotnie obecną.
  4. Przeanalizować całkowitą zawartość N, δ15 oraz zawartość 15N w każdej próbce pędów, korzeni i gleby z zabiegów.
    UWAGA: W tym doświadczeniu próbki roślin analizowano metodą spalania za pomocą analizatora elementarnego PDZ Europa ANCA-GSL połączonego ze spektrometrem mas do pomiaru stosunków izotopowych PDZ Europa 20-20 w UC Davis Stable Isotope Facility (UCD SIF). Próbki gleby analizowano za pomocą analizatora elementarnego Elementar Vario EL Cube połączonego ze spektrometrem mas do pomiaru stosunków izotopowych PDZ Europa 20-20 w UCD SIF.
  5. Obliczyć ilość 15N pochodzącą z markera w próbkach pędów i korzeni roślin.
    1. Po pierwsze, obliczyć ilość 15N w nadmiarze względem atmosferycznego 15N w każdej puli, 15P*:
      Równanie w analizie statystycznej, 15P* = 15P - 0,3663, wyrażenie algebraiczne.
      gdzie 15P to zawartość 15N wyrażona w % atomowych w analizowanej puli.
    2. Po drugie, obliczyć ilość 15N w nadmiarze względem atmosferycznego 15N w markerze, 15L*:
      Równanie równowagi; statyczny bilans sił, λ^15L=15L-0,3663; wyrażenie matematyczne.
      gdzie 15L to zawartość 15N wyrażona w % atomowych w znakowanym źródle N.
    3. Po trzecie, obliczyć ilość całkowitego N w każdej puli, Np:
      Wzór chemiczny: Nₚ = mₚ * %ₒₚ, równanie stechiometryczne, odniesienie edukacyjne.
      gdzie mp jest masą puli (np. całkowitą suchą biomasą pędów lub korzeni), a %p to procentowa zawartość N w tej puli.
    4. Na koniec, wykorzystać wyniki z punktów 14.5.1‒14.5.3 w równaniu Ndff19, aby obliczyć ilość N pochodzącą z markera, Nl:
      Równanie chemiczne, stosunek izotopowy, wzór Nl=Np(15P*/15L*), użytek edukacyjny.
      UWAGA: Równanie Ndff służy do określenia ilości N ze znakowanego źródła, która została pobrana przez rośliny. Zakłada ono, że podczas pobierania N przez roślinę nie dochodzi do frakcjonowania izotopowego i jest ono zazwyczaj prawidłowe dla źródeł N wzbogaconych o ok. 1‒10%19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Korzenie rosły preferencyjnie przy tylnej ściance pudełka, zgodnie z oczekiwaniami. Całkowita odrysowana długość korzeni na tylnej ściance pudełka wynosiła od 400 do 1 956 cm, w porównaniu do 93–758 cm na przedniej ściance. Obliczono współczynniki korelacji Pearsona dla par wartości zeskanowanej długości korzeni oraz odrysowanej długości korzeni na przedniej ściance pudełka, tylnej ściance pudełka, a także dla sumy z przedniej i tylnej ścianki, aby określić, czy odrysowywanie dokładnie od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ryzoboxy opisane w tym protokole mogą być używane do odpowiadania na różne pytania w nauce o korzeniach i ryzosferach, a także znalazły różne zastosowania gdzie indziej 10,20,21,22,23,24,25. Inni badacze wykonali poklatkowe zdjęcia kłączoboxów 21,25,26, nie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują anonimowym recenzentom za ich opinie, a także J.C. Cahillowi i Tan Bao za wstępne wskazówki dotyczące rozwoju protokołu rhizobox. Finansowanie zostało zapewnione przez Fundację Badań nad Wyżywieniem i Rolnictwem, Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA), Projekt Rolniczej Stacji Doświadczalnej CA-D-PLS-2332-H, dla A.G. oraz przez Wydział Nauk o Roślinach UC Davis poprzez stypendium dla J.S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rura PVC o średnicy 1,27 cmJM Eagle530048305 cm w pudełku, pocięta na odcinki określone w protokole
Kolanka boczne PVCLasco3154982 w pudełku
Kolanka PVC 90 stopniCharlottePVC 02300 06004 w pudełku
Łączniki PVC TCharlotte02402 06004 w pudełku
Szyby akrylowe ekstrudowaneTAP Tworzywa sztuczneNiedotyczy 2 w pudełku, 0,64 cm grubości x 40,5 cm szerokości x 61 cm długości
Przekładki HDPE (boki)TAP PlasticsN/A2 w pudełku, 0,64 cm grubości x 2,5 cm szerokości x 57 cm długości
Przekładki HDPE (na dole)TAP PlasticsN/A1 w pudełku, 0,64 cm grubości x 2,5 cm szerokości x 40,5 cm długości
Przekładki HDPE (łatka)TAP PlasticsN/Aw pudełku, 0,64 cm grubości x 3,8 cm szerokości x 28 cm długości
Poliestrowe mrugnięcieFairfield#A-X902,5 cm x 40,5 cm pasek w pudełku
20gwintowanych N/AN/A3,2 cm długości, 0,64 cm średnicy
PodkładkiN/AN/A0,64 cm średnica wewnętrzna
Nakrętki sześciokątneN/AN/Adopasowane do Tkanina
deprywująca światłoAmericover, Inc.Bold 8WB26.51 sztuka 95 cm szerokości i 69 cm długości w pudełku
PiasekQuikretenr 1113
Ziemia polowaNIE DOTYCZY
Folie do śledzeniaFXNFXNT1319100SJedna na stronę pudełka do śledzenia
2 NIE DOTYCZY

Bibliografia

  1. Hodge, A. Roots: The Acquisition of Water and Nutrients from the Heterogeneous Soil Environment. Progress in Botany 71. , 307-337 (2010).
  2. Grossman, J. D., Rice, K. J. Evolution of root plasticity responses to variation in soil nutrient distribution and concentration. Evolutionary Applications. 5 (8), 850-857 (2012).
  3. Melino, V. J., Fiene, G., Enju, A., Cai, J., Buchner, P., Heuer, S. Genetic diversity for root plasticity and nitrogen uptake in wheat seedlings. Functional plant biology. , Available from: http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201600101375 (2015).
  4. Zhang, H., Forde, B. G. An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrient-induced changes in root architecture. Science. 279 (5349), 407-409 (1998).
  5. Hodge, A., Stewart, J., Robinson, D., Griffiths, B. S., Fitter, A. H. Competition between roots and soil micro-organisms for nutrients from nitrogen-rich patches of varying complexity. Journal of Ecology. 88 (1), 150-164 (2000).
  6. Trachsel, S., Kaeppler, S. M., Brown, K. M., Lynch, J. P. Shovelomics: high throughput phenotyping of maize (Zea mays L.) root architecture in the field. Plant and Soil. 341 (1-2), 75-87 (2011).
  7. Rogers, E. D., Monaenkova, D., Mijar, M., Nori, A., Goldman, D. I., Benfey, P. N. X-ray computed tomography reveals the response of root system architecture to soil texture. Plant Physiology. , (2016).
  8. Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Effect of mechanical constraint on nodal and seminal root system of maize plants. Comptes Rendus De L Academie Des Sciences Serie Iii-Sciences De La Vie-Life Sciences. 321 (1), 63-71 (1998).
  9. Lin, Y., Allen, H. E., Di Toro, D. M. Barley root hair growth and morphology in soil, sand, and water solution media and relationship with nickel toxicity. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (8), 2125-2133 (2016).
  10. Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
  11. Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
  12. Vollsnes, A. V., Futsaether, C. M., Bengough, A. G. Quantifying rhizosphere particle movement around mutant maize roots using time-lapse imaging and particle image velocimetry. European Journal of Soil Science. 61 (6), 926-939 (2010).
  13. Hewitt, E. J. Sand and Water Culture Methods Used in the Study of Plant Nutrition. , Commonwealth Bureau. London. (1966).
  14. Choudhary, M. I., Shalaby, A. A., Al-Omran, A. M. Water holding capacity and evaporation of calcareous soils as affected by four synthetic polymers. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 26 (13-14), 2205-2215 (1995).
  15. Bakker, P. A. H. M., Berendsen, R. L., Doornbos, R. F., Wintermans, P. C. A., Pieterse, C. M. J. The rhizosphere revisited: root microbiomics. Frontiers in Plant Science. 4, 2013(2013).
  16. McNear, D. H. Jr The Rhizosphere - Roots, Soil, and Everything In Between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1(2013).
  17. Ortas, I. Determination of the extent of rhizosphere soil. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 28 (19-20), 1767-1776 (1997).
  18. UC Davis Stable Isotope Facility. Carbon (13C) and Nitrogen (15N) Sample Preparation. , Available from: https://stableisotopefacility.ucdavis.edu/13cand15nsamplepreparation.html (2018).
  19. Barraclough, D. 15N isotope dilution techniques to study soil nitrogen transformations and plant uptake. Fertilizer research. 42 (1-3), 185-192 (1995).
  20. Belter, P. R., Cahill, J. F. Disentangling root system responses to neighbours: identification of novel root behavioural strategies. AoB PLANTS. 7, (2015).
  21. Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Functional Plant Biology. 39 (11), 891-904 (2012).
  22. Adu, M. O., Yawson, D. O., Bennett, M. J., Broadley, M. R., Dupuy, L. X., White, P. J. A scanner-based rhizobox system enabling the quantification of root system development and response of Brassica rapa seedlings to external P availability. Plant Root. 11, 16-32 (2017).
  23. Neumann, G., George, T. S., Plassard, C. Strategies and methods for studying the rhizosphere-the plant science toolbox. Plant and Soil. 321 (1-2), 431-456 (2009).
  24. Bodner, G., Alsalem, M., Nakhforoosh, A., Arnold, T., Leitner, D. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (126), e56251-e56251 (2017).
  25. Kuchenbuch, R. O., Ingram, K. T. Image analysis for non-destructive and non-invasive quantification of root growth and soil water content in rhizotrons. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 165 (5), 573-581 (2002).
  26. Dresbøll, D. B., Thorup-Kristensen, K., McKenzie, B. M., Dupuy, L. X., Bengough, A. G. Timelapse scanning reveals spatial variation in tomato (Solanum lycopersicum L.) root elongation rates during partial waterlogging. Plant and Soil. 369 (1-2), 467-477 (2013).
  27. Wu, J., et al. RhizoChamber-Monitor: a robotic platform and software enabling characterization of root growth. Plant Methods. 14 (1), 44(2018).
  28. Rogers, S. W., Moorman, T. B., Ong, S. K. Fluorescent In Situ Hybridization and Micro-autoradiography Applied to Ecophysiology in Soil. Soil Science Society of America Journal. 71 (2), 620-631 (2007).
  29. Eickhorst, T., Tippkötter, R. Detection of microorganisms in undisturbed soil by combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and micropedological methods. Soil Biology and Biochemistry. 40 (6), 1284-1293 (2008).
  30. Spohn, M., Kuzyakov, Y. Distribution of microbial- and root-derived phosphatase activities in the rhizosphere depending on P availability and C allocation - Coupling soil zymography with 14C imaging. Soil Biology and Biochemistry. 67, 106-113 (2013).
  31. Lv, G., Kang, Y., Li, L., Wan, S. Effect of irrigation methods on root development and profile soil water uptake in winter wheat. Irrigation Science. 28 (5), 387-398 (2010).
  32. Asseng, S., Ritchie, J. T., Smucker, A. J. M., Robertson, M. J. Root growth and water uptake during water deficit and recovering in wheat. Plant and Soil. 201 (2), 265-273 (1998).
  33. Hernandez-Ramirez, G., et al. Root Responses to Alterations in Macroporosity and Penetrability in a Silt Loam Soil. Soil Science Society of America Journal. 78 (4), 1392-1403 (2014).
  34. Zhang, Y. L., Wang, Y. S. Soil enzyme activities with greenhouse subsurface irrigation. Pedosphere. 16 (4), 512-518 (2006).
  35. Robinson, D., Hodge, A., Griffiths, B. S., Fitter, A. H. Plant root proliferation in nitrogen-rich patches confers competitive advantage. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 266 (1418), 431-435 (1999).
  36. Lobet, G., Draye, X. Novel scanning procedure enabling the vectorization of entire rhizotron-grown root systems. Plant Methods. 9, 1(2013).
  37. Swarup, R., Wells, D. M., Bennett, M. J. Root Gravitropism. Plant Roots: The Hidden Half. , (2013).
  38. Smit, A. L., Bengough, A. G., Engels, C., van Noordwijk, M., Pellerin, S., van de Geijn, S. C. Root Methods: A Handbook. , Springer Science & Business Media. (2000).
  39. van Dusschoten, D., et al. Quantitative 3D Analysis of Plant Roots Growing in Soil Using Magnetic Resonance Imaging1[OPEN]. Plant Physiology. 170 (3), 1176-1188 (2016).
  40. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 17(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wizualizacja wzrostu korzenizlokalizowane obszary sk adnik w od ywczychobrazowanie nieniszcz cezmienno genotypowa kukurydzyodzyskiwanie azotu 15g sto d ugo ci korzeniprzygotowanie pod o a glebowegoodrysowywanie na folii przezroczystejmonta ramy z PVC
Zoptymalizowany protokół Rhizobox do wizualizacji wzrostu korzeni i reakcji na zlokalizowane składniki odżywcze
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.