Badania biologii dostarczają cennych informacji na temat procesów reprodukcyjnych, fizjologicznych, embriologicznych i rozwojowych, które napędzają organizmy wielu grup taksonomicznych. W tym miejscu przedstawiamy obszerny przewodnik po różnych metodologiach, które można wykorzystać do badania kontroli i monitorowania jajników u.
Artykuł metodologiczny
Techniki rozrodu do monitorowania i kontroli jajników u
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kontrola i monitorowanie jajników u wymaga wieloaspektowego podejścia. Istnieje kilka zastosowań, które mogą z powodzeniem indukować zachowania rozrodcze oraz pozyskiwanie gamet i zarodków do badań fizjologicznych lub molekularnych. przyczyniają się do jednej czwartej do jednej trzeciej badań nad kręgowcami, a interesujący w tym kontekście jest ich wkład w wiedzę społeczności naukowej na temat procesów rozrodczych i rozwoju embriologicznego. Jednak większość tej wiedzy pochodzi od niewielkiej liczby gatunków. W ostatnich czasach dziesiątkowanie na całym świecie wymagało coraz większej interwencji ze strony ekologów. Kolonie odbudowy i zabezpieczenia w niewoli, które nadal powstają w odpowiedzi na ryzyko wyginięcia, sprawiają, że istniejące badania i zastosowania kliniczne są nieocenione dla przetrwania i reprodukcji utrzymywanych pod opieką człowieka. Sukces każdej populacji żyjącej w niewoli opiera się na jej zdrowiu i reprodukcji oraz zdolności do rozwoju zdolnego do życia potomstwa, które przekazuje najbardziej zróżnicowaną reprezentację genetyczną swojego gatunku. Dla badaczy i weterynarzy możliwość monitorowania i kontrolowania rozwoju i zdrowia jajników jest zatem niezbędna. Celem tego artykułu jest zwrócenie uwagi na różne techniki wspomaganego rozrodu, które można wykorzystać do monitorowania i, w stosownych przypadkach lub w razie konieczności, kontrolowania funkcji jajników u. Idealnie byłoby, gdyby wszelkie problemy reprodukcyjne i zdrowotne zostały zmniejszone poprzez odpowiednią hodowlę w niewoli, ale jak w przypadku każdego zwierzęcia, kwestie zdrowotne i patologie reprodukcyjne są nieuniknione. Techniki nieinwazyjne obejmują ocenę behawioralną, oględziny i badania palpacyjne oraz pomiary morfometryczne w celu obliczenia wskaźników kondycji ciała i ultrasonografię. Techniki inwazyjne obejmują zastrzyki hormonalne, pobieranie próbek krwi i zabiegi chirurgiczne. Kontrola jajników może być wykonywana na wiele sposobów, w zależności od wymaganego zastosowania i gatunku będącego przedmiotem zainteresowania.
Wprowadzenie
od dawna są uznawane za ważne modele biologiczne i medyczne przez szeroki zakres dyscyplin badawczych. Dane uzyskane w wyniku badań nad poszczególnymi gatunkami, takimi jak Xenopus laevis i X. tropicalis, żaba lamparcia (Lithobates (dawniej Rana) pipiens) i aksolotl (Ambystoma mexicanum) zostały zastosowane do wielu innych gatunków kręgowców, w tym do ludzi. Techniki weterynaryjne, hodowlane i wspomaganego rozrodu, które wyłoniły się z badań nad tymi i innymi, zapewniają pomoc tym, których zadaniem jest rozwijanie skutecznej opieki, utrzymania i trwałości rzadszych populacji w niewoli1,2,3,4.
Rośnie zainteresowanie równoczesnym stosowaniem metod ochrony in i ex situ w celu odwrócenia fali wymierania wielu zagrożonych gatunków1,2. W artykule przedstawiono obecnie dostępne metodologie monitorowania i kontrolowania funkcji jajników u modelowych gatunków Anurans i Caudates. Ponadto przedstawiono istniejące techniki rozwiązywania powszechnej patologii reprodukcyjnej polegającej na zatrzymywaniu komórek jajowych.
Podobnie jak w wielu grupach taksonomicznych, kontrola jajników obejmuje szereg ściśle zsynchronizowanych interakcji między środowiskiem a fizjologią. Temperatura i fotoperiod (znane jako sygnały bliższe) są dekodowane przez oko i mózg, gdzie są szybko przekształcane w procesy genetyczne, hormonalne i okołodobowe (sygnały ostateczne)3,4. Metody monitorowania i kontrolowania funkcji jajników omówione w tym artykule obejmują techniki inwazyjne i nieinwazyjne. Wymagania badawcze i dydaktyczne Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) definiują techniki nieinwazyjne jako te, które powodują minimalny lub żaden ból fizyczny lub cierpienie psychiczne i nie wymagają leków przeciwbólowych5. W tym przypadku techniki nieinwazyjne obejmują oględziny i badanie palpacyjne, obserwacje behawioralne, oceny morfometryczne i ultrasonografię. Wręcz przeciwnie, techniki pobierania krwi, podawania hormonów i chirurgii (jajnikomia i usunięcie zatrzymanych komórek jajowych) są klasyfikowane jako inwazyjne, ponieważ mogą powodować pewien ból lub dyskomfort i wymagać znieczulenia lub pozabiegowej terapii farmakologicznej.
Nieinwazyjne techniki monitorowania jajników mogą być łatwo włączone do codziennej opieki nad większością żyjących w niewoli. W zależności od gatunku, ciężar jajnika można często określić za pomocą prostych oględzin (szklana żaba). W innych przypadkach badanie palpacyjne może wskazywać, czy samica jest ciężarna. Różne wskaźniki kondycji ciała (BCI), takie jak waga, długość pyska urostyle (SUL), długość pyska (SVL) i standardowy indeks masy (SMI) są dostępne do przewidywania obecności lub braku jaj4,6,7,8,9. Należy jednak zachować ostrożność przy interpretacji wyników, ponieważ większość z nich nie bierze pod uwagę wieku, kształtu ciała ani składu (np. zatrzymana woda w porównaniu z masą jajnika lub tłuszczem)6. Ostateczne diagnozy reprodukcyjne można uzyskać za pomocą ultrasonografii z bardziej dogłębną wiedzą na temat rozwoju komórek jajowych i oceny stopnia zaawansowania cyklu jajnikowego4,7. Ultrasonografia zapewnia również środki do potwierdzania i monitorowania patologii rozrodczych i związanych z nimi stanów fizjologicznych4, 8.
Oprócz dostarczania informacji o stanie zdrowia, pobieranie próbek krwi może być używane do pomiaru hormonów rozrodczych. Jeśli profilowanie hormonalne jest ostatecznym celem, ważne jest, aby unikać wpływów związanych ze stresem, które mogą zakłócić dane dotyczące sterydów ogólnoustrojowych. Chociaż jest to potencjalnie potężne narzędzie do monitorowania, nie przeprowadzono jeszcze badania wykazującego wrodzone reakcje endokrynologiczne na podawanie hormonów egzogennych u jakiegokolwiek gatunku. Krew można bezpiecznie pobrać z kilku miejsc; U żab obejmuje to brzuszną żyłę brzuszną, splot językowy, żyłę udową i serce9, 10. W ogoniastych krew jest pobierana z brzusznej żyły ogonowej. Stopień inwazyjności, wymagany stopień unieruchomienia, potrzeba znieczulenia, delikatność narządu, który jest celem ataku, oraz wielkość zwierzęcia to czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze techniki pobierania pokarmu od. W tym artykule przedstawiona zostanie technika pobierania krwi z żyły twarzowo-szczękowej lub mięśniowo-skórnej żab, oryginalnie opisana przez Forzan et al.9.
Kontrola jajników jest specyficzna dla gatunku i jako taka, protokoły hormonalne powinny być testowane i optymalizowane. Poza sezonowością i związanym z nią środowiskiem hormonów krążących, kontrola jajników może być również ściśle związana z wiekiem, czasem spędzonym w niewoli i narażeniem na wielokrotne podawanie hormonów, na temat których jest niewiele informacji w literaturze11,12,13. Wdrażanie terapii hormonalnych w celu wywołania zachowań rozrodczych, produkcji gamet, dojrzewania i składania jaj stało się szeroko opisywanym podejściem do rozwiązywania typowych problemów reprodukcyjnych związanych z niewolą4,8,14,15,16. Ponieważ mechanizmy kontrolujące rozrodczość u kręgowców są wysoce konserwatywne, istnieje szereg hormonów, neuropeptydów i dostępnych na rynku leków stosowanych terapeutycznie w innych grupach taksonomicznych, które mogą być również niezawodnie stosowane u wielu gatunków (tabela 1). Hormon uwalniający gonadotropiny (GnRH) i ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG) (lub ich odmiany, tj. PMSG i eCG)17, 18, pojedynczo lub w połączeniu, były szeroko stosowane w programach hodowlanych żyjących w niewoli, w tym: Południowe Góry Skaliste borealne (Anaxyrus boreas boreas)4,19,20; ropucha, żaba susła ciemnego, Rana sevosa (Langhorne et al., niepublikowane)7; pies wodny z wybrzeża Zatoki Meksykańskiej, Necturus beyeri20; Ropucha Wyoming, Anaxyrus baxteri18; żaba, Rana catesbiana21; ropucha amerykańska, Anaxyrus americanus22; żaba trawna, Lymnodyaster tasmaniensis23; Coqui, Eleutherodactylus coqui24; klasa Xenopus, Xenopus laevis25; ropucha Gunthera, Pseduophryne guentheri26; żaba lamparcia północna, Lithobates pipiens; argentyńska żaba rogata, ozdobna Ceratophrys; żaba rogata Cranwella, C. cranwelli; amerykańska żaba trawna, Odontophrynus americanus27; oraz salamandra ognista (Salamandra)228. Hormony steroidowe, takie jak progesteron (P4), są rzadziej zgłaszane, ale wykazały dobrą skuteczność w wywoływaniu owulacji i składania jaj u niektórych gatunków anuranów16,18,29. Prostaglandyny (zwłaszcza prostaglandyna 2-alfa (PGF2α)) biorą udział w owulacji razem z kortykosteroidami30,31,32,34 i osiągają wysokie poziomy podczas fazy owulacji31.
W badaniach in vitro, PGF2α jest silnym induktorem owulacji31, podczas gdy in vivo może wywołać składanie jaj w Rana muscosa4,30,32. Ekstrakty z przysadki mózgowej są również skutecznymi induktorami owulacji15,16,34; Jednak obawy związane z bioasekuracją i możliwością przenoszenia chorób są często czynnikiem odstraszającym kolonie hodowlane w niewoli, gdy rozważa się takie podejście35.
Ostatnia sekcja tego artykułu szczegółowo opisuje procedury chirurgiczne i przedstawia alternatywne podejścia do rozszerzenia badań nad jajnikami lub pomocy w rozwiązaniu patologii rozrodczych. Owariektomie najczęściej wykonuje się u w celu uzyskania oocytów do badań embriologicznych. Jednak może również stanowić lekarstwo na zatrzymane jaja, gdy inne opcje zawiodą. Chociaż zabieg ten jest inwazyjny, wymagający pełnego znieczulenia i nacięć w celu odsłonięcia mas jajowych, nie wymaga eutanazji. Ponadto po częściowej wycięciu jajników zwierzęta mogą w pełni wyzdrowieć i nadal być aktywne reprodukcyjnie po operacji8,36.
Opisane poniżej protokoły opisują inwazyjne i nieinwazyjne metody kontroli i monitorowania jajników u Anurans i Caudates. Konkretne gatunki wybrane do zilustrowania technik u Anuranów to R. mucosa i X. laevis. Necturus maculosus, N. beyeri, N. alabamensis i A. mexicanum należą do gatunków używanych do podobnego opisu technik w ogoniastych.
Protokół
Procedury Salamandry zostały zatwierdzone przez Cincinnati Zoo & Botanical Garden (CZBG) Institutional Care and Use Committee (IACUC) protokoły 11-106, 13-110, 14-133 i 15-138. Wszystkie procedury dotyczące żab i ropuch zostały zatwierdzone przez San Diego Zoo Global (SDZG), Institutional Care and Use Committee (IACUC) protokoły: 15-001, 16-005 i 18-003.
Opieka i traktowanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Narodowego Muzeum Historii Naturalnej (Paryż) (Museum National d'Histoire Naturelle-Ménagerie du Jardin des Plantes (MNHN)), zgodnie z Wytycznymi Instytucjonalnymi i Krajowymi (Commission de Génie Génétique, Direction Départementale des Services Vétérinaires, Dyrektywa Unii Europejskiej 2010/63/UE, decyzja umowna nr C75-05-01-2 dla Europejskiej Konwencji o kręgowcach wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych. Wszystkie protokoły użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone pod numerem referencyjnym 68-037.
1. Nieinwazyjne techniki monitorowania jajników
- Oględziny i badanie palpacyjne
- Przytrzymaj samicę Anuran na jeden z trzech sposobów opisanych poniżej.
- Zabezpiecz nogi żaby lub ropuchy palcem serdecznym i małym, podpierając grzbietową stronę (brzuch) ciała żaby palcem wskazującym i środkowym, a stronę brzuszną kciukiem (Rysunek 1A).
- Trzymaj żabę lub ropuchę w dominującej ręce, trzymając kciuk na jej brzuchu, a resztę palców zabezpieczając grzbiet zwierzęcia. Używając ręki niedominującej do badania palpacyjnego brzucha zwierzęcia, wyczuj, czy nie ma nierówności podskórnej (Ryc. 1B).
- Oprzyj brzuch żaby lub ropuchy na dłoni, przednie ramiona oprzyj na palcu wskazującym, a kciuk na górnej części pleców.
- Ponieważ ogoniaste są w pełni wodne, należy przeprowadzić oględziny jedną z dwóch metod opisanych poniżej.
- Przenieś zwierzę do oddzielnego pojemnika o pojemności 4 litrów zawierającego wodę w zbiorniku. Przytrzymaj pojemnik (zabezpieczona pokrywka) i zaświec latarką na spodzie, aby zwizualizować obecność/brak jaj.
- Znieczulenie w MS222 (0,5 g/l; Metanosulfonian trikainy, buforowany 0,5 M NaHCO3). Po indukcji obróć zwierzę na plecy i zbadaj brzuch.
- Przytrzymaj samicę Anuran na jeden z trzech sposobów opisanych poniżej.
- Oceny morfometryczne
- Anurans
UWAGA: Znieczulenie nie jest wymagane.- Za pomocą suwmiarki zmierz zwierzę od czubka pyska, wzdłuż środka ciała do końca ogona, aby uzyskać SUL i SVL (Rysunek 2A,B).
- Taruj plastikowy pojemnik na cyfrowej wadze precyzyjnej. Umieść zwierzę w wytarowanym pojemniku i zważ (Rysunek 2C).
- W przypadku większych zwierząt, takich jak żaby, lub podczas zdobywania ciężarów w terenie, użyj wagi wiszącej (Rysunek 2D).
- Podobnie jak u wielu gatunków bezogonowych, dorosłe samice R. muscosa odróżniamy od samców po ich większych rozmiarach i braku opuszków godowych (kciuków) na dłoniach (Ryc. 3).
- Oblicz kondycję ciała jako podstawową ocenę ogólnego stanu zdrowia za pomocą następującego wzoru:
Indeks Fultona: K = masa ÷ długość3
UWAGA: Indeks Fultona wykorzystuje wymiarową równowagę objętości związaną z masą i długością, gdzie 3 jest wykładnikiem skalowania, który odnosi masę i długość izometrycznie.
- Ogoniaste
- Waga tarowa z pustą torbą przed umieszczeniem w środku zwierzęcia nieznieczulonego. Uważaj, aby nie wprowadzać nadmiaru wody (Rysunek 2D) i działać szybko, ponieważ zwierzęta wydzielają śluz jako reakcję stresową na bycie skrępowanym.
- Środki dla dorosłych należy uzyskać, unieruchamiając osoby w pozycji prostej na dnie zamykanej plastikowej torby lub w oddzielnym plastikowym pojemniku, który może pomieścić rozszerzone zaciski.
- Zmierz długość ciała za pomocą suwmiarki (Rysunek 2E).
- Zmierz jądro ogoniaste od czubka pyska do czubka ogona (SVL), aby monitorować wzrost.
- Anurans
- Obserwacje behawioralne
- Fizycznie obserwuj zwierzęta w czasie rzeczywistym lub użyj kamery wideo, aby rejestrować zachowanie.
- Rejestruj obserwacje zwierząt, kategoryzuj zachowania i skonstruuj etogram (Rysunek 4).
- Klasyfikuj zachowania rozrodcze
UWAGA: Rysunek 4 ilustruje jeden z typów zachowań reprodukcyjnych obserwowanych u anuranów.
- Ultradźwięki
UWAGA: Wybrany przetwornik ultradźwiękowy, w tym przypadku liniowy 7,5 mHz lub wieloczęstotliwościowy (10-6 mHz) mikrowypukły, jest zalecany do Necturus i sondy 10 MHz oraz rozpuszczalnego w wodzie, bezsolnego żelu dla R. muscosa. Wykonanie badania ultrasonograficznego u salamander może wymagać znieczulenia (instrukcje znajdują się w punkcie 1.5).- Anuranowie
- Wykonaj badanie ultrasonograficzne na R. muscosa przy użyciu dwóch osób (Ryc. 5A).
- Pierwsza osoba: Przytrzymaj zwierzę dominującą ręką i nałóż rozpuszczalny w wodzie, bezsolny żel na brzuch zwierzęcia.
- Druga osoba (ultrasonografista): Weź sondę 10 MHz w rękę dominującą i przyłóż ją do brzucha, upewniając się, że sonda ma dobry kontakt z żelem.
- Wsuń się do środka tuż pod pachą w kierunku środka linii środkowej brzucha zwierzęcia, aby uwidocznić cały jajnik.
- Ultrasonografista: Użyj ręki niedominującej, aby zatrzymać klatkę i uchwycić pożądane obrazy na ultrasonografii.
- Kategoryzuj etap cyklu jajnikowego według systemu klasyfikacji ustalonego dla rodzaju4 (Tabela 2, Rysunek 5B-F).
- Pod koniec zabiegu spłucz żel ze zwierzęcia.
- Ogoniaste
- Przenieś nieznieczulony Necturus do prostokątnego pojemnika o pojemności 4 litrów wypełnionego 2 litrami wody w zbiorniku.
- Zminimalizuj ruchy zwierzęcia, wyłączając światła w pomieszczeniu i/lub kładąc jedną rękę na głowie zwierzęcia.
- Umieść przetwornik w odległości 1-2 cm od ścianki korpusu.
- Zlokalizuj serce na brzusznym poziomie linii środkowej do kończyn przednich, a następnie przesuń głowicę dystalnie i zbadaj tkankę jajnika7.
- Kategoryzuj samice zgodnie z systemem oceniania ustalonym dla rodzaju4 (Rysunek 6A,B,C).
- Uzyskaj dokładne pomiary jaj w średnim i późnym stadium ciężaru, rejestrując obrazy, gdy ciało zwierzęcia jest ustawione pod kątem do przetwornika (tj. nie liniowo, ale po lekkim łuku; Rysunek 6B). W przeciwnym razie zachodzące na siebie pęcherzyki utrudniają rozróżnienie wielkości poszczególnych komórek jajowych.
- Anuranowie
- Indukcja znieczulenia i rekonwalescencja
- Anuranowie
- Znieczulenie w MS222 (0,5 g/l; Metanosulfonian trikainy buforowany (0,5 M NaHCO3), jak opisano wcześniej.
- Użyj odruchu prostowania jako podstawowego wskaźnika stopnia, w jakim zwierzę zostało znieczulone. Całkowita utrata odruchu świadczy o stanie głębokiego znieczulenia.
- Usunąć zwierzę ze znieczulenia w kąpieli wodnej (MS-222) po utracie odruchu prostowania.
- Połóż zwierzę na mokrym (z odchlorowaną wodą bez środków znieczulających) ręczniku.
- Upewnij się, że zwierzę jest wilgotne podczas całego zabiegu chirurgicznego.
- Intubuj małe za pomocą cewników z czerwonej gumy, rurek bez mankietu lub klasycznych rurek dotchawiczych bez pompowania mankietu.
- Zapewnij niski przepływ tlenu (0,5-0,75 l/min) z 0,5-1% izofluranem.
- Po zabiegu należy przerwać podawanie izofluranu, ale utrzymać dopływ tlenu przez 1 minutę.
- Ekstubować zwierzę i dokładnie opłukać je odchlorowaną wodą bez środka znieczulającego przez 2 minuty.
- Umieść zwierzę w płytkiej ilości odchlorowanej wody lub na mokrym ręczniku.
- Oceń powrót zwierzęcia do zdrowia, delikatnie pociągając za tylną kończynę, aby się wydłużyć. Każdy reagujący skurcz kończyny wskazuje na odruch wycofania.
- Monitoruj inne wskaźniki powrotu do zdrowia, takie jak oddychanie gruczołowe (ruch gardła) i odruch prostujący.
- Weźmy pod uwagę, że wyzdrowiał, gdy powróciły wszystkie odruchy, a częstość akcji serca i oddechu powróciła do wartości sprzed znieczulenia.
- Ogoniaste
- Znieczulić nekturę i ambystomę w MS222 (0,5 g/l metanosulfonianu trikainy, buforowanego 0,5 M NaHCO3 (MS222) w prostokątnym zbiorniku o pojemności 4 l.
- Umieść kamień napowietrzający (1 cal) i pompę powietrza w zbiorniku i włącz go do stałego przepływu, aby zapewnić odpowiednie natlenienie.
- W przypadku utraty funkcji kończyny i odruchu prostowania należy wyjąć zwierzę ze znieczulenia w kąpieli wodnej (MS-222) i położyć zwierzę na mokrym (z odchlorowaną wodą bez środków znieczulających) ręczniku.
- Utrzymuj nawilżenie skóry i skrzeli za pomocą wyciśniętej butelki wody ze zbiornika.
- Aby odzyskać zwierzę, ostrożnie umieść je brzuszną stroną do dołu w plastikowym pojemniku o pojemności 4 litrów wypełnionym 2 litrami wody ze zbiornika z kamieniem napowietrzającym.
UWAGA: Rekonwalescencja zaczyna się od skrzelami, po których następuje zdolność do poruszania ogonem i napędzania do przodu, a na końcu funkcjonalny ruch kończyn. - Umieść zwierzę z powrotem w jego pierwotnym zbiorniku i uważnie monitoruj przez następne 24 godziny
UWAGA: Istnieją inne metody znieczulenia, które są opisane w Wright and Whitaker8.
- Anuranowie
2. Inwazyjne techniki monitorowania i kontroli jajników
UWAGA: Ta procedura została zaadaptowana z Forzán et al.10.
- Trzymaj żabę w dominującej ręce i osusz stronę twarzy żaby po nakłuciu żyły sterylną chusteczką lub gazą.
- Osusz twarz, aby uniknąć zbyt dużego rozproszenia krwi na skórze.
- Wbić igłę (26 G 1/2" i 27 G 1/2"), skosem skierowanym do góry, przez skórę, w miejscu, gdzie uniesiona skóra wokół oka i grzbiet górnej szczęki spotykają się, tworząc punkt trójkąta (żółty kontur) (Rysunek 7A) uzyskując dostęp do żyły twarzowej w pobliżu żyły oczodołowej tylnej.
- Nakłuć żyłę twarzową poniżej prawego oka i powyżej grzbietu górnej szczęki, zaczynając od 1-2 mm do tyłu od linii środkowej oka (Rysunek 7A).
UWAGA: W przypadku mniejszych żab (poniżej 20 g) przesuń punkt wprowadzania bliżej pozycji bezpośrednio poniżej linii środkowej oka. - Ustaw rurkę mikrohematokrytu pod kątem w dół, aby grawitacja pomogła w przepływie krwi do rurki. Krew powinna wypłynąć natychmiast po nakłuciu (Rysunek 7B,C).
- Przy pierwszych oznakach przepływu krwi umieść końcówkę rurki mikrohematokrytu w miejscu nakłucia i zbierz 1-2 pełne probówki z mikrohematokrytem krwi i umieść probówki w odpowiednich pojemnikach do pobrania (Rysunek 7B, C).
- Jeśli krew nie przepływa łatwo lub jej objętość jest bardzo mała, należy nieznacznie przesunąć wkłucie igły lub wprowadzić igłę po drugiej stronie twarzy.
- Zatamować krwawienie, mocno dociskając gazę do miejsca nakłucia przez co najmniej 20 sekund.
- Pozostaw żabę poza wodą na 10 minut, aby upewnić się, że miejsce nakłucia nie otworzy się ponownie.
- Użyj nowej igły i nowych probówek do mikrohematokrytu dla każdej pobranej żabki.
3. Indukcja hormonalna
- Przygotowanie hormonów
- Przygotuj zastrzyki hormonalne bezpośrednio przed użyciem, aby zapewnić maksymalny efekt.
- Wybierz hormon z listy wymienionej w Tabeli 1.
- Określ stężenie hormonu, który ma być wstrzyknięty, używając μl lub ml/g masy ciała16.
- Rozcieńczyć hormon w jednym z poniższych: wodzie, soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), roztworze soli fizjologicznej Ringera (SARS) lub soli fizjologicznej.
- Nie należy przekraczać objętości wstrzyknięcia wynoszącej 200 μl dla żab o masie 30-70 g i 300 μl dla żab o wadze 80-110 g (obserwacja osobista)16.
- W celu prawidłowego przetrzymywania zwierzęcia podczas podawania hormonów w dawce od 10 do 100 g należy zastosować którąkolwiek z odpowiednich metod przetrzymywania opisanych w sekcji 1.1.
- Anuranowie
- Obliczyć wymagane stężenie na osobę, obliczając gram na masę ciała (g/masę ciała).
- Tuż przed podaniem należy rozpuścić w sterylnym rozcieńczalniku z wyboru.
- Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że w strzykawce nie pozostały pęcherzyki powietrza.
- Trzymać zwierzę bezpiecznie w ręce niedominującej i wstrzykiwać je ręką dominującą.
- Wstrzykiwać zgodnie ze specyfikacją hormonalną. Najczęstsze wstrzyknięcia u anuranów to wstrzyknięcia podskórne, dootrzewnowe lub domięśniowe (Ryc. 8).
- Podawać zastrzyki IP w dolną część brzucha lub w dolną część grzbietowej strony ciała w pobliżu tylnej nogi (Ryc. 9).
- Podawać zastrzyki domięśniowe, najlepiej w tylne nogi.
- Ogoniasty (Nektur)
- Rozpuść wybrany hormon w sterylnej wodzie zgodnie z opisaną powyżej metodą gramów na masę ciała.
- W przypadku Necturus należy stosować dawki 1,7-2,3 μg GnRH/g masy ciała.
- Wyjmij Necturus z komory anestezjologicznej i umieść na powierzchni pod kątem 45° pokrytej serwetą chirurgiczną.
- Ustaw zwierzę z głową skierowaną w dół.
- Zbliżyć się do tylnego kwadrantu brzucha (ogonowego tylnej nogi) pod kątem 15-20°. Należy uważać, aby nie wprowadzić powietrza do strzykawki.
- Wstrzykiwać (IP) za pomocą strzykawki insulinowej i igły 27-30 G.
- Wstrzyknąć hormon za pomocą strzykawki insulinowej i igły 27-30 G.
4. Chirurgia
- Ogólne przygotowanie i zabieg chirurgiczny
- Aby utrzymać procedury aseptyki, należy używać przezroczystych, sterylnych plastikowych obłożeń w celu odizolowania miejsca operowanego. Zmniejsz parowanie, utrzymując wilgotność otaczającej skóry.
- Wszelkie materiały, które będą miały kontakt ze skórą zwierzęcia, zwilż sterylną wodą. Wykonaj nacięcie skóry za pomocą ostrza skalpela numer 15 lub numer 11.
UWAGA: Połączenie zimnej stali, radiochirurgii lub lasera diodowego. Hemostazę w łagodnym przebiegu krwotocznym można uzyskać za pomocą lasera elektrokauteryjnego lub diodowego. - Użyj włóczni lub aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby umożliwić zastosowanie miejscowego nacisku na małe naczynia śledzące utratę krwi.
- Używaj włóczni lub aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby zarządzać małymi ograniczonymi przestrzeniami zamiast standardowych kwadratów z gazy.
- Używaj mikroinstrumentów, takich jak instrumenty okulistyczne, z cienkimi, małymi końcówkami, podczas wykonywania operacji na zwierzętach ważących mniej niż 1 kg.
- Używaj plastikowych, samozabezpieczających się zwijaczy (np. zwijacz Lone Star), aby dopasować się do różnych rozmiarów nacięć.
- Użyj retraktorów powiek do cofnięcia nacięć celomicznych.
- W razie potrzeby należy użyć przyrządów do powiększania do wykonywania operacji u mniejszych pacjentów.
UWAGA: Analgezja jest wymagana przy każdym zabiegu chirurgicznym u. Niezastosowanie odpowiedniego środka przeciwbólowego podczas operacji wiązało się z opóźnionym powrotem do normalnych funkcji. Co więcej, analgezja nasila działanie leków znieczulających (Tabela 3)34.
- Anuranowie
- Po znieczuleniu X. laevis zgodnie z opisem w kroku 1.5.1, umieść zwierzę w pozycji leżącej grzbietowej (Rysunek 10A,C).
- Przygotować pole operacyjne aseptycznie, przecierając wilgotną sterylną gazę rozcieńczonym roztworem jodu powidonu (1/10) na miejscu przez 10-15 s lub 0,75% roztworem chlorheksydyny na miejscu operacyjnym przez co najmniej 10 minut przed zabiegiem35.
- Wykonaj 3 mm nacięcie skóry przyśrodkowej w środkowej części celom (między ramionami a kloaką) jednym odważnym pociągnięciem, pozostawiając czyste nacięcie za pomocą skalpela nr 15 lub nr 11.
UWAGA: Lasera diodowego można używać również do nacinania skóry. - Podnieś błonę brzuszną, wykonaj i nacinaj i dokładnie wypreparuj za pomocą skalpela nr 15 lub nr 11. (Rysunek 10B,D).
- Cofnąć nacięcia celomiczne za pomocą retraktorów powiek (lub odpowiedniego sprzętu).
- Wyciąć część masy jajowej bez podwiązywania jakichkolwiek naczyń krwionośnych.
- W przypadku całkowitej wycięcia jajników należy kauteryzować otaczające naczynia krwionośne za pomocą elektrokoagulacji lub diody laserowej (Ryc. 11).
- Za pomocą szwu monofilamentowego zamknij nacięcie celiotomii przerwanym, wiecznym wzorem szwów.
- Ogoniaste
- Po znieczuleniu A. mexicanum umieść go w prawej pozycji bocznej, tak aby lewa kończyna miedniczna była po prostu umieszczona u podstawy ogona.
- Przygotować pole operacyjne aseptycznie, umieszczając wilgotną sterylną gazę z rozcieńczonym roztworem jodu powidonu (1:10) na miejscu na 10-15 s. Alternatywnie użyj sterylnej gazy nasączonej 0,75% roztworem chlorheksydyny i umieść na miejscu operacji na co najmniej 10 minut przed zabiegiem (Rysunek 12A)36, 37 .
- Narysuj linię między ramieniem a tylnymi kończynami, aby podzielić ciało na trzy równe części (Rysunek 12B).
- Wykonaj miejsce nacięcia między drugą a trzecią częścią.
- Chwyć leżący pod spodem mięsień i unieś się z dala od trzewi celomicznych.
- Delikatnie przepchnij małe hemostatyki przez muskulaturę celomiczną do jamy celomicznej.
- Cofnij nacięcia celomiczne za pomocą retraktorów powiek (lub innego odpowiedniego materiału) (Ryc. 12C).
- W przypadku całkowitej wycięcia jajników należy kauteryzować otaczające naczynia krwionośne za pomocą elektrokoagulacji lub diody laserowej (Rysunek 12D).
- Za pomocą szwu monofilamentowego zamknij nacięcie celiotomii przerwanym, wiecznym wzorem szwów.
Wyniki
Morfometria i reprodukcja
Wizualizacja stanu rozrodczego samic płazów różni się w zależności od gatunku. Najskuteczniejszą metodą jest ultrasonografia; jednak niektóre gatunki mogą wykazywać różny stopień przezroczystości skóry (Rysunek 13A,B,C). Inspekcja wizualna często pozwala wyraźnie odróżnić samicę ciążną od nieciążnej, gdy skóra jest półprzezroczysta, co obserwuje się u N. alabamensis i N. maculosus (Rysunek 13A,B), lub przezroczysta, jak pokazano na przykładzie żaby szklanej (Rysunek 13C). Ciemne, plamiste ubarwienie skóry na brzuchu N. beyeri uniemożliwia taką ocenę. U R. muscosa skóra nie jest przezroczysta, ale można zauważyć istotne różnice między samicami ciążnymi a tymi, które niedawno zniosły jaja, ponieważ skóra jest wiotka, a zwierzę wygląda na szczuplejsze (żółta linia) w porównaniu do samicy ciążnej (niebieska linia) (Rysunek 13D). Z doświadczeniem osoba prowadząca może nauczyć się odróżniać dużą samicę od samicy ciążnej, jednak potwierdzenie etapu ciąży wymaga wykonania badania USG. Wskaźniki masy ciała u płazów można obliczyć za pomocą wielu wzorów, lecz ich zastosowanie jako narzędzia prognostycznego w rozrodzie pozostaje dyskusyjne. W przypadku R. muscosa korelacja między wskaźnikiem Fulton'a, stanem zdrowia a statusem rozrodczym pozostaje niejasna.
Zachowania rozrodcze i badanie ultrasonograficzne
Nasze wyniki pokazują, jak charakteryzować zachowania rozrodcze u R. muscosa w celu przewidywania składania jaj (Rycina 4). Kilka etapów trwających od kilku godzin do kilku tygodni obejmuje zaloty, podczas których samiec aktywnie goni samicę (Rycina 4A), oraz moment, w którym samiec dosiada i mocno chwyta samicę za grzbiet, co określa się mianem ampleksusu (Rycina 4B). Po zapoczątkowaniu ampleksusu para może pozostawać w tym stanie przez 1–5 tygodni, przejawiając przy tym inne zachowania. Ampleksus jest zachowaniem bardzo aktywnym, obejmującym delikatne, pompujące ściskanie samicy przez samca (Rycina 4C); przemieszczanie się samicy i okresowe przyjmowanie pozycji „na rękach” (Rycina 4D,E); a w czasie zbliżonym do składania jaj samica, będąc w pozycji „na rękach”, opiera się o powierzchnie, do których może przytwierdzić jaja, podczas gdy samiec energicznie pompuje jej odwłok (w tym przypadku można również zaobserwować, jak samica pociera odwłok w dół, od pach w stronę kloaki; może to być mechaniczny sposób na przesunięcie jaj w dół jajowodów) (Rycina 4F,G).
Niniejsze badanie ilustruje, w jaki sposób ultradźwięki mogą dostarczyć informacji pozwalających ustalić status rozrodczy u samic R. muscosa oraz Necturus. Cztery stadia rozwoju są reprezentowane u R. muscosa (Rysunek 5C,D,E,F) i są podobnie charakteryzowane u Necturus4 (Rysunek 6A,B,C). Ponadto zdarza się, że pozostałe jaja nie zostają wydalone, co prowadzi do retencji jaj (Rysunek 5G, Rysunek 15A,B). Stadium 1 przedstawia jajnik bezpośrednio po zniesieniu jaj, w którym pęcherzyki są trudne do wizualizacji (Rysunek 5C). Stadium 2 charakteryzuje się pojawieniem echogenicznych kropek (białych plamek) rozproszonych w całym jajniku (Rysunek 5D). Stadia 2 i 3 są reprezentowane przez większe, zaokrąglone kropki echogeniczne z ciemnymi centrami, które odpowiadają pęcherzykom z żółtkiem o średniej i dużej wielkości (Rysunek 5E,F). W latach 2013-2017 samice Necturus w niewoli były badane ultrasonograficznie w odstępach miesięcznych. Podczas każdego badania osobniki otrzymywały ocenę punktową zgodnie z kryteriami rozrodczymi ustalonymi dla tego rodzaju (Tabela 2). Procent samic rozwijających nowe jaja każdego roku wynosił średnio 88.2 ± 3.01% (Tabela 5). Mimo wysokiego poziomu rozwoju jaj, zniesienie jaj nie było gwarantowane (Rysunek 16). Większość samic, które zniosły jaja, złożyła pełny zestaw, podczas gdy niektóre osobniki złożyły tylko ułamek wykształconych jaj. Samice R. muscosa oraz Necturus z retencją jaj, współistniejącą z gromadzeniem się płynu w jamie ciała, były zewnętrznie powiększone, z czerwonymi plamami na skórze odpowiadającymi pękniętym naczyniom krwionośnym (Rysunek 14A,B). Stopień retencji płynu można było dalej ocenić za pomocą ultradźwięków (Rysunek 15B). U obu gatunków zatrzymane jaja uległy atrezji lub nabrały bardziej echogenicznego wyglądu (Rysunek 14C,D, Rysunek 15A).
Podawanie hormonów
W zależności od rodzaju iniekcji, kąt i głębokość wprowadzenia igły będą się różnić. W przypadku większości iniekcji u gatunków takich jak R. muscosa głębokość wprowadzenia igły nie musi przekraczać 1 -2 mm, natomiast zmieniać będzie się kąt penetracji. Iniekcje prostaglandyn wymagały domięśniowego (im) wprowadzenia igły pod kątem 90° w tylną kończynę R. muscosa , podczas gdy iniekcje doszpikowe (ip), o głębokości zbliżonej do iniekcji domięśniowych, podawano w obszarze jamy coelomicznej pod kątem 45° (Rysunek 10). Podanie preparatu Amphiplex nie miało istotnego wpływu na zwiększenie liczby jaj złożonych przez samice traktowane hormonami w porównaniu z grupą kontrolną (P = 0,547), nie stwierdzono również różnic w liczbie embrionów, które uległy podziałom (P = 0,673) lub przeżyły do stadium kijanki (P = 0,629) (Tabela 4). Ogólnie odsetek samic składających jaja spadł z 80% w 2011 roku do 28% w 2014 roku. Liczba samic składających jaja w 2015 roku była istotnie wyższa niż w 2013 (P = 0,0002), 2013 (P = 0,0001) i 2014 (P = 0,0026), ale nie w 2011 (P = 0,0885), co potwierdza przypuszczenie, że samice tego gatunku mogą nie rozmnażać się co roku i że protokoły hormonalne wymagają dopracowania. U samic R. muscosa z objawami retencji jaj iniekcje domięśniowe PGF2α wykazały 60% skuteczności w indukowaniu wydalania degenerujących jaj. Jednak u 1 z 5 zaaplikowanych iniekcji PGF2α nie wystarczyło do całkowitego wydalenia i niektóre jaja pozostały wewnątrz samicy do następnego sezonu lęgowego. Siedemnaście samic Necturus otrzymało LHRH/(GnRH), a 13 otrzymało iniekcję kontrolną ze sterylnej wody (Tabela 5). Łącznie siedem samic Necturus (n = 4 alabamensis, n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) złożyło jedenaście pełnych clutches (sprzęg jaj), przypisanych zarówno osobnikom traktowanym GnRH (n = 6), jak i grupie kontrolnej (n = 5). Trzy samice (n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) złożyły pięć niepełnych clutches (Rysunek 13). Zjawisko to nie wydawało się być związane z egzogennym leczeniem hormonalnym, ponieważ trzy samice z grupy kontrolnej analogicznie złożyły niepełne clutches (Tabela 5). Składanie jaj odbywało się w ciągu 37 dni (3/31-5/7) w okresie pięciu lat (Tabela 5). Nie stwierdzono różnic (P = 0,194) w tempie składania jaj między samicami traktowanymi LHRH/GnRH (41 ± 13,08%, zakres 17-67%) a kontrolnymi (66,75 ± 11,79%, zakres 50-100%). Samice traktowane LHRH/GnRH składały jaja średnio 7,44 ± 1,41 (zakres 3-13) dni po iniekcji. Ze względu na w pełni wodny tryb życia tych gatunków i niemożność ich manualnego unieruchomienia bez znieczulenia, konieczne było zapewnienie odpowiedniego poziomu sedacji przed wykonaniem iniekcji hormonalnych IP (instrukcje dotyczące znieczulenia znajdują się w sekcji 3.2).
Pobieranie krwi, znieczulenie i operacja
Technika pobierania krwi opisana w niniejszym artykule została zaczerpnięta z pracy Forzan i wsp. 201310 i okazała się skutecznym sposobem pobierania krwi od R. muscosa przy minimalnej inwazyjności i stresie. Przy użyciu kapilar do mikrohematokrytu można pobrać około 35-45µl osocza lub surowicy z 70 µL krwi pełnej (Rycina 7). Maksymalna objętość pobranej krwi u R. muscosa wynosiła jedną pełną kapilarę do mikrohematokrytu na 10 g żaby, do 4 kapilar na żaby o masie 40 g i większe. Była to konserwatywna objętość poboru wynosząca 0,7 mL na 100 g, co stanowi 70% maksymalnej zalecanej dawki 1,0 mL na 100 g (zaadaptowano z Allender i Fry, 2008)13.
Znieczulenie i zabiegi chirurgiczne u płazów są rzadko opisywane, jednak należy zauważyć, że dawki i skuteczność różnią się w zależności od gatunku. Na przykład u Bombina orientalis MS222 wykazuje bardzo słaby efekt, nawet przy wysokich dawkach (1 g/L), podczas gdy u ropuch borealnych, Anaxyrus boreas boreas, dawka 1 g/L działa szybko (w ciągu kilku minut) i długotrwale (powyżej 3 h) (Calatayud, obserwacja własna). U R. muscosa znieczulenie wymaga dawek raportowanych dla A. boreas boreas i wykazuje podobny efekt oraz czas wybudzania. Głodzenie płazów przed znieczuleniem zazwyczaj nie jest wymagane, ponieważ ich krtań pozostaje szczelnie zamknięta nawet w znieczuleniu ogólnym. Jeśli jednak zostanie to uznane za konieczne, zwłaszcza gdy procedura znieczulenia ma obejmować chirurgię celomiczną, zwierzęta można głodzić przez 24 h przed znieczuleniem.
Podczas operacji odruchem głównym wskazującym na to, że zwierzę zostało znieczulone, jest odruch prostowania. Odruch prostowania to zdolność i stopień łatwości, z jaką zwierzę może powrócić do pozycji pionowej po położeniu go na plecach. Utrata tego odruchu sugeruje lekki stopień znieczulenia. Płaszczyznę chirurgiczną wskazuje utrata odruchu cofania, co sprawdza się poprzez lekkie pociągnięcie kończyny w celu jej wyprostowania; zwierzę nie powinno być już w stanie jej cofnąć7. Chirurgia rozrodcza nie napotyka poważnych przeszkód, a pacjenci z grupy płazów zazwyczaj dobrze się goją, tolerując utratę krwi w większym stopniu niż wyższe kręgowce. Operacja powinna przebiegać szybko i trwać około 15 minut od początku do końca. Czas poszczególnych etapów powinien być następujący: <1 minuta na nacięcie wstępne, <2 minuty na celiotomię i wprowadzenie rozwieracza, <2-3 minuty na izolację każdego jajnika, <1 minuta na przeszycie lub kauteryzację naczyń oraz <4 minuty na szycie skóry. Całkowity czas rekonwalescencji po operacji przy zastosowaniu protokołów MS222 wynosi około 45 minut, lecz może być on zależny od gatunku. U A. boreas boreas i R. muscosa czas rekonwalescencji może być dłuższy, do 1–2 h. Podczas przeprowadzania operacji należy zachować ostrożność, aby uniknąć przebicia płuc, przewodu pokarmowego lub rozszerzonego pęcherza moczowego, a także nie uszkodzić makroskopowych gruczołów, serc limfatycznych i naczyń krwionośnych, zwłaszcza żyły brzusznej środkowej. W zależności od pory roku obecność dużych ciał tłuszczowych może utrudniać wizualizację innych organów. Po widocznym przebudzeniu reakcje zwierzęcia na stymulację kończyn, takie jak opór przy delikatnym rozciąganiu kończyny tylnej lub mruganie podczas stymulacji obszaru wokół oka (obserwacja własna), są klasyfikowane jako reakcje cofania. Odruch prostowania wraz z innymi wskaźnikami rekonwalescencji, w tym odruchami cofania i ruchami gardzielowymi, stanowią istotne wskaźniki wybudzenia.
| Podawanie | ||||||||||
| Nazwa pospolita | Gatunek | Hormon | Procedura | Związek przygotowawczy | Zgłoszona dawka przygotowawcza | Liczba dawek przygotowawczych | Czas (godz. przed dawką owulacyjną) | Związek(i) podawane w celu ostatecznej owulacji/składania jaj | Dawki | Referencja |
| Ropucha czubata portorykańska | Peltophryne lemur | GnRH & hCG | IP | hCG | 1,5 IU/g | 2 | hCG - 48 | GnRH; hCG; GnRHa + hCG | 0,2 µg; 4 IU; 0,5 µg + 4 IU | Calatayud et al. niepublikowane |
| Żaba górska żółwonoga | Rana muscosa | Amphiplex, Lut | IP | GnRHa (des-Gly10, D- Ala6, Pro-NHEt9-GnRH) | 0,4 µg/g | 1 | 24 | GnRH + MET | 1 x 0,4 µg/g + 10 µg/g | Calatayud et al., 2018 |
| PGF2α | IM | PGF2α | 5 ng/g | 1 | 48 | PGF2α | 5 ng/g | |||
| Ropucha borealna południowych Gór Skalistych | Anaxyrus boreas boreas | hCG, GnRH | IP | hCG | 3,7 IU/g | 2 | 96, 24 | hCG + GnRHa | 13,5 IU/g + 0,4 µg/g | Calatayud et al., 2015 |
| Żaba świerszczowa północna | Acris crepitan | Amphiplex | dodany do wody (10 mL) | Brak | Brak | 0 | na | GnRH + MET | 0,17 µg + 0,42 µg / µl | Snyder et al., 2012 |
| Żaba leopardzia północna | Lithobates pipiens | Amphiplex | IP | Brak | Brak | 0 | 24 | GnRH + MET | 1 x 0,4 µg/g + 10 µg/g | Trudeau et al., 2010 |
| Żaba rożata argentyńska | Ceratophyrs ornata | Amphiplex | IP | Brak | Brak | 0 | 24 | GnRH + MET | 1 x 0,4 µg/g + 10 µg/g | |
| Żaba rożata Cranwella | Ceratophrys cranwelli | Amphiplex | IP | Brak | Brak | 0 | 24 | GnRH + MET | 1 x 0,4 µg/g + 10 µg/g | |
| Żaba amerykańska naziemna | Odontophrynus americanus | Amphiplex | IP | Brak | Brak | 0 | 24 | GnRH + MET | 1 x 0,4 µg/g + 10 µg/g | |
| Żaba ciemna | Rana sevosa | hCG, GnRH | IP | hCG | 3,7 IU/g | 2 | 96 , 24 | GnRH + hCG | 1 x 0,4 µg/g + 13,5 IU/g | Graham et al., 2018 |
| Coqui pospolity | Eleutherodactylus coqui | rybie, ptasie, ssacze & GnRH (D-Ala, des-Gly, eth LHRH), hCG | SC | mLHRH; aLHR; fLHRH; GnRHa; hCG | Brak | 0 | na | mLHRH; aLHR; fLHRH; GnRHa; hCG | 7µg, 33µg; 28µg; 7µg, 20µg; 5, 10, 15, 20 µg; 165 IU | Michael et al 2004 |
| Ropucha Guntera | Pseudophryne guentheri | GnRH | GnRHa | 0,4 µg/g | 1 | 26 | GnRHa z przygotowaniem lub bez | 0,4 µg/g | Silla 2010 | |
| Żaba corroboree | Pseudophryne corroboree | Lucrin | SC | Lucrin | 1 µg | 1 | 26 | Lucrin | 5 µg | Byrne & Silla, 2010 |
| Żaba corroboree północna | Pseudophryne pengilleyi | GnRHa GnRH (D-Ala, des-Gly, eth LHRH) | TA | Brak | Brak | 0 | na | GnRHa | 0,5 -2,0 µg/g | Silla et al., 2017 |
| Salamandra wodna z Wybrzeża Zatoki | Necturus beyeri | [des-Gly10, D- Ala6]-LhRH-RH etylamid octanu sól hydrat | IP | Brak | Brak | 0 | na | LHRH | 100 µg / 500 µL | Stoops et al., 2014 |
| Żaba dzwonecznica południowa / żaba warcząca | Litoria raniformis | des-Gly10, D- Ala6-[LHRH] | SC | Brak | Brak | 0 | na | des-Gly10, D- Ala6-[LHRH] | 50 µg | Mann et al., 2010 |
| Ropucha Fowlera | Anaxyrus fowleri | GnRH, hCG, P4 | IP | hCG | 3,7 IU/g | Browne et al., 2006 | ||||
| Aksolotl (salamandra meksykańska) | Ambystoma mexicanum | hormony folikulostymulujące | IM | Brak | Brak | 0 | na | FSH | 400IU | Trottier and Armstrong, 1974 |
| Żaba pazurkowata afrykańska | Xenopus laevis | hCG & P4 | dodane do wody; IP | PMSG, hCG | Marcec , 2016 | |||||
| Salamandra tygrysia | Ambystoma tigrinum | hCG, LH | ||||||||
| Ropucha z Wyomingu | Anaxyrus baxteri | hCG, GnRHa, P4 | IP | hCG + GnRHa | 100 IU + 0,8 µg | 1 | 72 | hCG + GnRHa | 100 IU + 0,8 µg | Browne et al., 2006 |
| Żaba leopardzia północna | Lithobates pipiens | ekstrakt przysadkowy (PE), P4, testosteron (T), kortykosteron [C], Amphiplex, domperidon (D) | SC, IP | Brak | Brak | 0 | na | PE, PE+T, PE+P4, PE+C; Amphiplex, GnRH + D | ~100 IU (LHRH) w 1 mL; PE+0,002µg/µL; PE+0,01mg/50mL; PE+0,1mg/50mL; 0,4 µg/g + 10 µg/g; 0,4 µg/g + D | Wright, 1961; Fort, 2000; Trudeau et al., 2013 |
| Żaba naziemna | Lymnodynastes tasmeniensis | ekstrakty przysadkowe, hCG, GnRHa, PZ | IP | GnRHa | 0,9-1,2µg/g + PZ 10 µg/g | 1 | 20 | PE; PE + hCG; GnRH + PZ | obj. PE; obj. PE + 100 IU hCG; GnRH (0,9-1,2µg/g) + PZ (10µg/g) | Clulow et al., 2018 |
| Żaba dzwonecznica zielono-złota | Litoia aurea | GnRH | IP | GnRHa | 10 µg | 1 | 72 | GnRHa + hCG | 20 µg + 300 IU | Clulow et al., 2018 |
| Wielka żaba prążkowana | Mixophyes fasciolatus | hCG & PMSG | SC | PMSG, hCG | 50 IU & 25 IU; 1x100 IU | 2; 2 | PMSG-144 & 96; hCG-24 | hCG | 100IU | Clulow et al., 2012 |
| Więcej protokołów hormonalnych i gatunków można znaleźć w Wright and Whitaker, 2001 | ||||||||||
Tabela 1: Gatunki płazów oraz niektóre egzogenne hormony podawane badanym osobnikom, zgodnie z doniesieniami literaturowymi.Ludzka gonadotropina kosmórkowa (hCG); hormon uwalniający gonadotropiny (GnRH); hormon uwalniający hormon luteinizujący (LHRH); litery m, a i f oznaczają odpowiednio „ssaki”, „ptaki” i „ryby”; gonadotropina z surowicy klaczy w ciąży (PMSG); progesteron (P4); hormon folikulostymulujący (FSH); ekstrakt z przysadki (PE); testosteron (T); kortykosteron (C). Wymienione antagoniści dopaminy obejmują: domperydon (D); pimozyd (P); metoklopramid (MET). Amphiplex to nazwa związku składającego się z GnRH i metoklopramidu27. Lucrin jest dostępnym komercyjnie agonistą GnRH, którego substancją czynną jest octan leuproreliny.4,7,17,18,19,20,26,27,38,39,40,41,42,43,44,45
| Stopień | Stan rozrodczy | Opis |
| 0 | Nieciężarna | Brak widocznych jaj. |
| 1 | Wczesna ciąża | Widoczne jaja (rozmiar 1-2mm), brak wyraźnej linii echogennej związanej z jajem. |
| 2 | Środkowa ciąża | Jaja o rozmiarze 2-3mm, wyraźna linia lub linie echogenne związane z każdym jajem. |
| 3 | Późna ciąża | Jaja o rozmiarze 4-5mm, linie echogenne nadal widoczne, wyraźny wzrost bezechowości jaj. |
| 4 | Zatrzymane jaja | Różny stopień obecności materiału echogennego w wewnętrznej strukturze jaja, przybierającego amorficzny kształt. Niektóre mogą stać się silnie echogenne i wiązać się z retencją płynu w jamie ciała. |
Tabela 2: System stopniowania używany do oceny stanu rozrodczego uwięzionych samic Necturus oraz Rana muscosa za pomocą ultrasonografii.
| Lek | Dawka i droga podania | Komentarze - referencja |
| Buprenorfina | 50 mg/kg (dotrzewnowłókniactwo) | Badanie eksperymentalne na salamandrze plamistej (Notophthalmus viridescens). Przed operacją należy zastosować leki przeciwbólowe (Koeller, 2009). |
| Butorfanol | 1–10 mg/kg (domięśniowo lub do jamy ciała) | Występują różne specyficzne odpowiedzi. Zaleca się rozpoczęcie od dawki 1 mg/kg. |
| Butorfanol | 0,5 mg/l (kąpiel) | Badanie eksperymentalne na salamandrze plamistej (Notophthalmus viridescens). (Koeller, 2009) |
| Fentanyl | 1 mg/kg | Analgezja > 4 h, zniesione przez naltrekson (Stevens, 1997) |
| Meloksykam | 0,1 do 0,2 mg/kg (i.m.) | (Minter, 2011) |
Tabela 3: Protokoły przeciwbólowe u płazów.
| Rana muscosa | ||
| Rok | 2014 | 2015 |
| Nie. ♀ | 18 | 18 |
| Rozwój jaja | 61% | 94% |
| Kontrola ♀ | 4 | 6 |
| Amphiplex ♀ | 4 | 7 |
| Średni dzień po Amphiplex do złożenia jaj | 10.5 | 10.9 |
| Wskaźnik składania jaj (Amphiplex) | 22.20% | 33.33% |
| Wskaźnik składania jaj (kontrola) | 22.20% | 38.88% |
Tabela 4: Porównanie parametrów rozrodczych samic Rana muscosa w niewoli traktowanych amphiplexem w porównaniu do grupy kontrolnej w 2014 i 2015 roku.
| Necturus sp. | |||||
| Rok | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Liczba ♀ | 6* | 7 | 7* | 7* | 7* |
| Rozwój jaj | 83% | 100% | 86% | 86% | 86% |
| LHRH ♀ | 3 | 5 | 3 | 6 | 0 |
| Kontrola ♀ | 2 | 2 | 3 | 0 | 6 |
| Dzień od podania LHRH do złożenia jaj | 5 | 7 | 5.5 (zakres 3 - 8) | 13 | n/d |
| Wskaźnik składania jaj (LHRH) | 60% | 20% | 67% | 17% | n/d |
| Wskaźnik składania jaj (Kontrola) | 50% | 50% | 100% | n/d | 67% |
| * n=1 ♀ brak rozwoju jaj | |||||
Tabela 5: Porównanie parametrów rozrodczych u samic Necturus z trzech gatunków przetrzymywanych w niewoli, traktowanych LHRH(GnRH) oraz grupy kontrolnej (woda sterylna) w okresie 5 lat (2012-2017).
Rycina 1: Trzy metody trzymania żaby. (A) Procedura 1. (B) Procedura 2. (C) Procedura 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Ocena morfometryczna. (A, B) SVL/SUL (C, D) masa ciała u R. muscosa oraz D. Necturus. (E) Pomiar rozmiaru za pomocą suwmiarki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Dymorfizm płciowy rozpoznaje się po obecności guzków kopulacyjnych na kciukach dorosłych samców R. muscosa w porównaniu do samic. (A) Samica (B) Samiec. Dolny panel przedstawia długość samca w porównaniu do samicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Charakterystyka zachowań rozrodczych poprzedzających składanie ikry u R. muscosa (A) zaloty. (B) Ampleksus. (C) Samiec ściskający samicę podczas ampleksusu. (D, E) Samica w ampleksusie w pozycji stojącej na przednich łapach. (F, G) Skurcze brzucha i składanie ikry. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Badanie ultrasonograficzne R. muscosa A-B w zależności od stanu rozrodczego zgodnie z etapem rozwojowym4. (A, B) Wykonywanie badania ultrasonograficznego u Rana muscosa. (C) Stopień 0. (D) Stopień 1. (E) Stopień 2. (F) Stopień 3. (G) Stopień 4 (jaja owulowane i zatrzymane) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Obrazy ultrasonograficzne Necturus. (A) Stopień 1. (B) Stopień 2. (C) Jaja w stopniu 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 7: Pobieranie krwi u R. muscosa. (A) Pobieranie krwi poprzez nakłucie vena orbitalis posterior, żyły twarzowej tuż nad linią żuchwy w środkowej części oczodołu. (B, C) Krew wypływa na powierzchnię skóry i jest zbierana za pomocą heparynyzowanej rurki kapilarnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8: Metody iniekcji u płazów. W zależności od rodzaju i głębokości iniekcji, kąt oraz głębokość wprowadzenia igły będą się różnić. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 9: Iniekcja hormonalna u R. muscosa. Indukcja składania jaj poprzez leczenie hormonalne u samic Rana muscosa po domięśniowym wstrzyknięciu amphiplex. Jajniki znajdują się w jamie ciała Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 10: Przygotowanie przed operacją. (A) Aseptyczne przygotowanie pola operacyjnego przy użyciu rozcieńczonego roztworu powidonu z jodem (1/10), Trachycephalus resinifictrix. (B) Czyste nacięcie skalpelem u Xenopus laevis lub (C) nacięcie skóry laserem diodowym, Lithobates catesbeianus. (D) Unikanie uszkodzenia żyły brzusznej środkowej, Trachycephalus resinifictrix. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 11: Owariektomia u Xenopus laevis. (A) Odsłonięcie i odsunięcie dużych ciał tłuszczowych w celu odsłonięcia masy jajowej. (B) Wycięcie fragmentu masy jajowej bez podwiązywania naczyń krwionośnych. (C) Koagulacja otaczających naczyń krwionośnych za pomocą elektrokoagulacji w celu całkowitej owariektomii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 12: Przygotowanie przedoperacyjne i owariektomia u A. mexicanum. (A) Sterylna gaza nasączona 0,75% roztworem chlorheksydyny naniesiona na miejsce operacyjne (B). Linia między barkiem a kończynami tylnymi dzieli zwierzę na trzy równe części, a niebieska kropka oznacza miejsce nacięcia. (C) Rozchylenie nacięć w jamie ciała za pomocą rozwieraczy do powiek. (D) W celu całkowitej owariektomii należy wypalić otaczające naczynia krwionośne za pomocą elektrokoagulacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 13: Wizualna ocena etapów rozrodczych. (A, B) Wizualna ocena etapu rozrodczego przez półprzezroczystą skórę, Necturus. (C) Przezroczysta skóra, Hyalinobatrachium (żaba szklana). (D) Wizualna ocena R. muscosa przed (po prawej, niebieska linia) i po składaniu jaj (po lewej – żółta linia). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 14: Retencja jaj. (A, B) Samica Rana muscosa z ciężkim przypadkiem retencji jaj. (C) Ultrasonografia wykazuje stare, degenerujące się jaja (góra) oraz większe jaja (panele środkowy i dolny) owulowane i uwięzione w celomie. (D) Retencjonowane jaja usunięte poprzez manualne wyciskanie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 15: Obrazy ultrasonograficzne zatrzymanych jaj u Necturus, które (A) stały się echogenne (okrąg) i były powiązane z (B) retencją płynu w jamie ciała (strzałka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 16: Procent samic Necturus w niewoli, które zniosły pełne lub częściowe clutches (2013-2017), w porównaniu do osobników, które nie zniosły jaj. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Bezpośrednia obsługa, obserwacja wzrokowa i pomiary morfometryczne zapewniają techniki nieinwazyjne i są pierwszymi kryteriami oceny określającymi etap rozrodczy samicy. Jednak to badanie pokazuje, że ciążące jajniki nie zawsze mogą być wiarygodnie zidentyfikowane za pomocą badania palpacyjnego. W zależności od gatunku, ciążące jajniki można czasami wykryć wizualnie przez półprzezroczystą (ryc. 13A, B) lub całkowicie przezroczystą skórę po brzusznej stronie zwierzęcia (ryc. 13C). Samice, które zakończyły składanie jaj, mogą wykazywać oczywiste zmiany w wyglądzie w porównaniu z samicami z ciężarem (np. luźna skóra i utrata do 30% masy ciała, ryc. 13D). Podczas rozmnażania samce i samice będą wykazywać pewne zachowania, które dostarczają informacji o bliskości owulacji i składania jaj. W przypadku R. muscosa oznaczenia, że samica jest bliska złożenia jaj, zaczynają się od wejścia samicy w stanie na rękach.
Zastosowanie technologii ultradźwiękowej u Anuranów i Caudates pozwala na diagnozę obecności lub braku jaj oraz tego, czy składanie jaj było związane z całkowitym lub częściowym uwolnieniem rozwiniętych komórek jajowych. W związku z tym metoda ta zapewnia pełniejszą i dokładniejszą ocenę stanu rozrodczego, nie ograniczając się do określania stanu ciężkości/braku ciężaru za pomocą techniki wizualizacji, która różni się w zależności od przezroczystości skóry brzucha lub konsystencji naskórka u różnych gatunków. Ultradźwięki mogą być wykonywane ze względną łatwością i przy niewielkim stresie dla zwierząt (ryc. 5 i ryc. 13) i mogą być wykorzystywane do charakteryzowania cykli rozrodczych i określania statusu rozrodczego4. Bardzo ważne jest, aby zapoznać się z gatunkiem; jednak badanie to wykazało, że Necturus i R. muscosa mają wspólne objawy rozwojowe w swoich wzorcach rozrodczych, co pozwala na podobną klasyfikację etapu rozrodczego (ryc. 5). Dzięki tej technologii istnieją obecnie dowody na to, że rozwój jaj jest wysoki u żyjących w niewoli Necturus i R. muscosa oraz że oba te gatunki podążają za wzorcem sezonowym. Chociaż przyczyny tych zjawisk są nieznane i wymagają dalszych badań, bez użycia ultradźwięków kilka obszarów dysfunkcji jajników, takich jak zatrzymywanie komórek jajowych i częściowe składanie jaj, pozostałoby niewykrytych. Przyszłe zastosowania tej techniki zostaną wykorzystane do określenia, czy samice powinny być wybierane do hodowli w danym roku i czy składanie jaj jest zakończone.
Protokół pobierania krwi, taki jak ten przedstawiony u R. muscosa, który jest zarówno skuteczny, jak i powoduje minimalny stres u zwierzęcia, jest optymalny do badania profili hormonalnych u anuranów żyjących w niewoli i żyjących na wolności (Calatayud, niepublikowane). Do tej pory nie ma informacji na temat rocznych profili hormonalnych R. muscosa żyjących w niewoli, a tym samym nie ma wiedzy na temat tego, jak hormony wpływają na ich zdrowie i reprodukcję. Co więcej, mając dowody na to, że samice tego gatunku mogą nie być jednorocznymi rozpłodami, profilowanie hormonalne będzie kolejną metodą śledzenia cykli jajnikowych. Wraz z ultradźwiękami, analiza hormonalna może prowadzić do lepszego przewidywania, jakie samice będą gotowe do złożenia jaj. Ponadto w ubiegłym roku udokumentowano dwa przypadki interpłciowości w populacji R. muscosa żyjącej w niewoli. Ponadto rozwój opuszków kciuków został zauważony u niektórych starszych kobiet założycielek. Przyczyny tego są obecnie badane, ale wstępne wyniki sugerują, że może to mieć związek ze zmianami w poziomie testosteronu (Calatayud, niepublikowane). Rozpoznanie cykli hormonalnych u kobiet w różnym wieku pomoże nam zrozumieć, dlaczego kobiety mogą rozwijać drugorzędowe cechy płciowe związane z mężczyznami i czy należy się tego spodziewać w starzejącej się populacji.
Egzogenna terapia hormonalna jest stosowana w celu przezwyciężenia dysfunkcji rozrodczych często spotykanych u żyjących w niewoli. Jednak zarówno w przypadku populacji R. muscosa , jak i Necturus w tym badaniu nie wykryto istotnych różnic w składaniu jaj między samicami leczonymi hormonami i kontrolnymi odpowiednio w okresie 2 i 5 lat. Może to wskazywać na to, że zastosowany protokół podawania hormonów, dawki, torowanie i kombinacja hormonów nie były odpowiednie dla danego gatunku. Bliższa analiza historii rozrodczych poszczególnych samic sugeruje, że R. muscosa może nie doświadczać corocznego rozmnażania, co może również tłumaczyć brak efektu hormonalnego obserwowanego u leczonych samic. Ponieważ pewien odsetek samic konsekwentnie pomija rozmnażanie każdego roku, zrozumienie naturalnej historii gatunku może pomóc w ustaleniu, czy istnieje zapotrzebowanie na egzogenne hormony i kiedy mogą być one najbardziej skuteczne. Procedury opisane w tym artykule mogą być stosowane do wielu gatunków (tabela 1) i dotyczą anuranów w zakresie od 5 g do 150 g; Większe zwierzęta mogą wymagać różnych strzykawek i igieł. Lokalizacja wstrzyknięcia różni się w zależności od niektórych hormonów wymagających wstrzyknięcia domięśniowego, dootrzewnowego, podskórnego lub śródskórnego (ryc. 7).
Operacja w celu wycięcia jajników jest powszechną metodą stosowaną u różnych gatunków w celu uzyskania oocytów do badań embriologicznych. Owariektomia może być również wskazana w przypadku kontroli populacji i problemów medycznych, takich jak zatrzymywanie komórek jajowych. W przypadku częściowej owariektomii, w której pobieranie komórek jajowych odbywa się w celach badawczych, operacja musi zapewnić, że zwierzę pozostanie zdolne do reprodukcji. Podawanie PGF2α okazało się obiecujące w rozwiązywaniu problemu zatrzymywania jaj u samic R. muscosa. U kilku osobników PGF2α spowodował całkowite złożenie wcześniej zatrzymanych jaj, ale u innych wystąpiło tylko częściowe złożenie, co wymagało ręcznego usuwania wszystkich jaj. Podczas gdy PGF2α może służyć jako alternatywa dla chirurgicznego zatrzymywania jaj u R. muscosa, jego zdolność do radzenia podobnym stanom patologicznym u innych będzie wymagała walidacji specyficznej dla gatunku. Gdy interwencja chirurgiczna jest wymagana u pacjenta z Anuranem lub ogoniastym, konieczne jest zapewnienie odpowiedniej płaszczyzny znieczulenia przed wykonaniem nacięć. Umiejętności wnikliwej obserwacji są potrzebne do oceny i monitorowania normatywnych reakcji na indukcję i odzyskiwanie, jak opisano w tym badaniu dla każdego z taksonów. Po zapoznaniu się ze specyficzną anatomią, odpowiednim podejściem chirurgicznym, hemostazą, delikatną manipulacją tkankami i odpowiednim postępowaniem pooperacyjnym, operacje rozrodu nie stanowią przytłaczającej przeszkody.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Natalie Calatayud chciałaby podziękować dr Barbarze Durrant za szkolenie i pomoc w zakresie ultrasonografii, a także Exploradora de Immuebles, S.A. (EISA) za przyznanie pomocy finansowej na moje stanowisko pracownika naukowego w SDZG. Podziękowania dla dr Kylie Cane za komentarze do manuskryptu, a także dla oficjalnych recenzentów (kimkolwiek by nie byli). Podziękowania dla Jonathana Daina, naszego stypendysty 2018 Summer Fellow, San Diego Zoo Institute for Conservation Research za udostępnienie zdjęć (Rysunek 1A,B). Monica Stoops wyraża wdzięczność Stowarzyszeniu Ogrodów Zoologicznych i Akwariów (Association of Zoos and Aquariums Conservation Fund) oraz Disney Worldwide Conservation Fund za wsparcie finansowe w celu stworzenia populacji Necturus w niewoli. Dodatkowo wsparcie otrzymano również w postaci prywatnych darowizn od rzeczniczki, pani Iris de la Motte. Podziękowania należą się panu Christopherowi DeChantowi i dr Markowi Campbellowi za ich znaczący wkład w badania.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sonda GE logiq Book XP i 8C-RS 4e10 MHz Systemy medyczne | GE Systemy medyczne GE | logiq Book XP | Ultrasonograf |
| Aloka 500 7,5 mHz liniowy lub IBEX wieloczęstotliwościowy (10-6 mHz) mikrowypukły | Systemy medyczne GE | 8C-RS (10 MHz) | Sonda ultradźwiękowa |
| BD jednorazowa strzykawka insulinowa U-100 (igła 28-29 G) | Mettler Electronics Corp CA | Sonigel | Żel do ultradźwięków (rozpuszczalny w wodzie, bez soli) |
| Hormon | |||
| uwalniający gonadotropiny | BACHEM | 4012028 | synonim: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH octan skrót: GnRH |
| hormon lutenizujący uwalniający hormon | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4033013; L1898 | synonim: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 sól octanowa; [D-Ala6}-LHRH ocan soli hydrat skrót: LHRH |
| Ludzka gonadotropina kosmówkowa | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 | synonim: Gonadotropina kosmówkowa-β (109-145)(109-119); Choriogonina, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU) skrót: hCG |
| Prostaglandyna 2&alfa; | Sigma-Aldrich | P40424; | synonim: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-trihydroksyprosta-5,13-dienowy kwas tris, PGF2&alfa; − Tris; skrót: PGF2α |
| Hormon folikulotropowy | Sigma-Aldrich | F4021, F8174< | silny>synonim: świnia, owca skrót: FSH |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | 46665; P7556 | synonim: Vetranal; P4 rozpuszczalny w wodzie skrót: P4 |
| z przysadki na | synonim: Sprawdź dokumenty dotyczące pochodzenia gatunków skrót: PE | ||
| Surowica klaczy ciężarnej Gonadotropina | Prospec; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich | HOR-272; 493-10; 9002-70-4 | synonim: Surowica klaczy ciężarnej Gonadotropiny skrót: PMSG |
| Metaclopromide | Sigma-Aldrich | M0763 | synonim: 4-amino-5-chloro-N-[2-(dietyloamino)etylo]-2-metoksybenzamid, metoksychloroprokainamid skrót: MET |
| Lucrin | BACHEM; Sigma-Aldrich | 4033014; L0399 | synonim: octan leuproreliny skrót: Lucrin |
| Lutalyse | Pfizer | synonim: PGF2&alfa; - Dinoprost trometamina skrót: Lut | |
| Pimozide | Sigma-Aldrich | P1793 | synonim: 1-[1-[4,4-bis(4-fluorofenylo)butylo]-4-piperydynylo]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-on skrót: PZ |
| Amphiplex | patrz wyżej | synonim: hormon uwalniający gonadotropiny + metoklopramid skrót: GnRH + MET | |
| Ovopel | Ovopel | na | synonim: GnRHa + antagonista receptora dopaminy (podawany 1 granulka/kg) skrót: Ovo |
| Ovaprim | Pentair | ekosystemy Ova10 | synonim: Gonadotropina łososia + domperydon skrót: Ova |
| Domperidon | Sigma-Aldrich | D122 | synonim: 4-(5-chloro-2-okso-1-benzimidazolinylo)-1-[3-(2-oksobenzimidazolinylo)propylo]piperydyna skrót: DOM |
Bibliografia
- Conde, D. A., Flesness, N., Colchero, F., Jones, O. R., Scheuerlein, A. An emerging role of zoos to conserve biodiversity. Science. 331 (6023), 1390-1391 (2011).
- Conde, D. A., et al. Zoos through the Lens of the IUCN Red List: A Global Metapopulation Approach to Support Conservation Breeding Programs. PLoS ONE. 8 (12), e80311(2013).
- Morrison, C., Hero, J. -M. Geographic variation in life-history characteristics of amphibians: a review. Journal of Animal Ecology. 72 (2), 270-279 (2003).
- Calatayud, N. E., Stoops, M., Durrant, B. S. Ovarian control and monitoring in amphibians. Theriogenology. , 70-81 (2018).
- National Research Council. Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook. , (2010).
- Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
- Graham, K. M., Langhorne, C. J., Vance, C. K., Willard, S. T., Kouba, A. J. Ultrasound imaging improves hormone therapy strategies for induction of ovulation and in vitro fertilization in the endangered dusky gopher frog (Lithobates sevosa). Conservation Physiology. 6 (1), coy020(2018).
- Wright, K. M., Whitaker, B. R. Amphibian Medicine and Captive Husbandry. , Krieger Publishing Company. (2001).
- Forzán, M. J., Vanderstichel, R. V., Ogbuah, C. T., Barta, J. R., Smith, T. G. Blood collection from the facial (maxillary)/musculo-cutaneous vein in true frogs (family Ranidae). Journal of Wildlife Diseases. 48 (1), 176-180 (2012).
- Allender, M. C., Fry, M. M. Amphibian hematology. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 11 (3), 463-480 (2008).
- Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (3), 64-67 (2007).
- Jorgensen, C. B. External and internal control of patterns of feeding, growth and gonadal function in a temperate zone anuran, the toad Bufo bufo. Journal of Zoology. 210 (2), 211-241 (1986).
- Jørgensen, C. B. Growth and reproduction. Environmental Physiology of the Amphibians. , 439-466 (1992).
- Vu, M., Trudeau, V. L. Neuroendocrine control of spawning in amphibians and its practical applications. General and Comparative Endocrinology. 234, 28-39 (2016).
- Clulow, J., Trudeau, V. L., Kouba, A. J. Amphibian declines in the twenty-first century: why we need assisted reproductive technologies. Reproductive Sciences in Animal Conservation. , 275-316 (2014).
- Kouba, A., et al. Assisted reproductive technologies (ART) for amphibians. Amphibian Husbandry Resource Guide. 2, 60-118 (2012).
- Clulow, J., et al. Optimisation of an oviposition protocol employing human chorionic and pregnant mare serum gonadotropins in the Barred Frog Mixophyes fasciolatus (Myobatrachidae). Reproductive Biology and Endocrinology. 10 (1), 60(2012).
- Browne, R. K., Seratt, J., Vance, C., Kouba, A. Hormonal priming, induction of ovulation and in-vitro fertilization of the endangered Wyoming toad (Bufo baxteri). Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 34(2006).
- Calatayud, N. E., et al. A hormone priming regimen and hibernation affect oviposition in the boreal toad (Anaxyrus boreas boreas). Theriogenology. 84 (4), 600-607 (2015).
- Stoops, M. A., Campbell, M. K., Dechant, C. J. Successful captive breeding of Necturus beyeri through manipulation of environmental cues and exogenous hormone administration: a model for endangered Necturus. Herpetological Review. 45 (2), 251-256 (2014).
- Mc Creery, B. R., Licht, P. Induced ovulation and changes in pituitary responsiveness to continuous infusion of gonadotropin-releasing hormone during the ovarian cycle in the bullfrog, Rana catesbeiana. Biology of Reproduction. 29 (4), 863-871 (1983).
- Johnson, C. J., Vance, C. K., Roth, T. L., Kouba, A. J. Oviposition and ultrasound monitoring of American toads (Bufo americanus) treated with exogenous hormones. Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 299, 301(2002).
- Herbert, D. Studies of assisted reproduction in the spotted grass frog Limnodynastes tasmaniensis: ovulation, early development and microinjection (ICSI). , (2004).
- Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2, 6(2004).
- Ogawa, A., Dake, J., Iwashina, Y., Tokumoto, T. Induction of ovulation in Xenopus without hCG injection: the effect of adding steroids into the aquatic environment. Reproductive Biology and Endocrinology. 9 (1), 11(2011).
- Silla, A. J. Effects of luteinizing hormone-releasing hormone and arginine-vasotocin on the sperm-release response of Günther’s Toadlet, Pseudophryne guentheri. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 139(2010).
- Trudeau, V. L., et al. Hormonal induction of spawning in 4 species of frogs by coinjection with a gonadotropin-releasing hormone agonist and a dopamine antagonist. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 36(2010).
- Krause, E. T., von Engelhardt, N., Steinfartz, S., Trosien, R., Caspers, B. A. Ultrasonography as a minimally invasive method to assess pregnancy in the fire salamanders (Salamandra salamandra). Salamandra. 49, 211-214 (2013).
- Browne, R. K., Li, H., Seratt, J., Kouba, A. Progesterone improves the number and quality of hormone induced Fowler toad (Bufo fowleri) oocytes. Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 3(2006).
- Bramucci, M., et al. Different modulation of steroidogenesis and prostaglandin production in frog ovary in vitro by ACE and ANG II. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 273 (6), R2089-R2096 (1997).
- Gobbetti, A., Zerani, M. Possible roles for prostaglandins E2 and F2α in seasonal changes in ovarian steroidogenesis in the frog (Rana esculenta). Journal of Reproduction and Fertility. 98 (1), 27-32 (1993).
- Gobbetti, A., Zerani, M., Carnevali, O., Botte, V. Prostaglandin F2α in female water frog, Rana esculenta: Plasma levels during the annual cycle and effects of exogenous PGF2α on circulating sex hormones. General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 175-180 (1990).
- Guillette, L. J. Jr, Dubois, D. H., Cree, A. Prostaglandins, oviducal function, and parturient behavior in nonmammalian vertebrates. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 260 (5), R854-R861 (1991).
- Clulow, J., Mahony, M., Browne, R., Pomering, M., Clark, A. Applications of assisted reproductive technologies (ART) to endangered anuran amphibians. Declines and Disappearances of Australian Frogs'. Campbell, A. , 219-225 (1999).
- Browne, R. K., Wolfram, K., García, G., Bagaturov, M. F., Pereboom, Z. Zoo-based amphibian research and conservation breeding programs. Amphibian and Reptile Conservation. 5 (3), 1-14 (2011).
- Chai, N. Surgery in amphibians. Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice. 19 (1), 77-95 (2016).
- Gentz, E. J. Medicine and surgery of amphibians. Ilar Journal. 48 (3), 255-259 (2007).
- Snyder, W. E., Trudeau, V. L., Loskutoff, N. M. 168 a noninvasive, transdermal absorption approach for exogenous hormone induction of spawning in the northern cricket frog, Acris crepitans: a model for small, endangered amphibians. Reproduction, Fertility and Development. 25 (1), 232-233 (2012).
- Kouba, A. J., et al. Emerging trends for biobanking amphibian genetic resources: the hope, reality and challenges for the next decade. Biological Conservation. 164, 10-21 (2013).
- Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2 (1), 6(2004).
- Fort, D. J. Frog reproduction and development study 2000 rana pipiens reproduction and development study. , Environmental Protection Agency. (2003).
- Clulow, J., et al. Differential success in obtaining gametes between male and female Australian temperate frogs by hormonal review: A Review. General and Comparative Endocrinology. 265, 141-148 (2018).
- Trottier, T. M., Armstrong, J. B. Diploid gynogenesis in the Mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
- Marcec, R. M. Development of assisted reproductive technologies for endangered North American salamanders. , Mississippi State University. (2016).
- Wright, M. L. Melatonin, diel rhythms, and metamorphosis in anuran amphibians. General and Comparative Endocrinology. 4, (2002).
Przedruki i uprawnienia
