Oddzielanie bakterii według ilości kapsułek za pomocą nieciągłego gradientu gęstości

Summary

Pokazujemy użycie nieciągłych gradientów gęstości do rozdzielania populacji bakterii na podstawie produkcji kapsułek. Metoda ta służy do porównywania ilości kapsułek między kulturami, izolowania mutantów o określonym fenotypie kapsułki lub do identyfikacji regulatorów kapsułki. Opisano tutaj optymalizację i przebieg testu.

Abstract

Kapsułka jest kluczowym czynnikiem wirulencji u wielu gatunków bakterii, pośrednicząc w unikaniu odporności i odporności na różne stresy fizyczne. Chociaż dostępnych jest wiele metod ilościowego określania i porównywania produkcji kapsułek między różnymi szczepami lub mutantami, nie ma powszechnie stosowanej metody sortowania bakterii na podstawie ilości wytwarzanych przez nie kapsułek. Opracowaliśmy metodę rozdzielania bakterii według ilości kapsułek, wykorzystując nieciągły gradient gęstości. Metodę tę stosuje się do półilościowego porównywania ilości kapsułek między kulturami, do izolowania mutantów ze zmienioną produkcją kapsułek oraz do oczyszczania bakterii w kapsułkach ze złożonych próbek. Metodę tę można również połączyć z sekwencjonowaniem insercji transpozonów w celu identyfikacji genów zaangażowanych w regulację kapsułki. W tym miejscu szczegółowo zademonstrowano metodę, w tym sposób optymalizacji warunków gradientu dla nowego gatunku lub szczepu bakterii oraz sposób konstruowania i uruchamiania gradientu gęstości.

Introduction

Wiele gatunków bakterii wytwarza kapsułkę polisacharydową, która chroni komórkę bakteryjną przed różnymi stresami fizycznymi oraz przed rozpoznaniem i zabiciem przez układ odpornościowy. U Klebsiella pneumoniae produkcja kapsułek jest bezwzględnym wymogiem infekcji^1,2. Kapsułka K. pneumoniae pośredniczy w oporności na peptydy przeciwdrobnoustrojowe, oporności na zabijanie za pośrednictwem dopełniacza, zapobieganiu fagocytozie i tłumieniu wrodzonej odpowiedzi immunologicznej³. Nadmierna produkcja kapsułek wiąże się ze zwiększoną zjadliwością i zakażeniami pozaszpitalnymi (a nie szpitalnymi)⁴.

Dostępny jest szereg testów ilościowych i jakościowych do badania produkcji kapsułek. W przypadku gatunków Klebsiella należą do nich test ciągu⁵, w którym wykałaczka przyłożona do kolonii jest ciągnięta w górę i mierzona jest długość wytworzonego sznurka, oraz test lepkości śluzowej⁶, który polega na powolnym odwirowaniu kultury, a następnie pomiarze gęstości optycznej supernatantu. Metody te są proste i szybkie, ale brakuje im czułości, gdy są stosowane na klasycznych szczepach Klebsiella, a nie na szczepach nadprodukcyjnych w kapsułkach. Inną metodą oznaczania ilościowego kapsułek jest test kwasu uronowego, który jest trudny technicznie i wymaga użycia stężonego kwasu siarkowego¹. Wreszcie, kapsułka jest widoczna bezpośrednio pod mikroskopem (ryc. 1A). Spośród tych metod tylko mikroskopia pozwala użytkownikowi obserwować różne stany kapsułkowania w jednej populacji, a żadna z tych metod nie umożliwia fizycznego oddzielenia bakterii w kapsułkach i bez nich.

Separacje oparte na gęstości metodą wirowania gradientowego są rutynowo stosowane w biologii komórki do oczyszczania różnych typów komórek eukariotycznych⁷, ale rzadko stosowane w badaniach mikrobiologicznych. Test lepkości śluzowej dla Klebsiella opiera się na obserwacji, że wysoce kapsułkowane bakterie potrzebują więcej czasu na osadzanie się przez wirowanie i doszliśmy do wniosku, że może to być spowodowane zmniejszoną ogólną gęstością otoczkowanych komórek. Przedstawiona tutaj metoda została opracowana w celu fizycznego oddzielenia populacji K. pneumoniae według ilości kapsułki, przy użyciu wirowania w gradiacji gęstości (ryc. 1). Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do Streptococcus pneumoniae, co wskazuje, że ma ona zastosowanie do innych gatunków bakterii. Separacja gradientu gęstości nasyconej biblioteki mutantów transpozonów w połączeniu z sekwencjonowaniem transpozonowo-insercyjnym (gęstość-TraDISort) została wykorzystana do identyfikacji genów zaangażowanych w produkcję i regulację kapsułki⁸. Podobnie, metodę tę zastosowano w połączeniu z losową reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) poszczególnych kolonii w celu wyizolowania nieotoczkowanych mutantów K. pneumoniae. Metoda ta może być również stosowana do szybkich porównań produkcji kapsułek między różnymi populacjami i warunkami lub do oczyszczania bakterii w kapsułkach ze złożonych próbek (ryc. 1B). Wreszcie, istnieje możliwość oznaczenia innych fenotypów, które wpływają na gęstość, takich jak wielkość komórki lub agregacja.

Ten manuskrypt pokazuje, jak zoptymalizować procedurę dla nowego gatunku lub szczepu bakterii oraz demonstruje konstrukcję i przebieg nieciągłego gradientu gęstości w celu oddzielenia bakterii hiperkapsułkowanych, kapsułkowanych i niekapsułkowanych.

Protocol

UWAGA: Upewnij się, że wszelkie oceny ryzyka dotyczące szczepów bakteryjnych są przestrzegane podczas hodowli i obchodzenia się z próbkami. Należy pamiętać, że ustawienie zbyt wielu gradientów jednocześnie może prowadzić do zaburzeń układu mięśniowo-szkieletowego spowodowanych naciskiem na stawy spowodowanym powolnym pipetowaniem. Zaplanuj pracę i podejmij środki ostrożności, aby uniknąć obrażeń.

1. Przygotowanie szczepów bakteryjnych lub bibliotek mutantów

1. Szczepy, które mają być testowane, należy rozmieścić na odpowiednich płytkach agarowych. Są to standardowe tabliczki do eksperymentu.
   1. Inkubuj płytki przez noc w żądanej temperaturze, aby uzyskać pojedyncze kolonie. W tym eksperymencie posiewu posiewu K. pneumoniae (NTUH-K2044 i szczepy ATCC43816) na agarze z bulionu Luria (LB) w temperaturze 37 °C, a S. pneumoniae (23F typu dzikiego i 23F Δcps) na agarze z krwią w nawilżonym słoiku ze świecą w temperaturze 37 °C.
2. Wybierz pojedynczą kolonię z talerza podstawowego (krok 1.1), aby zaszczepić 10 ml odpowiedniego bulionu za pomocą sterylnej pętli lub patyczka koktajlowego. W celu przesiewu bibliotek losowych mutantów należy zaszczepić bulion 10 μl zapasu biblioteki losowych mutantów (biblioteka TraDIS).
   1. Szczepy K. pneumoniae inkubować w pożywkach LB o niskiej zawartości soli w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, a szczepy S. pneumoniae w pożywce do infuzji serca (BHI) statycznie w temperaturze 37 °C.
   2. Przenieść kulturę przez noc do probówki o pojemności 15 ml i odwirować w wirówce stołowej przez 10 minut przy 3 200 x g w odchylanych wiadrach z wkładkami do probówek o pojemności 15 ml i szczelnymi pokrywkami aerozolowymi.
   3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
      nuta: Supernatant należy usunąć w laboratorium odpowiednią drogą ciekłych odpadów biologicznych. Celem etapów wirowania i ponownego zawieszania (ppkt 1.2.2 i 1.2.3) jest zagęszczenie bakterii w celu łatwej wizualizacji na nachyleniu. W razie potrzeby kultury bakteryjne można załadować bezpośrednio na gradient. Mocno kapsułkowane szczepy mogą nie tworzyć szczelnego osadu. W takim przypadku należy usunąć jak najwięcej supernatantu bez usuwania jakichkolwiek komórek bakteryjnych, dodać 1x PBS do końcowej objętości 5 ml i ponownie zawiesić osad. Kontynuuj postępowanie z krokiem 1.2.5.
   4. W przypadku szczepów nieśluzowatych przejdź do kroku 2.
   5. Odwirować probówki zgodnie z opisem w kroku 1.2.2.
   6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml 1x PBS. Komórki są teraz gotowe do użycia.
      nuta: Gęstość zawiesiny komórek bakteryjnych nie jest krytyczna, ale musi być wystarczająca do wizualizacji w gradiencie. Sugerowana jest minimalna wartość OD₆₀₀ (gęstość optyczna przy 600 nm) wynosząca 4.

2. Przygotowanie rozcieńczeń gradientowych i testu mini-gradientu

1. Przygotować rozcieńczenia gradientowe.
   nuta: Dokładne stężenia podłoża o gradiencie gęstości (np. Percoll) potrzebne w gradientach gęstości do uzyskania dobrej separacji będą się różnić w zależności od zastosowanego szczepu bakterii i warunków wzrostu. Najpierw przeprowadza się testy mini-gradientowe, aby określić stężenia, które zapewnią najlepszą separację. Zawierają one 500 μl pojedynczego rozcieńczenia w probówce o pojemności 2 ml. Jeśli bakterie mają zostać wyekstrahowane z gradientu i poddane hodowli do dalszych zastosowań, kroki te należy wykonać w warunkach aseptycznych.
   1. Połącz podłoże o gradiencie gęstości z 1x PBS, aby uzyskać rozcieńczenia gradientu gęstości. Rozcieńczyć 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% i 80% (np. 2 ml pożywki o gradiencie gęstości plus 8 ml 1x PBS = 10 ml pożywki o gradiencie gęstości 20%).
   2. Porcję 500 μl 20% rozcieńczenia gradientowego do probówki o pojemności 2 ml dla każdego badanego szczepu (np. 4 szczepy = 4 probówki zawierające 500 μl 20% rozcieńczenia gradientowego).
   3. Powtórzyć krok 2.1.2 dla pozostałych rozcieńczeń gradientu.
2. Zastosuj bakterie do gradientu.
   1. Nałożyć 100 μl komórek bakteryjnych przygotowanych w krokach 1.2.3 i 1.2.6 na wierzch każdego rozcieńczenia gradientowego, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
      1. Pobrać 100 μl komórek za pomocą pipety o pojemności 200 μl i umieścić końcówkę pipety z boku probówki tuż poniżej menisku minigradientu.
      2. Odsysanie komórek bakteryjnych do gradientu bardzo powoli, tak aby utworzyły warstwę na górze gradientu, bez mieszania interfejsu.
      3. Powtórzyć kroki 2.2.1.1–2.2.1.2 dla wszystkich szczepów, które mają być badane.
   2. Za pomocą wirnika o stałym kącie z pokrywą szczelną w aerozolu, odwirować przygotowane probówki w mikrowirówce przez 10 minut przy 8 000 x g.
   3. Po odwirowaniu przenieś probówki na stojak, aby uwidocznić minimalne rozcieńczenie gradientu wymagane do zatrzymania komórek tuż nad warstwą gradientu po odwirowaniu.
   4. Jeżeli wyniki nie są jednoznaczne, należy powtórzyć badanie z minigradientem z przyrostami 5% rozcieńczeń podłoża o gradiencie gęstości powyżej i poniżej stężeń określonych w kroku 2.1.1 (np. należy zbadać rozcieńczenia 25% i 35%, jeżeli wynik przy 30% jest niejednoznaczny).
      nuta: Zobacz Rysunek 2A, aby zapoznać się z typowymi wynikami przy pojedynczym rozcieńczeniu medium o gradiencie gęstości.
   5. Skorzystaj z wyników z kroków 2.2.3–2.2.4, aby określić idealne rozcieńczenia gradientu, które można zastosować do rozdzielenia komórek w nieciągłych gradientach na większą skalę.

3. Przygotowanie komórek do głównego eksperymentu

1. Przygotować świeże kultury przez noc, zaszczepiając 10 ml odpowiedniego bulionu, jak opisano w kroku 1.2.
   1. Inkubować kultury przez noc w odpowiednich warunkach, jak opisano w kroku 1.2.1.
   2. Osadzać nocną kulturę w osadach zgodnie z opisem w kroku 1.2.2.
2. Umyj komórki zgodnie z opisem w kroku 1.2.3.
3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1x PBS. Jeśli szczep jest śluzowaty i nie osadza się łatwo, należy ponownie zawiesić osad w objętości do 2 ml PBS lub pożywki resztkowej. Ogniwa są teraz gotowe do użycia.

4. Przygotowanie nieciągłych gradientów gęstości

UWAGA: Alternatywna metoda przygotowania gradientu od dołu (najbardziej skoncentrowany) do góry (najmniej skoncentrowany) za pomocą pipety jest opisana w kroku 7.

1. Odpipetować 1 ml najbardziej rozcieńczonego gradientu gęstości do 5 ml polipropylenowej probówki z okrągłym dnem, aby utworzyć górną, najbardziej rozcieńczoną warstwę gradientu.
   UWAGA: Kolejne warstwy bardziej skoncentrowanych rozcieńczeń gradientowych będą dodawane poniżej tej warstwy za pomocą igły, aby nie naruszyć warstw. Zalecane są co najmniej dwie i maksymalnie trzy warstwy gradientowe po 1 ml każda, aby zapewnić solidną separację i łatwą wizualizację bakterii.
   1. Używając jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml z dołączoną igłą o długości 1,5 cala, pobrać do strzykawki 1 ml następnego najbardziej stężonego podłoża o gradionym gradiencie gęstości. Unikaj pobierania powietrza, ponieważ pęcherzyki mogą zakłócić warstwy gradientu.
   2. Umieścić koniec igły na dnie probówki zawierającej pierwszą warstwę. Zawartość strzykawki należy odsysać bardzo powoli, aby uniknąć pomieszania interfejsu.
      nuta: Granica faz dwóch rozcieńczeń wzrośnie w miarę dodawania bardziej skoncentrowanego rozcieńczenia gradientowego. Obserwuj interfejs, trzymając go w pozycji do światła lub okna zewnętrznego. Jeśli nie zostanie zaobserwowany żaden wyraźny interfejs, odrzuć gradient i zacznij od nowa.
      1. Usunąć igłę z gradientu bardzo delikatnie, aby nie naruszyć granicy faz między różnymi rozcieńczeniami gradientu. Umieść rurkę w odpowiednim stojaku, aby utrzymać ją w pozycji pionowej.
   3. W przypadku stosowania trzech różnych rozcieńczeń należy powtórzyć kroki 4.1.1–4.1.2.1 tak, aby najgęstsze rozcieńczenie znajdowało się na dole. Jeśli gradient został pomyślnie skonstruowany, będą trzy odrębne warstwy bez mieszania na interfejsach.

5. Dodawanie przygotowanych komórek do gradientów i rozdzielanie przez wirowanie

1. Dodaj 600 μl przygotowanych komórek z kroku 3.3 do górnej części gradientu w probówce bardzo powoli i bez mieszania interfejsu, jak opisano w kroku 2.2.
2. Umieść probówki w adapterach rur i zważ połączone łączniki i rurki, aby upewnić się, że są wyważone.
   1. Umieść adaptery probówek w wirniku o stałym kącie w wirówce stołowej. Wirować przez 30 minut przy 3 000 x g.
   2. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki, umieść je w odpowiednim stojaku i sfotografuj wyniki jako zapis.
3. Odzyskaj frakcje bakteryjne do kwantyfikacji kwasu uronowego lub ekstrakcji DNA, wykonując krok 6.
   1. Jeżeli dalsze zastosowania nie są wymagane, próbki/gradienty należy usunąć w laboratorium odpowiednią drogą do płynnych odpadów biologicznych.
      nuta: Ważne jest, aby potwierdzić separację dla nowych gatunków/szczepów bakterii. Poszczególne frakcje z gradientu należy zbadać pod mikroskopem, za pomocą testu kwasu uronowego (etap 8) lub innego odpowiedniego testu ilościowego w celu potwierdzenia fenotypu kapsułki każdej frakcji. Jeżeli celem jest rozdzielenie na podstawie agregacji lub wielkości komórek, należy zastosować niezależne odpowiednie testy.

6. Odzyskiwanie frakcji próbki i opcjonalny etap wzrostu

1. Odzyskaj frakcje z gradientu, usuwając i odrzucając jakąkolwiek ciecz z górnego rozcieńczenia, jeśli w tej warstwie nie ma frakcji bakteryjnej.
   1. Aby usunąć górną frakcję, użyj pipety P200 i delikatnie przełóż końcówkę pipety przez gradient do frakcji i podnieś frakcję. Umieść frakcję w probówce o pojemności 1,5 ml i odpowiednio oznacz.
   2. Aby odzyskać dalsze frakcje, nadal używając pipety P200, delikatnie przełóż końcówkę przez gradient do frakcji i odzyskaj frakcję do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Usuń nadmiar gradientu, gdy uzyskuje się dostęp do ułamków znajdujących się niżej w gradiencie.
   3. Jeśli wymagana jest ekstrakcja DNA z frakcji zawierającej bardzo niską liczbę komórek (np. w przypadku gęstości-TraDISort), należy przeprowadzić subkulturę frakcji, postępując zgodnie z protokołem z kroku 6.2 w celu opcjonalnego wzrostu w celu uzyskania większej liczby komórek.
      nuta: Będzie niski poziom przenoszenia z komórek na górze gradientu do niższych frakcji, ponieważ frakcje są usuwane od góry do dołu. Zminimalizuj to, pracując ostrożnie, aby nie mieszać gradientu, używając igły do usuwania niższych frakcji i wykonując ponowne oczyszczanie próbek o bardzo niskiej obfitości, w przypadku których przeniesienie może wpłynąć na wyniki.
2. Przenieść komórki z frakcji o niskiej liczebności odzyskanej w krokach 6.1.1–6.1.2 do 5 ml odpowiedniej pożywki płynnej. Umieścić w inkubatorze i rosnąć przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
   1. Po 2 godzinach wzrostu lub gdy próbka osiągnie OD₆₀₀ równe 1, przenieść kulturę do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę przez 10 minut przy stężeniu 3 200 x g w wirówce z odchylanymi wiadrami i pokrywkami szczelnymi jak aerozol. Odrzucić supernatant
   2. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml 1x PBS.
3. Przygotować świeży gradient gęstości pojedynczego stężenia w probówce polipropylenowej o pojemności 5 ml. Użyj stężenia gradientu tuż nad położeniem frakcji w pierwotnym gradiencie (np. do oczyszczania mutanta ΔslyA pokazanego na Rysunek 2D, użyto by pożywki o gradinie gęstości 15%).
   UWAGA: Ten etap ponownego oczyszczania jest opcjonalny.
   1. Nałożyć komórki na wierzch gradientu i odwirować zgodnie z opisem w krokach 2.2 i 5.1.
   2. Wyjmij probówki z wirówki i umieść je w odpowiednim stojaku. Sfotografować gradient i odzyskać frakcję do ekstrakcji DNA, jak opisano w 6.1–6.1.2.
      nuta: Próbka jest teraz gotowa do ekstrakcji DNA lub innych dalszych zastosowań.

7. Alternatywna metoda przygotowania gradientu od dołu (najbardziej skoncentrowany) do góry (najmniej skoncentrowany) za pomocą pipety

1. Użyć rozcieńczeń gradientowych określonych w kroku 2.2.3. Używając pipety o pojemności 1 000 μl, dodaj 1 ml najgęstszego rozcieńczenia gradientowego do probówki o pojemności 5 ml.
   1. Używając pipety o pojemności 200 μl, bardzo powoli dodać 200 μl następnego gęstego rozcieńczenia gradientowego na wierzch warstwy w probówce, aby nie mieszać granicy faz. Dodaj kolejne 200 μl, a następnie końcowe 600 μl. Dodanie wielu mniejszych objętości daje większą kontrolę nad szybkością pipetowania i zapobiega mieszaniu się międzyfazy. Jeśli interfejs się miesza, odrzuć i zacznij od nowa.
   2. Powtórzyć krok 7.1.1 z trzecim, najmniej gęstym stężeniem gradientu, jeżeli stosowane są trzy rozcieńczenia. Probówka powinna teraz mieć nachylenie 2 ml lub 3 ml, w zależności od wyników z kroku 2.2.3.
   3. Przejdź do kroku 5 protokołu, aby dodać komórki i kontynuować eksperyment.

8. Pomiar ilości kapsułki za pomocą testu kwasu uronowego

1. Dostosować OD₆₀₀ każdej odzyskanej frakcji do 4,0 przez rozcieńczenie PBS. Kontynuuj kwantyfikację kwasów uronowych zgodnie z wcześniejszymi publikacjami¹.

Results

Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 2. Dokładny wynik, którego można się spodziewać, będzie zależał od gatunku bakterii, ustawienia gradientów gęstości oraz od tego, czy użytkownik bada pojedynczy szczep, czy pulę mutantów. Większość szczepów migruje do jednego miejsca w gradiencie, jak pokazano na Rysunek 2A i 2D. Zastosowanie tej metody do biblioteki mutantów bakteryjnych spowoduje powstanie głównego pasma powyżej gradientu, mniej gęstego pasma rozmieszczonego w najwyższej warstwie gradientu i mniejszej frakcji beztorebkowej na dole (Rysunek 2B). Frakcje te różnią się ilością kapsułek, jak pokazano w teście dla kwasów uronowych (Rysunek 2B). Sekwencjonowanie insercji transpozonów poszczególnych frakcji powoduje wyraźną lokalizację specyficznych mutantów w różnych frakcjach gradientowych, jak pokazano dla locus biosyntezy kapsułki K. pneumoniae ATCC43816 (Rysunek 2C). Reprezentatywne wyniki dla czystych kultur K. pneumoniae NTUH-K2044 i S. pneumoniae oraz różnych mutantów biosyntezy kapsułek lub regulatorów przedstawiono w Rysunek 2D.

Rysunek 1: Schemat metody wirowania gęstości do separacji bakterii na podstawie kapsułki i jej zastosowań. (A) Obraz z mikroskopii elektronowej kapsułkowanej komórki Klebsiella pneumoniae. Kapsułka jest widoczna jako gęsta warstwa na zewnątrz komórki. (B) Zastosowania wirowania gęstości do badania bakterii w kapsułkach. (Bi) Separacja gęstości może być wykorzystana do wygenerowania frakcji o wysokiej, niskiej i bezkapsułkowej bibliotece mutantów transpozonów, a następnie sekwencjonowania insercji transpozonów w celu zdefiniowania genów wpływających na produkcję kapsułek. (Bii) Oczyszczanie bakterii w kapsułkach ze złożonej próbki. (biii) Zastosowanie separacji opartej na gęstości do szybkiego porównywania ilości kapsułek między próbkami. Metoda ta pozwala również na wizualizację produkcji heterogenicznych kapsułek w populacjach bakterii, jak pokazano w (Biii). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki. (A) Przykład wyników z testów mini-gradientowych. Dwa różne szczepy K. pneumoniae odwirowano na 1 ml pożywki o gradiencie gęstości 15%. Nadśluzówkowy szczep NTUH-K2044 jest zatrzymywany powyżej warstwy ośrodka gradientu gęstości, podczas gdy ATCC43816 (co daje mniej kapsułki) migruje na dno warstwy. (Bi) Użycie gradientu gęstości do rozdzielenia biblioteki mutantów transpozonów na trzy frakcje. Zwróć uwagę, że dolna frakcja zawiera niewielki odsetek mutantów i nie jest widoczna na tym zdjęciu. (Bii) Walidacja różnych ilości kapsułek w górnej, środkowej i dolnej frakcji przy użyciu testu na kwasy uronowe. Komórki z górnej, środkowej i wyrosłej dolnej frakcji wyizolowano i ponownie zawieszono w PBS do OD₆₀₀ 4, następnie wyekstrahowano polisacharydy w kapsułkach i zmierzono kwasy uronowe¹. (C) Przykładowe wyniki pomiaru gęstości-TraDISort. Zidentyfikowane lokalizacje mutacji są pokazane niebieskimi liniami nad diagramem chromosomów. Mutanty pozbawione kapsułki można zidentyfikować jako te, które są obecne w bibliotece wejściowej, ale są zubożone w górnej frakcji, podczas gdy są wzbogacane w dolną frakcję, jak pokazano tutaj dla locus⁸ biosyntezy kapsułki. (D) Przykład użycia wirowania w gradimencie gęstości do porównania ilości kapsułek między dzikimi i zmutowanymi szczepami K. pneumoniae NTUH-K2044 i S. pneumoniae 23F. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Kapsułka jest ważnym czynnikiem wirulencji u wielu gatunków bakterii, w tym K. pneumoniae³, Streptococcus pneumoniae⁹, Acinetobacter¹⁰ i Neisseria¹¹ . Chociaż istnieją różne metody kwantyfikacji i wizualizacji kapsułek bakteryjnych, obecnie nie ma powszechnie stosowanej metody fizycznego oddzielania komórek otoczkowanych i niekapsułkowanych. W tym artykule zademonstrowaliśmy solidną metodę separacji populacji bakterii na podstawie kapsułek, z wieloma potencjalnymi zastosowaniami w połączeniu z różnymi protokołami upstream lub downstream.

Obecność kapsułki powierzchniowej może zmniejszyć gęstość komórek bakteryjnych, co umożliwia separację przez wirowanie w gradiacji gęstości (ryc. 2D). Zwalidowaliśmy tę metodę u K. pneumoniae NTUH-K2044¹² i ATCC43816¹³, a także u Streptococcus pneumoniae 23F¹⁴ i jego mutanta Δcps ¹⁵. W tej metodzie wykorzystuje się Percoll¹⁶ jako główny składnik gradientu gęstości, który jest zawiesiną powlekanych cząstek krzemionki koloidalnej, która ma niską lepkość i nie jest toksyczna dla bakterii - w zasadzie do wyznaczenia gradientu gęstości można zastosować inne substancje spełniające te kryteria.

Zapewnienie, że warstwy o różnej gęstości nie mieszają się podczas konstruowania gradientów gęstości, może być trudne, a jeśli dojdzie do mieszania, metoda separacji nie da czystych wyników. Uwzględniliśmy dwie alternatywne metody nalewania gradientów, za pomocą igły lub pipety - obie są skuteczne, a to, którą metodę zastosować, jest po prostu kwestią preferencji. W przypadku wszystkich etapów, które obejmują pipetowanie substancji (zawiesiny bakteryjnej lub bardziej rozcieńczonej warstwy gradientu) powyżej warstwy gradientowej, pipetowanie wielu porcji o mniejszych objętościach może ułatwić uzyskanie ostrej granicy faz bez mieszania warstw.

Ograniczeniem tego protokołu jest to, że nie można zagwarantować jego działania z innymi gatunkami bakterii. Dlatego tak ważne jest, aby podczas badania nowego gatunku lub szczepu bakterii zweryfikować separację na podstawie gęstości przy użyciu dodatkowej, niezależnej metody kwantyfikacji kapsułek. Wizualizacja bakterii obecnych w każdej frakcji za pomocą mikroskopii z odpowiednimi barwnikami na kapsułkach jest niezawodną metodą, dla której dostępne są szczegółowe protokoły¹⁷. Alternatywnie, kapsułki zawierające kwasy uronowe (takie jak Escherichia coli i K. pneumoniae) można określić ilościowo za pomocą specjalnego testu, jak pokazano na rysunku 2B¹. Test lepkości śluzowej oparty na wirowaniu nie nadaje się jako niezależna metoda walidacji, ponieważ test ten zależy również od gęstości komórek bakteryjnych.

Innym ograniczeniem tej metody jest to, że produkcja kapsułek jest bardzo wrażliwa na warunki hodowli i nawet niewielkie zmiany pożywki, temperatury lub napowietrzenia mogą wpłynąć na wyniki tego testu. Aby zminimalizować ten problem, badacze mogą użyć zdefiniowanej pożywki wzrostowej lub złożonej pożywki spójnej z partią, zachować identyczność wszystkich innych parametrów wzrostu między eksperymentami i uwzględnić odpowiednie szczepy kontrolne, aby umożliwić interpretację nieoczekiwanych wyników. Niektóre kapsułki bakteryjne są delikatne i mogą odciąć się od komórki podczas pipetowania kultur. Aby uniknąć ścinania kapsułek, kultury należy odwirować i ponownie zawiesić nie więcej niż dwa razy podczas przygotowania do załadunku na gradiacji. Jeśli utrata torebki podczas koncentracji kultur pozostaje problematyczna, kultury bakteryjne można zastosować bezpośrednio do gradientu gęstości, dodając większą objętość zawiesiny bakteryjnej, jeśli to konieczne w celu wizualizacji.

Przyszłe zastosowania tej metody polegają na zastosowaniu jej do innych gatunków bakterii i wykorzystaniu tej separacji w połączeniu z różnymi technologiami poprzedzającymi i następczymi. Oprócz gęstości-TraDISort⁸ sugerujemy, że separacja w gradinie gęstości bakterii otoczkowanych może być stosowana do izolacji mutantów ze zmienioną kapsułką, do oczyszczania otoczkowanych komórek z mieszanych kultur lub złożonych próbek oraz do szybkiego profilowania produkcji kapsułek w wielu szczepach. Wreszcie, technologia ta może być wykorzystana do badania innych fenotypów bakteryjnych, takich jak agregacja.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Wirówka 5810R z wirnikiem A-4-81 i wiadrami 500 ml	Eppendorf	5810 718.007
Adaptery do probówek 15 ml	Eppendorf	5810 722.004
Stały wirnik andgle F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
Adapter probówek 2,6 do 7 ml	Eppendorf	5804 739.000
Wirówka 5424 z wirnikiem FA-45-24-11	Eppendorf	5424 000.460
Probówki 2 ml	Eppendorf	0030 120.094
Probówki 1,5 ml	Eppendorf	0030 120.086
5 mL polipropylenowa rurka z okrągłym dnem	Falcon	352063
1 mL jednorazowa strzykawka Luer slip	Becton Dickinson	300013
Igła AGANI 21G Zielona x 1,5"	Terumo	AN 2138R1
P1000 pipeta i końcówki
Pipeta i końcówki