Method Article

Wizualizacja struktury 3D białej tkanki tłuszczowej za pomocą barwienia całościowego

DOI:

10.3791/58683

⸱

November 17th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine Program, The Hospital for Sick Children, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Neurosciences & Mental Health Program, The Hospital for Sick Children, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, Smart-Aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 5Banting and Best Diabetes Centre, University of Toronto

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedmiotem niniejszego badania jest zademonstrowanie techniki barwienia immunologicznego i wizualizacji jako idealnej metody do obrazowania 3D architektury tkanki tłuszczowej i komponentu komórkowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka tłuszczowa jest ważnym organem metabolicznym o wysokiej plastyczności i reaguje na bodźce środowiskowe oraz stan odżywczy. W związku z tym opracowano różne techniki badania morfologii i biologii tkanki tłuszczowej. Jednak konwencjonalne metody wizualizacji ograniczają się do badania tkanki w przekrojach 2D, nie udaje im się uchwycić architektury 3D całego narządu. W tym miejscu przedstawiamy barwienie całościowe, metodę immunohistochemiczną, która zachowuje nienaruszoną morfologię tkanki tłuszczowej przy minimalnych etapach przetwarzania. Dzięki temu struktury adipocytów i innych składników komórkowych są utrzymywane bez zniekształceń, uzyskując najbardziej reprezentatywną wizualizację 3D tkanki. Ponadto barwienie całego mocowania można połączyć z metodami śledzenia linii w celu określenia decyzji dotyczących losu komórki. Technika ta ma jednak pewne ograniczenia w dostarczaniu dokładnych informacji dotyczących głębszych partii tkanki tłuszczowej. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, barwienie całościowe można dodatkowo połączyć z technikami oczyszczania tkanek w celu usunięcia zmętnienia tkanki i umożliwienia pełnej wizualizacji całej anatomii tkanki tłuszczowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszem świetlnym. Dzięki połączeniu tych technik można uzyskać wyższą rozdzielczość i dokładniejsze odwzorowanie struktur tkanki tłuszczowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka tłuszczowa jest niezbędnym organem do magazynowania energii i charakteryzuje się dynamicznym przekształcaniem oraz niemal nieograniczoną ekspansją1. Oprócz homeostazy energetycznej, tkanka tłuszczowa odgrywa również istotną rolę w wydzielaniu hormonów ponad 50 adipokin, które modulują funkcje metaboliczne całego ciała2. Tkanka tłuszczowa ma zróżnicowaną architekturę składającą się z różnych typów komórek, w tym dojrzałych adipocytów, fibroblastów, komórek śródbłonka, komórek odpornościowych i komórek progenitorowych adipocytów3. Ostatnie badania wykazały, że otyłość i inne dysfunkcje metaboliczne mogą znacząco zmienić funkcję tkanki tłuszczowej i jej mikrośrodowiska, co obejmuje między innymi powiększenie adipocytów, infiltrację komórek zapalnych (np. makrofagów) i dysfunkcję naczyń krwionośnych3.

Konwencjonalne techniki morfologiczne, takie jak histologia i kriosekcja, wykazują kilka ograniczeń w badaniu biologii tkanki tłuszczowej, takich jak długie etapy chemicznego przetwarzania, które mogą prowadzić do kurczenia się tkanek i zniekształceń struktury3,4. Co więcej, te techniki 2D są niewystarczające do obserwacji interakcji międzykomórkowych wywieranych przez różne typy komórek, ponieważ uzyskane skrawki są ograniczone do mniejszych obszarów całej tkanki3. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami obrazowania fluorescencyjnego, barwienie w całości nie wymaga dodatkowych inwazyjnych etapów, takich jak osadzanie, cięcie i odwodnienie; W ten sposób pozwala uniknąć problemu zmniejszającej się swoistości przeciwciał. W związku z tym jest to prosta i skuteczna metoda obrazowania tkanki tłuszczowej, z lepszym zachowaniem morfologii adipocytów i ogólnej struktury tkanki tłuszczowej5. W związku z tym, aby zachować architekturę 3D tkanki tłuszczowej, ustalono barwienie całego mocowania jako szybką i niedrogą technikę znakowania immunologicznego w celu zachowania architektury 3D tkanki tłuszczowej1,6,"xref">8.

Jednakże, pomimo zachowania morfologii tkanki tłuszczowej za pomocą barwienia całościowego, technika ta nadal nie jest w stanie uwidocznić wewnętrznych struktur pod powierzchnią lipidową tkanki. Kilka ostatnich badań9,10 opracowało techniki oczyszczania tkanek w połączeniu z immunoznakowaniem całego wierzchowania1,6, aby umożliwić kompleksową wizualizację 3D w tkance tłuszczowej. W szczególności w ostatnich badaniach zwizualizowano gęste sieci neuronowe i naczyniowe9,10,11,12 z obrazowaniem objętościowym 3D. Rzeczywiście, badanie plastyczności neuronalnej i naczyniowej tkanki tłuszczowej w różnych warunkach fizjologicznych jest niezbędne do zbadania jej biologii. Trójwymiarowe obrazowanie narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem (iDISCO+) z obsługą znakowania immunologicznego to proces składający się ze wstępnej obróbki metanolem, immunoznakowania i oczyszczania zmętnienia tkanek za pomocą organicznych odczynników chemicznych dichlorometanu (DCM) i eteru dibenzylowego (DBE)13,14. Dzięki temu, że tkanka tłuszczowa jest całkowicie przezroczysta, można uzyskać dokładniejsze odwzorowanie anatomii w tkance, takiej jak naczynia krwionośne i włókna nerwowe9,10. IDISCO+ ma tę zaletę, że jest kompatybilny z różnymi przeciwciałami i fluorescencyjnymi reporterami11,14, i wykazał sukces w wielu narządach, a nawet zarodkach14. Jednak jego głównym ograniczeniem jest długi czas inkubacji, w którym do zakończenia całego eksperymentu potrzeba od 18 do 20 dni.

Innym ważnym zastosowaniem barwienia całego wierzchowca jest wizualizacja losu komórki w połączeniu z systemem śledzenia linii. Śledzenie linii to oznaczanie określonego genu/markera w komórce, który może być przekazywany do wszystkich komórek potomnych i jest zachowany w czasie15. W związku z tym jest to potężne narzędzie, które można wykorzystać do określenia losu potomstwa komórki15. Od lat dziewięćdziesiątych XX wieku system rekombinowany Cre-LoxP stał się potężnym podejściem do śledzenia linii w organizmach żywych15. Kiedy linia myszy, która wyraża Cre, enzym rekombinazy DNA, jest krzyżowana z inną linią myszy wyrażającą reporter, który sąsiaduje z sekwencją loxP-STOP-loxP, białko reporterowe ulega ekspresji15.

Do barwienia całego montażu, użycie fluorescencyjnych wielokolorowych reporterów jest odpowiednie do obrazowania tkanki tłuszczowej, ponieważ pozwala na minimalną ingerencję w wewnątrzkomórkową aktywność adipocytów16. Jednak tradycyjne reportery zazwyczaj barwią cytoplazmę, co utrudnia prześledzenie linii białych adipocytów, które mają ograniczoną zawartość cytoplazmatyczną17. Aby przezwyciężyć ten problem, idealnym narzędziem jest zastosowanie fluorescencyjnego markera reporterowego tdTomato/membranowego eGFP (mT/mG) związanego z membraną. TdTomato ukierunkowany na błonę ulega ekspresji w komórkach Cre-ujemnych18. Po wycięciu Cre następuje przełączenie na ekspresję eGFP ukierunkowanego na błonę, dzięki czemu ten reporter nadaje się do śledzenia linii progenitorów adipocytów17,18 (Rysunek uzupełniający 1).

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego protokołu barwienia całego montażu i pokazanie, jak można go połączyć z innymi technikami do badania rozwoju i fizjologii tkanki tłuszczowej. Dwa przykłady zastosowań opisanych w tym protokole to jego użycie z 1) wielokolorowymi liniami myszy reporterowej w celu identyfikacji różnych pochodzenia adipocytów oraz 2) oczyszczaniem tkanek w celu dalszej wizualizacji arboryzacji neuronalnej w białej tkance tłuszczowej (WAT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Centrum Fenogenomiki (TCP) zgodnie ze standardami Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Myszy utrzymywano w 12-godzinnych cyklach światła/ciemności i zapewniono im swobodny dostęp do wody i pożywienia. 7-miesięczne samce myszy C57BL/6J wykorzystano w eksperymencie barwienia całego wierzchowca.

UWAGA: Sekcje od 1 do 2 są w porządku chronologicznym, a sekcja 3 jest opcjonalnym krokiem zaraz po sekcji 1. Sekcja 4 może być wykonana w celu analizy wielkości adipocytów i gęstości naczyń krwionośnych po zakończeniu sekcji 2.

1. Przygotowanie materiałów i izolacja tkanek

  1. Przygotuj świeży 1% paraformaldehyd (PFA) rozcieńczony w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do utrwalenia tkanek. Przygotować 0,3% niejonowy środek powierzchniowo czynny rozcieńczony w 1x PBS (zwanym dalej PBS-0,3T) do kolejnych etapów płukania tkanek.
    UWAGA: Dla każdej tkanki przygotuj około 1,5 ml 1% PFA, aby zapewnić całkowite zanurzenie. Objętość fiksacji może być zwiększona lub zmniejszona w zależności od wielkości tkanki.
    UWAGA: Ten krok jest niebezpieczny, ponieważ PFA jest i toksyczny. Nosić środki ochrony osobistej (np. rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, obuwie, okulary ochronne) i uchwyt w okapie.
  2. Eutanazja zwierząt zgodnie z zatwierdzoną procedurą (np. zwichnięcie szyjki macicy i/lub uduszenie dwutlenkiem węgla). Bezzwłocznie przeprowadź sekcję pożądanych magazynów tkanki tłuszczowej (np. pachwinowej białej tkanki tłuszczowej lub perigonad białej tkanki tłuszczowej)18.
  3. Nożyczkami preparacyjnymi pokrój tkankę na szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm2 na kawałki o wielkości około 0,5–1 cm i zanurz je w probówkach do mikrowirówek wypełnionych 1% PFA. Trzymaj na lodzie.

2. Całkowite zabarwienie białej tkanki tłuszczowej

  1. Po zakończeniu sekcji przenieś próbki tkanek w 1% PFA z lodu do temperatury pokojowej (RT) na 1 godzinę, a następnie przenieś tkanki na 12- lub 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej w celu szybszego mycia.
  2. Umyj chusteczki PBS-0,3T, 3 razy po 5 minut w RT na wytrząsarce nachylonej pod kątem 22°, z prędkością 20–25 przechyłów na minutę.
    UWAGA: Użyj tego nachylenia i prędkości do wszystkich kolejnych kroków wymagających użycia wytrząsarki.
    UWAGA: Jeśli używasz wielokolorowej linii myszy reporterowej, takiej jak mT/mG, a dodatkowe barwienie przeciwciałami nie jest potrzebne, tkanka jest gotowa do mikroskopii po kroku 2.2.
  3. Dodać 0,5–1 ml buforu blokującego (5% surowicy zwierzęcej rozcieńczonej w PBS-0,3T). Umieścić płytkę na wytrząsarce i inkubować przez 1 godzinę w suchej masce.
  4. Odessać roztwór blokujący i dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w PBS-0,3T z 1% surowicą zwierzęcą.
  5. Umieścić talerz na shakerze w temperaturze 4 °C przez noc.
  6. Następnego dnia umyj chusteczki PBS-0,3T 3 razy po 5 minut w RT.
  7. Stosować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w PBS-0,3T. Dodaj 0,5-1 ml roztworów przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. Zawiń płytkę w folię aluminiową i inkubuj ją na wytrząsarce przez 1 godzinę w temperaturze RT.
    UWAGA: Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu.
  8. Po wtórnej inkubacji przeciwciał przemyć PBS-0,3T dwukrotnie przez 5 minut, każdy w RT. Zobrazuj próbki, jeśli neutralne barwienie lipidowe nie jest pożądane. Jeśli potrzebna jest wizualizacja kropelek lipidów za pomocą neutralnego barwnika lipidowego, przemyj 1x PBS (bez niejonowego środka powierzchniowo czynnego) dwukrotnie po 5 minut.
  9. Po etapach mycia inkubować z obojętnym barwnikiem lipidowym rozcieńczonym współczynnikiem rozcieńczenia 1:1500 w 1x PBS przez 30 minut w RT. Tkanki są teraz gotowe do mikroskopii. Do przyszłego obrazowania tkanki można przechowywać w tym roztworze w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Jakość obrazowania pogarsza się z czasem; Dlatego najlepszy czas na obrazowanie to 1 lub 2 dni.
  10. Za pomocą kleszczy połóż tkankę płasko na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 x 60 mm² i umieść ją na systemie odwróconego konfokalnego mikroskopu laserowego.
  11. Jeśli pożądane jest barwienie jąder DAPI, dodaj 1-2 krople podłoża montażowego zawierającego DAPI, aby całkowicie zanurzyć tkankę i zapobiec jej wyschnięciu.
  12. Aby uzyskać obrazy całych zabarwionych tkanek w wielu płaszczyznach ogniskowych, należy wykonać stosy Z o głębokości 100–150 μm z krokiem 4–6 μm przy żądanym powiększeniu.

3. Oczyszczanie tkanek i znakowanie immunologiczne za pomocą iDISCO+

UWAGA: Ten protokół jest oparty na wcześniej opublikowanych procedurach9,10,19.

  1. Utrwalanie i wstępna obróbka metanolem
    1. Inkubować tkanki w 4% PFA rozcieńczonym w 1x PBS w temperaturze 4°C przez noc w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml.
      UWAGA: Pozostaw tkanki w probówkach o pojemności 2 ml na wszystkie poniższe zabiegi do czasu obrazowania.
    2. Następnego dnia umyj chusteczki w 1x PBS trzy razy, po 1 godzinę każda na shakerze w RT.
      UWAGA: Ten etap może być punktem przerwy w pozostawieniu próbki na noc w temperaturze RT lub 4 °C.
    3. Odwodnić tkanki w temperaturze pokojowej w 20%, 40%, 60% i 80% metanolu, a następnie przez 1 godzinę każda. Odwodnić w 100% metanolu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, następnie przenieść tkanki do świeżego 100% metanolu i inkubować w temperaturze 4 C przez 1 h.
      UWAGA: Rozcieńczyć metanol w wodzie destylowanej. Podczas inkubacji metanolu nie ma potrzeby umieszczania próbek na wytrząsarce, o ile próbki tkanek są zanurzone.
      UWAGA: Ten krok jest niebezpieczny, ponieważ metanol jest toksyczny. Jest wysoce łatwopalny na otwartym ogniu. Nosić środki ochrony osobistej (np. rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne) i uchwyt w okapie oparowym. Metanol należy przechowywać z dala od zapłonu i w łatwopalnej szafie bezpieczeństwa.
    4. Wybielać tkanki 5% nadtlenkiem wodoru (H2O2; 1 objętość 30%H2O2rozcieńczony w 5 objętościach 100% metanolu) przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: 30% nadtlenek wodoru jest bardzo niebezpieczny w kontakcie ze skórą i oczami. Nosić środki ochrony osobistej (np. rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne) i uchwyt w okapie oparowym.
    5. Nawadniaj tkanki w temperaturze pokojowej w 80%, 60%, 40% i 20% metanolu i 1x PBS, a następnie przez 1 godzinę każda.
    6. Przemyć 0,2% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym rozcieńczonym w 1x PBS dwukrotnie, po 1 h każdy na wytrząsarce w temperaturze RT.
  2. Znakowanie immunologiczne
    UWAGA: Napełnij probówki o pojemności 2 ml zawierające tkankę do górnej części probówki roztworem stosowanym na każdym etapie, aby zapobiec utlenianiu tkanek, gdy tylko rozpocznie się znakowanie immunologiczne, aż do zakończenia oczyszczania.
    1. Przepuszczalność tkanek poprzez inkubację ich w roztworze 1x PBS, 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego, 20% dimetylosulfotlenku (DMSO) i 0,3 M glicyny w temperaturze 37 °C na inkubowanej wytrząsarce orbitalnej przez 2 dni.
      UWAGA: Maksymalny czas inkubacji dla etapu przepuszczalności w temperaturze 37 °C wynosi 2 dni.
    2. Zablokuj tkanki w roztworze 1x PBS, 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego, 10% DMSO, 5% surowicy osła i 1% bloku Fc w temperaturze 37 °C na inkubowanej wytrząsarce orbitalnej na stole przez 2 dni.
      UWAGA: Maksymalny czas inkubacji dla etapu blokowania wynosi 2 dni.
    3. Inkubować tkanki w badanych przeciwciałach pierwotnych w roztworze 1x PBS, 0,2% polisorbatu 20, 10 μg/ml heparyny, 5% DMSO i 5% surowicy osła w temperaturze 37 °C na inkubowanej wytrząsarce orbitalnej przez 4 dni.
    4. Przemyć 1x PBS, 0,2% polisorbatu 20 i 10 μg/ml heparyny na shakerze w temperaturze RT pięć razy, każdy przez 1 h.
      UWAGA: Ten krok może być punktem pauzy w celu pozostawienia próbek na noc w RT.
    5. Inkubować tkanki z przeciwciałem drugorzędowym w roztworze 1x PBS, 0,2% polisorbatu 20, 10 μg/ml heparyny i 5% surowicy osła w temperaturze 37 °C na stołowej wytrząsarce orbitalnej przez 4 dni.
      UWAGA: Od kroku 3.2.5 wszystkie próbki muszą być owinięte folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu przeciwciał wtórnych.
    6. Umyj tkanki w roztworze 1x PBS, 0,2% polisorbatu 20 i 10 μg/ml heparyny na wytrząsarce w RT pięć razy, po 2 godziny każdy.
      UWAGA: Ten krok może być punktem przerwy w pozostawieniu próbek na noc w temperaturze pokojowej.
  3. Oczyszczanie tkanek z białej tkanki tłuszczowej i obrazowanie objętościowe
    1. Odwodnić tkanki zawarte w probówkach o pojemności 2 ml, inkubując je w 20%, 40%, 60% i 80% metanolu, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dwukrotnie odwodnić próbki w 100% metanolu w temperaturze RT.
      UWAGA: Ten krok może być punktem przerwy, aby pozostawić próbki w 100% metanolu na noc w temperaturze pokojowej.
    2. Inkubować tkanki z mieszaniną 2 objętości DCM i 1 objętości metanolu przez 3 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
      UWAGA: DCM jest niestabilny. Upewnij się, że rurki są szczelnie zamknięte, aby zapobiec parowaniu.
      UWAGA: Ten krok jest niebezpieczny. DCM jest toksyczny w następstwie wdychania. Długotrwałe narażenie może potencjalnie spowodować oparzenia chemiczne. Nosić środki ochrony osobistej (np. rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, obuwie, okulary ochronne). Użyj dygestorium.
    3. Inkubować tkanki w 100% DCM dwukrotnie, po 15 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
    4. Inkubować w 100% DBE w RT do czasu obrazowania i przechowywania próbki. Przed obrazowaniem należy kilkakrotnie odwrócić probówki, aby wymieszać roztwory.
      UWAGA: Całkowicie napełnij probówki DBE, aby zapobiec utlenianiu, które może spowodować nieudane usunięcie tkanek. Nie potrząsać probówkami podczas inkubacji DBE.
      UWAGA: Ten krok jest niebezpieczny. DBE jest toksyczny. Może powodować podrażnienie oczu i skóry. Nosić środki ochrony osobistej (np. rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne) i uchwyt w okapie oparowym.
    5. Zobrazuj całą próbkę tkanki za pomocą mikroskopu świetlnego, który odpowiada współczynnikowi załamania światła rozpuszczalnika organicznego DBE. Wykonaj układanie w stos Z w pożądanym powiększeniu i rozmiarze kroku dla całej tkanki.

4. Przykłady analizy danych z obrazów tkanek barwionych w całości za pomocą ImageJ

UWAGA: Zobacz https://imageJ.nih.gov/ij/download.html, aby uzyskać instrukcje pobierania i instalacji.

  1. Kwantyfikacja gęstości naczyń krwionośnych (rysunek uzupełniający 2)
    1. Zaimportuj zapisane obrazy tylko kanału z immunologicznym barwieniem naczyń krwionośnych do ImageJ.
      UWAGA: Obrazy do oceny ilościowej powinny być spójne pod względem procedury barwienia i warunków akwizycji obrazu. Należy użyć identycznych odczynników. Czas naświetlania, intensywność i powiększenie powinny być również równoważne w procesie obrazowania20.
    2. Przekonwertuj kolor obrazu na czarno-biały, aby określić ilościowo gęstość naczyń krwionośnych. Aby to zrobić, w zakładce "Obraz" wybierz polecenie "Dostosuj", a następnie opcję "Próg koloru". W polu wyświetlania "Kolor progu" wybierz "Ciemne tło"20 i wybierz "B&W" w sekcji "Kolor progu".
    3. Aby zmierzyć procentowy udział obszaru sygnału naczynia krwionośnego na tle tła, wybierz zakładkę "Analizuj", a następnie polecenie "Analizuj cząstki". Pod wyświetleniem "Analizowane cząstki" wybierz opcje "Wyczyść wyniki" i "Podsumuj". Kliknij "OK".
    4. Skopiuj i wklej wartość obszaru procentowego na karcie podsumowania do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy. Procent powierzchni będzie wskazywał gęstość naczyń krwionośnych. Powtórz kroki 4.3.1–4.3.4 dla każdego obrazu z osobna.
  2. Kwantyfikacja wielkości adipocytów21 (Rysunek uzupełniający 3)
    1. Zaimportuj zapisane obrazy adipocytów do ImageJ.
    2. Aby ustawić skalę obrazu, zmierz długość skali w pikselach, śledząc linię do skali o znanej odległości na obrazie za pomocą narzędzia do zaznaczania linii prostej. Na karcie "Analizuj" wybierz polecenie "Ustaw skalę". Odległość linii, która została wcześniej prześledzona, zostanie automatycznie obliczona w pikselach.
    3. Pojawi się okno wyświetlania "Ustaw skalę". Wprowadź znaną odległość i jednostkę długości. Wybierz "Globalny", aby zastosować ustawienie skali dla wszystkich importowanych obrazów i kliknij "OK".
    4. Aby wybrać obszar jako metodę pomiaru, w zakładce "Analizuj" wybierz polecenie "Ustaw pomiary". Pojawi się lista różnych opcji pomiarów. Wybierz opcję "Obszar" i kliknij "OK".
    5. Korzystając z narzędzia do zaznaczania odręcznego, prześledź obwód każdego interesującego adipocytu. W zakładce "Analizuj" wybierz polecenie "Zmierz (Ctrl + M)", a pojawi się obszar adipocytu. Powtórz tę procedurę dla innych adipocytów na obrazie.
      UWAGA: Aby zapewnić dokładne pomiary, użyj wielu obrazów do oceny ilościowej.
    6. Skopiuj i wklej pomiary powierzchni do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy danych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na kruchość tkanki tłuszczowej, metody obejmujące wiele etapów przetwarzania i sekcji mogą prowadzić do zniekształcenia morfologii tkanki tłuszczowej3 (Rysunek 1A). Jednak barwienie całością może zachować morfologię adipocytów, zapewniając dokładną interpretację wyników (Ryc. 1B).

Nadmierne utrwalenie tkanki tłuszczowej prowadzi do autofluorescencji wywołanej utrwalaczem. Jak pokazano na

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż konwencjonalne techniki, takie jak histologia i kriosekcja, oferują korzyści w obserwacji struktury wewnątrzkomórkowej, barwienie całościowe zapewnia inną perspektywę w badaniach tkanki tłuszczowej, co umożliwia wizualizację 3D architektury komórkowej minimalnie przetworzonej tkanki.

Aby skutecznie przeprowadzić barwienie całego montażu, należy wziąć pod uwagę następujące sugestie. Różne magazyny tkanki tłuszczowej mogą dawać różne wyniki barwienia immunologicznego; W związku z tym w p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantów z Rady Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC) z Kanady, Grant Pilotażowy i Studium Wykonalności Banting & Best Diabetes Centre (BBDC), SickKids Start-up Fund dla H-K.S., Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) przez National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT, i Planowanie Przyszłości do J-R.K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LipidToxLife TechnologiesH34477
Przeciwciało pierwszorzędowe PECAM-1 Przeciwciało pierwszorzędoweMilliporeMAB1398Z(CH)
TH (hydroksylaza tyrozyny)MilliporeAB152, AB1542
Barwienie DAPIBD Pharmingen564907
Mikroskop konfokalny Nikon A1RMikroskop konfokalnyNikon
Ultramikroskop ILaVision BioTecObraz obrazu arkusza świetlnego mikroskop fluorescencyjny
Alexa Fluor Przeciwciała drugorzędoweJackson ImmunoResearchDługości fal 488, 594 i 647
Oczyszczone szczurze anty-mysie CD16 / CD32BioSciences553141
DichlorometanSigma-Aldrich270997
Eter dibenzylowySigma-Aldrich33630
MetanolFisher ChemicalA452-1
30% Nadtlenek wodoruBIO BASIC CANADA INCHC4060
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650
GlicynaSigma-AldrichJ7126
HeparynaSigma-AldrichH3393
Zestaw lektyny I, fluoresceina oznaczonejako VECTOR LABORATORIESFLK-2100
F4/80Bio-RadMCA497GA
VECTASHIELD Twarde podłoże montażowe z DAPIVECTOR LABORATORIESH-1500
Bufor fosforanowy (PFA)
Triton-X
Surowica zwierzęca (koza, osioł)
używane z solą fizjologiczną (PBS) Tween

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
  2. Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
  3. Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
  4. Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
  5. Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
  6. Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
  7. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
  8. Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
  9. Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
  10. Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
  11. Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
  12. Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
  13. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
  16. Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
  17. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  19. Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
  20. Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
  21. Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
  22. Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
  23. Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
  24. UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
  25. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
  26. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002(2018).
  27. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Whole mount StainingAdipose Tissue3D VisualizationTissue ClearingConfocal MicroscopyImmunohistochemistryAdipocyte MorphologyBlood Vessel DensityLight sheet MicroscopyZ stack Imaging

Related Articles