Artykuł metodologiczny

System BW Reporter do badania oddziaływań receptor-ligand

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58685

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Hematology, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 2The Lautenberg Center for General and Tumor Immunology, Department of Immunology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel Canada (IMRIC), Hadassah - Hebrew University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak ustanowić system reporterowy, który może być używany do identyfikacji i ilościowego określania interakcji receptor-ligand.

Streszczenie

Interakcje między receptorami i ligandami stanowią podstawowy proces biologiczny. Jednak bezpośrednie eksperymenty z komórkami, które wyrażają natywny receptor i ligand, są trudne, ponieważ ligand określonego receptora może być nieznany, a procedury eksperymentalne z natywnym ligandem mogą być technicznie skomplikowane. Aby rozwiązać te przeszkody, opisujemy system reporterowy do wykrywania wiązania i aktywacji określonego receptora przez ligand będący przedmiotem zainteresowania. W tym systemie reporterowym domena zewnątrzkomórkowa określonego receptora jest sprzężona z mysim CD3ζ, a następnie to chimeryczne białko ulega ekspresji w mysich komórkach BW. Te transfekowane komórki BW mogą być następnie inkubowane z różnymi celami (np. komórkami lub przeciwciałami). Aktywacja transfekowanego receptora prowadzi do wydzielania mysiej interleukiny-2 (mIL-2), którą można wykryć za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Ten system reporterowy ma tę zaletę, że jest czuły i specyficzny dla pojedynczego receptora. Ponadto poziom aktywacji określonego receptora można łatwo określić ilościowo i można go stosować nawet w przypadkach, gdy ligand receptora jest nieznany. System ten został z powodzeniem wdrożony w wielu naszych badaniach w celu scharakteryzowania interakcji receptor-ligand. Niedawno wykorzystaliśmy ten system do badania aktywacji ludzkich receptorów Fcγ (FcγR) przez różne przeciwciała monoklonalne anty-CD20 w zastosowaniu klinicznym.

Wprowadzenie

System reporterowy BW to technika do badania interakcji receptor-ligand1. System ten jest szczególnie korzystny, gdy ligand określonego receptora jest nieznany lub eksperymenty z endogennym ligandem są technicznie trudne. Może być również stosowany do badania wiązania przeciwciał monoklonalnych z ludzkimi FcγR. Metoda opiera się na ekspresji białka chimerycznego w mysich komórkach BW. To chimeryczne białko składa się z zewnątrzkomórkowej domeny receptora będącego przedmiotem zainteresowania, połączonej z transbłonowymi i wewnątrzkomórkowymi domenami łańcucha ζ myszy. Wiązanie odpowiednich ligandów receptora prowadzi do wydzielania mysiej IL-2, które można łatwo wykryć za pomocą testu ELISA, jak pokazano na rycinie 1. Metoda ta jest czuła i specyficzna dla pojedynczego receptora, łatwa w obsłudze i wysoce odtwarzalna. Może zatem stanowić uzupełnienie dodatkowych narzędzi do badania oddziaływań receptor-ligand. Na przykład może być stosowany do badań przesiewowych kilku linii komórkowych pod kątem obecności liganda dla określonego receptora (nawet jeśli sam ligand nie został zidentyfikowany) lub do wykrywania aktywacji ludzkich FcγR przez przeciwciała monoklonalne lub przez ludzką surowicę zawierającą przeciwciała przeciwwirusowe. Chociaż pierwotne komórki odpornościowe wyrażają endogenne FcγR, są one na ogół trudne w obsłudze i zwykle wyrażają kilka receptorów Fc.

Z powodzeniem używaliśmy tego systemu w wielu naszych badaniach, aby scharakteryzować interakcje receptor-ligand. Obejmują one identyfikację hemaglutyniny jako liganda receptora komórek NK NKp462, identyfikację PVR i nektyny-2 jako ligandów dla ludzi i myszy TIGIT3,4, oraz pokazanie, że bakteria Fusobakteria Fusobacterium nucleatum wiąże i aktywuje ludzką TIGIT5. Ponadto komórki BW, które wyrażają receptory Fc, zostały z powodzeniem wykorzystane do wykrywania przeciwciał przeciwwirusowych w surowicy ssurowico6,7,8. W szczególności niedawno ustaliliśmy komórki BW, które wyrażają ludzkie FcγR w celu wykrycia różnicowej aktywacji FcR przeciwciał anty-CD20 stosowanych w leczeniu przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL)9. Co ważne, wyniki systemu reporterowego BW zostały zwalidowane w uzupełniających się eksperymentach.

Protokół

1. Generowanie plazmidu, który wyraża konstrukt chimeryczny

UWAGA: Celem jest wygenerowanie plazmidu, który wyraża zewnątrzkomórkową domenę interesującego nas receptora połączonego z domenami transbłonowymi i wewnątrzkomórkowymi mysiego łańcucha CD3ζ (Rysunek 2A).

  1. Pobierz sekwencję domeny zewnątrzkomórkowej receptora będącego przedmiotem zainteresowania, w tym peptydu sygnałowego. Uzyskać materiał DNA, który ma wyrażać ten receptor (np. cDNA lub plazmid).
  2. Uzyskaj materiał DNA, który wyraża domeny transbłonowe i wewnątrzkomórkowe mysiego łańcucha CD3ζ (np. cDNA lub plazmid).
  3. Zaprojektuj sekwencję białka fuzyjnego w oparciu o ogólną strukturę pokazaną na Rysunek 2A. Upewnij się, że cała sekwencja znajduje się w tej samej ramce odczytu kodonu. Sekwencja ta służy do zaprojektowania odpowiednich starterów i weryfikacji produktu końcowego.
  4. Zaprojektuj dwie reakcje PCR, aby amplifikować każdy z fragmentów białek fuzyjnych osobno (Rysunek 2B, 2C)10.
    UWAGA: Specyficzne warunki reakcji PCR (np. czas wydłużania i temperatura wyżarzania) zależą od charakteru starterów, które są przeznaczone dla określonego receptora.
    1. Wzmocnij zewnątrzkomórkowy segment receptora.
      1. Zaprojektuj 5-calowy starter, który zawiera część peptydu sygnałowego receptora, sekwencję konsensusu Kozaka i odpowiednie miejsce restrykcyjne (Rysunek 2B).
      2. Zaprojektuj 3' starter, który otacza obie części białka fuzyjnego (Rysunek 2B). Na przykład, dla początkowego projektu, ten starter 3' może zawierać ostatnie 20 par zasad segmentu zewnątrzkomórkowego receptora i pierwsze 9 par zasad segmentu CD3ζ.
        UWAGA: Nie ma potrzeby dodawania miejsca restrykcyjnego do startera 3', ponieważ ten starter będzie używany do generowania skondensowanej sekwencji i nie jest używany do ligacji.
    2. Wzmocnij segment CD3ζ.
      1. Zaprojektuj 5' starter, który otacza obie części białka fuzyjnego (Rysunek 2C). Na przykład w początkowym projekcie starter 5' może zawierać ostatnie 9 par zasad segmentu zewnątrzkomórkowego receptora i pierwsze 20 par zasad segmentu CD3ζ.
        UWAGA: Nie ma potrzeby dodawania miejsca restrykcyjnego do startera 5', ponieważ ten starter będzie używany do generowania stopionej sekwencji i nie jest używany do ligacji.
      2. Zaprojektuj 3' starter, który zawiera koniec sekwencji CD3ζ, a także odpowiednie miejsce restrykcyjne ( Rysunek 2C).
    3. Skoryguj sekwencje starterów w każdej z tych dwóch reakcji tak, aby temperatura wyżarzania była podobna w każdej parze (należy zauważyć, że starter, który zawiera sekwencje dwóch części białka fuzyjnego, wyżarza się tylko z częścią sekwencji w każdej reakcji).
  5. Wykonaj dodatkowy PCR, w którym mieszanina produktów PCR pierwszych dwóch reakcji jest używana jako matryca DNA ze starterem 5' segmentu receptora zewnątrzkomórkowego (krok 1.4.1.1) i 3' segmentu CD3ζ (krok 1.4.2.2) (Rysunek 2D)10. Ta reakcja powinna wygenerować końcową sekwencję fuzji.
  6. Postępuj jak zwykle w przypadku klonowania.
    1. Związać końcowy produkt PCR z docelowym wektorem cięcia (wektorem docelowym jest zwykle pcDNA3, który wyraża oporność na G418 i ampicylinę).
    2. Przekształć zligowany wektor w kompetentną bakterię11.
      1. Rozmrozić 50 μl kompetentnych bakterii na lodzie.
      2. Dodaj zligowany wektor do bakterii i inkubuj na lodzie przez 20 minut.
      3. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 45 s.
      4. Dodaj 200 μl LB bez antybiotyków.
      5. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, ciągle wytrząsając.
      6. Wysiewać nasiona na płytce LB z odpowiednimi antybiotykami (np. roztworem ampicyliny o końcowym stężeniu 0,1 mg/ml).
    3. Zbierz i wyhoduj kilka kolonii bakteryjnych w 5 ml LB (w probówkach 15 ml).
    4. Następnego dnia wyekstrahuj plazmidy za pomocą mini zestawu przygotowawczego.
    5. Przeanalizuj wstawkę genu za pomocą enzymów restrykcyjnych.
    6. Zsekwencjonuj odpowiednie kolonie i sprawdź, czy sekwencja i ramka odczytu są prawidłowe (jak wskazano w kroku 1.3).
  7. Przekształć zweryfikowany plazmid w kompetentną bakterię11.
    1. Rozmrozić 20 μl kompetentnych bakterii na lodzie.
    2. Dodać 1 μl plazmidu do bakterii i inkubować na lodzie przez 20 minut.
    3. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 45 s.
    4. Dodaj 200 μl LB bez antybiotyków.
    5. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, ciągle wytrząsając.
    6. Wysiew na płytce wzrostu bakterii z odpowiednimi antybiotykami (np. roztworem ampicyliny o końcowym stężeniu 0,1 mg/ml).
  8. Następnego dnia wyhoduj kolonię bakteryjną w dużym pojemniku LB z 0,1 mg / ml ampicyliny (~ 250 ml).
  9. Następnego dnia wykonaj maxi prep zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dostarczonymi przez zestaw.
    UWAGA: Do zabiegu elektroporacji wymagana jest duża ilość plazmidu, jak opisano poniżej.

2. Transfekcja plazmidu wyrażającego białko chimeryczne do komórek BW

UWAGA: Różne metody mogą być również stosowane do transfekcji (np. przez infekcję lentiwirusową). Przed elektroporacją należy przeprowadzić wytrącanie DNA etanolem, jak opisano poniżej. Kolejne kroki wymagają sterylnych warunków.

  1. Dzień wcześniej przygotuj ogniwa BW5147 ("ogniwa BW") do elektroporacji. Płytka 10 płytek (o długości 10 cm) z 10 ml 100 000 komórek/ml BW5147 (tj. łącznie 10 x 106 komórek) z RPMI uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 1% pirogronianem sodu, 1% L-glutaminą, 1% aminokwasami endogennymi i 1% penicyliną-streptomycyną ("kompletna pożywka").
  2. Umieść 100 μg plazmidu pcDNA3, który wyraża białko fuzyjne w probówce o pojemności 1,5-2 ml i dodaj do niego 3 M octan sodu o pH 5,3-5,5. Objętość octanu sodu powinna odpowiadać 0,1 (10%) objętości plazmidu o stężeniu 100 μg; miareczkować pH octanu sodu za pomocą pH-metru, dodając NaOH lub HCl.
  3. Dodać 2,5 objętości 100% etanolu do mieszaniny plazmidu i octanu sodu, jak opisano w kroku 2.2 (2,5x całkowita objętość plazmidu i octanu sodu). Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C lub przez 2 godziny w temperaturze 70 °C.
  4. 2.4. 24 godziny po pokryciu błon BW zebrać wszystkie komórki BW (~100 ml) w 2 probówkach o pojemności 50 ml. Odwirować komórki przez 5 minut przy 515 x g i odrzucić supernatant.
  5. Ponownie zawiesić osad z obu probówek w 25 ml RPMI- w pojedynczej probówce o pojemności 50 ml. Na przykład, ponownie zawiesić osad jednej probówki z 25 ml RPMI, a następnie użyć tego płynu do ponownego zawieszenia płynu w drugiej probówce o pojemności 50 ml, tak aby całkowita osadka z komórek BW została ponownie zawieszona w 25 ml pożywki w jednej probówce.
    UWAGA: Pożywka powinna być bez dodatków, ponieważ surowica może zakłócać elektroporację.
  6. Ponownie odwirować komórki przez 5 minut przy 515 x g. Ponownie zawiesić granulkę w 1 ml RPMI i przenieść zawartość do kuwety o średnicy 0,4 cm na lodzie.
  7. Odwirować plazmid, który został poddany wytrącaniu etanolu (etap 2.3) przez 30 minut w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C.
  8. Przemyć raz 1 ml 70% etanolu i odwirować przez kolejne 20 minut w temperaturze 16 000 x g i 4 °C (w celu wypłukania soli).
  9. Usunąć cały etanol i pozostawić osad do lekkiego wyschnięcia (tj. w otwartej probówce w kapturze do hodowli tkankowych). Ponownie zawiesić granulat ze 100 μL RPMI- uprzednio podgrzanym do 60 °C.
  10. Dodać ponownie zawieszony plazmid (krok 2.8) do komórek w kuwecie i inkubować przez 5 minut na lodzie.
  11. Elektroporuj ogniwa przy napięciu 0,23 kV, pojemności 250. Powinno to zająć ~4 ms.
  12. Przenieść elektroporowane ogniwa do probówki o pojemności 50 ml, dodać 50 ml kompletnej pożywki i wirować przez 5 minut przy 515 x g.
  13. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 ml kompletnej pożywki.
  14. Umieść elektroporowane komórki w 24-dołkowych szalkach hodowlanych (1 ml na studzienkę, w sumie ~50 dołków) i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.
  15. Wybrać transfekowane komórki antybiotykami. Po 48 godzinach dodać 1 ml kompletnej pożywki uzupełnionej 10 mg/ml G418 do każdej studzienki (na tym etapie końcowa objętość w każdym dołku wynosi 2 ml, a końcowe stężenie G418 w każdym dołku wynosi 5 mg/ml).
    UWAGA: Jeśli plazmid zawiera inną oporność na antybiotyki, przed tym krokiem określ stężenie antybiotyku wymagane do zabicia nietransfekowanych komórek BW.
  16. Co 48 godzin ostrożnie wyrzucaj 1 ml górnej objętości każdej studzienki, nie mieszając pożywki w studzience (komórki BW zwykle znajdują się na dnie studzienki). Dodać kompletną pożywkę uzupełnioną 5 mg/ml G418 do każdej studzienki, tak aby końcowa objętość w każdym dołku wynosiła ponownie 2 ml.
  17. Regularnie badaj płytki hodowlane pod kątem wzrostu komórek we wszystkich studzienkach.
    UWAGA: Zmiana koloru podłoża na żółty może pomóc w identyfikacji rosnących komórek; jednak na początku medium będzie żółte ze względu na sam G418. Zidentyfikuj dodatnie dołki (studzienki z rosnącymi komórkami). Studzienki te są odporne na G418 i dlatego oczekuje się, że będą wyrażać białko fuzyjne. Proces ten trwa zwykle ~3 tygodnie.

3. Weryfikacja ekspresji transfekowanego receptora w komórkach w dołkach dodatnich.

  1. Wybarwić transfekowane komórki BW specyficznym przeciwciałem przeciwko receptorowi, który został transfekowany.
  2. Porównaj poziom ekspresji receptora za pomocą cytometrii przepływowej z ekspresją komórek kontrolnych (nietransfekowane komórki BW).
  3. Po weryfikacji jednego lub więcej studzienek należy natychmiast użyć komórek do celów eksperymentalnych, wyhodować w kulturze lub zamrozić do przyszłych zastosowań.
  4. Sprawdź ekspresję transfekowanego receptora przed wykonaniem nowego eksperymentu. Po kilku tygodniach wzrostu komórki z G418 o stabilnej ekspresji receptora, G418, można pominąć w pożywce hodowlanej.

4. Inkubacja transfekowanych komórek BW z celami

UWAGA: Gdy po raz pierwszy używa się transfekowanych komórek BW, lepiej jest przetestować je na tarczach, które wyrażają znany ligand interesującego nas receptora lub na przeciwciałach związanych z płytką, które są skierowane przeciwko receptorowi będącemu przedmiotem zainteresowania (eksperymenty z sieciowaniem; patrz poniżej, sekcja 4.2.1.3).

  1. Najlepiej podzielić komórki BW na 24 godziny przed eksperymentem (na przykład dodając 10 ml kompletnej pożywki do 2 ml komórek w hodowli na nowej 10 cm płytce hodowlanej).
  2. Inkubować transfekowane komórki BW z ich celami. Przeprowadź eksperyment jednocześnie na kontrolnych komórkach BW, które wyrażają pusty wektor (lub rodzicielskie komórki BW). Preferowane są płyty 96F (ale można również użyć płyt 96U). Wykonaj eksperyment w trzech egzemplarzach. Zawieś wszystkie komórki w kompletnym podłożu.
    1. Przygotuj cele. Rodzaj celu różni się w zależności od celu i mogą to być komórki, komórki, które zostały wstępnie inkubowane z przeciwciałami lub same przeciwciała. System ten był również używany z bakteriami jako celami5.
      1. Jeśli cele dzielą komórki (tj. Linie komórkowe), napromieniuj je prądem 6,000 rad przed testem. Umieścić 50 000 komórek docelowych w jednym dołku na 96 płytkach (w objętości 100 μl).
      2. W przypadku eksperymentów z przeciwciałami i komórkami BW, które wyrażają ludzkie FcγR, należy inkubować komórki docelowe z przeciwciałem na lodzie na płytce 96-dołkowej (na przykład 50 μl komórek docelowych i 50 μl przeciwciała; można testować różne dawki przeciwciał).
      3. W przypadku stosowania samych przeciwciał jako celów (eksperymenty z sieciowaniem), powinny one być związane płytką. W tym celu należy najpierw inkubować przeciwciała w kompletnym podłożu na płytce 96F przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (typowa dawka początkowa to 0,5 μg swoistego przeciwciała w 50 μL). Umyć płytkę w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.
        UWAGA: W tym przypadku płytka 96F umożliwi związanie przeciwciała z płytką, co po dodaniu transfekowanych komórek BW doprowadzi do aktywacji transfekowanego receptora.
    2. Dodaj komórki BW (komórki efektorowe). Umieść 50 000 komórek BW w jednym dołku na 96 płytkach (w objętości 100 μl).
    3. W razie potrzeby uzupełnić objętość w każdym studzience do 200 μl.
    4. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin (ten czas można skalibrować).
  3. Po 48 godzinach zamrozić płytki w temperaturze -20°C i rozmrozić przed testem ELISA lub natychmiast użyć do testu ELISA (patrz następne kroki).

5. TEST ELISA

  1. Pokryj płytkę ELISA przeciwciałem anty-mysim IL-2 (anty-mIL-2). Umieścić 0,05 μg anty-mIL-2 w objętości 50 μL 1x PBS na studzienkę. Inkubować powlekaną płytkę ELISA z przeciwciałem anty-mIL-2 w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze 37 °C przez 2 godziny
    UWAGA: Aby przeprowadzić test ELISA bezpośrednio po etapie inkubacji, płytkę ELISA należy pokryć 24 godziny przed końcem okresu inkubacji komórek BW.
  2. Wyrzucić płyn z płytki ELISA i dodać roztwór blokujący (200 μl na studzienkę), który składa się z 1x PBS i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Inkubować płytkę ELISA przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Umyj płytkę ELISA trzykrotnie 0,05% roztworem PBS Tween (tj. 0,5 ml Tween-20 w 1 litrze 1x PBS).
  4. Wziąć płytkę 96, na której znajdują się komórki BW, które były inkubowane ze swoimi tarczami (4.3). Jeżeli płytka została zamrożona, należy ją całkowicie rozmrozić (np. przez krótką inkubację w temperaturze 37 °C). Odwirować 96 płytek (5 min, 515 x g) i ostrożnie przenieść 100 μl supernatantu z każdej studzienki na wstępnie pokrytą i zablokowaną płytkę ELISA.
    UWAGA: Supernatant należy pobrać z boków każdej studzienki, aby uniknąć pobierania komórek.
  5. W razie potrzeby dodaj rekombinowany mIL-2 o określonych stężeniach do jednego z pustych rzędów powlekanej płytki ELISA, aby wygenerować standardową krzywą mIL-2. Na przykład zacznij od stężenia mIL-2 wynoszącego 2,500 pg/ml, a następnie zmniejszaj o 50% w każdym kolejnym dołku; nie dodawać mIL-2 do ostatniej studzienki.
  6. Inkubować płytkę ELISA w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  7. Umyj płytkę ELISA czterokrotnie za pomocą PBS Tween.
  8. Dodaj biotynę anty-mysią IL-2 do płytki ELISA. Użyj stężenia 1 μg przeciwciała w 1 ml 1x PBS z 1% BSA i podziel na 100 μl na studzienkę.
  9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  10. Umyj płytkę ELISA sześć razy za pomocą PBS Tween.
  11. Dodaj streptawidynę sprzężoną z HRP. Użyj stężenia 1 μl streptawidyny w 1 ml PBSX1 z 1% BSA i podziel je na 100 μl na studzienkę.
  12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  13. Umyj płytkę ELISA sześć razy za pomocą PBS Tween.
  14. Dodać 100 μl roztworu substratu TMB na studzienkę. Zakończ ten etap szybko, aby zminimalizować różnice między studzienkami spowodowane opóźnieniami podczas dodawania TMB.
  15. Odczytaj płytkę ELISA za pomocą czytnika płytek ELISA przy 650 nm (odczyt można powtórzyć, jeśli sygnał jest słaby).

Wyniki

Rysunek 3 przedstawia wyniki eksperymentu z użyciem systemu reporterowego BW. W tym eksperymencie komórki CLL poddano preinkubacji z różnymi przeciwciałami anty-CD20 (rytuksymabem i obinutuzumabem), a następnie współinkubowano z transfekowanymi komórkami BW wykazującymi ekspresję CD16a-CD3ζ. Podobne eksperymenty przeprowadzono w naszym badaniu9. Rysunek 3A przedstawia obraz surowej płytki ELISA, gdzie intensywność koloru odpowiada stężeniu mIL-2. Eksperyment wykonano w trzech powtórzeniach. Eksperyment ten obejmował kilka kontroli: komórki CLL inkubowane z rodzicielskimi, nietransfekowanymi komórkami BW (górny rząd) oraz komórki CLL inkubowane z komórkami BW wykazującymi ekspresję CD16a-CD3ζ, ale bez przeciwciał lub z przeciwciałem kontrolnym (sześć dołków w drugim rzędzie po lewej stronie). Inkubacja komórek BW wykazujących ekspresję CD16 z komórkami CLL, które zostały poddane preinkubacji z przeciwciałami anty-CD20, wywołała znaczną sekrecję mIL-2 w porównaniu do poziomu mIL-2 w dołkach kontrolnych. Co istotne, preinkubacja komórek CLL z anty-CD20 obinutuzumabem aktywowała CD16 silniej niż rytuksymab, co jest znanym wynikiem, który został odwzorowany przez nasz system. Ostatni rząd pokazuje malejące, zdefiniowane stężenia rekombinowanego mIL-2 (bez dodania komórek). Prawy dołek w ostatnim rzędzie nie zawiera mIL-2 i reprezentuje odczyt tła, który wydaje się podobny do dołków kontrolnych. Rysunek 3B przedstawia kwantyfikację wyników z płytki ELISA pokazanej na Rysunku 3A. Poziomy gęstości optycznej (OD) przekształcono na stężenia mIL-2 na podstawie krzywej wzorcowej z rekombinowanego mIL-2. Rysunek 3C przedstawia eksperyment odpowiedzi na dawkę, w którym różne dawki przeciwciał poddano preinkubacji z komórkami CLL, a następnie inkubowano z komórkami BW wykazującymi ekspresję CD16.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja systemu reporterowego BW. Komórki BW5147 są stabilnie transfektowane zewnętrzną częścią różnych receptorów połączoną z domenami transbłonową i cytoplazmatyczną łańcucha CD3ζ myszy (chimeryczny receptor-CD3ζ). Aktywacja specyficznego receptora-CD3ζ przez ligand skutkuje sekrecją mIL-2, która może być wykrywana za pomocą testu ELISA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Struktura chimerycznego receptora-CD3ζ oraz projekt starterów PCR. (A) Ogólna struktura domeny zewnątrzkomórkowej receptora połączonej z domenami transbłonowymi i wewnątrzkomórkowymi mysiej CD3ζ. (B) Domena zewnątrzkomórkowa receptora została amplifikowana za pomocą startera 3', który zawierał również nukleotydy CD3ζ. (C) Domeny wewnątrzkomórkowe i transbłonowe CD3ζ zostały amplifikowane za pomocą startera 5', który zawierał również nukleotydy receptora. (D) W końcowej reakcji PCR oba segmenty, posiadające nakładające się sekwencje, posłużyły jako matryca DNA. Na wszystkich panelach ryciny różne domeny białkowe są oznaczone kolorami i obramowane niebieskimi prostokątami (sekwencja CD3ζ) oraz czerwonymi prostokątami (sekwencja receptora). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Ilustracja produktu końcowego systemu reporterowego BW. (A, B, C) Komórki CLL poddano preinkubacji z dwoma przeciwciałami anty-CD20 (rytuksymabem i obinutuzumabem) lub przeciwciałem kontrolnym, bądź bez nich. Następnie komórki związane z przeciwciałami inkubowano z rodzicielskimi komórkami BW lub komórkami BW wykazującymi ekspresję CD16a-CD3ζPoziom mIL-2 w supernatancie określono za pomocą testu ELISA. (A) Zdjęcie surowej płytki ELISA. Intensywność koloru wskazuje stężenie mIL-2 w supernatancie. Doświadczenie przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Dolny rząd przedstawia odczyt ELISA dla malejących stężeń rekombinowanego mIL-2, które analizowano na tej samej płytce. (B) Ilościowe oznaczenie odczytu ELISA przedstawionego w (A). Poziomy mIL-2 obliczono przy użyciu krzywej wzorcowej dla mIL-2. (C) Doświadczenie z odpowiedzią na dawkę, w którym różne dawki przeciwciał inkubowano wstępnie z komórkami CLL, a następnie inkubowano z komórkami BW wykazującymi ekspresję CD16a-CD3.ζ. ***, P < 0,001; t-Studenta t test (B) lub ANOVA z wielokrotnymi porównaniami (C). Jedynym porównaniem w (C), które nie wykazało istotnej statystycznie różnicy, było porównanie rytuksymabu z przeciwciałem kontrolnym przy pierwszym stężeniu (0.01 µg/mL). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z trzech powtórzeń. Analogiczne eksperymenty przeprowadzono w ramach jednego z naszych niedawnych badań9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania systemu reporterowego do badania oddziaływań receptor-ligand (patrz skrócona forma tego protokołu w1). Protokół składa się z trzech głównych części: klonowania białka chimerycznego, które obejmuje domenę zewnątrzkomórkową specyficznego receptora połączonego z domeną wewnątrzkomórkową CD3ζ, transfekcji plazmidu, który wyraża białko fuzyjne do komórek BW (np. przez elektroporację) oraz ilościowego wykrywania mysiej IL-2 za pomocą testu ELISA. Produkt końcowy każdej z tych części powinien być weryfikowany niezależnie: proces klonowania powinien być weryfikowany poprzez pełne sekwencjonowanie białka fuzyjnego w plazmidzie docelowym, transfekcja komórek BW powinna być weryfikowana poprzez badanie ekspresji receptora będącego przedmiotem zainteresowania w komórkach BW (np. za pomocą cytometrii przepływowej), a proces ELISA powinien być weryfikowany przez ogólne kontrole dodatnie (np., rekombinowany mIL-2), jak również ze specyficznymi kontrolami dla transfekowanych komórek BW; tj. cele, które wyrażają znany ligand receptora będącego przedmiotem zainteresowania (np. komórki wykazujące ekspresję CD48 mogą być używane jako kontrola pozytywna dla komórek BW, które wyrażają receptor komórek NK 2B4). Na przykład proces klonowania może się powieść, ale białko fuzyjne nie ulega ekspresji przez komórki BW. W takim przypadku elektroporację należy powtórzyć. Alternatywnie, jeśli nie ma sygnału powyżej poziomu tła płytki ELISA (szczególnie w przypadku kontroli dodatnich), transfekowane komórki BW mogły nie wyrazić receptora (lub ekspresja została utracona) lub mógł wystąpić problem techniczny podczas procesu ELISA.

Do protokołu można wprowadzić szereg modyfikacji, zachowując przy tym ogólne zasady procedury. Modyfikacje te obejmują wektor używany do ekspresji białka fuzyjnego, metodę transfekcji plazmidu do komórek BW oraz specyficzne parametry związane z inkubacją i testem ELISA, takie jak rodzaj celu (np. komórki, przeciwciała itp.), liczba komórek docelowych lub stężenie przeciwciał, jeśli jest to istotne (używamy 50 000 komórek na studzienkę i dawkę początkową przeciwciała 0,5 μg/dołk), czas inkubacji (stosujemy czas inkubacji 48 godzin) i objętość supernatantu, która jest przenoszona na płytkę ELISA.

Metoda ta jest czuła, specyficzna i można ją łatwo określić ilościowo. Idealnie nadaje się do badań przesiewowych na obecność ligandów dla określonych receptorów (zwłaszcza jeśli sam ligand nie został rozpoznany). Po przygotowaniu transfekowanych komórek BW, które wyrażają określony receptor, komórki te można zamrozić i wykorzystać w razie potrzeby do dodatkowych eksperymentów. My i inni z powodzeniem wykorzystaliśmy ten system w poprzednich badaniach do zbadania interakcji receptor-ligand (na przykład 2,3,5,12,13,14,15,16), a wyniki uzyskane przez ten system zostały zweryfikowane za pomocą innych technik. Metoda ta może być również stosowana do badania aktywacji różnych ludzkich receptorów FcγR przez przeciwciała, tak jak to zrobiono w przypadku przeciwciał przeciwwirusowych w surowicy 6,7,8 lub przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD209.

Ponieważ jest to system reporterowy, w którym ekspresji ulega tylko zewnątrzkomórkowy segment receptora, wyniki uzyskane przez ten system powinny być uzupełnione dodatkowymi eksperymentami z endogennym receptorem, takimi jak testy cytotoksyczności z komórkami NK (Natural Killer) w celu zbadania interakcji z receptorami komórek NK. Co więcej, niektóre interakcje ligand/receptor mogą nie powodować wydzielania mIL-2 przez układ reporterowy, a zatem mogą zostać przeoczone. Ponadto, jak w każdej konfiguracji eksperymentalnej, wyniki powinny być weryfikowane dla różnych parametrów, jak opisano powyżej. Jest to szczególnie ważne w przypadkach, gdy wymagane jest porównanie dwóch warunków (np. aktywacja tego samego receptora Fc przez różne przeciwciała). Ważne jest również sprawdzenie, czy czułość określonej interakcji ligand-receptor mieści się w liniowym zakresie układu. W przeciwnym razie może to prowadzić do wartości nasycenia, które mogą uniemożliwić prawidłowe porównanie między warunkami. Można to osiągnąć za pomocą krzywej wzorcowej mIL-2, a także poprzez wygenerowanie krzywej dawka-odpowiedź z badanym ligandem (w przypadku wartości nasycenia należy zmodyfikować parametry doświadczalne; np. mniejsza objętość supernatantu powinna być analizowana metodą ELISA). Innym możliwym ograniczeniem tego systemu jest wykorzystanie komórek docelowych z endogennym wydzielaniem mIL-2 (np. mysich limfocytów T), które maskowałyby wydzielanie IL-2 przez komórki BW. Aby przezwyciężyć te bardzo rzadkie zjawiska, które są ograniczone do komórek myszy, ten system reporterowy można ulepszyć poprzez użycie innego reportera (np. GFP), który nie ulega ekspresji w komórkach docelowych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Esther Singer za redakcję językową. Badanie to było wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP/2007-2013) / Umowa o grant ERBN nr 320473-BacNK. Dalsze wsparcie zostało zapewnione przez Program I-CORE Komitetu Planowania i Budżetu oraz Izraelską Fundację Naukową, a także przez I-Core on Chromatin and RNA in Gene Regulation, GIF Foundation, Lewis Family Foundation, grant profesury ICRF, grant Helmholtz Israel i Rosetrees Trust (wszystkie dla O.M.). Badanie to było również wspierane przez Izraelską Fundację Naukową (grant 502/15), Kass Medical Research Award oraz grant badawczy z Izraelskiego Towarzystwa Hematologii i Transfuzjologii (dla S.E.). O.M jest profesorem koronnym immunologii molekularnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AccuPrep, Mini zestaw do ekstrakcji plazmiduBioneerK-3030
Anty-mysi IL-2BioLegend503702
Biotyna anty-mysia IL-2BioLegend503804
płytki ELISADe-groot60-655061
Płodowa surowica bydlęcaSigmaF7524-500ml
G418Mercury
Gene Pulser IIBio-Rad165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110
L-glutaminaPrzemysł biologiczny03-020-1B
MEM Roztwór aminokwasów endogennychPrzemysł biologiczny01-340-1B
Roztwór penicyliny-streptomycynyPrzemysł biologiczny03-031-1B
peroksydaza streptawidynaJackson ImmunoResearch016-030-084
Zestaw Maxiprep filtra plazmidowego PureLink HiPureThermoFisher ScientificK210016
RPMI-1640 ŚredniPrzemysł biologiczny30-2001
Pirogronian soduPrzemysł biologiczny03-042-1B
TMB SouthernBiothech0410-01
MBS3458105GM

Bibliografia

  1. Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. Natural Killer Cell Protocols. , Second edn, Humana Press. 258-262 (2010).
  2. Mandelboim, O., et al. Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells. Nature. 409 (6823), 1055-1060 (2001).
  3. Stanietsky, N., et al. The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17858-17863 (2009).
  4. Stanietsky, N., et al. Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR. European Journal of Immunology. , (2013).
  5. Gur, C., et al. Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack. Immunity. 42 (2), 344-355 (2015).
  6. Corrales-Aguilar, E., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors. Journal of Immunoogical Methods. 387 (1-2), 21-35 (2013).
  7. Corrales-Aguilar, E., et al. Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans. Medical Microbiology and Immunology. 205 (5), 409-424 (2016).
  8. Radinsky, O., et al. Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI. Scientific Reports. 7 (1), 6054(2017).
  9. Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Oncoimmunology. 7 (6), e1428158(2018).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  11. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253(2007).
  12. Bar-On, Y., et al. NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy. Journal of Virology. 91 (19), (2017).
  13. Glasner, A., et al. Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe. Journal of Immunology. 195 (8), 3959-3969 (2015).
  14. Glatzer, T., et al. RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44. Immunity. 38 (6), 1223-1235 (2013).
  15. Gur, C., et al. The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes. Nature Immunology. 11 (2), 121-128 (2010).
  16. Markel, G., et al. Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions. Journal of Clinical Investigation. 110 (7), 943-953 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Receptory Fc gammaprzeciwcia a monoklonalnetest ELISAtransfekcja kom rek BWmetoda elektroporacjisekrecja interleukiny 2receptory kom rek NKekspresja chimerycznego receptora

Powiązane artykuły