Artykuł metodologiczny

Ocena wzajemnych oddziaływań między białkiem dopełniacza C1q a kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek

DOI:

10.3791/58688

⸱

15 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, University of Trieste, 2Institute for Maternal and Child Health, IRCCS (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Burlo Garofolo, 3Department of Medical, Surgical and Health Science, University of Trieste

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Składnik dopełniacza C1q jest cząsteczką prozapalną o wysokiej ekspresji w mikrośrodowisku tkankowym, która może wchodzić w interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową. W tym miejscu opisujemy metodę testowania, w jaki sposób C1q związany z kwasem hialuronowym wpływa na adhezję komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coraz częściej wykazano, że mikrośrodowisko guza odgrywa aktywną rolę we wzroście nowotworu i przerzutach. Poprzez różne szlaki komórki nowotworowe mogą skutecznie rekrutować komórki zrębu, odpornościowe i śródbłonka poprzez wydzielanie czynników stymulujących, chemokin i cytokin. Z kolei komórki te mogą zmieniać właściwości sygnalizacyjne mikrośrodowiska, uwalniając sygnały stymulujące wzrost, metabolity i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej w celu utrzymania wysokiej proliferacji i zdolności przerzutowych. W tym kontekście stwierdzamy, że składnik dopełniacza C1q, silnie eksprymowany lokalnie przez szereg ludzkich nowotworów złośliwych, po interakcji z macierzą zewnątrzkomórkową kwasu hialuronowego, silnie wpływa na zachowanie komórek pierwotnych wyizolowanych z ludzkich próbek guza. W tym miejscu opisujemy metodę testowania, w jaki sposób C1q związany z kwasem hialuronowym (HA) wpływa na adhezję komórek nowotworowych, podkreślając fakt, że właściwości biologiczne kluczowych składników macierzy zewnątrzkomórkowej (w tym przypadku HA) mogą być kształtowane przez sygnały bioaktywne w kierunku progresji guza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowisko guza (TME) wpływa na rozwój i progresję raka, ponieważ może zapewnić dopuszczalną niszę dla przetrwania, wzrostu i inwazji komórek. Identyfikacja nowych kluczowych graczy w TME może być przydatna do odkrycia nowych narzędzi molekularnych do terapii celowanej. TME obejmuje złożoną i dynamiczną sieć komórek niezłośliwych, takich jak komórki śródbłonka, fibroblasty i komórki układu odpornościowego, osadzonych w otaczających składnikach macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), w tym kolagenach, lamininach, fibronektynach, proteoglikanach i hialuronianach. Zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe syntetyzują i wydzielają składniki ECM wraz z cytokinami, chemokinami, czynnikami wzrostu oraz enzymami zapalnymi i przebudowującymi macierz, które ogólnie zmieniają właściwości fizyczne, chemiczne i sygnalizacyjne TME. Wśród tych składników pojawił się kwas hialuronowy (HA), który odgrywa kluczową rolę w biologii nowotworów. Pomimo swojego prostego składu chemicznego, HA, wraz z cząsteczkami wiążącymi HA (hialadheryny), może modulować angiogenezę, reakcję układu odpornościowego i przebudowę ECM w sposób zależny od wielkości i stężenia1.

System dopełniacza (C) jest również częścią lokalnego TME, który ostatnio cieszy się coraz większym zainteresowaniem. System C obejmuje zestaw rozpuszczalnych i związanych z błoną białek biorących udział w pierwszej linii obrony przed komórkami niebędącymi własnymi, niepożądanymi elementami gospodarza i patogenami. Funkcjonalnie, C łączy dwuefektorowe ramiona systemów wrodzonych i adaptacyjnych, aby promować bezpośrednie zabijanie komórek lub montowanie odpowiedzi zapalnej2. Aktywacja C może hamować wzrost guza, niszcząc komórki rakowe lub hamując ich wzrost, ale staje się coraz bardziej jasne, że może mieć działanie promujące nowotwór poprzez podtrzymywanie przewlekłego stanu zapalnego, promowanie tworzenia środowiska immunosupresyjnego, indukowanie angiogenezy i aktywację szlaków sygnałowych związanych z rakiem3. W tym kontekście, C1q, pierwsza cząsteczka rozpoznająca klasycznego szlaku układu C, pojawiła się, aby pełnić ważne funkcje w mikrośrodowisku guza niezależnie od aktywacji C4. Wykazano, że C1q ulega lokalnej ekspresji w szeregu ludzkich nowotworów złośliwych, gdzie może sprzyjać adhezji, migracji i proliferacji komórek rakowych, a także angiogenezie i przerzutom5. Co ciekawe, C1q wchodzi w interakcje z głównym składnikiem ECM, takim jak HA.

Opracowaliśmy technikę izolowania pierwotnych komórek rakowych z masy guza. Ponadto stworzyliśmy matrycę, która może stymulować mikrośrodowisko guza, w szczególności interakcję między C1q a kwasem hialuronowym o wysokiej masie cząsteczkowej. C1q związany z HA był w stanie indukować adhezję komórek nowotworowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki tkanek od pacjentów zostały pobrane po świadomej zgodzie, po zatwierdzeniu względów etycznych przez Radę Instytucjonalną Szpitala Uniwersyteckiego w Trieście, Włochy.

1. Izolacja i hodowla komórek nowotworowych (Dzień 1)

  1. Wyizoluj ludzkie komórki międzybłoniaka z próbek stałych MPM. Drobno zmielić tkankę nożem, aby uzyskać fragmenty o wielkości około 2-3mm2 i inkubować w 5 ml roztworu trawiącego składającego się ze zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) uzupełnionego 0,5 mM Ca2+/Mg2+, 0,5% trypsyny i 50 μg/ml DNazy I, przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Izolacja i hodowla komórek nowotworowych (dzień 2)
    1. Po całonocnej inkubacji umieścić strawioną tkankę na 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.
    2. Zastąpić roztwór wytrawiający po odwirowaniu (250 x g) roztworem kolagenazy typu 1 o stężeniu 3 mg/ml rozpuszczonym w 5 ml pożywki 199 z HBSS i dalej inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.
    3. Zablokuj reakcję enzymatyczną, dodając 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Ponownie zawiesić komórki bardzo ostrożnie za pomocą pipety o pojemności 5 ml, aby upewnić się, że większość komórek została uwolniona z tkanki. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr porowy 100 μm.
    4. Wysiewać komórki w kolbie o średnicy 12,5cm2 i hodować je w temperaturze 37 °C za pomocą pożywki bez surowicy ludzkich komórek śródbłonka (HESF), z 10% FBS i uzupełnionej EGF (10 ng/ml), zasadowym FGF (20 ng/ml) i 1% penicyliny-streptomycyny.
      UWAGA: Wymieniaj na świeże podłoże co 2-3 dni.

2. Powłoka HA (Dzień 1)

  1. Zawiesić HA o wysokiej masie cząsteczkowej (1,5 kDa) w wodzie podwójnie destylowanej o stężeniu 1 mg/mL6.
  2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy HA do 50 μg/ml w buforze węglanowo-wodorowęglanowym (0,1 M, pH 9,6) delikatnie pipetując.
  3. Pokryć 96-dołkową płytkę 100 μl rozcieńczonego roztworu podstawowego HA na basenik przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Kwas hialuronowy był miłym prezentem od profesora Ivana Donatiego, Wydziału Nauk Przyrodniczych, Uniwersytetu w Trieście7.

3. Powłoka C1q (Dzień 2)

  1. Po całonocnej inkubacji odessać próżniowo studzienki poddane działaniu środka i przemyć 96-dołkową płytkę 100 μl PBS (dPBS) Dulbecco na studzienkę.
  2. Pozwolić, aby C1q (25 μg/ml lub różne stężenia do eksperymentów z odpowiedzią na dawkę) lub BSA (jako kontrola ujemna) związały się z unieruchomionym HA z tworzywa sztucznego poprzez inkubację tych białek w stężeniu 25 μg/ml w 100 μl dPBS + 0,5% BSA i 0,7 mM Ca2 + / Mg2+. Następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. Odessać próżniowo studzienki i umyć 96-dołkową płytkę 100 μl/studzienkę dPBS.

4. Etykietowanie komórek za pomocą FAST DiI

  1. Zawieś 1 x 105 komórek nowotworowych w 500 μl dPBS zawierającym 10 μg/ml barwnika fluorescencyjnego FAST DiI. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% v/v CO2 w celu etykietowania, mieszając ręcznie w odstępach 5 minut.
    1. Aby usunąć nadmiar FAST DiI, dodaj 10 ml dPBS, delikatnie pipetuj w górę i w dół i odwiruj przy 250 x g przez 7 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml wolnej pożywki ludzkiej surowicy śródbłonka zawierającej 0,1% BSA (HESF + 0,1% BSA).

5. Adhezja komórek na matrycach HA/C1q (Dzień 1)

  1. Odsysać próżniowo studzienki pokryte różnymi matrycami (studzienki zostały pokryte w kroku 3.2).
  2. Rozprowadzić 100 μl oznakowanej zawiesiny komórek do powlekanych studzienek i inkubować płytkę przez 35 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% v/v CO2 .
  3. Usunąć nieprzylegające komórki poprzez zasysanie supernatantu. Przemyć raz dPBS zawierającym 0,5% BSA, 0,7 mM Ca2+ i 0,7 mM Mg2+.
  4. Poddać lizie przylegające komórki, dodając 200 μl/basenik 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 + 0,1% v/v SDS i natychmiast odczytać 96-dołkową płytkę za pomocą czytnika fluorescencji (544 nm, emisja 590 nm) przy użyciu krzywej kalibracyjnej wygenerowanej w wyniku lizy rosnącej liczby znakowanych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HA to ujemnie naładowany polisacharyd o wysokiej masie cząsteczkowej, który składa się z powtarzających się jednostek disacharydów kwasu (β,1-4)-D-glukuronowego-(β,1-3)-N-acetylo-D-glukozaminy (Rysunek 1B)7. Występowanie wiązania HA na płytce 96-dołkowej, a także skuteczność jego immobilizacji badano z wykorzystaniem biotynylowanego HA (bio-HA). Różne stężenia Bio-HA, w zakresie od 10 μg/ml do 1 mg/ml, zawieszono ponownie w 100 mM bufo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy łatwą metodę zbadania, w jaki sposób składnik dopełniacza C1q, oddziałując z kwasem hialuronowym, jest w stanie modulować zachowanie pierwotnych komórek wyizolowanych z ludzkich tkanek nowotworowych. Zarówno HA, jak i C1q są obficie obecne w mikrośrodowisku tkankowym zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych, uczestnicząc w kilku procesach biologicznych komórki. Na przykład wykazano, że C1q jest obecny w mikrośrodowisku łożyska, gdzie sprzyja inwazji trofoblastu poza kosmkami na matczyne decidua...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Ivanowi Donati za dostarczenie HA, Leonardo Amadio, Gabrielli Zito (Oddział Ginekologii IRCCS "Burlo Garofolo", Triest, Włochy) i Andrei Romano (Operacyjny Oddział Kliniczny Anatomii i Patologii Histologii, Szpital Cattinara, Triest, Włochy) za pobranie próbki tkanki. Dziękujemy również Nicolò Morosiniemu za pomoc w przygotowaniu filmu oraz Alexowi Coppoli, który użyczył głosu. Praca ta była wspierana przez granty z Instytutu Zdrowia Matki i Dziecka, IRCCS "Burlo Garofolo", Triest, Włochy (RC20/16) oraz Fondazione Cassa di Risparmio Trieste dla R. Bulla.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100&cienkie; &mikro; m filtr porowyBD Falcon352360
Amfoterycyna B roztwór (fungizone)Sigma-Aldrich 1397-89-3
nauki immunologiczneFGFGRF-15595
Chlorek wapniaSigma-Aldrich C-4901
Kolagenaza typu IWorthington Biochemical Corporation, DBAMX1D12644
D-GlucoseSigma-Aldrich 50-99-7
DNaza I Roche10 104 159 001
EDTASigma-Aldrich 60-00-4
EGFNauki ImmunologiczneGRF-10544
FAST DiISondy molekularne, Invitrogen, Thermo Fisher ScientificD7756
Surowica bydlęcapłodu Gibco,  Thermo Fisher Scientific10270-106
FibronectinRoche11051407001
Kolba do hodowli komórkowychCorning430639Sterylny, wentylowany
roztwór gentamycynySigma-Aldrich G1397-10ML
Motek ' s Zrównoważony roztwór soli (HBBS) Sigma-Aldrich H6648Uzupełniony EDTA, glukozą, penicyliną-streptamicyną, gentamycyną i fungizonem
Kwas hialuronowy o wysokiej masie cząsteczkowejMiły prezent od prof. Ivana Donati
Ludzka surowica śródbłonkowa wolne podłoże Gibco,  Thermo Fisher Scientific11111-044Uzupełniony o EGF (5  ng/mL), zasadowy FGF (10  ng/ml), oraz  1% penicyliny– streptomycyna (Sigma-Aldrich)
Chlorek magnezuCarlo Erba13446-18-9
Medium 199 z Hank' ssól Sigma-Aldrich M7653
Penicylina-StreptomycynaSigma-Aldrich P0781
Mikroskopia poklatkowa Nikon System obrazowania BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA ReaderFlow Labs
TrypsinSigma-Aldrich Zobacz materiał T4674
podstawowe TGL

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
  2. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  3. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
  4. Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346(2016).
  5. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23(2015).
  6. Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
  7. Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
  8. Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
  9. Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).
  10. Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
  11. Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).
  12. Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
  13. Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
  14. Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Complement Protein C1qHyaluronic AcidCell AdhesionExtracellular MatrixTumor MicroenvironmentEnzyme Linked Immunosorbent AssayFluorescent Cell LabelingStandard Curve GenerationCoating ProcedureCell Adhesion Assay

Powiązane artykuły