Method Article

Identyfikacja klas kodujących i niekodujących RNA wyrażonych we krwi pełnej świń

DOI:

10.3791/58689

⸱

November 28th, 2018

 ,  , 
1Virus and Prion Research Unit, National Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, 2ORAU/ORISE

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół zoptymalizowany do przetwarzania kodujących (mRNA) i niekodujących (ncRNA) bibliotek sekwencyjnych RNA zredukowanych globiną z pojedynczej próbki krwi pełnej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawienie się innowacyjnych i coraz bardziej potężnych technik sekwencjonowania nowej generacji otworzyło nowe możliwości w zakresie możliwości badania podstawowej ekspresji genów związanych z interesującymi procesami biologicznymi. Innowacje te pozwalają naukowcom nie tylko obserwować ekspresję sekwencji mRNA, które kodują geny wpływające na funkcję komórkową, ale także cząsteczki niekodującego RNA (ncRNA), które pozostają nietranslowane, ale nadal pełnią funkcje regulacyjne. Chociaż naukowcy mają możliwość obserwowania zarówno ekspresji mRNA, jak i ncRNA, zwyczajowo badanie koncentruje się na jednym lub drugim. Jednak, gdy badania są zainteresowane zarówno ekspresją mRNA, jak i ncRNA, często używają oddzielnych próbek do badania kodujących lub niekodujących RNA ze względu na różnicę w przygotowaniach bibliotecznych. Może to prowadzić do konieczności pobrania większej liczby próbek, co może wydłużyć czas, materiały eksploatacyjne i stres zwierząt. Dodatkowo może to spowodować, że badacze zdecydują się przygotować próbki tylko do jednej analizy, zwykle mRNA, ograniczając liczbę pytań biologicznych, które można zbadać. Jednak ncRNA obejmują wiele klas z rolami regulacyjnymi, które wpływają na ekspresję mRNA. Ponieważ ncRNA są ważne dla podstawowych procesów biologicznych i zaburzeń tych procesów podczas infekcji, mogą stanowić atrakcyjne cele terapeutyczne. Manuskrypt ten demonstruje zmodyfikowany protokół generowania mRNA i niekodujących bibliotek ekspresji RNA, w tym wirusowego RNA, z pojedynczej próbki krwi pełnej. Optymalizacja tego protokołu, poprawa czystości RNA, zwiększona ligacja w celu odzyskania metylowanych RNA i pominięcie wyboru rozmiaru, aby umożliwić wychwytywanie większej liczby gatunków RNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) stało się potężnym narzędziem do badania zmian zachodzących na poziomie genomu organizmów biologicznych. Przygotowanie próbek do metod NGS może być zróżnicowane w zależności od organizmu, rodzaju tkanki, a co ważniejsze, pytań, na które naukowcy chcą odpowiedzieć. Wiele badań zwróciło się ku NGS jako sposobowi badania różnic w ekspresji genów między stanami, takimi jak osoby zdrowe i chore1,2,3,4. Sekwencjonowanie odbywa się na podstawie całego genomu i pozwala badaczowi uchwycić większość, jeśli nie całość, informacji genomowych dla określonego markera genetycznego w danym punkcie czasowym.

Najczęstszymi markerami ekspresji są informacyjne RNA (mRNA). Najczęściej stosowane procedury przygotowywania bibliotek do sekwencjonowania RNA są zoptymalizowane pod kątem odzyskiwania cząsteczek mRNA poprzez zastosowanie serii oczyszczania, fragmentacji i ligacji5,6. Jednak decyzja o tym, w jaki sposób protokół ma zostać wykonany, zależy w dużej mierze od rodzaju próbki i pytań stawianych w związku z tą próbką. W większości przypadków ekstrahuje się całkowity RNA; jednak nie wszystkie cząsteczki RNA są interesujące, a w przypadkach takich jak badania nad ekspresją mRNA zbyt obfite gatunki RNA, takie jak rybosomalne RNA (rRNA), muszą zostać usunięte, aby zwiększyć liczbę wykrywalnych transkryptów związanych z mRNA. Najpopularniejszą i najszerzej stosowaną metodą usuwania licznych cząsteczek rRNA jest redukcja poliadenylowanych transkryptów RNA, określana jako zubożenie poliA7. Takie podejście dobrze sprawdza się w analizie ekspresji mRNA, ponieważ nie wpływa na transkrypty mRNA. Jednak w badaniach, które są zainteresowane niekodującymi lub wirusowymi RNA, zubożenie poliA również usuwa te cząsteczki.

Wiele badań skupia się na przygotowaniu biblioteki sekwencji RNA w celu zbadania ekspresji (kodowania) mRNA lub określonej klasy małego lub dużego niekodującego RNA. Chociaż istnieją inne procedury8 takie jak nasza, które pozwalają na przygotowanie podwójnej próbki, wiele badań przygotowuje biblioteki z oddzielnych próbek do oddzielnych badań, jeśli są dostępne. W przypadku badania takiego jak nasze, zwykle wymagałoby to wielu próbek krwi, co wydłuża czas, materiały eksploatacyjne i stres zwierząt. Celem naszego badania było wykorzystanie pełnej krwi pochodzącej od zwierząt do identyfikacji i ilościowego określenia różnych klas zarówno mRNA, jak i niekodującego RNA wyrażonych między zdrowymi i wysoce zjadliwymi świniami zakażonymi wirusem zespołu rozrodczości i oddechowości świń (HP-PRRSV)9,10, mimo że mamy tylko jedną próbkę krwi pełnej (2,5 ml) od każdej świni. Aby to zrobić, musieliśmy zoptymalizować typowe protokoły ekstrakcji i tworzenia bibliotek, aby wygenerować odpowiednie dane, które umożliwią analizę ekspresji zarówno mRNA, jak i niekodującego RNA (ncRNA) 11 z pojedynczej próbki.

To spowodowało potrzebę wprowadzenia protokołu, który pozwalałby na analizę mRNA i niekodujących RNA, ponieważ dostępne standardowe zestawy i metody ekstrakcji RNA i tworzenia bibliotek były przeznaczone głównie dla mRNA i wykorzystywały etap depulacji poli-A12. Ten krok uniemożliwiłby odzyskanie niekodującego RNA lub wirusowych transkryptów z próbki. Dlatego potrzebna była zoptymalizowana metoda, która pozwoliłaby na całkowitą ekstrakcję RNA bez zubożenia próbki poliA. Metoda przedstawiona w tym manuskrypcie została zoptymalizowana, aby umożliwić użycie krwi pełnej jako rodzaju próbki oraz zbudować biblioteki sekwencjonowania zarówno dla mRNA, jak i ncRNA o małych, i dużych rozmiarach. Metoda została zoptymalizowana, aby umożliwić analizę wszystkich wykrywalnych niekodujących RNA, a także zachować wirusowe RNA do późniejszych badań13. Podsumowując, nasz zoptymalizowany protokół przygotowania biblioteki pozwala na badanie wielu cząsteczek RNA z jednej próbki krwi pełnej.

Ogólnym celem zastosowania tej metody było opracowanie procesu, który pozwolił na pobranie zarówno niekodującego RNA, jak i mRNA z jednej próbki krwi pełnej. Dzięki temu możemy mieć mRNA, ncRNA i wirusowe RNA dla każdego zwierzęcia w naszym badaniu pochodzące z pojedynczej próbki9. To ostatecznie pozwala na więcej odkryć naukowych bez dodatkowych kosztów zwierzęcych i daje pełniejszy obraz ekspresji każdej pojedynczej próbki. Opisana metoda pozwala na badanie regulatorów ekspresji genów, a także pozwala na przeprowadzenie badań korelacyjnych porównujących ekspresję mRNA i niekodującego RNA przy użyciu pojedynczej próbki krwi pełnej. W naszym badaniu wykorzystaliśmy ten protokół do zbadania zmian w ekspresji genów i możliwych regulatorów epigenetycznych u zakażonych wirusem 9-tygodniowych samców świń komercyjnych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Centrum Chorób Zwierząt (USDA-ARS-NADC).

1. Pobieranie próbek krwi świń

  1. Zbierz próbki krwi do probówek RNA. Zbierz ~2,5 ml lub więcej, jeśli dostępne są większe probówki zbiorcze.

2. Przetwarzanie próbek krwi świń

  1. Odwirować probówki z krwią o sile 5 020 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (15–25 °C). W przypadku przetwarzania zamrożonych próbek należy inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny przed odwirowaniem.
  2. Usunąć supernatant i dodać 8 ml wody wolnej od RNaz do osadu. Zamknij i wiruj osad, aż widocznie się rozpuści. Odwirować probówki z próbkami o masie 5,020 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu odzyskania osadu. Odrzucić cały supernatant i zachować osad.

3. Ekstrakcja organiczna dla całkowitego RNA i małego RNA (zestaw do izolacji miRNA)

  1. Rozpocząć ekstrakcję całkowitego RNA od pipetowania 300 μl buforu wiążącego lizę z osadem z kroku 2.2.
  2. Odwirować i przenieść mieszaninę do nowej, oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl dodatku homogenatycznego z zestawu. Zwiruj rurkę i umieść na lodzie na 10 minut.
  3. Wyjąć probówkę i dodać 300 μl odczynnika kwas-fenol: chloroform z zestawu. Odwiruj rurkę, aby wymieszać. Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Ostrożnie usunąć fazę wodną (300-350 μl) do świeżej probówki. Zanotuj głośność do następnego kroku.

4. Procedura izolacji całkowitego RNA

  1. W zależności od ilości odzysku wodnego (300-350 μL) dodać 1,25x objętość 100% (~375 μL) etanolu do fazy wodnej. Wymieszać próbkę za pomocą pipety.
  2. Dla każdej próbki należy ustawić nowe probówki zbiorcze zawierające wkład filtrujący. Odpipetować ~ 675 μL mieszaniny lizatu i etanolu na wkład filtracyjny.
    nuta: Nie dodawaj jednorazowo > 700 μl do wkładu filtra. W przypadku większych ilości należy stosować kolejno.
  3. Odwirować krótko (~15-20 s) przy 10 000 x g, aby przepuścić ciecz przez filtr. Nie kręć mocniej niż to.
  4. Odlać przepływający przepływ i, jeśli to konieczne, powtórzyć odwirowanie z pozostałą mieszaniną lizatu i etanolu, aż do całkowitego nałożenia. Zachowaj ten sam wkład filtra i rurkę zbiorczą do następnego kroku.
  5. Dodać 700 μl roztworu płuczącego 1 z zestawu do wkładu filtra i krótko odwirować (~10 s), aby przeciągnąć filtr. Odrzuć przepływ i zachowaj ten sam wkład filtra i rurkę zbiorczą.
  6. Dodać 500 μl roztworu myjącego 2/3. Odwirować, aby przeciągnąć ciecz przez wkład filtra. Odrzuć przepływ. Powtórz krok prania.
  7. W tej samej probówce odkręć wkład filtra przez dodatkowe 60 sekund, aby usunąć resztki płynu z filtra. Przenieś wkład filtra do świeżej probówki zbiorczej.
  8. Dodać 100 μl wstępnie podgrzanej (95 °C) wody wolnej od nukleaz do środka wkładu filtrującego. Wirować przez około 20-30 s na maksymalnej prędkości wirówki stołowej.
    nuta: RNA jest zawarte w eluacie i może być teraz dalej przetwarzane lub przechowywane w temperaturze -20 °C lub niższej. Nie przeprowadzono wzbogacania małych RNA.

5. Redukcja globiny (w oparciu o protokół zoptymalizowany dla próbek krwi pełnej świń)14,15

UWAGA: Redukcja globiny jest wykonywana tak, aby biblioteki nie były przepełnione odczytami mapującymi geny globiny, co zmniejszyłoby liczbę odczytów dostępnych do mapowania na inne geny o większym zainteresowaniu14,15 .

  1. Hybrydyzacja z oligonukleotydami redukującymi globinę
    1. Denaturacja RNA (próbka 6 μg RNA o maksymalnej objętości 7 μl) poprzez pipetowanie wyekstrahowanej próbki do cienkościennej probówki reakcyjnej o pojemności 0,2 ml wolnej od nukleaz i umieszczenie w termocyklerze w temperaturze 70 °C na 2 minuty. Ma to kluczowe znaczenie dla rurek lodowych natychmiast po pierwszym etapie denaturacji w celu uzyskania optymalnej jakości RNA. Nie jest wymagane leczenie DNazą.
    2. Podczas schładzania probówek przygotuj 400 μl 10-krotnej mieszanki oligonugokrzewów redukujących globinę: po 100 μl każdy z dwóch oligonukleotydów HBA (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3' i 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3') w temperaturze 30 μM, dwóch oligonukleotydów HBB (5'- AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3' i 5'- GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3') przy 120 μM na reakcję, uzyskując końcowe stężenie 7,5 μM oligonukleotydów HBA i 30 μM HBB oligonukleotydów. Przygotować 10x bufor do hybrydyzacji oligo: 100 mM Tris-HCL, pH 7,6; 200 mM KCl.
    3. Przygotować mieszaninę hybrydyzacyjną: 6 μg próbki RNA (maksymalnie 7 μl objętości), 2 μl z 400 μl 10x mieszaniny oligonów redukujących globinę (stężenie końcowe 2X), 1 μL 10x buforu do hybrydyzacji oligonucyklocytów (stężenie końcowe 1x). Dodać wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 10 μl.
    4. Ustaw termocykler w temperaturze 70 °C na 5 minut. Natychmiast schłodzić do 4 °C i przystąpić do mineralizacji RNazy H.
  2. Trawienie RNazy H
    1. Rozcieńczyć 10x RNaza H (10 U/μL) do 1x RNaza H z 1x buforem RNazy H.
      UWAGA: Bufor RNazy jest dostępny 10x i przed użyciem należy go rozcieńczyć 1x buforem RNazy H do 1x.
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną RNazy H, łącząc: 2 μl 10x buforu RNazy, 1 μl inhibitora RNazy w 2 μl 1x RNazy H i 5 μl wody wolnej od nukleaz do całkowitej objętości 10 μL.
    3. Dokładnie wymieszać próbki hybrydyzacji z redukcją globiny z 10 μl mieszaniny reakcyjnej RNazy H i trawić w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Schłodzić do 4 °C.
    4. Przerwać trawienie przez dodanie 1,0 μl 0,5 M EDTA do każdej próbki i natychmiast przejść do etapu oczyszczania.
  3. Oczyszczanie całkowitego RNA poddanego działaniu RNazy H.
    1. Oczyść RNA poddane działaniu RNazy H za pomocą zestawu do oczyszczania elucji na bazie membrany krzemionkowej zgodnie z instrukcjami producenta. premiksowe: Aby uzyskać łagodny bufor myjący, dodaj 44 ml 100% etanolu.
    2. Nie przenoś próbki do nowej probówki. Dodaj 80 μl wody wolnej od RNaz i 350 μl buforu do lizy. Dodać 250 μl 100% etanolu do rozcieńczonego RNA i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
      UWAGA: Nie wirować. Przejdź natychmiast do kroku 5.3.3.
    3. Teraz przenieś próbkę o objętości 700 μl do wkładu filtra elucyjnego umieszczonego w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml w celu zebrania przepływu. Wirować przez 15 s przy ≥ 8 000 x g. Odrzuć przepływ.
    4. Powtórz tę czynność, umieszczając wkład filtra elucji w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Dodać 500 μl łagodnego buforu płuczącego do wkładu filtracyjnego i wirować przez 15 s w temperaturze ≥ 8 000 x g w celu przepłukania membrany wkładu filtrującego. Odrzuć przepływ. Ponownie użyj probówki zbiorczej w kroku 5.3.5.
    5. Teraz, używając tej samej probówki z próbką, dodaj kolejne 500 μl 80% etanolu do wkładu filtra. Tym razem odwirować probówkę przez 2 minuty w ≥ 8 000 x g. Zebrać wirową kolumnę elucji do następnego kroku i wyrzucić zarówno rurkę przepływową, jak i probówkę zbiorczą.
    6. Umieścić wkład filtra elucji z ostatniego etapu do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml. Pozostaw otwartą pokrywę wkładu filtra i wiruj z pełną prędkością przez 5 minut, aby wysuszyć membranę kolumny wirowej i zapobiec przenoszeniu etanolu. Wyrzuć rurkę przepływową i zbiorczą.
      nuta: Aby uniknąć uszkodzenia, pokrywy należy ustawić pod kątem skierowanym w kierunku przeciwnym do kierunku wirnika.
    7. Weź wysuszony wkład filtra i umieść go w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 14 μl wody wolnej od RNaz do membrany wkładu filtrującego, upewniając się, że woda wolna od RNaz jest dodawana bezpośrednio do środka. Wirować przez 60 s z pełną prędkością, aby wymyć RNA.
  4. Oceń jakość próbek RNA zredukowanego globiną (krok 6). Przejdź do przygotowania próbki mRNA (krok 7) i przygotowania małej biblioteki RNA (krok 8)16,17.
    UWAGA: Próbki RNA o obniżonej ilości globiny mogą być teraz przechowywane w temperaturze -20 °C, jednak przechowywanie w temperaturze -80 °C jest zalecane w celu długotrwałej konserwacji.

6. Ocena RNA

  1. Określić ilościowo stężenie RNA za pomocą spektrofotometru. Zbadaj stosunek długości fali 260 i 280 nm. Współczynniki ~2 lub większe są uważane za czyste dla RNA, a niższe wartości wskazują na pewne zanieczyszczenie. Przyrząd wykorzystuje ten stosunek do określenia stężenia RNA jako ng/μL.
  2. Oceń jakość RNA, używając 1 μl (100 ng) próbki na odpowiednim chipie. Produktem końcowym powinien być RIN ~2 lub wyższy i szczyt na poziomie ~280 nt dla bibliotek pojedynczego odczytu mRNA; piki małych bibliotek RNA na poziomie 143 odpowiadają miRNA.

7. Przygotowanie próbki całkowitego RNA dla bibliotek mRNA i długich ncRNA. 16

  1. UWAGA: Doprowadzić bufor elucyjny i kulki do usuwania rRNA do temperatury pokojowej. Wstępnie oznaczone cienkościenne probówki PCR o pojemności 0,2 ml (można również użyć płytek). Kroki protokołu oparte na instrukcjach producenta16.
    1. Zacznij od 4 μl RNA o obniżonej ilości globiny. Dodać 6 μl wody wolnej od nukleaz, 5 μl buforu wiążącego rRNA i 5 μl mieszanki do usuwania rRNA na probówkę (1. probówka). Odpipetować do wymieszania i ponownego zamknięcia. Umieścić w termocyklerze z pokrywką podgrzewaną w temperaturze 100 °C na 5 minut w temperaturze 68°C. Wyjąć i pozostawić w temperaturze pokojowej na 60 s.
    2. Ponownie zawiesić kulki usuwające rRNA za pomocą wiru; dodać 35 μl kulek do nowej (2. r.) probówki do PCR i pobrać próbkę pipety z 1. probówki na kulki w 2. probówce. Inkubować 2probówkę PCR w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Umieść na stojaku magnetycznym na 7 min.
      nuta: Dokładnie wymieszaj każdą próbkę, pipetując, aby uzyskać optymalne zubożenie rRNA. Podnoszenie/opuszczanie rury w stojaku może przyspieszyć proces separacji.
    3. Przenieść supernatant z 2. probówki PCR do pasującej 3. probówki do PCR i umieścić na stojaku magnetycznym na co najmniej 60 s. Powtórzyć transfer do nowej probówki PCR tylko wtedy, gdy kulki nie zostaną przesunięte na boki probówki.
    4. Wymieszaj kulki oczyszczające próbkę za pomocą wiru; dodaj 99 μl do każdej 3probówki PCR. Odstawić w temperaturze pokojowej na 15 minut. Umieść na stojaku magnetycznym na 5 min. Upewnij się, że koraliki przesuwają się na boki. Odpipetować w celu odrzucenia supernatantu.
    5. Trzymaj zestaw 3rurek na stojaku magnetycznym. Dodaj 200 μl 70% etanolu, uważając, aby nie potrząsnąć kulkami. Pozostawić na co najmniej 30 s i odpipetować do usunięcia supernatantu. Powtórz krok.
    6. Pozostaw próbkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut na stojaku magnetycznym. Odwirować zestaw buforu elucyjnego przez 5 s przy 600 x g. Wyjąć probówkę i dodać 11 μl buforu elucyjnego, dokładnie mieszając. Inkubować przez 2 minuty na stole, a następnie co najmniej 5 minut na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej.
    7. Przenieść 8,5 μl supernatantu z 3.do nowej (4-tej) probówki PCR. Dodaj 8,5 μl mieszanki Elute/Prime/Fragment High z zestawu. Dobrze wymieszaj. Zakryj i umieść w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką na 8 minut w temperaturze 94 °C, przytrzymaj w temperaturze 4 °C. Wyjąć i krótko odwirować.
  2. Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA
    1. Odczekać, aż pierwsza nić syntezy wymiesza się z zestawu do osiągnięcia temperatury pokojowej i odwirować przy 600 × g przez 5 s. Przenieść 50 μl odwrotnej transkryptazy do mieszanki syntezy pierwszej nici. Odwrotną transkryptazę można dodać do syntezy pierwszej nici w stosunku 1:9.
    2. Odpipetować 8 μl połączonej syntezy odwrotnej transkryptazy/pierwszej nici wymieszać z próbką do czwartej probówki. Nasadka i odwirować 600 x g przez 5 s. Umieścić w termocyklerze z podgrzaną pokrywką ustawioną na 100 °C. Pracować przez: 10 minut w temperaturze 25 °C, 15 minut w temperaturze 42 °C, 15 minut w temperaturze 70 °C, następnie odpocząć w temperaturze 4 °C. Ostateczna objętość wynosi ~25 μL na studzienkę. Przejdź od razu do następnego kroku.
  3. Zsyntetyzuj drugą nić cDNA
    1. Doprowadzić odczynnik do naprawy końcowej (ERR) i mieszaninę drugiej nici (SSM) do temperatury pokojowej i odwirować przy 600 x g przez 5 s. Wymieszać ERR z buforem do reprodukcji w rozcieńczeniu 1:50. Odkręcićczwartą probówkę i dodać do każdej z nich 5 μl rozcieńczonego ERR i 20 μl SSM; Odpipetować do dobrego wymieszania. Objętość końcowa ~50 μL ds cDNA.
    2. Zakryć i inkubować w termocyklerze przez 1 godzinę w temperaturze 16 °C. Po zakończeniu cyklu zdejmij nakrętki i pozostaw do osiągnięcia temperatury pokojowej na blacie stołu.
  4. Etap oczyszczania cDNA ds
    1. Zacznij od wymieszania kulek paramagnetycznych z odwracalnym immobilizacją w fazie stałej (SPRI) za pomocą wiru. Przenieść 90 μl kulek do próbki wczwartej probówce(ds cDNA) i wymieszać. Ostateczna objętość wynosi 140 μL. Pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na 15 minut. Inkubuj na stojaku magnetycznym przez ~5 minut. Usunąć ~135 μl supernatantu z każdej studzienki. W każdej studzience powinno pozostać 5 μl.
    2. Pozostaw probówkę na stojaku magnetycznym i umyj, dodając 200 μl 80% etanolu. Pozostawić na 30 sekund, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz krok prania. Pozostaw probówki na stojaku magnetycznym na 15 minut do wyschnięcia.
    3. Odwirować bufor do reprodukcji przy 600 x g przez 5 s po osiągnięciu temperatury pokojowej. Wyjmij probówki ze stojaka. Przenieść 17,5 μl buforu do reprodukcji do probówki i wymieszać. Pozwól probówkom inkubować na blacie stołu przez 2 minuty, a następnie przenieś na stojak magnetyczny na 5 minut.
    4. Odpipetować 15 μl supernatantu zawierającego próbki cDNA ds do nowego zestawu (5tysięcy) cienkościennych probówek o pojemności 0,2 ml. Natychmiast przejść do następnego kroku lub zamknąć i przechowywać w temperaturze od -15 °C do -25 °C nie dłużej niż 7 dni.
  5. Kończy się Adenylate 3'.
    1. Odpipetować 2,5 μl buforu do resuspensji w temperaturze pokojowej do probówki z próbką, a następnie dodać 12,5 μl rozmrożonej mieszanki A-Tailing. Całkowicie wymieszać przez pipetowanie.
      UWAGA: Nie stosuje się kontroli ogona A.
    2. Zakryj pokrywką i inkubuj w termocyklerze z pokrywką nagrzaną do 100 °C. Pracować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie w temperaturze 70 °C przez 5 minut z podgrzewaną pokrywą. Pozostawić termocykler do odpoczynku w temperaturze 4 °C.
  6. Adaptery indeksu Ligate
    1. Doprowadź probówki z adapterem RNA i mieszankę buforu do wiązania zatrzymującego do temperatury pokojowej. Dla każdego odwirować przy 600 x g przez 5 s. Pozostaw mieszankę do podwiązywania w zamrażarce, aż będzie gotowa do użycia. Układ łączenia próbek do indeksowania powinien być znany.
    2. Do każdej probówki z próbką dodać 2,5 μl buforu do sporządzania zawiesiny i 2,5 μl mieszanki do ligacji. Teraz należy wprowadzić pipetę do każdej probówki z odpowiednią próbką o pojemności 2,5 μl odpowiedniego adaptera RNA. Wybór adaptera powinien być dokonany zgodnie z instrukcją producenta wybranego zestawu.
    3. Ponownie zamknąć i wymieszać przez odwirowanie przez 1 minutę przy 280 x g. Inkubować w termocyklerze przez 10 minut w temperaturze 30 °C. Dodać 5 μl buforu do ligacji końcowej do próbki, aby zatrzymać reakcję i dobrze wymieszać.
    4. Rozpocznij czyszczenie od mieszania kulek paramagnetycznych SPRI przez wir przez 60 s. Przenieś 42 μl kulek do każdej probówki. Dokładnie wymieszaj, a następnie inkubuj przez 15 minut na blacie ławki.
    5. Przenieś probówki na stojak magnetyczny i pozostaw do momentu, aż płyn stanie się klarowny (~5 min). Po oczyszczeniu usunąć i wyrzucić 79,5 μl supernatantu. Pozostaw probówki na stojaku magnetycznym i umyj, dodając 200 μl 80% etanolu. Odstawić na co najmniej 30 sekund, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz krok prania. Pozostaw na stojaku magnetycznym na dodatkowe ~15 minut, aby umożliwić wyschnięcie. Nie przerywaj koralików podczas etapów prania.
    6. Dodać 52,5 μl buforu do reprodukcji do probówki z próbką i mieszać aż do całkowitego ponownego zawieszenia kulek. Inkubować przez 2 minuty na blacie ławki. Przenieś probówkę z próbką z powrotem na stojak magnetyczny, aż ciecz będzie czysta (~5 min).
    7. Pozostawić na stojaku i delikatnie odpipetować 50 μl supernatantu do nowych (6-tysięcych) probówek. Dodaj 50 μl wirowanych kulek SPRI. Pozostawić do inkubacji na blacie ławki przez 15 minut.
    8. Przenieś się na stojak magnetyczny i pozostaw płytkę, aż płyn stanie się klarowny (~5 min). Odrzucić 95 μl supernatantu, pozostawiając 5 μl w każdej probówce.
    9. Pozostaw probówki na stojaku magnetycznym i umyj, dodając 200 μl 80% etanolu. Pozostawić probówkę na 30 sekund, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz pranie. Pozostaw probówki do wyschnięcia na stojaku magnetycznym na 15 minut.
    10. Dodać 22,5 μl buforu do sporządzania zawiesiny i mieszać aż do zawieszenia kulek. Inkubować na ławce przez 2 minuty, a następnie przenieść na stojak magnetyczny, aż płyn stanie się klarowny (~5 min). Pobrać pipetę z 20 μl próbki do nowych probówek do PCR (7th).
  7. Doprowadź potrzebne elementy zestawu do temperatury pokojowej. Przenieść 5 μl mieszaniny starterów do PCR i 25 μl mieszanki wzorcowej PCR z zestawu do próbki (7. probówkaPCR) zawierającej zindeksowane próbki. Wymieszać próbkę i probówkę.
    1. Umieść probówki w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą. Uruchom program: 98 °C przez 30 s, następnie 15 cykli po 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s, 72 °C przez 5 min. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Oczyść próbki, dodając 50 μl wystarczająco wymieszanych kulek SPRI do probówki z próbką i pipety w celu połączenia. Pozostawić reakcję do inkubacji na blacie stołu przez 15 minut.
    1. Przenieś probówkę na stojak magnetyczny i inkubuj, aż płyn stanie się klarowny (~5 min). Odrzucić 95 μl supernatantu, pozostawiając 5 μl w każdej probówce.
    2. Pozostaw probówkę na stojaku magnetycznym i umyj, dodając 200 μl 80% etanolu. Pozostawić na co najmniej 30 s, a następnie wyjąć i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok prania. Pozostaw na stojaku magnetycznym na 15 minut do wyschnięcia.
    3. Dodać 32,5 μl buforu do sporządzania zawiesiny i mieszać, aż kulki zostaną całkowicie ponownie zawieszone. Inkubować na ławce przez 2 minuty, a następnie przenieść na stojak magnetyczny, aż płyn stanie się klarowny (~5 min). Pobrać pipetę 30 μl próbki z każdej probówki do nowej probówki do PCR.
    4. Oceń ilość i jakość DNA, powtarzając kroki 6.1 i 6.2 z odpowiednim chipem. Przejdź do kroku poolingu (krok 9).

8. Mała biblioteka RNA Przygotowanie dla sncRNAs. 17

UWAGA: Kroki protokołu oparte na instrukcjach producenta17.

  1. Rozpocznij przygotowanie małej biblioteki RNA od ~220 ng - ~1,1 μg/ μL próbek RNA zredukowanych globiną (4 μL).
  2. Podwiązanie adaptera
    1. Zwiąż adapter 3', dokładnie mieszając 1 μl adaptera, 2 μl wody wolnej od nukleaz i 4 μl próbki RNA o zredukowanej globinie. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 minuty, a następnie natychmiast umieścić na lodzie.
    2. Dodać 10 μl buforu do ligacji i 3 μl mieszanki enzymów ligacyjnych, wymieszać i inkubować w temperaturze 16 °C przez 18 godzin
      UWAGA: Wydłużenie czasu inkubacji próbki do 18 godzin w niższej temperaturze 16 °C jest zalecane w przypadku badań zainteresowanych metylowanymi gatunkami RNA, takimi jak RNA piwi. Dłuższy czas inkubacji pozwala na większą skuteczność podwiązania ze względu na klasę modyfikacji podczas fazy podwiązania adaptorowego 3'
      3. .
    3. Dodaj 1 μl startera do odwrotnej transkrypcji w 4,5 μl wody wolnej od nukleaz do mieszaniny ligacji, aby zapobiec tworzeniu się adaptera-dimeru nadmiaru adaptera 3'.
    4. Inkubować w nagrzanym termocyklerze zaprogramowanym na 5 minut w temperaturze 75 °C, 15 minut w temperaturze 37 °C, 15 minut w temperaturze 25 °C i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    5. Denaturować 1 μl wstępnie rozcieńczonego adaptera 5' na próbkę w termocyklerze w temperaturze 70 °C przez 2 minuty, a następnie natychmiast umieścić na lodzie.
    6. Dodać 1 μl denaturowanego adaptera 5', 1 μl 10x buforu ligacyjnego 5' i 2,5 μl enzymu ligacyjnego 5'. Wymieszać i inkubować w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę.
  3. Synteza i amplifikacja cDNA
    1. Dokładnie wymieszać, pipetując 30 μl RNA ligowanego 5′/3′-adapterem, 8 μl buforu pierwszej nici, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy. Inkubować mieszaninę w temperaturze 50 °C przez 60 minut. Natychmiast przejść do amplifikacji PCR lub podgrzewania, dezaktywować reakcję w temperaturze 70 °C przez 15 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. PCR amplifikować 40 μl reakcji odwrotnej transkryptazy, dodając 50 μl głównej mieszanki PCR, 2,5 μl startera RNA PCR, dodać 2,5 μl wyznaczonego wskaźnika startera RNA PCR do próbki i wodę wolną od nukleaz do całkowitej objętości 100 μl. Wymieszać pipetując. Przeprowadzić PCR w termocyklerze, stosując następujące warunki cykliczne: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 30 s; 11 cykli w temperaturze 94 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 62 °C przez 30 s i przedłużanie w temperaturze 70 °C przez 15 s; następnie końcowe przedłużenie w temperaturze 70 °C przez 5 minut; próbki mogą być przechowywane w cyklerze w temperaturze 4 °C.
    3. UWAGA: Indeksy są dodawane w celu łączenia próbek.
  4. Oczyszczanie próbek
    1. Z zestawu do oczyszczania DNA dodaj 500 μl buforu wiążącego (5 M Gu-HCl, 30% izopropanolu) do 100 μl amplifikowanej próbki PCR, aby umożliwić skuteczne wiązanie z błoną kolumny spinowej.
      UWAGA: Jeśli bufor wiążący ma dołączony wskaźnik pH, sprawdź, czy kolor mieszaniny jest żółty.
    2. Odpipetować 600 μl mieszaniny próbki i buforu wiążącego do wkładu filtracyjnego wewnątrz probówki zbiorczej o pojemności 2 ml, wirować przez 30-60 s przy 17 900 x g w wirówce stołowej. Odrzuć przepływ.
    3. Umyj wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej z 0,75 ml dołączonego zestawu buforu płuczącego (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 80% etanolu), wirując przez 30-60 s przy 17 900 x g w wirówce stołowej i odrzucając przepływ. Odwiruj wkład filtra do sucha przez dodatkowe 60 sekund.
    4. Umieść wkład filtra w czystej probówce zbiorczej o pojemności 1.5 ml. Dodać 30 μl buforu elucyjnego (10 mM Tris-HCl pH 8,5), odstawić kolumnę na 60 s, a następnie wirować przez 60 s przy 17 900 x g w wirówce stołowej.
  5. Oceń jakość próbki, powtarzając kroki 6.1 i 6.2 z odpowiednim chipem DNA. Przejdź do kroku łączenia (krok 9).

9. Łączenie próbek do sekwencjonowania

  1. Puluj próbki oznaczone kodami kreskowymi i poddane kontroli jakości, ustawiając i etykietując nowe probówki (lub 96-dołkową płytkę PCR) tak, aby zawierały próbki mRNA lub ncRNA. Przenieś 13 μl z każdej biblioteki 10 nM z kodem kreskowym do odpowiednich probówek (lub studzienek w nowej płycie) zgodnie z instrukcjami producenta16,17. Przesyłaj próbki zbiorcze do sekwencjonowania, upewnij się, że wybierasz podobne długości odczytu, jeśli próbki mają być uruchamiane na tym samym chipie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne próbki w naszym badaniu to próbki krwi pełnej zubożonej w globinę i rybo. Reprezentatywny wynik protokołu składa się z próbki biblioteki zubożonej w globinę o liczbie integralności RNA (RIN) powyżej 7 (Rysunek 1a) i stosunkach stężeń 260/280 nm na poziomie lub powyżej 2 (Rysunek 1b i 1c). Walidację wyniku próbki przeprowadzono za pomocą spektrofotometru, aby podać końcowe stężenie każdej biblioteki i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszym krytycznym krokiem w protokole, który umożliwił jego optymalizację, były dodatkowe etapy zubożania globiny, które umożliwiły uzyskanie wysokiej jakości odczytów z próbek krwi pełnej. Jednym z największych ograniczeń w stosowaniu krwi pełnej w badaniach sekwencjonowania jest duża liczba odczytów w próbce, które będą mapować na cząsteczki globiny i zmniejszać odczyty, które mogą mapować na inne cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania18. W związku z tym, optymalizując protokół dla nas...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była głównie wspierana przez USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, a częściowo przez USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Badanie to zostało częściowo wsparte powołaniem do Programu Uczestnictwa w Badaniach Rolniczych (Agricultural Research Service Research Participation Program) zarządzanego przez Oak Ridge Institute for Science and Education (ORISE) na mocy umowy międzyagencyjnej między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych (DOE) a Departamentem Rolnictwa USA. ORISE jest zarządzany przez Oak Ridge Associated Universities na podstawie umowy DOE nr 1. DE-AC05-06LUB2310.

Chcielibyśmy podziękować dr Kay Faaberg za zakaźne klony HP-PRRSV, dr Susan Brockmeier za pomoc w pracy ze zwierzętami biorącymi udział w eksperymencie oraz Sue Ohlendorf za pomoc sekretarską w przygotowaniu manuskryptu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki PAXgenePreAnalytix762165
Woda klasy biologii molekularnejThermoFisher10977-015
Zestaw do izolacji miRNA mirVanaThermoFisherAM1560
Rneasy MinElute Clean Up KitQIAGEN74204
100% etanolDecon Labs, Inc.2716
Probówki cienkościenne 0,2 mlThermoFisher98010540
1,5 ml probówki bez RNazy/DNazDowolny dostawca
Veriti 96-dołkowy termocyklerThermoFisher4375786R
Oligo do redukcji globiny (&alfa; 1)Dowolny dostawcaSekwencja GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Oligo do redukcji globiny (α 2)Dowolny dostawcaSekwencja TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Globin Reduction Oligo (β 1)Dowolny dostawcaSekwencja AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Oligo Globin Reduction Oligo (β 2)Dowolny dostawcaSekwencja GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization
, pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100-KCl
Millipore Sigma60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7,6Fisher ScientificBP1757-100
 -DTTThermoFisherY00147
 -MgCl2PromegaA351B
 -Biologia molekularna Klasa WodaThermoFisher10977-015
RNaza HThermoFisherAM2292
SUPERase-INThermoFisherAM2694Inhibitor rnazy
EDTAMillipore SigmaE7889
MikrowirówkaDowolny dostawca
  2100 Elektroforeza BioAnalyzer InstrumentAgilent TechnologiesG2938C
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent Technologies5067-1511
Agilent DNA o wysokiej czułości  ZestawAgilent Technologies5067-4626
TruSeq Zestaw do przygotowania biblioteki całkowitego RNA z Ribo-Zero ZestawIllumina RS-122-2201; Zestaw ludzi/myszy/szczurów A  (48 próbek, 12 indeksów)
TruSeq Stranded Total RNA Sample Przewodnik IlluminaDostępny on-line
RNAClean XP BeadsBeckmanCoulterA63987
AMPure XP BeadsBeckmanCoulterA63880
MicroAmp Optical 8-rurkowy pasekThermoFisherN80105800,2 ml cienkościenne rurki
MicroAmp Optical 8-rurkowa nasadka paskowaThermoFisherN801-0535
RNaza/DNaza - wolne od odczynników zbiornikiDowolny dostawca
SuperScript II Odwrotna transkryptazaThermoFisher18064-014
MicroAmp Optical 96-dołkowe płytkiThermoFisherN8010560W razie potrzeby zastosowano je zamiast płytek o pojemności 3 ml
MicroAmp Optyczna folia samoprzylepnaThermoFisher4311971
NEBNext Multiplex Zestaw do przygotowania małej biblioteki RNA dla Illumina® (Zestaw 1) New England BiolabsE73005mały zestaw RNA
NEBNext Multiplex Zestaw do przygotowania małej biblioteki RNA dla Illumina® (Zestaw 2) New England BiolabsE75805mały zestaw RNA
QIAQuick Zestaw do oczyszczania PCRQIAGEN28104
96S Super Magnet PlateALPAQUAA001322
Buffer-Tris-HCl mRNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
  2. Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084(2014).
  3. Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412(2015).
  4. Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256(2017).
  5. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  6. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  7. Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  8. Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf (2015).
  9. Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
  10. Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).
  11. Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
  12. Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
  13. Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9(2015).
  14. Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954(2014).
  15. Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf (2007).
  16. TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
  17. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018).
  18. Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041(2014).
  19. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916(2010).
  20. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Whole Blood RNAmRNA SequencingNon coding RNARNA IsolationGlobin ReductionLibrary PreparationNext Generation SequencingPhenol ChloroformRNase H DigestionFilter Cartridge

Related Articles