Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki znakowanych fluorescencyjnie neuronów myszy przy użyciu ręcznego sortowania i podwójnej transkrypcji in vitro z sekwencjonowaniem bezwzględnym (DIVA-Seq)

DOI:

10.3791/58690

⸱

26 października 2018

 , 
1Cold Spring Harbor Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje procedurę ręcznego sortowania w celu izolacji pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie neuronów, a następnie amplifikacji mRNA opartej na transkrypcji in vitro w celu sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki o dużej głębokości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (sekwencjonowanie RNA) jest obecnie powszechnie stosowanym narzędziem do oznaczania ekspresji genów. Dostępne na rynku platformy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek przetwarzają wszystkie komórki wejściowe bezkrytycznie. Czasami sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest stosowane przed wyizolowaniem specjalnie oznakowanej populacji będącej przedmiotem zainteresowania. Ograniczeniem FACS jest potrzeba dużej liczby komórek wejściowych ze znacznie znakowanymi frakcjami, co jest niepraktyczne w przypadku zbierania i profilowania rzadkich lub słabo znakowanych populacji neuronów z mózgu myszy. W tym miejscu opisujemy metodę ręcznego zbierania rzadkich, znakowanych fluorescencyjnie pojedynczych neuronów ze świeżo zdysocjowanej tkanki mózgowej myszy. Proces ten pozwala na wychwytywanie pojedynczych znakowanych neuronów o wysokiej czystości, a następnie integrację z protokołem amplifikacji opartym na transkrypcji in vitro, który zachowuje endogenne proporcje transkryptów. Opisujemy metodę podwójnej amplifikacji liniowej, która wykorzystuje unikalne identyfikatory cząsteczek (UMI) do generowania indywidualnych liczb mRNA. Dwie rundy amplifikacji skutkują wysokim stopniem detekcji genu na pojedynczą komórkę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (sekwencjonowanie RNA) zmieniło badania transkryptomiczne. Podczas gdy sekwencja RNAseq pojedynczej komórki na dużą skalę może być wykonywana przy użyciu różnych technik, takich jak droplets1,2, microfluidics3, nanogrids4 i microwells5, większość metod nie może sortować zdefiniowanych typów komórek, które wyrażają genetycznie kodowane fluorofory. Aby wyizolować wybraną populację komórek, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest często używane do sortowania oznakowanych komórek w trybie pojedynczej komórki. Jednak FACS ma pewne ograniczenia i wymaga skrupulatnych etapów przetwarzania próbek. Po pierwsze, zwykle potrzebna jest duża liczba komórek wejściowych (często kilka milionów komórek na ml), przy czym znaczna część (>15–20%) zawiera znakowaną populację. Po drugie, przygotowanie komórek może wymagać wielu rund wirowania w gradionym gradimencie gęstości w celu usunięcia frakcji glejowej, zanieczyszczeń i grudek komórek, które w przeciwnym razie mogłyby zatkać dyszę lub komórkę przepływową. Po trzecie, FACS zwykle stosuje etapy barwienia i odbarwiania do barwienia żywego/martwego (np. 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), jodek propidyny (PI) i barwniki Cytotracker), które zajmują dodatkowy czas. Po czwarte, zgodnie z zasadą sortowania dwukolorowego (takiego jak DAPI i zielone/czerwone białko fluorescencyjne (GFP/RFP)), zwykle potrzebne są dwie próbki i jedna kontrola, co wymaga przetworzenia nieoznakowanej próbki oprócz pożądanego szczepu myszy. Po piąte, filtrowanie jest często wykonywane wielokrotnie przed i w trakcie sortowania próbek, aby proaktywnie zapobiegać zatykaniu się linii pobierania próbek w maszynie FACS. Po szóste, w najczęściej używanych konfiguracjach FACS należy przeznaczyć czas na inicjalizację i stabilizację strumienia płynu oraz przeprowadzenie kalibracji kropel. Po siódme, próbki kontrolne są zwykle uruchamiane w sekwencji przed faktycznym pobraniem próbki w celu ustawienia matryc kompensacji, odrzucenia dubletów, ustawienia bramek itp. Użytkownicy albo wykonują kroki szóste i siódme samodzielnie z wyprzedzeniem, albo wymagają pomocy technika równolegle. Wreszcie, po FACS, często wykonuje się kroki, aby upewnić się, że w każdej studzience obecne są tylko oznakowane pojedyncze komórki; Na przykład poprzez sprawdzanie próbek w konfiguracji do przesiewania o wysokiej zawartości, takiej jak szybki imager płytowy.

Aby obejść kroki opisane powyżej i ułatwić stosunkowo szybkie, ukierunkowane sekwencjonowanie małej populacji pojedynczych, fluorescencyjnie znakowanych neuronów, opisujemy procedurę ręcznego sortowania, po której następują dwie rundy bardzo czułego protokołu amplifikacji in vitro, zwanego podwójną transkrypcją in vitro z sekwencjonowaniem bezwzględnym (DIVA-Seq). Amplifikacja RNA i generowanie biblioteki cDNA zostały zaadaptowane z Eberwine i wsp.6 oraz Hashimshony et al.7, z pewnymi modyfikacjami, aby dopasować je do mysich interneuronów, które mają mniejsze objętości komórkowe; Co więcej, odkryliśmy również, że jest równie przydatny dla pobudzających neuronów piramidowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez IACUC w Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).

1. Ręczne sortowanie fluorescencyjnie znakowanych neuronów myszy

  1. Pociągnij szklane mikrokapilary (patrz tabela materiałów) do średnicy wyjściowej 10–15 μm za pomocą ściągacza kapilarnego z następującymi ustawieniami: ciepło: 508, pociągnięcie: ślepe, vel: puste, czas: puste.
  2. Podłącz elastyczną rurkę silikonową o długości 120–150 cm (średnica wewnętrzna ~0,8 mm) do membranowego filtra strzykawkowego z polifluorku winylidenu (PVDF) o średnicy 0,2 μm i dwukierunkowego zaworu rurkowego za pomocą odpowiednich łączników do rurek.
  3. Przygotować 500 ml schłodzonego (4 °C) sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF, Tabela 1) i natlenić przez bulgotanie 5% tlenu o stężeniu dwutlenku węgla przez kamień napowietrzający przez 15 minut lub do momentu, gdy roztwór całkowicie się klaruje.
  4. Przygotuj 100 ml ACSF z koktajlem blokerów aktywności w zlewce o pojemności 150 ml (Tabela 1).
  5. Przygotować 100 ml ACSF z 1 mg/ml proteazy Streptococcus frakcji IV w zlewce o pojemności 150 ml (Tabela 1).
  6. Przygotować 100 ml ACSF z 1% roztworem płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w zlewce o pojemności 150 ml i natlenić 5% dwutlenkiem węgla przez kamień napowietrzający.
  7. Wypreparuj mózg myszy poddanej eutanazji, otwierając czaszkę małymi nożyczkami i wydobywając świeży mózg za pomocą cienkich kleszczy, nie uszkadzając kory mózgowej.
    UWAGA: Myszy dowolnej odmiany, wieku i płci mogą być używane zgodnie z potrzebami. Nie zamrażaj mózgu ani nie wykonuj ręcznego sortowania na myszach, którym wstrzyknięto wirusy lub inne niebezpieczne/zakaźne czynniki.
  8. Utrzymuj mózg w schłodzonym i natlenionym ACSF, pozostawiając kamień napowietrzający przyczepiony do 5% dwutlenku węgla, który równoważy tlen przez cały czas trwania sekcji.
  9. Umieść mózg na uchwycie wibratomicznym i wytnij odcinki czołowe lub strzałkowe o grubości 300 μm. Zbierz tyle sekcji, ile potrzeba, aby uzyskać co najmniej ~10–50 oznaczonych komórek do kilkuset komórek. Połóż plastry na uchwycie na plastry z bawełnianą siatką, umieszczonym w zlewce, tak aby były skąpane w natlenionym ACSF.
  10. Przenieś świeże plastry do zlewki zawierającej ACSF z blokerami aktywności i blokuj przez 15–20 minut w temperaturze pokojowej. Kontynuuj bulgotanie tlenu za pomocą kamienia napowietrzającego.
  11. Przenieś plastry do zlewki zawierającej ACSF z roztworem proteazy, aby przeprowadzić łagodne trawienie w temperaturze pokojowej: 20–30 minut dla zwierząt P4-14 lub do 45–60 minut dla zwierząt P28-56. Kontynuuj bulgoczący tlen.
  12. Wypłukać ACSF proteazą, przenosząc plastry z powrotem do zlewki zawierającej ACSF z roztworem blokerów aktywności przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. Kontynuuj bulgoczący tlen.
  13. Przenieść poszczególne sekcje na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą ACSF z 1% FBS w temperaturze pokojowej. Pod fluorescencyjnym zakresem preparacji mikrodyparuj obszary i warstwy zainteresowania mające co najmniej 10-50 komórek (do kilkuset). Wykonaj mikrodysekcję za pomocą cienkich kleszczy lub przymocowując igły iniekcyjne o wadze 22–28 G do drewnianych uchwytów (szaszłyków).
  14. Za pomocą pipety Pasteura przenieś wycięte kawałki do probówki o pojemności 2 ml zawierającej ~0,8 ml 1% FBS w roztworze ACSF.
  15. Rozwarstwioną tkankę należy rozwarstwić w probówce do mikrofugi w temperaturze pokojowej. Wykonaj trzy pipety Pasteura z długimi nóżkami o zmniejszających się średnicach wylotów, przetaczając je nad otwartym ogniem. Wykonaj ~10 pociągnięć każdą pipetą, zaczynając od największej, a kończąc na najmniejszej.
  16. Dozować zdysocjowane komórki na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą natleniony ACSF (w razie potrzeby szalkę Petriego można cienko pokryć 5 mm 1% agaru lub klarownego związku silikonowego w stosunku 1:10). Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  17. Odczekaj ~5-7 minut, aż komórki stopniowo się uspokoją, a następnie obserwuj sygnał GFP/RFP pod mikroskopem preparacyjnym.
    UWAGA: Pojedyncze komórki, szczątki i małe grudki będą widoczne w jasnym polu (BF).
  18. Pobieraj jednorazowo 10–15 komórek GFP/RFP za pomocą pipety kapilarnej (z kroku 1.1) przymocowanej do elastycznej silikonowej rurki (średnica wewnętrzna 0,4–0,8 mm) i dozuj komórki do 100-milimetrowej szalki Petriego zawierającej świeżo natleniony ACSF.
  19. Blokując koniec zaworu rurki językiem, umieść kapilar blisko interesującej się komórki. Po odciążeniu bloku należy wychwycić komórki za pomocą działania kapilarnego i szybko zablokować je ponownie, aby zapobiec przedostawaniu się nadmiaru płynu do pipety. Dozować komórki na 100-milimetrową szalkę Petriego ze świeżo natlenionym ACSF, delikatnie, obserwując końcówkę kapilary pod optyką fluorescencyjną mikroskopu preparacyjnego. Staraj się zebrać łącznie ~100–150 komórek.
  20. Powtórz krok 1.19 jeszcze raz lub dwa razy (w zależności od zanieczyszczeń) i przenieś w sumie ~50–75 komórek na nową szalkę Petriego o średnicy 100 mm, upewniając się, że zanieczyszczenia, takie jak zanieczyszczenia, są minimalne w optyce DIC (Different-field Differentance Contrast
    21. ).
  21. Na koniec, za każdym razem używając świeżej pipety mikrokapilarnej, wybierz pojedynczą komórkę o objętości nie większej niż 0,5 μl i wyrzuć ją do pojedynczej probówki do mikrorurki o pojemności 0,2 ml (lub jednego paska ośmiu probówek do mikrokrówek o pojemności 0,2 ml) zawierającej 1 μl buforu do pobierania próbek ze starterami N10B1-N10B96 (Tabela 2). Złamać końcówkę pipety w probówce do mikrofuge, aby upewnić się, że komórka pozostaje w buforze zbiorczym. Wyrzuć pipety.
  22. Zamrażać komórki, umieszczając probówki na suchym lodzie i przechowując je przez długi czas w zamrażarce o temperaturze -80 °C, dopóki nie będą gotowe do przetworzenia w celu amplifikacji RNA.

2. Pierwsza runda amplifikacji RNA

UWAGA: Poniższa procedura dotyczy pojedynczego paska ośmiu probówek do mikrofuge o pojemności 0,2 ml. W razie potrzeby skaluj reakcje.

  1. Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA (pierwsza runda).
    1. Podgrzewać paski od kroku 1.22 w temperaturze 70 °C przez 5 minut, a następnie 4 °C przez 5 minut; powtórzyć dwukrotnie.
    2. Złóż na lodzie mieszankę główną odwrotnej transkryptazy (RT)/główną mieszankę syntezy pierwszej nici, używając następujących składników (patrz tabela materiałów): 10x bufor pierwszej nici (2 μL), mieszanina dNTP (4 μL), inhibitor RNazy (1 μL) i enzym (1 μL).
    3. Krótko odwiruj pasek na wirówce stołowej, aby zebrać wszystko na dole. Trzymaj na lodzie.
    4. Dodać 1 μl głównej mieszanki RT/głównej mieszanki syntezy pierwszej nici do powyższych probówek (całkowita objętość 1 μl buforu próbki z pobrania komórek + 1 μl RT = 2 μl/probówkę). Dobrze wymieszać przez pipetowanie. Krótko zakręć, aby zebrać całą zawartość na dole i trzymać ją na lodzie.
    5. Inkubować powyższą probówkę lub probówki w temperaturze 42 °C przez 2 godziny w piecu powietrznym. Natychmiast umieść probówki na lodzie, aby zakończyć reakcję i przejść do etapu syntezy drugiej nici.
  2. Zsyntetyzuj drugą nić cDNA (pierwsza runda).
    1. Sporządzić drugą nić mieszanki głównej (80 μl) na lodzie w następującej kolejności w probówce o pojemności 1,5 ml: woda wolna od nukleaz (63 μl), 10x bufor drugiej nici (10 μl), mieszanina dNTP (4 μl), polimeraza DNA (2 μl) i RNaza H (1 μl). Dobrze wymieszaj składniki, wirując, a następnie zakręć, aby zebrać na dnie i trzymaj na lodzie.
    2. Uruchom termocykler, uruchom następujący program, aby wstępnie schłodzić urządzenie, bądź gotowy do rozpoczęcia kroku 2.2.3 (ogrzewanie pokrywy = wyłączone; 16 °C przez 2 godziny, 4 °C wstrzymanie) i zatrzymaj się w temperaturze 16 °C.
    3. Dodać 80 μl/pasek (lub 10 μl/tubę) drugiej mieszanki wzorcowej nici do każdej probówki paska i przechowywać na lodzie. Przenieś pasek do termocyklera i wznów krok 16 °C zainicjowany powyżej. Inkubować pas przez 2 godziny w temperaturze 16 °C.
    4. Po etapie syntezy drugiej nici umieść probówki na lodzie, aby przejść do następnego etapu oczyszczania cDNA.
  3. Oczyść dwuniciowe cDNA (pierwsza runda).
    UWAGA: Wszystkie wirowania przeprowadza się przy ~ 8 000 x g w temperaturze pokojowej. Nigdy nie przekraczaj 16 000 x g, aby uniknąć uszkodzenia wkładu filtra.
    1. Rozpocznij podgrzewanie 100 μl wody wolnej od nukleaz do temperatury 50–55 °C w celu późniejszego wykorzystania w suchym bloku grzewczym. Nigdy nie przekraczaj 58 °C, aby zapobiec częściowej denaturacji cDNA.
    2. Dodać 250 μl buforu wiążącego cDNA do probówki o pojemności 1,5 ml. Sprawdzić, czy w buforze nie ma osadów, a następnie ogrzać roztwór buforowy do temperatury 37 °C przez 10 minut, aby ponownie rozpuścić osady.
    3. Przenieś cDNA z pojedynczego paska z 8 probówkami do buforu wiążącego cDNA. Połącz ogniwa na tym etapie w celu przeprowadzenia dalszych procesów (8 ogniw w 1 probówce). Dokładnie wymieszaj, pipetując 2-3 razy i trzepiąc 3-4 razy. Zakręć, aby zebrać zawartość na dole.
    4. Mocno włóż wkład filtra cDNA do probówek do płukania (z zestawu do transkrypcji in vitro (IVT)). Dodaj powyższą mieszankę do środka filtra. Wirować przy 8 000 x g przez ~1 minutę lub do momentu, gdy przejdzie przez filtr. Wyrzuć przepływ i wymień rurkę myjącą.
    5. Dodać 500 μl buforu płuczącego z zestawu IVT do kolumny.
      UWAGA: Upewnij się, że etanol został wcześniej dodany do bufora myjącego.
    6. Wirować przy 8 000 x g przez ~1 minutę lub do momentu, gdy przejdzie przez filtr. Wyrzucić przepływowy płyn i ponownie odwirować przy 8 000 x g przez ~1 minutę, aby opróżnić wkład.
    7. Przenieś filtr cDNA do probówki elucyjnej cDNA (probówka 1,5 ml bez nukleazy). Nałóż 8,5 μl wstępnie podgrzanej wody wolnej od nukleaz na środek filtra. Odczekać 2 minuty i odwirować przy 8 000 x g przez ~1,5 min.
    8. Ponownie wypłukać 8,5 μl wstępnie podgrzanej wody wolnej od nukleaz i natychmiast przejść do pierwszej rundy IVT.
      UWAGA: Dwuniciowa objętość odzysku cDNA wyniesie ~16 μL.
  4. Wykonaj reakcję transkrypcji in vitro (IVT) w celu produkcji amplifikowanego RNA (aRNA) z cDNA (pierwsza runda).
    1. Ustawić piec powietrzny do hybrydyzacji na 37 °C.
    2. Przygotować mieszankę wzorcową do IVT na lodzie w następującej kolejności: do 16 μl eluowanego dwuniciowego cDNA z kroku 2.3.8 dodać 4 μl roztworu T7 ATP (75 mM); 4 μl roztworu T7 CTP (75 mM); 4 μl roztworu T7 GTP (75 mM); 4 μl roztworu T7 UTP (75 mM); 4 μL buforu reakcyjnego T7 10x; i 4 μL T7 mieszanina enzymów. Dobrze wymieszaj, odwiruj i przytrzymaj na lodzie.
    3. Dodać 24 μl głównej mieszanki IVT do każdej probówki zawierającej 16 μl cDNA. Wymieszać zawartość, delikatnie i dokładnie pipetując. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 14 h.
      UWAGA: Inkubacja przez <12 h poważnie wpływa na plon.
    4. Dodać 60 μl wody wolnej od RNaz poddanej działaniu pirowęglanu dietylu (bez DEPC), aby zwiększyć objętość do 100 μl i zatrzymać reakcję IVT.
  5. Oczyść aRNA.
    UWAGA: Wszystkie wirowania przeprowadza się przy ~ 8 000 x g w temperaturze pokojowej. Nigdy nie przekraczaj 16 000 x g, aby uniknąć uszkodzenia wkładu filtra.
    1. Rozpocznij podgrzewanie ~200 μL wody wolnej od nukleaz do 50–55 °C w celu późniejszego wykorzystania w suchym bloku grzewczym lub maszynie do PCR. Nigdy nie przekraczaj 58 °C, aby zapobiec częściowej denaturacji aRNA.
    2. Przenieś aRNA do 1,5 ml probówki wolnej od nukleazy. Dodać 350 μl buforu wiążącego aRNA do każdej próbki aRNA. Dodać 250 μl 100% etanolu do każdej probówki i wymieszać 3 razy pipetując (nie mieszać i nie wirować).
    3. Natychmiast przenieś mieszaninę do kolumny oczyszczającej RNA, delikatnie dodając ją do środka wkładu filtrującego. Wirować przy 8 000 x g przez ~1 minutę lub do momentu, gdy mieszanina całkowicie przejdzie przez filtr. Wyrzuć przelew i ponownie wykorzystaj rurkę do zbierania odpadów
      UWAGA: RNA zacznie się wytrącać po dodaniu etanolu.
    4. Dodać 650 μl buforu do przemywania do każdego wkładu filtracyjnego. Wirować przez ~1 min przy 8,000 x g lub do momentu, gdy cały bufor przejdzie przez . Wyrzuć przepływowy i obracaj filtry przez dodatkowe ~1 minutę, aby usunąć ślady buforu myjącego.
    5. Przenieś filtr do świeżej probówki do pobierania aRNA. Dodać 100 μl podgrzanej (50-55 °C) wody wolnej od nukleaz do środka filtra. Odczekaj 2 minuty, a następnie odwiruj przez ~1,5 minuty przy 8 000 x g lub do momentu, gdy przejdzie do probówki zbiorczej.

3. Wzmocnienie drugiej rundy

  1. Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA (druga runda).
    1. Przenieś aRNA z kroku 2.5.5 do probówki do mikrofuge o pojemności 200 μl i zagęść próżniowo 100 μl elutantu do 10 μl. Nie używając ciepła, uruchom koncentrator próżniowy na 65 minut. Porównaj z 10 μl wody w probówce o pojemności 200 μl, aby oszacować zmniejszoną objętość.
    2. Rozgrzej powietrzny piekarnik do hybrydyzacji do 42 °C.
    3. Dodaj 2 μl losowych starterów heksamerowych z zestawu IVT do aRNA, krótko zwiruj i zakręć, aby zebrać zawartość.
    4. Inkubować probówkę do mikrofuge w temperaturze 70 °C przez 10 minut w termocyklerze, a następnie umieścić ją na lodzie.
    5. Przygotuj następującą główną mieszankę RT: 2 μl 10x buforu do syntezy pierwszej nici, 4 μl mieszanki dNTP, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl enzymu ArrayScript. Dobrze wymieszaj w probówce do mikrofugi o pojemności 200 μl, delikatnie wirując, a następnie odwiruj, aby zebrać zawartość i umieść na lodzie.
    6. Dodać 8 μl mieszanki wzorcowej RT (pierwsza nić) do każdej probówki do mikrofuge. Umieścić probówki w inkubatorze powietrza o temperaturze 42 °C na 2 godziny.
    7. Dodać 1 μl RNaseH do powyższej reakcji. Dobrze wymieszaj, pipetując 2-3 razy i trzepiąc 3-4 razy, a następnie wiruj, aby zebrać zawartość. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut na maszynie do PCR. Po inkubacji natychmiast przejdź do etapu syntezy drugiej nici.
  2. Zsyntetyzuj drugą nić cDNA (druga runda).
    1. Dodać 3 μl startera T7-RA5 (przy rozcieńczeniu roboczym 25 ng/μl, tabela 2) i 2 μl wody wolnej od RNaz do każdej próbki cDNA. Dobrze wymieszaj i zakręć, aby zebrać zawartość.
    2. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut w termocyklerze. Umieść reakcję na lodzie.
    3. Przygotować główną mieszankę RT (druga nić) na lodzie: 58 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μl 10 x buforu drugiej nici, 4 μl mieszanki dNTP i 2 μl polimerazy DNA. Dobrze wymieszaj, wirując i obracając, aby zebrać zawartość. Trzymaj na lodzie.
    4. Dodać 74 μl powyższej mieszanki do każdej probówki z kroku 3.2.2. Dobrze wymieszaj, pipetując 2-3 razy i trzepając 3-4 razy, a następnie odwiruj, aby zebrać zawartość. Trzymaj na lodzie i trzymaj.
    5. Wstępnie schłodzić termocykler do 16 °C, wyłączając ogrzewanie pokrywy. Umieścić probówki w termocyklerze na 2 godziny w temperaturze 16 °C.
    6. Po etapie syntezy drugiej nici umieść probówki na lodzie, aby przejść do etapu oczyszczania cDNA lub zamroź w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: przed zamrożeniem zaleca się oczyszczanie cDNA.
  3. Wykonaj oczyszczanie cDNA (druga runda).
    UWAGA: Wszystkie wirowania przeprowadza się przy ~ 8 000 x g w temperaturze pokojowej. Nigdy nie przekraczaj 16 000 x g, aby uniknąć uszkodzenia wkładu filtra.
    1. Rozpocznij podgrzewanie wody wolnej od nukleaz do temperatury 50–55 °C w celu późniejszego wykorzystania w suchym bloku grzewczym. Nigdy nie przekraczaj 58 °C, aby zapobiec częściowej denaturacji cDNA.
    2. Przenieś cDNA do probówki bez nukleazy o pojemności 1,5 ml. Do każdej probówki dodać 250 μl buforu wiążącego cDNA. Sprawdzić, czy w buforze nie ma osadów i ogrzać roztwór buforowy do temperatury 37 °C przez 10 minut w celu ponownego rozpuszczenia. Dokładnie wymieszaj, pipetując 2-3 razy i trzepając 3-4 razy. Zakręć, aby zebrać zawartość.
    3. Mocno włóż wkład filtra cDNA do rurek myjących. Dodaj powyższą mieszankę do środka filtra. Wirować przy 8 000 x g przez ~1 minutę lub do momentu, gdy przejdzie przez filtr. Wyrzuć przepływ i wymień rurkę myjącą.
    4. Dodać 500 μl buforu do płukania. Upewnij się, że etanol został wcześniej dodany do buforu do mycia. Wirować przy 8 000 x g przez ~1 minutę lub do momentu, gdy przejdzie przez filtr.
    5. Wyrzucić przepływowy płyn i ponownie odwirować przy 8 000 x g przez ~1 minutę, aby opróżnić wkład. Przenieś filtr cDNA do probówki elucyjnej cDNA.
    6. Nałóż 8,5 μl wstępnie podgrzanej wody wolnej od nukleaz na środek filtra. Odczekać 2 minuty i odwirować przy 8 000 x g przez ~1,5 min. Ponownie wypłukać za pomocą dodatkowych 8,5 μl wstępnie podgrzanej wody wolnej od nukleaz.
      UWAGA: Dwuniciowa objętość odzysku cDNA wyniesie ~16 μL.
    7. Natychmiast przejdź do drugiej rundy IVT lub zamroź cDNA w temperaturze -20 °C przez noc.
  4. Wykonaj drugą rundę produkcji aRNA przez IVT.
    1. Ustaw powietrzny piekarnik hybrydyzacyjny na 37 °C (nastawa 36 °C).
    2. Przygotować mieszankę wzorcową do IVT na lodzie w następującej kolejności: do 16 μl eluowanego dwuniciowego cDNA z kroku 3.3.7 dodać 4 μl roztworu T7 ATP (75 mM); 4 μl roztworu T7 CTP (75 mM); 4 μl roztworu T7 GTP (75 mM); 4 μl roztworu T7 UTP (75 mM); 4 μL buforu reakcyjnego T7 10x; i 4 μL T7 mieszanina enzymów. Dobrze wymieszaj, krótko obróć, aby zebrać zawartość i przytrzymaj lód.
    3. Dodać 24 μl głównej mieszanki IVT do każdej probówki zawierającej 16 μl cDNA. Wymieszać zawartość, delikatnie i dokładnie pipetując. Probówkę inkubować w temperaturze 37 °C przez 14 h.
      UWAGA: Inkubacja przez < 12 h poważnie wpływa na plon.
    4. Dodać 60 μl wody wolnej od RNaz niepoddanej działaniu DEPC, aby zwiększyć objętość do 100 μl i zatrzymać reakcję IVT.
  5. Wykonaj oczyszczanie aRNA (druga runda).
    UWAGA: Wszystkie wirowania przeprowadza się przy ~ 8 000 x g w temperaturze pokojowej. Nigdy nie przekraczaj 16 000 x g, aby uniknąć uszkodzenia wkładu filtra.
    1. Rozpocznij podgrzewanie ~200 μL wody wolnej od nukleaz do 50–55 °C w celu późniejszego wykorzystania w suchym bloku grzewczym lub maszynie do PCR. Nigdy nie przekraczaj 58 °C, aby zapobiec częściowej denaturacji aRNA.
    2. Przenieś aRNA do probówki bez nukleazy o pojemności 1,5 ml. Dodać 350 μl buforu wiążącego aRNA do każdej próbki aRNA. Do każdej probówki dodać 250 μl 100% etanolu klasy ACS i wymieszać 3 razy przez pipetowanie (nie wirować w celu mieszania i wirowania).
      UWAGA: RNA zacznie się wytrącać po dodaniu etanolu.
    3. Natychmiast przenieś mieszaninę do kolumny oczyszczającej RNA, delikatnie dodając ją do środka wkładu filtrującego. Wirować przy 8 000 x g przez ~1 minutę lub do momentu, gdy mieszanina całkowicie przejdzie przez filtr. Wyrzuć przepływ i ponownie użyj rurki do zbierania odpadów.
    4. Dodać 650 μl buforu do przemywania do każdego wkładu filtracyjnego. Wirować przez ~1 min przy 8,000 x g lub do momentu, gdy cały bufor przejdzie przez . Wyrzuć przepływowy i obracaj filtry przez dodatkowe ~1 minutę, aby usunąć ślady buforu myjącego.
    5. Przenieś filtry do świeżej probówki do pobierania aRNA. Dodaj 100 μl podgrzanej wody wolnej od nukleaz do środka filtra. Odczekaj 2 minuty, a następnie odwiruj przez ~1,5 minuty przy 8 000 x g lub do momentu, gdy minie.
    6. Podwielokrotność 2 μl w probówce do analizy rozprzestrzeniania się spektrofotometru (o długości fali 260 nm) i bioanalizatora w celu sprawdzenia wydajności i jakości aRNA.
      UWAGA: Stężenie musi wynosić co najmniej 5 ng/μL; W przeciwnym razie odrzuć próbkę. Próbka może być przechowywana przez ~1 rok w temperaturze -80 °C. Unikać zamrażania i rozmrażania próbek.
    7. Sprawdź próbki za pomocą bioanalizatora, aby zobrazować prawidłowe rozprzestrzenianie się produktów aRNA zgodnie z protokołem producenta (Rysunek 2).

4. Wzmocniona fragmentacja RNA i oczyszczanie

  1. Wymieszać na lodzie (całkowita objętość 40 μl, połączyć 2 probówki z nienakładającymi się kodami kreskowymi próbki aRNA): 36 μl aRNA (łącznie 200 ng) i 4 μl buforu do fragmentacji RNA. Inkubować mieszaninę w temperaturze 94 °C przez 90 s.
  2. Natychmiast przenieść mieszaninę do lodu i dodać 4 μl buforu zatrzymującego fragmentację RNA. Dostosuj objętość do 100 μl, dodając 56 μl wody wolnej od nukleaz.
  3. Dodać 350 μl buforu RLT z zestawu do oczyszczania RNA (patrz tabela materiałów) i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Dodać 250 μl EtOH, dobrze wymieszać przez pipetowanie i przenieść próbkę do kolumny wirowej do oczyszczania RNA. Wirowanie przez 15 s przy 8,000 x g.
  4. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i dodać 500 μl buforu RPE. Wirowanie przez 15 s przy 8,000 x g. Odrzuć przepływ. Dodaj 500 μl 80% EtOH i wiruj przez 2 minuty w temperaturze 8 000 x g.
  5. Przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej, otwórz pokrywę kolumny i wiruj przez 5 minut z pełną prędkością.
  6. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i eluować 16 μl wody wolnej od nukleaz, wirując z pełną prędkością przez 1 minutę.

5. Przygotowanie biblioteki

UWAGA: IVT mogą być w tym momencie łączone, jeśli nie ma nakładania się używanych kodów kreskowych. Czas zabiegu fosfatazy wynosi 40 min. Czas leczenia kinazą polinukleotydową wynosi 1 h.

  1. Do 16 μl rozdrobnionego aRNA w probówce PCR o pojemności 0,7 ml dodaj 4 μl następującej mieszanki: 2 μl 10x buforu fosfatazy, 1 μl fosfatazy antarktycznej i 1 μl rekombinowanego inhibitora rybonukleazy (np. RNaseOUT). Inkubować w termocyklerze zgodnie z następującym protokołem: 37 °C przez 30 min, 65 °C przez 5 min i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  2. Do probówki PCR o pojemności 0,7 ml z kroku 5.1 dodać 30 μl następującej mieszanki: 17 μl wody wolnej od nukleaz, 5 μl 10-krotnego buforu fosfatazy, 5 μl ATP (10 mM), 1 μl rekombinowanego inhibitora rybonukleazy i 2 μl PNK. Inkubować w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 60 minut, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  3. Wykonaj czyszczenie kolumny z fosfatazy i aRNA poddanego działaniu PNK.
    1. Dostosuj objętość do 100 μl, dodając 50 μl wody wolnej od nukleaz. Dodaj 350 μl buforu RLT i dobrze wymieszaj. Dodać 250 μl EtOH, dobrze wymieszać przez pipetowanie i przenieść próbkę do kolumny wirowej do oczyszczania RNA.
    2. Wirować przez 15 s w temperaturze 8 000 x g. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i dodać 500 μl buforu RPE.
    3. Wirować przez 15 s w temperaturze 8 000 x g. Wyrzucić przepływowy płyn i dodać 500 μl 80% EtOH.
    4. Wirować przez 2 minuty przy 8,000 x g. Przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej, otwórz pokrywę kolumny i wiruj przez 5 minut z pełną prędkością.
    5. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i eluować 14 μl wody wolnej od nukleaz, wirując z pełną prędkością przez 1 minutę, aby odzyskać ~10 μl objętości materiału. Odrzuć kolumnę. Zmniejsz objętość do 5 μL za pomocą koncentratora próżniowego na ~10 min.
  4. Nałóż adapter 3' za pomocą zestawu komercyjnego (patrz tabela materiałów).
    1. Rozcieńczyć adapter 3' (RA3) z zestawu TrueSeq 3 folds wodą wolną od nukleaz i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    2. Do 5 μl fosfatazy i RNA poddanego działaniu PNK dodać 1 μl rozcieńczonego adaptera 3'. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 minuty, a następnie natychmiast umieścić probówkę na lodzie, aby zapobiec tworzeniu się drugorzędowej struktury.
    3. Dodać 4 μl następującej mieszanki: 2 μl 5x buforu ligacyjnego HM (HML), 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl ligazy T4 RNA 2 (skróconej). Inkubować probówkę na wstępnie podgrzanym termocyklerze w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę (nieogrzewana lub z otwartą pokrywą).
    4. Trzymając probówkę reakcyjną na termocyklerze, dodaj 1 μl roztworu zatrzymującego (STP) i delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 6–8 razy, aby dokładnie wymieszać. Kontynuować inkubację probówki reakcyjnej na termocyklerze w temperaturze 28 °C przez 15 minut, a następnie umieścić probówkę na lodzie.
    5. Dodać 3 μl wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 12 μl. Użyć 6 μl, a pozostałe 6 μl przechowywać w temperaturze -80 °C.
  5. Wykonaj reakcję odwrotnej transkrypcji.
    1. W probówce do PCR połącz następujące elementy: 6 μl RNA ligowanego adapterem i 1 μl startera RNA RT (RTP). Inkubować probówkę w temperaturze 70 °C przez 2 minuty, a następnie natychmiast umieścić probówkę na lodzie.
    2. Dodać 5,5 μl następującej mieszanki: 2 μl 5x buforu pierwszej nici, 0,5 μl 12,5 mM mieszanki dNTP, 1 μl 100 mM DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy. Inkubować probówkę w nagrzanym termocyklerze w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę, a następnie umieścić probówkę na lodzie (próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C).
  6. Wykonaj amplifikację PCR w 11-15 cyklach, aby wzbogacić produkt ligowany 5', 3'-starterem.
    1. Do każdej reakcji odwrotnej transkrypcji dodać 35,5 μl następującej mieszanki: 8,5 μl ultraczystej wody, 25 μl mieszanki PCR (PML) i 2 μl startera RNA PCR (RP1). Do każdej reakcji dodać 2 μl jednoznacznie indeksowanego startera RNA PCR (RPIX, X = 1 do 24).
    2. Amplifikować probówkę w termocyklerze, stosując następujące warunki cykliczne PCR: 98 °C przez 30 s; 12-15 cykli po 98 °C przez 10 s; 60 °C przez 30 s; 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 10 min; następnie utrzymać w temperaturze 4 °C.

6. Czyszczenie produktu PCR i wybór rozmiaru

  1. Rozgrzej kulki magnetyczne AmpureXP w temperaturze pokojowej. Wiruj kulki, aż będą dobrze zdyspergowane, a następnie dodaj 50 μl do 50 μl reakcji PCR (produkt 1:1 PCR: kulki). Wymieszaj zawartość do dziesięciu razy, aby dokładnie wymieszać.
  2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Umieścić na stojaku magnetycznym na co najmniej 5 minut, aż płyn stanie się klarowny. Usunąć i wyrzucić 95 μl supernatantu.
  3. Dodać 200 μl świeżo przygotowanego 80% EtOH. Inkubować przez co najmniej 30 s, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek. Powtórz to jeszcze raz.
  4. Suszyć koraliki na powietrzu przez 15 minut lub do całkowitego wyschnięcia. Zawiesić za pomocą 32,5 μl buforu do sporządzania zawiesiny. Odpipetuj całą objętość w górę i w dół dziesięć razy, aby dokładnie wymieszać.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Umieścić na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż płyn stanie się klarowny. Przenieść 30 μl supernatantu do nowej probówki. Dodać 20 μl wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 50 μl.
  6. Dokonaj wyboru wielkości produktów PCR za pomocą kulek magnetycznych z odwracalnym unieruchomieniem w fazie stałej (SPRI).
    1. Dodać 0,7 razy więcej (35 μl) granulek SPRI do probówki przygotowanej w kroku 6.5 i dokładnie wymieszać pipetując. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 5 minut lub do momentu, aż koraliki się rozdzielą. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając kulek.
    3. Dodać 200 μL świeżo przygotowanego 85% EtOH. Odczekaj 30 sekund, a następnie wyjmij EtOH. Suszyć koraliki na powietrzu przez 10 minut.
  7. Dodaj 20 μl wody wolnej od nukleaz. Umieść probówkę z powrotem na magnesie, odczekaj 5 minut i odpipetuj porcję płynu, nie naruszając ani nie dotykając kulek. Przechowywać DNA w temperaturze -20 °C.

7. Określanie ilości i jakości biblioteki

  1. Sprawdź stężenie DNA za pomocą spektrofotometru o długości fali 260 nm (oczekiwane stężenie to co najmniej ~5–10 ng/μL).
  2. Uruchom 1 μl każdej próbki na bioanalizatorze przy użyciu chipa DNA o wysokiej czułości, aby zbadać rozkład wielkości (oczekiwany szczyt to 300–400 pz (patrz Rysunek 3)).

8. Przesyłanie próbek

  1. Połącz nienakładające się na siebie sekwencjonowane kody kreskowe PCR (stosunek 1:1). Na przykład, połącz produkty PCR próbek z RPI-1 i RPI-2, RPI-3 i RPI-4 razem w równych ilościach nanogramów, zgodnie z zaleceniami dotyczącymi całkowitej wymaganej ilości próbki wejściowej rdzenia sekwencjonowania RNA.
  2. Po połączeniu dostosować całkowite stężenie do 5 ng/μl i co najmniej 10 μl objętości lub zgodnie z zaleceniami rdzenia zakładu sekwencjonowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z protokołu opisanego powyżej, neurony GABAergiczne zostały ręcznie posortowane (Rysunek 1), a RNA zostało amplifikowane, a następnie przekształcone w bibliotekę cDNA (Rysunek 2) i zsekwencjonowane na dużej głębokości8. Produkty amplifikowanego RNA (aRNA) miały wielkość od 200 do 4000 pz, z rozkładem pików nieco powyżej 500 pz (Figura 3A). Oczyszczona perełkowo biblioteka cDNA została dodatkowo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ręcznego sortowania jest odpowiedni do nadzorowanego sekwencjonowania RNA populacji neuronów, które są albo słabo znakowane w mózgu myszy, albo reprezentują rzadką populację komórek, która w inny sposób nie jest możliwa do zbadania przy użyciu obecnych metod sortowania i amplifikacji komórek o wysokiej przepustowości. Ogniwa poddane działaniu FACS są zwykle poddawane ciśnieniu w osłonie i linii próbki w zakresie ~9–14 psi, w zależności od rozmiaru dyszy i pożądanych szybkości zdarzeń. Ponadto, po wyrzuceniu z dy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z NIH (5R01MH094705-04 i R01MH109665-01 dla Z.J.H.), przez CSHL Robertson Neuroscience Fund (dla Z.J.H.) oraz przez stypendium podoktorskie NARSAD (dla A.P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ERCC RNA Spike-In Control MixesThermo FisherCat# 4456740
SuperScript IIIThermo FisherCat# 18080093
RNaseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazyThermo FisherCat# 10777019
Bufor do fragmentacji RNANew England BiolabsCat# E6105S
RNA MinElutekit QiagenCat# 74204
Fosfataza antarktycznaNew England BiolabsCat# M0289
Kinaza polinukleotydowaNew England BiolabsCat# M0201
Ligaza RNA T42, obciętaNew England BiolabsCat# M0242
Ampure Xp magnetyczne  koralikiBeckman CoulterCat# A63880
SPRIwybierz wybór rozmiaru koralikimagnetyczneThermo FisherCat# B23317
DL-AP5TocrisCat# 0105
CNQXTocrisCat# 1045
TTXTocrisCat# 1078
Proteaza ze Streptomyces griseusSigma-AldrichCat# P5147
Zestaw Message Amp IIThermo FisherCat# AM1751
CarbogenAirgasCat# UN3156
Sylgard 184Sigma-AldrichCat# 761036
Illumina TrueSeq zestaw smallRNAIlluminaCat# RS-200-0012
Bioanalizator RNA Chip PicoAgilentCat# 5067-1513
Bioanalizator o wysokiej czułości Chip DNAAgilentCat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100Agilent
Mikroskop preparacyjny z fluorescencją i oświetleniem jasnego pola z optyką DIC.  (Leica model MZ-16F).LeicaModel MZ-16F
Mikrokapilara szklana: borokrzemianowe rurki kapilarne 500/op. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, ścianka= 0.21 mm, Długość= 150 mm.Instrumenty WarnerModel GC100-15, zamówienie# 30-0017
Ściągacz do pipet kapilarnychSutter Instruments CoP-97
Klimatyzator do tkanek Vibratome
Thermo Microm HM 650V Vibratome Thermo Microm CU 65

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  3. Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
  4. Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228(2017).
  5. Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883(2016).
  6. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  7. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  8. Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
  9. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
  10. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
  11. Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
  12. Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
  13. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101(2016).
  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  15. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neurony znakowane fluorescencyjnier czne sortowanie kom rekmetoda DIVA Seqtkanka m zgu myszymikrosekcja kapilarnaamplifikacja oparta na UMIdetekcja gen w na poziomie pojedynczej kom rki

Powiązane artykuły