Kwantyfikacja zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich

Podsumowanie

Opisujemy metodę oceny wpływu istniejącej wcześniej odporności na wirusa dengi na infekcję wirusem Zika za pomocą ludzkiej surowicy, pierwotnych komórek ludzkich i kwantyfikacji infekcji za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Niedawne pojawienie się flawiwirusa Zika i powikłań neurologicznych, takich jak zespół Guillaina-Barrégo i małogłowie u niemowląt, przyniosły poważne obawy dotyczące bezpieczeństwa publicznego. Wśród czynników ryzyka największym zagrożeniem jest wzmocnienie zależne od przeciwciał (ADE), ponieważ niedawne ponowne pojawienie się wirusa Zika (ZIKV) ma miejsce przede wszystkim na obszarach, na które populacja była narażona i znajduje się w stanie preodporności na inne blisko spokrewnione flawiwirusy, zwłaszcza wirusa dengi (DENV). W tym miejscu opisujemy protokół ilościowego określania wpływu ludzkich przeciwciał surowicy przeciwko DENV na zakażenie ZIKV w pierwotnych komórkach ludzkich lub liniach komórkowych.

Wprowadzenie

Wśród chorób wirusowych przenoszonych przez komary, zakażenie wirusem Zika jest jednym z najważniejszych klinicznie¹. Infekcja jest wywoływana przez flawiwirusa ZIKV, który w większości przypadków wykorzystuje Aedes aegypti jako główny wektor^1,2. Istnieją jednak badania, które wykazały, że Aedes albopictus jest głównym wektorem w niektórych epidemiach ZIKV ³. Chociaż w wielu przypadkach infekcja przebiega bezobjawowo, najczęstszymi objawami są gorączka, ból głowy i ból mięśni². Nie ma lekarstwa ani szczepionki na zakażenie ZIKV, a dostępne leczenie ma w większości charakter wspomagający. Niedawne wybuchy epidemii ZIKV w Ameryce Południowej doprowadziły do ciężkich przypadków choroby i około 20-krotnego wzrostu zaburzeń neurorozwojowych u płodów o nazwie microcephaly². Ponieważ Ameryka Południowa jest obszarem endemicznym dla kilku arbowirusów, takich jak DENV i wirus Zachodniego Nilu, kluczowe znaczenie ma zbadanie, czy wcześniejsza odporność na inne flawiwirusy odgrywa rolę w ciężkości zakażeń i choroby ZIKV.

Na przestrzeni wieków, wirusy rozwijały różne strategie, aby zwiększyć swoje szanse na zakaźność, aby przejąć maszynerię komórek gospodarza i stłumić odpowiedź przeciwwirusową. Jednym z najbardziej fascynujących jest wykorzystanie przez wirusy przeciwciał przedimmunologicznych gospodarza w celu zwiększenia ich replikacji za pomocą zjawiska ADE⁴. ADE we wszystkich czterech serotypach DENV zostało dobrze przebadane i wykazano, że zwiększa miana wirusa i wynik choroby^5,6,7. W poprzednim badaniu in vitro wykazaliśmy znaczne zwiększenie replikacji ZIKV ze względu na istniejącą wcześniej odporność DENV w pierwotnych ludzkich komórkach odpornościowych⁸. Wykazaliśmy również odpowiednią metodę in vitro do ilościowego określenia zdolności istniejących wcześniej przeciwciał DENV do zwiększenia replikacji ZIKV w komórkach pierwotnych.

Protokół, który opracowaliśmy, wykorzystuje próbki ludzkiej surowicy, które są testowane pod kątem neutralizacji DENV w testach TCID-50 lub teście neutralizacji płytki nazębnej (PRNT), wraz z ZIKV w biologicznie istotnych komórkach lub komórkach pochodzących z tkanek, które ZIKV może zainfekować.

Protokół

Próbki surowicy użyte w tym badaniu zostały pobrane od ludzkich uczestników kohorty z Kolumbii. Pobranie próbki zostało zatwierdzone przez wewnętrzną komisję rewizyjną (IRB) na Universidad de Pamplona (Columbia, Ameryka Południowa) i Los Potios Hospital⁸. Próbki zostały dostarczone anonimowo, a badacze nie mieli dostępu do informacji o pacjentach. Próbki surowicy przebadano pod kątem serotypu DENV. Potwierdzono również, że próbki neutralizują zakażenie DENV in vitro. Do kontroli wykorzystano próbki surowicy od osób zdrowych (HC) z USA.

UWAGA: Ten protokół może być użyty do zbadania ADE replikacji ZIKV w dowolnym typie ludzkiej komórki wyrażającej receptor Fcγ. Protokół składa się z trzech części (Rysunek 1).

1. Konfiguracja rozsiewania komórek i infekcji

UWAGA: W tym konkretnym badaniu użyto ludzkich pierwotnych makrofagów lub linii komórek mielomonocytarnych U937 (ATCC-CRL-1593.2). Komórki utrzymywano w pożywce wzrostowej RPMI uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO₂ ). Wszystkie etapy zostały przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) w sterylnych warunkach.

1. Wysiać 3 x 10⁴ komórki na basenie na sterylnej płaskiej 96-dołkowej płytce wraz ze 100 μl pożywki i umieścić je w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
2. Po wysianiu komórek rozmrozić próbki surowicy w temperaturze pokojowej i wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia (tj. 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10 000), mieszając próbki w pożywce bez surowicy. Porcjować rozcieńczenia na sterylną płytkę 96-dołkową. Wirusa należy stosować bez surowicy jako dodatkową kontrolę.
3. Rozmrażaj bulion ZIKV w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 1 - 2 minuty i szybko przenieś go do lodu do wykorzystania w przyszłości.
4. Dodać równoważną 0,1 wielokrotności infekcji (MOI) ilość szczepu ZIKV MR766 do podwielokrotności surowicy podwielokrotności.
   nuta: Upewnij się, że współczynnik rozcieńczenia pozostaje stały, a całkowita objętość wynosi ~200 μL; To wystarcza na trzykrotne powtórzenia każdego zabiegu. Utrzymuj trzy studzienki niezainfekowane, aby wykorzystać je jako kontrolę ujemną do dalszej analizy.
5. Rozcieńczenia surowicy należy inkubować z dodatkiem wirusa w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% stężeniem CO₂ przez 1 godzinę, aby umożliwić przeciwciałom DENV utworzenie kompleksów z wirionami Zika (dla wygody, zwanych dalej "kompleksami immunologicznymi").
6. Odessać pożywkę z komórek, które zostały wysiane na płaskiej 96-dołkowej płytce. Umyj komórki sterylnym 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS).
7. Dodać 50 μl kompleksów immunologicznych do każdej studzienki i inkubować je w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 2 godziny.
8. Po 2 godzinach inkubacji odessać pożywkę zawierającą kompleksy immunologiczne z komórek za pomocą pipety wielokanałowej i umyć komórki 2x 1x PBS, aby całkowicie usunąć kompleksy immunologiczne i wszelkie nieprzyłączone wiriony.
9. Dodać 100 μl świeżej, kompletnej pożywki uzupełnionej 10% FBS do każdej studzienki i inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 48 godzin.

2. Ekstrakcja RNA

1. Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i przenieść ją do komory bezpieczeństwa biologicznego.
2. Odessać pożywkę, przemyć komórki 2x 1x PBS i przystąpić do ekstrakcji RNA.
   nuta: RNA można wyekstrahować dowolną metodą (patrz Tabela materiałów).
3. Dodać 250 μl buforu do lizy komórek z 10% β-merkaptoetanolem na studzienkę. Pipetuj bufor w górę i w dół co najmniej 5 razy, a także zarysuj komórki końcówką pipety, aby przyspieszyć procedurę lizy.
4. Przenieś lizaty komórkowe do nowych, oznakowanych, sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml.
5. Dodać równą ilość 70% etanolu (250 μL). Pipetować w górę i w dół 4x - 5x, aż mieszanina będzie klarowna.
6. Przenieś mieszaninę (~500 μl) do znakowanych kolumn na bazie krzemionki w probówkach zbiorczych o pojemności 2 ml i odwiruj przy 15 000 x g przez 30 s. Odrzuć przepływ i utrzymuj kolumny w tych samych probówkach zbiorczych.
7. Dodać 700 μl buforu płuczącego 1 do każdej kolumny i odwirować przy 15 000 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ i utrzymać kolumny w tych samych probówkach zbiorczych.
8. Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do każdej kolumny i odwirować przy 15 000 x g przez 30 s. Odrzucić supernatant. Powtórz ten krok 2 razy.
9. Przenieść kolumny do nowych probówek zbiorczych o pojemności 2 ml i odwirować przy 15 000 x g przez 2 minuty. Upewnij się, że kolumny na bazie krzemionki całkowicie wyschły i nie pozostały żadne etanole z buforu płuczącego 2.
10. Wyrzuć probówki o pojemności 2 ml i umieść kolumny w nowych, sterylnych, oznakowanych probówkach regeneracyjnych o pojemności 1,5 ml.
11. Dodać podgrzane (42 °C) 30 μl wody wolnej od RNaz na środek każdej kolumny i odwirować przy 15 000 x g przez 1 minutę.
12. Odzyskać wymyty RNA i określić ilościowo próbki za pomocą spektrofotometru o długości fali 260 nm.
    nuta: Najlepiej określić czystość RNA, obliczając stosunek wartości absorbancji przy 260 nm i 280 nm. Stosunek oczyszczonego RNA 260/280 wynosi idealnie od 1,8 do 2,0.

3. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym

UWAGA: Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) może być przeprowadzona przy użyciu dowolnej zielonej mieszanki SYBR, która zwykle składa się z barwnika SYBR Green I, polimerazy DNA Taq, trifosforanów deoksynukleotydowych (dNTP) i barwnika pasywnego. Każda maszyna qPCR zdolna do wykrywania koloru zielonego SYBR może być użyta do przeprowadzenia reakcji i pozyskania danych. W tym eksperymencie użyto jednoetapowego zestawu RT-PCR, który zawierał koktajl SYBR Green I, barwnika ROX, polimerazy DNA Taq, dNTP i dodatkowej mieszaniny odwrotnej transkryptazy (patrz Tabela materiałów). Startery zaprojektowane w odniesieniu do regionu otoczki i użyte w tym badaniu do ilościowego określenia poziomów genomu ZIKV to CCGCTGCCCAACACAAG dla ZIKV-qF i CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT dla ZIKV-qR. Jako kontrolę, ludzka β-2-mikroglobulina (B2M) została zmierzona i wykorzystana do normalizacji ekspresji ZIKV (gen porządkowy). Sekwencje starterowe do ilościowego określenia ekspresji genu B2M użyte w tym badaniu to CTCCGTGGCCTTAGCTGTG dla B2M-qF i TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT dla B2M-qR. Upewnij się, że umieścisz trzy kontrpróby techniczne dla każdej próbki zarówno dla genów ZIKV, jak i B2M. Konfiguracja RT-PCR jest pokrótce opisana poniżej.

1. Konfiguracja RT-PCR
   1. Użyj 100 ng RNA na próbkę.
   2. Dodać 1 μl z 10 μM zapasów zarówno przednich, jak i odwrotnych starterów określonego genu dla każdej reakcji.
   3. Dodać 0,25 μl mieszaniny odwrotnej transkryptazy na próbkę.
   4. Do każdej pojedynczej reakcji dodać 12,5 μl mieszanki SYBR Green.
   5. Dodać do 25 μl wody. Sporządzić główną mieszaninę wszystkich wyżej wymienionych odczynników z wyjątkiem RNA, podwielokrotnić ją na 96-dołkowej płytce do PCR i dodać RNA na końcu.
   6. Uszczelnij płytkę przezroczystą taśmą klejącą.
   7. Odwirować płytkę o sile 1 000 x g przez 1 minutę w celu wymieszania odczynników.
   8. Umieść płytkę w maszynie qPCR.
2. Profil RT-PCR
   nuta: Należy użyć profilu RT-PCR przedstawionego w Tabeli 1.
   1. Inkubować próbki w temperaturze 50 °C przez 10 minut w celu zapewnienia syntezy komplementarnego DNA (cDNA).
   2. Po syntezie cDNA aktywować polimerazę DNA Taq w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
   3. Wykonać 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 s oraz wyżarzania i przedłużania podkładu w temperaturze 60 °C przez 30 s.
   4. Umieść dodatkowy stopień krzywej topnienia (65°C) na końcu.
3. analiza danych
   1. Monitoruj krzywą topnienia, klikając zakładkę krzywej topnienia w programie używanym do uruchamiania maszyny qPCR, która w idealnym przypadku pokazuje pojedynczy pik we wszystkich próbkach dla określonego genu, aby potwierdzić obecność tylko jednego amplikonu i wartość amplifikacji większą niż 1,6, jeśli algorytm uważa 2 za 100% wartość amplifikacji (wartość amplifikacji zmienia się w zależności od algorytmu używanego przez maszynę qPCR). Upewnij się, że używasz przyrostów temperatury o 0,5 °C między krokami i minimalnego czasu utrzymywania 10 s w protokole krzywej topnienia, aby uzyskać optymalne wyniki.
   2. Po upewnieniu się, że istnieje pojedynczy amplikon i dobra wartość amplifikacji, najpierw kliknij kartę danych kwantyfikacji, aby uzyskać cykl ilościowy (wartość Ct/Cq) każdej próbki i wyeksportować ją do programu Microsoft Excel.
   3. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, oblicz średnią z każdej próbki, używając wartości Ct. Następnie kliknij formuły i wybierz średnią. Średnie wartości CT każdej próbki (kontrpróby) są wykorzystywane do dalszej analizy.
   4. Następnie należy obliczyć ΔCt za pomocą wzoru ΔCt = średnia Ct genu docelowego - średnia Ct genu kontrolnego (w tym przypadku ΔCt = średnia Ct genu ZIKV - średnia Ct genu B2M).
   5. Obliczyć ΔΔCt, aby znormalizować dane (w tym przypadku ΔΔCt = ΔCt ZIKV próbki - próbki B2M).
   6. Oblicz ekspresję genu zwiększającego krotność, wpisując wzór 2^-(ΔΔCt) dla każdej znormalizowanej wartości ΔΔCt. Wyniki zwiększania krotności w celu przeprowadzenia testów statystycznych można uzyskać zgodnie z opisem we wcześniejszych badaniach^9,10.

Wyniki

W Rysunek 1, znajduje się diagram krok po kroku przedstawiający wszystkie kroki związane z przeprowadzeniem protokołu ADE. Jest to schemat ideowy przedstawiający całą procedurę ADE firmy ZIKV ze względu na istniejącą wcześniej odporność na DENV. Rysunek 2 pokazuje, jak próbki ludzkiej surowicy zostały podzielone na trzy różne grupy: próbki potwierdzone zakażeniem DENV są określane jako grupa zakażona DENV, próbki potwierdzone prz...

Dyskusja

Reaktywność krzyżowa przeciwciał DENV prowadząca do ADE innych serotypów DENV utrudniła opracowanie skutecznej szczepionki¹¹. ZIKV należy do tej samej rodziny, Flaviviridae, i ma znaczną homologię z innymi flawiwirusami, zwłaszcza DENV¹². Głównym celem przeciwciał neutralizujących zarówno dla ZIKV, jak i DENV jest białko otoczki, które ma bardzo wysoką homologię sekwencji strukturalnej i czwartorzędowej między tymi dwoma wirusami 13,14,15....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Surowica bydlęca płodu	GEMINI	100-106
iCycler	BioRad	785BR02188	Nr modelu CFX96 Moduł optyczny
Wirówka Microfuge 18 Beckman	Coulter	367160
Nanodrop-1000	Termonaukowy	1072
Jednoetapowy zestaw RT-PCR Quantifast SYBR	Qiagen	204154	Używany do 1-etapowego
zestawu do izolacji RNeasy RNeasy	Qiagen	74106	Służy do ekstrakcji RNA
RPMI-medium	Gibco	11875093