Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

Summary

Kompleksy RNA/białkowe oczyszczone przy użyciu strategii botyna-streptawidyna są eluowane do roztworu w warunkach denaturacji w formie nieodpowiedniej do dalszego oczyszczania i analizy funkcjonalnej. Tutaj opisujemy modyfikację tej strategii, która wykorzystuje fotorozszczepialny łącznik w RNA i delikatny etap elucji UV, dając natywne i w pełni funkcjonalne kompleksy RNA / białko.

Abstract

Przez wiele lat, wyjątkowo silna i szybko powstająca interakcja między biotyną a streptawidyną była z powodzeniem wykorzystywana do częściowego oczyszczania biologicznie ważnych kompleksów RNA/białkowych. Strategia ta ma jednak jedną poważną wadę, która ogranicza jej szersze wykorzystanie: interakcja biotyna/streptawidyna może zostać przerwana tylko w warunkach denaturacji, które również zakłócają integralność eluowanych kompleksów, uniemożliwiając w ten sposób ich późniejszą analizę funkcjonalną i/lub dalsze oczyszczanie innymi metodami. Ponadto eluowane próbki są często zanieczyszczone białkami tła, które niespecyficznie kojarzą się z kulkami streptawidyny, co komplikuje analizę oczyszczonych kompleksów za pomocą barwienia srebrem i spektrometrii mas. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy wariant strategii biotyny/streptawidyny, w którym biotyna jest przyłączana do substratu RNA za pomocą łącznika fotorozszczepialnego, a kompleksy unieruchomione na kulkach streptawidyny są selektywnie eluowane do roztworu w postaci natywnej przez długofalowe promieniowanie UV, pozostawiając białka tła na kulkach. Krótsze substraty wiążące RNA mogą być syntetyzowane chemicznie z biotyną i fotorozszczepialnym łącznikiem kowalencyjnie przyłączonym do końca 5' RNA, podczas gdy dłuższe substraty RNA mogą być dostarczane z dwiema grupami przez komplementarny oligonukleotyd. Te dwa warianty metody elucji UV zostały przetestowane pod kątem oczyszczania zależnych od U7 snRNP kompleksów przetwarzających, które rozszczepiają histony pre-mRNA na końcu 3' i oba okazały się korzystne w porównaniu z innymi wcześniej opracowanymi metodami oczyszczania. Próbki eluowane promieniami UV zawierały łatwo wykrywalne ilości snRNP U7, który był wolny od głównych zanieczyszczeń białkowych i nadawał się do bezpośredniej analizy za pomocą spektrometrii mas i testów funkcjonalnych. Opisana metoda może być łatwo zaadaptowana do oczyszczania innych kompleksów wiążących RNA i stosowana w połączeniu z jedno- i dwuniciowymi miejscami wiązania DNA w celu oczyszczania białek specyficznych dla DNA i kompleksów makromolekularnych.

Introduction

U eukariontów, prekursory mRNA generowane przez polimerazę II (pre-mRNA) przechodzą kilka zdarzeń dojrzewania w jądrze, zanim staną się w pełni funkcjonalnymi matrycami mRNA do syntezy białek w cytoplazmie. Jednym z takich zdarzeń jest przetwarzanie 3' end. W przypadku zdecydowanej większości pre-mRNA przetwarzanie końca 3' obejmuje rozszczepienie sprzężone z poliadenylacją. Ta dwuetapowa reakcja jest katalizowana przez stosunkowo obfity kompleks składający się z ponad 15 białek¹. Zależne od replikacji zwierzęcej histonowe pre-mRNA są przetwarzane na końcu 3' przez inny mechanizm, w którym kluczową rolę odgrywa U7 snRNP, kompleks o niskiej licz....

Protocol

1. Przygotowanie podłoża

UWAGA: Substraty RNA krótsze niż ~65 nukleotydów mogą być syntetyzowane chemicznie z biotyną (B) i łącznikiem fotorozszczepialnym (pc) (razem określanym jako biotyna fotorozszczepialna lub pcB) kowalencyjnie przyłączonym do końca RNA 5' (konfiguracja cis). Substraty RNA zawierające znacznie dłuższe miejsca wiązania muszą być generowane in vitro przez transkrypcję T7 (lub SP6), a następnie wyżarzane do krótkiego komplementarnego oligonukleotydu adaptorowego zawierającego ugrupowanie pcB na końcu 5' (konfiguracja trans) (Rysunek 1).

1. W przypadku miej....

Results

Metoda elucji UV została przetestowana z dwoma chemicznie zsyntetyzowanymi substratami RNA kowalencyjnie przyłączonymi na końcu 5' do ugrupowania pcB (konfiguracja cis): pcB-SL (Rysunek 1) i pcB-dH3/5m RNA (Rysunek 2). 31-nukleotydowe pcB-SL RNA zawiera strukturę pętli macierzystej, po której następuje 5-nukleotydowy jednoniciowy ogon, a jego sekwencja jest identyczna z końcem 3' dojrzałego mRNA histonu (tj. po rozszczepieniu histo.......

Discussion

Opisana tutaj metoda jest prosta i oprócz tego, że zawiera łącznik z możliwością fotorozszczepienia i etap elucji UV, nie różni się od powszechnie stosowanych metod, które wykorzystują niezwykle silne oddziaływanie między biotyną a streptawidyną. Etap elucji UV jest bardzo wydajny, zwykle uwalniając ponad 75% unieruchomionego RNA i powiązanych białek z kulek streptawidyny, pozostawiając wysokie tło białek, które niespecyficznie wiążą się z kulkami. Eliminując to tło, etap elucji UV pozwala uzyskać niezwykle czyste próbki.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptawidyna-Agaroza	Sigma	S1638-5ML
Długofalowa lampa UV o wysokiej intensywności	Cole-Parmer	UX-97600-00
Wymienna żarówka	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 watów Żarówka Mercury H44GS-100M emitująca światło UV 366 nm (Sylvania)
RNA i oligonukleotydy zawierające biotynę i łącznik fotorozszczepialny w cis	Dharmacon (Lafayette, CO) lub Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Zapytaj o wycenę w Dharmacon
Beckman GH 3.8 wirnik kubełkowy wahadłowy	Beckman
RiboMAX Systemy produkcji RNA na dużą skalę (polimeraza T7)	Promega	P1300
RiboMAX Systemy produkcji RNA na dużą skalę (polimeraza SP6)	Zestaw	P1280
Pierce Silver	ThermoFisher Scientific	24612