Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

Summary

Kompleksy RNA/białkowe oczyszczone przy użyciu strategii botyna-streptawidyna są eluowane do roztworu w warunkach denaturacji w formie nieodpowiedniej do dalszego oczyszczania i analizy funkcjonalnej. Tutaj opisujemy modyfikację tej strategii, która wykorzystuje fotorozszczepialny łącznik w RNA i delikatny etap elucji UV, dając natywne i w pełni funkcjonalne kompleksy RNA / białko.

Abstract

Przez wiele lat, wyjątkowo silna i szybko powstająca interakcja między biotyną a streptawidyną była z powodzeniem wykorzystywana do częściowego oczyszczania biologicznie ważnych kompleksów RNA/białkowych. Strategia ta ma jednak jedną poważną wadę, która ogranicza jej szersze wykorzystanie: interakcja biotyna/streptawidyna może zostać przerwana tylko w warunkach denaturacji, które również zakłócają integralność eluowanych kompleksów, uniemożliwiając w ten sposób ich późniejszą analizę funkcjonalną i/lub dalsze oczyszczanie innymi metodami. Ponadto eluowane próbki są często zanieczyszczone białkami tła, które niespecyficznie kojarzą się z kulkami streptawidyny, co komplikuje analizę oczyszczonych kompleksów za pomocą barwienia srebrem i spektrometrii mas. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy wariant strategii biotyny/streptawidyny, w którym biotyna jest przyłączana do substratu RNA za pomocą łącznika fotorozszczepialnego, a kompleksy unieruchomione na kulkach streptawidyny są selektywnie eluowane do roztworu w postaci natywnej przez długofalowe promieniowanie UV, pozostawiając białka tła na kulkach. Krótsze substraty wiążące RNA mogą być syntetyzowane chemicznie z biotyną i fotorozszczepialnym łącznikiem kowalencyjnie przyłączonym do końca 5' RNA, podczas gdy dłuższe substraty RNA mogą być dostarczane z dwiema grupami przez komplementarny oligonukleotyd. Te dwa warianty metody elucji UV zostały przetestowane pod kątem oczyszczania zależnych od U7 snRNP kompleksów przetwarzających, które rozszczepiają histony pre-mRNA na końcu 3' i oba okazały się korzystne w porównaniu z innymi wcześniej opracowanymi metodami oczyszczania. Próbki eluowane promieniami UV zawierały łatwo wykrywalne ilości snRNP U7, który był wolny od głównych zanieczyszczeń białkowych i nadawał się do bezpośredniej analizy za pomocą spektrometrii mas i testów funkcjonalnych. Opisana metoda może być łatwo zaadaptowana do oczyszczania innych kompleksów wiążących RNA i stosowana w połączeniu z jedno- i dwuniciowymi miejscami wiązania DNA w celu oczyszczania białek specyficznych dla DNA i kompleksów makromolekularnych.

Introduction

U eukariontów, prekursory mRNA generowane przez polimerazę II (pre-mRNA) przechodzą kilka zdarzeń dojrzewania w jądrze, zanim staną się w pełni funkcjonalnymi matrycami mRNA do syntezy białek w cytoplazmie. Jednym z takich zdarzeń jest przetwarzanie 3' end. W przypadku zdecydowanej większości pre-mRNA przetwarzanie końca 3' obejmuje rozszczepienie sprzężone z poliadenylacją. Ta dwuetapowa reakcja jest katalizowana przez stosunkowo obfity kompleks składający się z ponad 15 białek¹. Zależne od replikacji zwierzęcej histonowe pre-mRNA są przetwarzane na końcu 3' przez inny mechanizm, w którym kluczową rolę odgrywa U7 snRNP, kompleks o niskiej liczebności składający się z U7 snRNA ~60 nukleotydów i wielu białek^2,3. Para zasad snRNA U7 ze specyficzną sekwencją w histonowym pre-mRNA, a jedna z podjednostek snRNP U7 katalizuje reakcję rozszczepienia, generując dojrzałe mRNA histonu bez ogona poli(A). Przetwarzanie 3' końca histonu pre-mRNA wymaga również białka wiążącego pętlę macierzystą (SLBP), które wiąże konserwatywną pętlę macierzystą znajdującą się przed miejscem cięcia i zwiększa rekrutację U7 snRNP do substratu^2,3. Badania mające na celu identyfikację poszczególnych składników U7 snRNP były trudne ze względu na niskie stężenie U7 snRNP w komórkach zwierzęcych oraz skłonność kompleksu do dysocjacji lub częściowej proteolizy podczas oczyszczania w wyniku stosowania łagodnych detergentów^4,5,6, płukanie o wysokiej zawartości soli i/lub wiele etapów chromatograficznych^{7, 8,9}.

Niedawno, aby określić skład zależnej od U7 maszynerii przetwarzającej, krótki fragment histonowego pre-mRNA zawierającego biotynę na 3' lub 5' został inkubowany z ekstraktem jądrowym, a złożone kompleksy zostały wychwycone na pokrytych streptawidyną kulkach agarozy^5,6,10. Ze względu na wyjątkowo silne oddziaływanie między biotyną a streptawidyną, białka unieruchomione na kulkach streptawidyny eluowano w warunkach denaturacji przez gotowanie w SDS i analizowano za pomocą barwienia srebrem i spektrometrii mas. Chociaż to proste podejście zidentyfikowało szereg składników snRNP U7, dało stosunkowo prymitywne próbki, często zanieczyszczone dużą liczbą białek tła niespecyficznie związanych z kulkami streptawidyny, potencjalnie maskując niektóre elementy maszynerii przetwórczej i uniemożliwiając ich wykrycie na żelach barwionych srebrem^5,6,10. Co ważne, takie podejście wykluczyło również jakiekolwiek badania funkcjonalne z wyizolowanym materiałem i jego dalsze oczyszczanie do jednorodności za pomocą dodatkowych metod.

Z biegiem czasu zaproponowano szereg modyfikacji, aby rozwiązać problem praktycznie nieodwracalnej natury interakcji biotyna/streptawidyna, przy czym większość z nich miała na celu albo osłabienie interakcji, albo zapewnienie chemicznie rozszczepialnego ramienia dystansowego w odczynnikach zawierających biotynę^11,12. Wadą wszystkich tych modyfikacji było to, że znacznie zmniejszały one skuteczność metody i/lub często wymagały warunków niefizjologicznych na etapie elucji, zagrażając integralności lub aktywności oczyszczonych białek.

Tutaj opisujemy inne podejście do rozwiązania nieodłącznego problemu strategii biotyna/streptawidyna za pomocą substratów RNA, w których biotyna jest kowalencyjnie przyłączona do końca 5' za pomocą fotorozszczepialnej grupy 1-(2-nitrofenylo)etylu, która jest wrażliwa na długie fale UV^13,14. Przetestowaliśmy to podejście do oczyszczania ograniczającej zależnej od U7 maszynerii przetwarzania z ekstraktów jądrowych Drosophila i ssaków¹⁵. Po krótkiej inkubacji histonów pre-mRNA zawierających biotynę i fotorozszczepialnego łącznika z ekstraktem jądrowym, złożone kompleksy przetwórcze są unieruchamiane na kulkach streptawidyny, dokładnie myte i delikatnie uwalniane do roztworu w postaci natywnej przez ekspozycję na światło UV ~360 nm. Metoda elucji UV jest bardzo wydajna, szybka i prosta, dając wystarczające ilości snRNP U7 do wizualizacji jego składników poprzez barwienie srebrne już od 100 μl ekstraktu¹⁵. Materiał eluowany promieniami UV jest wolny od białek tła i nadaje się do bezpośredniej analizy spektrometrii mas, dodatkowych etapów oczyszczania i testów enzymatycznych. Ta sama metoda może być przyjęta do oczyszczania innych kompleksów RNA/białko, które wymagają stosunkowo krótkich miejsc wiązania RNA. Biotyna i fotorozszczepialny łącznik mogą być również kowalencyjnie przyłączane do jedno- i dwuniciowego DNA, potencjalnie rozszerzając metodę elucji UV w celu oczyszczenia różnych kompleksów DNA/białko.

Chemiczna synteza substratów RNA zawierających kowalencyjnie dołączoną biotynę i fotorozszczepialny łącznik jest praktyczna tylko w przypadku sekwencji, które nie przekraczają ~65 nukleotydów, co staje się kosztowne i nieefektywne dla znacznie dłuższych sekwencji. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy również alternatywne podejście, które jest odpowiednie dla znacznie dłuższych celów wiązania RNA. W tym podejściu RNA o dowolnej długości i sekwencji nukleotydowej jest generowane in vitro przez transkrypcję T7 lub SP6 i wyżarzane do krótkiego komplementarnego oligonukleotydu, który zawiera biotynę i fotorozszczepialny łącznik na końcu 5' (konfiguracja trans). Powstały duplex jest następnie wykorzystywany do oczyszczania pojedynczych białek wiążących lub kompleksów wielkocząsteczkowych na kulkach streptawidyny zgodnie z tym samym protokołem, który opisano dla substratów RNA zawierających fotorozszczepialną biotynę przyłączoną kowalencyjnie (konfiguracja cis). Dzięki tej modyfikacji, fotorozszczepialna biotyna może być stosowana w połączeniu z transkryptami generowanymi in vitro zawierającymi setki nukleotydów, rozszerzając metodę elucji UV do oczyszczania szerokiego zakresu RNA/białka.

Protocol

1. Przygotowanie podłoża

UWAGA: Substraty RNA krótsze niż ~65 nukleotydów mogą być syntetyzowane chemicznie z biotyną (B) i łącznikiem fotorozszczepialnym (pc) (razem określanym jako biotyna fotorozszczepialna lub pcB) kowalencyjnie przyłączonym do końca RNA 5' (konfiguracja cis). Substraty RNA zawierające znacznie dłuższe miejsca wiązania muszą być generowane in vitro przez transkrypcję T7 (lub SP6), a następnie wyżarzane do krótkiego komplementarnego oligonukleotydu adaptorowego zawierającego ugrupowanie pcB na końcu 5' (konfiguracja trans) (Rysunek 1).

1. W przypadku miejsc wiązania składających się z mniej niż ~ 65 nukleotydów, użyj komercyjnego producenta (tabela materiałów) do chemicznej syntezy interesującego RNA z pcB kowalencyjnie przyłączonym do końca RNA 5' (Rysunek 1A i Rysunek 2A). Rozpuścić w sterylnej wodzie do osiągnięcia pożądanego stężenia i przechowywać w małych porcjach w temperaturze -80 °C.
2. W przypadku miejsc wiązania znacznie dłuższych niż ~ 65 nukleotydów, utwórz częściowy dupleks interesującego nas RNA wygenerowanego in vitro i komplementarnego oligonukleotydu adaptorowego zawierającego ugrupowanie pcB na końcu 5' (Figura 3A).
   1. Wykonaj transkrypcję T7 na zlinearyzowanym plazmidowym DNA lub odpowiedniej matrycy PCR, aby wygenerować RNA z miejscem wiązania będącym przedmiotem zainteresowania przedłużonym na końcu 3' przez dowolną sekwencję ~ 20-nukleotydową.
   2. Użyj komercyjnego producenta (Tabela materiałów) do chemicznej syntezy oligonukleotydu adaptorowego, który jest komplementarny do rozszerzenia 3' w RNA generowanym przez T7 i zawiera pcB na końcu 5' (Rysunek 3A).
      UWAGA: Dwa 18-atomowe przekładki i 2-3 niekomplementarne nukleotydy można umieścić na końcu 5' oligonukleotydu, aby zmniejszyć potencjalną przeszkodę steryczną między związanym kompleksem a kulkami streptawidyny. Pożądane jest również, aby oligonukleotyd był równomiernie modyfikowany grupą 2'O-metylową w celu zwiększenia wytrzymałości dupleksu i zapewnienia odporności na różne nukleazy.
   3. Wyżarzanie RNA generowanego przez T7 do oligonukleotydu adaptora pcB.
      1. Zmieszać 20 pmol RNA i 100 pmol oligonukleotydu adaptora pcB (stosunek molowy 1:5) w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 100 μl buforu wiążącego o następującym składzie: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glicerolu, 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
         UWAGA: Ważne jest, aby użyć minimalnej ilości oligonukleotydu adaptorowego, która jest wystarczająca do utworzenia dupleksu z większością (jeśli nie wszystkim) substratu pre-mRNA używanego w reakcji wyżarzania. Można to wygodnie określić, znakując substrat RNA na końcu 5' ^{za pomocą 32}P, wyżarzając znakowany substrat zwiększającymi się ilościami oligonukleotydu adaptorowego przy użyciu różnych warunków buforowych i monitorując zatrzymywanie sygnału radioaktywnego na kulkach streptawidyny po kilku płukaniach kulek buforem wiążącym.
      2. Umieść probówkę we wrzącej wodzie na 5 minut.
      3. Poczekaj, aż woda ostygnie do temperatury pokojowej.

2. Złożony montaż

1. Uzupełnij 1 ml mysiego ekstraktu jądrowego (lub innego ekstraktu z wyboru) 80 mM EDTA pH 8 do końcowego stężenia 10 mM w celu zablokowania niespecyficznych nukleaz zależnych od metalu, które są obecne w ekstrakcie.
   UWAGA: Spowoduje to dostosowanie buforu w ekstrakcie do tego samego składu, co bufor wiążący (patrz Krok 1.2.3.1). EDTA nie wpływa na przetwarzanie in vitro histonów pre-mRNA, ale może być szkodliwy w oczyszczaniu białek lub kompleksów białkowych, które gromadzą się w sposób zależny od magnezu. W takich przypadkach należy unikać EDTA.
2. Dodać 5-10 pmol substratu RNA oznaczonego ugrupowaniem pcB w cis (patrz krok 1.1) lub trans (patrz krok 1.2.3.3) do 1 ml ekstraktu zawierającego 10 mM EDTA.
   UWAGA: Ilość RNA musi być dokładnie oceniona w serii eksperymentów próbnych. Użycie zbyt dużej ilości substratu RNA do oczyszczenia kompleksu ograniczającego może przynieść efekt przeciwny do zamierzonego, znacznie zwiększając tło niespecyficznych białek wiążących RNA bez żadnego wpływu na wydajność określonych białek.
3. Inkubować substrat RNA z ekstraktem przez 5 minut na lodzie, od czasu do czasu mieszając próbkę.
   UWAGA: Zarówno czas, jak i temperatura inkubacji muszą być ustalone empirycznie i mogą się znacznie różnić, w zależności od specyficznego charakteru kompleksu RNA/białko.
4. Mieszaninę inkubacyjną należy obracać we wstępnie schłodzonej mikrowirówce przez 10 minut przy sile 10 000 x g, aby usunąć wszelkie potencjalne osady i ostrożnie zebrać supernatant, unikając przenoszenia osadu.

3. Immobilizacja kompleksów RNA/białko na kulkach streptawidyny.

1. Przenieś ~100 μl zawiesiny perełkek agarozy streptawidyny od komercyjnego dostawcy (tabela materiałów) do probówki o pojemności 1,5 ml i zwiększ objętość za pomocą buforu wiążącego (75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glicerol, 10 mM EDTA).
   UWAGA: Ten bufor powinien mieć taki sam skład, jak w mieszaninie do wyżarzania i w ekstrakcie używanym do złożonego montażu (krok 2.1).
2. Zebrać kulki na dnie probówki, obracając przez 2-3 minuty przy 25 x g i odessać supernatant.
3. Powtórz tę samą procedurę mycia/wirowania 2-3 razy, aby zrównoważyć kulki z buforem wiążącym.
   UWAGA: Na końcu tego kroku granulka kulek powinna mieć objętość ~ 30 μL.
4. Załadować supernatant zawierający złożony kompleks (krok 2.4) na zrównoważone kulki agarozy streptawidyny.
5. Obracać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, aby unieruchomić RNA i związane kompleksy na kulkach.
6. Zbierz koraliki na dnie tuby, obracając przez 2-3 minuty przy 25 x g.
   UWAGA: Użyj odchylanego wirnika, aby uniknąć znacznej utraty koralików, jeśli mają one tendencję do przylegania do boku rury w wirnikach kątowych.
7. Odessać supernatant i dwukrotnie przepłukać kulki 1 ml buforu wiążącego, stosując te same warunki wirowania.
8. Dodać 1 ml buforu wiążącego i obracać próbkę przez 1 godziny w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Ten krok można skrócić, jeśli kompleks utworzony na podłożu ma tendencję do dysocjacji.
9. Wirować kulki przez 2-3 minuty przy 25 x g, dodać 1 ml buforu i przenieść zawiesinę do nowej probówki.
10. Obracaj przez dodatkową 1 godzinę lub krócej, jeśli kompleks nie jest stabilny, wirować przez 2-3 minuty przy 25 x g i przenieś kulki do probówki o pojemności 500 μl w 200 μl buforu wiążącego.

4. Lucja UV.

1. Włącz lampę UV o wysokiej intensywności emitującą światło UV 365 nm przez 5-10 minut, zanim osiągniesz pełną jasność.
   UWAGA: Jest to niezbędne do osiągnięcia maksymalnej energii emisji UV na początku napromieniowania.
2. Napełnij dno szalki Petriego (100 mm x 15 mm) szczelnie zapakowanym lodem i ułóż go na pokrywie naczynia.
3. Krótko zawirować probówkę zawierającą unieruchomiony kompleks, umieścić ją poziomo na lodzie i przykryć wstępnie ogrzaną lampą, upewniając się, że próbka znajduje się w odległości 2-3 cm od powierzchni bańki.
   UWAGA: Jeśli odległość jest zbyt duża, użyj dodatkowych szalek Petriego lub innych odpowiednich przedmiotów, aby zbliżyć próbkę do bańki.
4. Naświetlać łącznie przez 30 minut, często odwracając i wirując rurkę, aby zapewnić równomierną ekspozycję zawiesiny na promieniowanie UV i zapobiec przegrzaniu.
   UWAGA: Aby zapewnić dodatkowe chłodzenie, etap elucji UV można przeprowadzić w zimnym pomieszczeniu. Przełącz się na szalkę Petriego ze świeżym lodem w przypadku nadmiernego topnienia lodu.
5. Wirować kulki przez 2-3 minuty przy 25 x g i zebrać supernatant.
6. Ponownie odwiruj supernatant w tych samych warunkach i zbierz supernatant.
   UWAGA: Pozostaw niewielką ilość supernatantu na dnie, aby uniknąć przenoszenia resztek kulek.

5. Analiza próbki za pomocą barwienia srebrem, a następnie spektrometria mas.

1. Użyć elektroforezy w żelu SDS/poliakrylamidowym, aby oddzielić frakcję supernatantu eluowanego promieniami UV i tę samą frakcję materiału pozostałą na kulkach po elucji UV.
   UWAGA: Analiza może również obejmować podwielokrotność kulek pobranych z próbki przed elucjącją.
2. Wybarwić żel zawierający oddzielone białka za pomocą dostępnego w handlu zestawu do barwienia srebra.
3. Ocenić skuteczność elucji UV, porównując intensywność białek obecnych w supernatancie wymywanym promieniami UV i tych pozostawionych na kulkach po naświetlaniu promieniowaniem UV.
4. Wytnij interesujące nas pasma białkowe i określ ich tożsamość za pomocą spektrometrii mas przy użyciu standardowych protokołów^10,15.

6. Globalna analiza próbki wymytej promieniami UV za pomocą spektrometrii mas.

1. Bezpośrednio przeanalizuj frakcję supernatantu eluowanego w promieniowaniu UV za pomocą spektrometrii mas, aby określić cały proteom oczyszczonego materiału w sposób bezstronny.
   UWAGA: Można to zrobić poprzez traktowanie oczyszczonych próbek trypsyną w roztworze, a następnie standardowe protokoły spektrometrii mas w celu określenia tożsamości generowanych peptydów^10,15.

Results

Metoda elucji UV została przetestowana z dwoma chemicznie zsyntetyzowanymi substratami RNA kowalencyjnie przyłączonymi na końcu 5' do ugrupowania pcB (konfiguracja cis): pcB-SL (Rysunek 1) i pcB-dH3/5m RNA (Rysunek 2). 31-nukleotydowe pcB-SL RNA zawiera strukturę pętli macierzystej, po której następuje 5-nukleotydowy jednoniciowy ogon, a jego sekwencja jest identyczna z końcem 3' dojrzałego mRNA histonu (tj. po rozszczepieniu histo...

Discussion

Opisana tutaj metoda jest prosta i oprócz tego, że zawiera łącznik z możliwością fotorozszczepienia i etap elucji UV, nie różni się od powszechnie stosowanych metod, które wykorzystują niezwykle silne oddziaływanie między biotyną a streptawidyną. Etap elucji UV jest bardzo wydajny, zwykle uwalniając ponad 75% unieruchomionego RNA i powiązanych białek z kulek streptawidyny, pozostawiając wysokie tło białek, które niespecyficznie wiążą się z kulkami. Eliminując to tło, etap elucji UV pozwala uzyskać niezwykle czyste próbki...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptawidyna-Agaroza	Sigma	S1638-5ML
Długofalowa lampa UV o wysokiej intensywności	Cole-Parmer	UX-97600-00
Wymienna żarówka	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 watów Żarówka Mercury H44GS-100M emitująca światło UV 366 nm (Sylvania)
RNA i oligonukleotydy zawierające biotynę i łącznik fotorozszczepialny w cis	Dharmacon (Lafayette, CO) lub Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Zapytaj o wycenę w Dharmacon
Beckman GH 3.8 wirnik kubełkowy wahadłowy	Beckman
RiboMAX Systemy produkcji RNA na dużą skalę (polimeraza T7)	Promega	P1300
RiboMAX Systemy produkcji RNA na dużą skalę (polimeraza SP6)	Zestaw	P1280
Pierce Silver	ThermoFisher Scientific	24612