Method Article

Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

DOI:

10.3791/58698

⸱

June 22nd, 2019

 , 
1Department of Microbial, Biochemical and Food Biotechnology, University of the Free State

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół przygotowania wspólnej hodowli komórek kryptokokowych i ameb, która jest badana przy użyciu nieruchomych, fluorescencyjnych obrazów i obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości. Zilustrowano tutaj, w jaki sposób dane ilościowe mogą uzupełniać takie informacje jakościowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby symulować infekcję Cryptococcus, ameba, która jest naturalnym drapieżnikiem komórek kryptokokowych w środowisku, może być używana jako model dla makrofagów. Ten drapieżny organizm, podobny do makrofagów, wykorzystuje fagocytozę do zabijania zinternalizowanych komórek. Za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego rejestrowane są obrazy przedstawiające interaktywne momenty między komórkami kryptokokowymi a amebą. Moc rozdzielcza mikroskopu elektronowego pomaga również ujawnić ultrastrukturalne szczegóły komórek kryptokokowych uwięzionych w wakuoli pokarmowej ameby. Ponieważ fagocytoza jest procesem ciągłym, dane ilościowe są następnie integrowane z analizą, aby wyjaśnić, co dzieje się w momencie, gdy obraz jest rejestrowany. Mówiąc dokładniej, względne jednostki fluorescencji są odczytywane w celu ilościowego określenia skuteczności ameby w internalizacji komórek kryptokokowych. W tym celu komórki kryptokokowe są barwione barwnikiem, który sprawia, że fluoryzują po uwięzieniu w kwaśnym środowisku wakuoli pokarmowej. Wykorzystane razem, informacje zebrane za pomocą takich technik mogą dostarczyć krytycznych informacji, które pomogą wyciągnąć wnioski na temat zachowania i losu komórek po internalizacji przez amebę i, być może, przez inne komórki fagocytarne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroby ewoluowały z biegiem czasu, aby zajmować i rozwijać się w różnych niszach ekologicznych, takich jak otwarte fizyczne granice gleby i wody, między innymi1. W tych niszach mikroorganizmy często angażują się w bezpośrednią konkurencję o ograniczone zasoby; Co ważne, w przypadku składników odżywczych, których używają do wspierania swojego wzrostu lub przestrzeni, których potrzebują, aby pomieścić rosnącą populację2,3. W niektórych przypadkach niektóre organizmy holozoiczne, takie jak ameba, mogą nawet żerować na komórkach kryptokokowych jako sposób na ekstrakcję składników odżywczyc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptococcus neoformans i niektóre szczepy Acanthamoeba castellanii są uważane za patogeny poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), dlatego badacze muszą podjąć odpowiednie środki ostrożności podczas pracy z tymi organizmami. Na przykład personel laboratoryjny powinien przejść specjalne szkolenie i posiadać środki ochrony osobistej (PPE), takie jak fartuchy laboratoryjne, rękawice i ochrona oczu. Szafa bezpieczeństwa biologicznego (poziom 2) powinna być używana do procedur, które mogą powodować infekcję14.

1. Hodowla i standaryzacja komórek grzybów (zmodyfikowana z Madu et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroby to mikroskopijne organizmy, których nie można dostrzec gołym okiem. Jednak ich wpływ może skutkować obserwowalnymi klinicznie widocznymi chorobami, takimi jak infekcje skóry. Podczas badania niektórych aspektów drobnoustrojów, począwszy od ich morfologii, produktów ubocznych i interakcji, możliwość dostarczenia dowodów obrazowych i wideo ma ogromne znaczenie.

Najpierw staraliśmy się zobrazować interakcję między komórkami.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule z powodzeniem zastosowano różne techniki, aby ujawnić możliwy wynik, który może wystąpić, gdy ameba wchodzi w interakcję z komórkami kryptokoki. Byliśmy również zainteresowani pokazaniem wpływu 3-hydroksykwasów tłuszczowych na wynik interakcji Cryptococcus-ameba.

Pierwszą zastosowaną techniką była mikroskopia konfokalna, która pozwalała na renderowanie nieruchomych obrazów. Główną wadą tej techniki było to, że dawała nam tylko informacje, które są ograniczone do określonego.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca została wsparta grantem z Narodowej Fundacji Badawczej Południowej Afryki (numer grantu: UID 87903) oraz Uniwersytetu Wolnego Państwa. Jesteśmy również wdzięczni za usługi i pomoc oferowaną przez Pietera van Wyka i Hanlie Grobler podczas naszych badań mikroskopowych.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-diazabicyklo-[2.2.2]-oktanowaplastikowa tubka Sigma-AldrichD27802-1,5
ml Thermo Fisher Scientific69715-15-mL
Probówka wirówkowa Thermo Fisher Scientific
7252018-50 ml Thermo Fisher Scientific
1132017-8-Well zjeżdżalnia komorowaThermo Fisher Scientific1109650-Aceton
Merck
SAAR1022040LC-Amoeba szczepATCCÒ 30234TM-
ATCC średni 712ATCCÒ 712TMAmoeba medium
96-dołkowa płytka do mikromiareczkowaniaThermo Fisher Scientific
152089-WirówkaHermle--
ChloroformSigma-AldrichC2432-Mikroskop
konfokalnyNikonNikon TE 2000-Żywica
epoksydowa:
[1] NSA[1] ALS[1] R1054-
[2] DER 736[2] ALS[2] R1073-
[3] Żywica ERL Y221[3] ALS[3] R1047R-
[4] S1 (2-dimetyloaminoetanol)[4] ALS [4] R1067-Izotiocyjanian
fluoresceinySigma-AldrichF4274-Kwas
mrówkowySigma-Aldrich
489441-Fluoroskan Ascent FLThermo Fisher Scientific374-91038CCzytnik mikropłytek
GlukozaSigma-AldrichG8270-Aldehyd
glutarowyALSR1009-
HemocytometrBoeco--
Cytrynian ołowiuALSR1209-Chromatografia
cieczowa Spektrometr masowyThermo FisherScientific-Methanol
Sigma-AldrichR 34,860-Wytrząsarka
orbitalnaLasec --
Tetratlenek osmuALSR1015-pHrodo
Green Zymosan A BioParticlesLife TechnologiesP35365Jest to barwnik wrażliwy na pH
Fizjologiczny roztwór buforowySigma-AldrichP4417-50TAB-Wytrząsarka
obrotowaLabcon-
-Bufor fosforanu sodu:
[1] Wodoroortofosforan sodu dwuwodny [1] Merck[1] 106580-
[2] di-wodorortofosforan sodu dwuwodny[2] Merck [2] 106345
Transmisyjny mikroskop elektronowyPhilipsPhilips EM 100 -
Błękit trypanowy Sigma-AldrichT8154-Ultramikrotom
LeicaEM UC7-Octan
uranyluALSR1260A-Eksykator
próżniowyLasec -
-FiolkaSigma-Aldrich29651-U-YNB
Lasec 239210-YPD
agarSigma-AldrichY-1500-
Probówka wirówkowa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
  2. Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
  3. Comolli, L. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryptococcus Amoeba InteractionsConfocal MicroscopyTransmission Electron MicroscopyPhagocytosis AssayFluorescence ReadingpHrodo StainingFungal Cell CultureAmoeba ViabilityCo culture PreparationUltrastructural Analysis

Related Articles