Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58698

⸱

22 czerwca 2019

 , 
1Department of Microbial, Biochemical and Food Biotechnology, University of the Free State

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół przygotowania wspólnej hodowli komórek kryptokokowych i ameb, która jest badana przy użyciu nieruchomych, fluorescencyjnych obrazów i obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości. Zilustrowano tutaj, w jaki sposób dane ilościowe mogą uzupełniać takie informacje jakościowe.

Streszczenie

Aby symulować infekcję Cryptococcus, ameba, która jest naturalnym drapieżnikiem komórek kryptokokowych w środowisku, może być używana jako model dla makrofagów. Ten drapieżny organizm, podobny do makrofagów, wykorzystuje fagocytozę do zabijania zinternalizowanych komórek. Za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego rejestrowane są obrazy przedstawiające interaktywne momenty między komórkami kryptokokowymi a amebą. Moc rozdzielcza mikroskopu elektronowego pomaga również ujawnić ultrastrukturalne szczegóły komórek kryptokokowych uwięzionych w wakuoli pokarmowej ameby. Ponieważ fagocytoza jest procesem ciągłym, dane ilościowe są następnie integrowane z analizą, aby wyjaśnić, co dzieje się w momencie, gdy obraz jest rejestrowany. Mówiąc dokładniej, względne jednostki fluorescencji są odczytywane w celu ilościowego określenia skuteczności ameby w internalizacji komórek kryptokokowych. W tym celu komórki kryptokokowe są barwione barwnikiem, który sprawia, że fluoryzują po uwięzieniu w kwaśnym środowisku wakuoli pokarmowej. Wykorzystane razem, informacje zebrane za pomocą takich technik mogą dostarczyć krytycznych informacji, które pomogą wyciągnąć wnioski na temat zachowania i losu komórek po internalizacji przez amebę i, być może, przez inne komórki fagocytarne.

Wprowadzenie

Mikroby ewoluowały z biegiem czasu, aby zajmować i rozwijać się w różnych niszach ekologicznych, takich jak otwarte fizyczne granice gleby i wody, między innymi1. W tych niszach mikroorganizmy często angażują się w bezpośrednią konkurencję o ograniczone zasoby; Co ważne, w przypadku składników odżywczych, których używają do wspierania swojego wzrostu lub przestrzeni, których potrzebują, aby pomieścić rosnącą populację2,3. W niektórych przypadkach niektóre organizmy holozoiczne, takie jak ameba, mogą nawet żerować na komórkach kryptokokowych jako sposób na ekstrakcję składników odżywczych z ich biomasy4,5. To z kolei pozwala takim organizmom na ustanowienie dominacji terytorialnej poprzez kontrolowanie liczebności populacji swojej ofiary. Ze względu na tę drapieżną presję, niektóre ofiary mogą zostać wybrane do produkcji czynników mikrobiologicznych, takich jak kapsułka kryptokokowa 6, aby pogodzić negatywne skutki presji. Jednak niezamierzoną konsekwencją tej presji jest to, że niektóre mikroorganizmy nabywają czynniki, które pozwalają im przekroczyć barierę gatunkową i szukać nowych nisz do kolonizacji7, takich jak zamknięte przestrzenie ludzkiego ciała, które są bogate w składniki odżywcze i mają idealne warunki. To ostatnie może wyjaśniać, w jaki sposób mikrob lądowy, taki jak Cryptococcus (C.) Nowotwory mogą przekształcać się w patogenne.

W tym celu ważne jest zbadanie początkowego kontaktu, jaki komórki kryptokokowe mogą mieć z amebą i jak to może je selekcjonować do stania się patogennymi. Mówiąc dokładniej, może to dać wskazówki na temat tego, jak zachowują się komórki kryptokokowe, gdy działają na nie makrofagi podczas infekcji. Z tego powodu ameba została wybrana jako model dla makrofagów, ponieważ jest stosunkowo tania i łatwa do utrzymania hodowla ameby w laboratorium8. Interesujące było również zbadanie, w jaki sposób wtórne metabolity kryptokokowe, tj. 3-hydroksykwasy tłuszczowe9,10 wpływają na interakcję między amebami a komórkami kryptokoki.

Prostym sposobem na dostrzeżenie interakcji między amebą a jej ofiarą gołym okiem jest stworzenie trawnika z wykorzystaniem zdobyczy na powierzchni płytki agarowej i plamki ameby. Wizualizacja blaszek lub przezroczystych stref na płytce agarowej przedstawia obszary, w których ameba mogła żywić się swoją zdobyczą. Jednak na tym poziomie makro odnotowuje się tylko wynik procesu i nie można zaobserwować procesu fagocytozy zmechanizowanej. Dlatego, aby docenić ten proces na podstawie komórki, istnieje kilka mikroskopijnych metod, które można zastosować11,12. Na przykład, odwrócony mikroskop z komorą inkubacyjną może być użyty do nagrania wideo poklatkowego zdarzeń między komórką fagocytarną a jej celem13. Niestety, ze względu na koszt mikroskopu z funkcją poklatkową, laboratoria nie zawsze mają możliwość zakupu takiego mikroskopu, zwłaszcza w warunkach ubogich w zasoby.

Aby obejść powyższe ograniczenie, to badanie przedstawia sekwencyjny projekt eksploracyjny, który ocenia interakcję C. neoformans, tj. C. neoformans UOFS Y-1378 i C. neoformans LMPE 046 z Acanthamoeba castellani. Po pierwsze, stosuje się metodę jakościową, która poprzedza metodę ilościową. Nieruchome obrazy są rejestrowane za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, a także transmisyjnego mikroskopu elektronowego, aby zobrazować interakcje ameba-Cryptococcus. Następnie przeprowadzono ilościowe określenie fluorescencji za pomocą czytnika płytek w celu oszacowania skuteczności ameby w internalizacji komórek kryptokokowych. Uzgadnianie wyników tych metod na etapie interpretacji danych może w równym stopniu ujawnić tyle samo krytycznych informacji, co oglądanie filmu poklatkowego z fagocytozą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Cryptococcus neoformans i niektóre szczepy Acanthamoeba castellanii są uważane za patogeny poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), dlatego badacze muszą podjąć odpowiednie środki ostrożności podczas pracy z tymi organizmami. Na przykład personel laboratoryjny powinien przejść specjalne szkolenie i posiadać środki ochrony osobistej (PPE), takie jak fartuchy laboratoryjne, rękawice i ochrona oczu. Szafa bezpieczeństwa biologicznego (poziom 2) powinna być używana do procedur, które mogą powodować infekcję14.

1. Hodowla i standaryzacja komórek grzybów (zmodyfikowana z Madu et al. 15 )

  1. Badane szczepy grzybów (tj. C. neoformans UOFS Y-1378 i C. neoformans LMPE 046) należy usunąć z kultur podstawowych (nie starszych niż 9 miesięcy) na płytkach agarowych z drożdżami, peptonem i dekstrozą (YPD). Informacje na temat składników agaru YPD można znaleźć w tabeli 1.
    UWAGA: Wykazano, że C. neoformans UOFS Y-1378 wytwarza 3-hydroksykwasy tłuszczowe, podczas gdy C. neoformans LMPE 046 nie wytwarza 3-hydroksykwasów tłuszczowych. Patrz plik uzupełniający 1, aby uzyskać informacje na temat tego, w jaki sposób określa się obecność tych cząsteczek.
  2. Inkubować płytki agarowe przez 48 godzin w temperaturze 30 °C.
    UWAGA: Płytka może być przechowywana do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C, zanim będzie można ją wyrzucić lub użyć do wytworzenia kultury podstawowej16.
  3. Zeskrobać pętlę pełną komórek kryptokokowych (C. neoformans UOFS Y-1378 lub C. neoformans LMPE 046) z płytki 48 h i zaszczepić w stożkowej kolbie o pojemności 250 ml zawierającej 100 ml chemicznie zdefiniowanego bulionu YNB (6,7 g / l) uzupełnionego o 4% (w/v) glukozy. Informacje o składnikach bulionu YNB znajdują się w tabeli 2.
  4. Inkubować kolby w temperaturze 30 °C przez 24 godziny, mieszając z prędkością 160 obr./min na wytrząsarce obrotowej.
  5. Po 24 godzinnym okresie inkubacji należy policzyć komórki grzyba za pomocą hemocytometru i dostosować liczbę komórek do 1 x 106 komórek/ml z PBS o pH 7,4,
    UWAGA: Przygotowany inokulum C. neoformans UOFS Y-1378 użyto w krokach 3.1 i 3.2, podczas gdy inokulum C. neoformans LMPE 046 użyto tylko w kroku 3.2.

2. Hodowla i standaryzacja komórek ameby (zmodyfikowane z Madu et al. 15 )

  1. Rozmrozić kulturę Acanthamoeba castellanii i doprowadzić ją do temperatury pokojowej (RT).
    UWAGA: Amoeba została przygotowana w oparciu o zmodyfikowane protokoły Axelsson-Olsson et al.8 oraz Schuster17.
  2. Pobrać pipetę o pojemności 1 ml rozmrożonej kultury i zaszczepić ją w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 15 ml pożywki ATCC 712. Informacje na temat składników ATCC medium 712 można znaleźć w Tabeli 3.
  3. Ręcznie delikatnie wstrząsnąć i natychmiast odwirować przez 5 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 30 °C.
  4. Odessać supernatant.
  5. Zawiesić komórki w 15 ml pożywki ATCC 712 i inkubować probówkę w temperaturze 30 °C przez 14 dni.
    UWAGA: Okresowo sprawdzaj komórki za pomocą prostego mikroskopu świetlnego, aby określić, czy są w stanie trofozoitowym. Gdy znajdą się w stanie trofozoitu, rozpocznij nową kulturę.
  6. Pobrać pipetę o pojemności 1 ml z hodowli, która pokazuje komórki w stanie trofozoitowym i użyć jej do zaszczepienia sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 15 ml świeżej, sterylnej pożywki ATCC 712.
  7. Inkubować probówkę w temperaturze 30 °C przez 1 tydzień, mieszając z prędkością 160 obr./min na wytrząsarce obrotowej.
  8. Po tygodniu policz komórki ameby za pomocą hemocytometru i ustaw liczbę komórek na 1 x 107 komórek/ml za pomocą świeżej, sterylnej pożywki ATCC 712.
  9. Wykonaj test żywotności przy użyciu niebieskiego barwnika trypanowego, zgodnie z opisem w Strober18. Kontynuuj z kulturami, które wykazują co najmniej 80% żywotności.

3. Barwienie fluorescencyjne komórek w celu zbadania fagocytozy (zmodyfikowane z Madu et al. 15 )

  1. Gromadzenie danych jakościowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego
    UWAGA: Wykonaj ten test z Acanthamoeba castellanii i C. neoformans UOFS Y-1378.
    1. Dozować 200 μl zawiesiny standaryzowanych ameb (1 x 10 7 komórek/ml w pożywce ATCC 712) do studzienek komory z przylegającym szkiełkiem i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 30 °C, aby komórki przylegały do powierzchni.
    2. Podczas gdy komórki ameby osiadają, aby przylegać, zabarwić standaryzowane komórki C. neoformans UOFS Y-1378, które zostały dostosowane do 1 x 106 komórek/ml (w 999 μl PBS) 1 μl izotiocyjanianu fluoresceiny w plastikowej probówce o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Przygotuj plamę, rozpuszczając 1 mg izotiocyjanianu fluoresceiny w 1 ml acetonu.
    3. Delikatnie mieszaj komórki C. neoformans UOFS Y-1378 na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 50 obr./min przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i w ciemności.
    4. Po 2 godzinach odwirować przy 960 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C w celu osadzenia komórek.
    5. Odessać supernatant w celu usunięcia PBS z barwnikiem.
    6. Dodać 1 ml PBS do probówki w celu przepłukania osadu komórkowego. Umyj komórki, delikatnie pipetując.
    7. Odwirować komórki przy 960 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C. Odrzucić supernatant. Powtórz krok prania jeszcze raz.
    8. Ponownie zawiesić umyte komórki w 1 ml PBS.
    9. Dozować 200 μl zawiesiny barwionych komórek C. neoformans UOFS Y-1378 do studzienek komorowych zawierających niebarwione komórki ameby.
    10. Przygotowaną kokulturę inkubować w temperaturze 30 °C przez dodatkowe 2 godziny.
      UWAGA: Współkultura może być inkubowana przez różne punkty czasowe, aby dopasować się do celu eksperymentu.
    11. Pod koniec okresu wspólnej inkubacji zassać zawartość studzienek.
    12. Dodać 300 μl PBS do studzienek, aby umyć studzienki komory i usunąć wszelkie niezwiązane współhodowane komórki. W tym celu należy delikatnie pipetować. Zassać zawartość studzienek. Powtórz krok prania jeszcze raz.
    13. Przygotować 3% roztwór aldehydu glutarowego, dodając 3 ml aldehydu glutarowego do 97 ml wody destylowanej.
    14. Utrwalić współhodowane komórki, dodając 250 μl 3% roztworu do studzienek komory i inkubując przez 1 godzinę.
    15. Zassać utrwalacz i umyć studzienki komory, jak opisano w kroku 3.1.13.
    16. Zdemontuj studzienki studzienki za pomocą narzędzia, które zostało dostarczone wraz ze zsuwami studzienki.
    17. Dodaj kroplę związku zapobiegającego blaknięciu, 1,4-diazabicyklo-[2.2.2]-oktanu do szkiełka, aby zapobiec samowybielaniu. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij boki lakierem do paznokci, aby zapobiec parowaniu.
    18. Zobacz współhodowane komórki za pomocą soczewki obiektywowej 100x (z olejem) konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.
      UWAGA: Ważne jest, aby robić zdjęcia w jasnym polu i fluorescencji, aby zobaczyć interakcję między amebą a komórkami kryptokoku. Tam, gdzie to możliwe, fluorescencja może być nakładana na obrazy w jasnym polu. Komórki ameby są zazwyczaj większe (tj. 45-60 μm), a komórki trofozoitu mają nieregularny kształt. Komórki kryptokokowe mają średnicę 5-10 μm i kształt od kulistego do jajowatego. Po wystawieniu na działanie lasera możliwe jest, że niebarwione komórki ameby mogą emitować autofluorescencję. Zapoznaj się z Beisker i Dolbeare19 oraz Clancy and Cauller20, aby zapoznać się z metodami redukcji autofluorescencji.
  2. Pozyskiwanie danych ilościowych za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych
    UWAGA: Wykonaj ten test z Acanthamoeba castellanii i C. neoformans UOFS Y-1378 lub C. neoformans LMPE 046.
    1. Dozować 100 μl zawiesiny standaryzowanych ameb (dostosowanych do 1 x 107 komórek/ml w pożywce ATCC 712) do czarnej, przylegającej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.
    2. Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 30 °C, aby komórki ameby mogły przylgnąć do powierzchni.
    3. Podczas gdy komórki ameby osiadają, aby przylegać, wybarwić standaryzowane komórki C. neoformans UOFS Y-1378, które zostały dostosowane do 1 x 106 komórek/ml (w 999 μl PBS) za pomocą 1 μl pHrodo Green Zymosan A BioParticles w 1,5 ml probówce do mikrowirówki. Wybarwić komórki C. neoformans LMPE 046 również w osobnej probówce.
      UWAGA: Barwnik, w przeciwieństwie do FITC, selektywnie barwi komórki, które są uwięzione w kwaśnym środowisku komórki fagocytarnej21,22. W przypadku tej techniki ważne jest, aby komórki kryptokokowe były utrzymywane w pożywce o neutralnym pH (PBS), a ameba w pożywce o neutralnym pH (pożywka ATCC 712). Pożywka o kwaśnym środowisku spowoduje fałszywie dodatni odczyt względnych jednostek fluorescencji, co oznacza, że większa liczba kryptokoków została zinternalizowana.
    4. Delikatnie mieszaj komórki kryptokokowe na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 50 obr./min przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i w ciemności.
    5. Po 2 godzinach odwirować probówkę do mikrowirówek o sile 960 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C w celu osadzenia komórek. Odessać supernatant, aby usunąć PBS z barwnikiem.
    6. Dodaj 1 ml PBS do probówki, aby przepłukać granulowane komórki. Umyć komórki delikatnym pipetowaniem.
    7. Odwirować komórki przy 960 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C. Odrzucić supernatant. Powtórz krok prania jeszcze raz.
    8. Zawiesić osad przemytych komórek w 1 ml PBS.
    9. Dozować 100 μl zawiesiny barwionych komórek kryptokokowych do studzienek zawierających niebarwione komórki ameby.
    10. Przygotowaną kokulturę inkubować w temperaturze 30 °C przez dodatkowe 2 godziny.
      UWAGA: Współkultura może być inkubowana dla różnych punktów czasowych, aby dopasować się do celu eksperymentu.
    11. Pod koniec okresu wspólnej inkubacji zmierzyć fluorescencję na czytniku mikropłytek. Konwertuj sygnały logarytmiczne na względne jednostki fluorescencji.
      UWAGA: Wzbudzenie barwnika wynosi 492 nm, a emisja 538 nm. Skonsultuj się z Beiskerem i Dolbeare19 oraz Clancy and Cauller20, aby dowiedzieć się o metodach redukcji autofluorescencji.

4. Wykorzystanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej do badania fagocytozy (zmodyfikowane z van Wyk i Wingfield 23 )

  1. Dodać 5 ml zawiesiny ameb (dostosowanej do 1 x 107 komórek/ml w pożywce ATCC 712) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozostawić na 30 minut w temperaturze 30 °C.
  2. Dodać 5 ml zawiesiny komórek C. neoformans UOFS Y-1378 (dostosowanych do 1 x 106 komórek/ml w PBS) do tej samej probówki wirówkowej, która zawiera 5 ml standaryzowanych komórek ameby.
  3. Odstawić probówkę na 2 godziny w temperaturze 30 °C.
  4. Odwirować probówkę o sile 640 x g przez 3 minuty w temperaturze 30 °C w celu osadzenia współhodowanych komórek. Odessać supernatant. Nie myj współhodowanych komórek.
  5. Utrwalić współhodowane komórki poprzez ponowne zawieszenie osadu w 3 ml 1,0 M (pH = 7,0) 3% aldehydu glutarowego buforowanego fosforanem sodu na 3 godziny.
  6. Odwirować probówkę o masie 1,120 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C w celu osadzenia współhodowanych komórek. Odessać supernatant.
  7. Dodać 5 ml buforu fosforanu sodu do probówki wirówkowej, aby przepłukać granulowane komórki. Myć, delikatnie pipetując zawartość probówki przez 20 sekund.
  8. Odwirować probówkę o masie 1,120 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C w celu osadzenia współhodowanych komórek.
  9. Powtórz kroki 4.8-4.10. Odessać supernatant.
  10. Ponownie utrwalić współhodowane komórki, ponownie zawieszając osad w 3 ml 1,0 M (pH = 7,0) buforowanego 1% tetratlenkiem osmu z 1,0 M (pH = 7,0) na 1,5 godziny.
  11. Usunąć utrwalacz (tetratlenek osmu) poprzez przemycie współhodowanych komórek w podobny sposób, jak w przypadku usunięcia 3% aldehydu glutarowego.
  12. Odwodnić materiał TEM (znany również jako komórki z kohodowlą) w stopniowanej serii acetonu odpowiednio 30%, 50%, 70%, 95% i dwóch przemianach po 100% przez 15 minut każda. W tym celu dodaj 3 ml roztworu acetonu do granulowanych komórek i odstaw na 15 minut. Następnie odwirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej Odrzucić supernatant i dodać większą zawartość procentową roztworu acetonu.
  13. Przygotuj żywicę epoksydową o normalnej konsystencji zgodnie z protokołem Spur24.
    UWAGA: Żywica epoksydowa służy do cięcia.
  14. Osadź materiał TEM w świeżo przygotowanej żywicy epoksydowej. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
    1. Dodać 3 ml świeżo przygotowanej żywicy epoksydowej do probówki zawierającej materiał TEM zawieszony w 3 ml 100% roztworu acetonu. Odstawić probówkę na 1 godzinę.
    2. Odwirować probówkę o stężeniu 200 x g przez 10 minut w temperaturze 30 °C. Odessać roztwór epoksydowo-acetonowy.
    3. Dodaj 6 ml świeżo przygotowanej żywicy epoksydowej do granulki w probówce. Odstawić probówkę na 1 godzinę.
    4. Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 30 °C. Odessać cały roztwór epoksydowo-acetonowy.
    5. Dodaj 3 ml świeżo przygotowanej żywicy epoksydowej do probówki. Odstawić probówkę na 8 godzin.
    6. Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 30 °C. Odessać cały roztwór epoksydowy
    7. Dodaj 3 ml świeżo przygotowanej żywicy epoksydowej do probówki. Materiał TEM należy przechowywać przez noc w roztworze epoksydowym w eksykatorze próżniowym.
      UWAGA: Żywica epoksydowa jest materiałem radioaktywnym. Do obchodzenia się z żywicą epoksydową należy używać środków ochrony indywidualnej. Z żywicą epoksydową należy również obchodzić się w dygestorium. Badacze powinni przestrzegać przepisów bezpieczeństwa dotyczących wyrzucania takich materiałów, określonych przez każdy kraj25.
  15. Polimeryzować materiał TEM przez 8 godzin w temperaturze 70 °C.
  16. Na ultramikrotomie należy przyciąć małe odcinki o wymiarach około 0,1 mm x 0,1 mm i grubości 60 nm z materiału osadzonego w żywicy epoksydowej za pomocą zamontowanego noża do szkła. Zmontuj sekcje na siatce i umieść je w pudełku z uchwytem na próbki TEM przed barwieniem.
  17. Zabarwić skrawki kroplą 6% octanu uranylu przez 10 minut w ciemności. Upewnij się, że sekcje są całkowicie zakryte.|
    UWAGA: Rozpuść plamę (6 g) w 100 ml wody destylowanej.
    UWAGA: Octan uranylu jest materiałem radioaktywnym. Używaj środków ochrony indywidualnej do obchodzenia się z octanem uranylu. Octan uranylu powinien być również przenoszony w dygestorium. Badacze powinni przestrzegać przepisów bezpieczeństwa dotyczących wyrzucania takich materiałów, określonych przez każdy kraj25.
  18. Opłucz sekcje, zanurzając je pięć razy w zlewce zawierającej 100 ml wody destylowanej.
    UWAGA: Wodę destylowaną należy odpowiednio zutylizować, ponieważ zawiera śladowe ilości octanu uranylu.
  19. Zabarwić sekcję kroplą cytrynianu ołowiu przez 10 minut w ciemności. Upewnij się, że sekcje są całkowicie zakryte.
    UWAGA: Cytrynian ołowiu powinien być przygotowany zgodnie z protokołem Reynold26.
  20. Opłucz sekcje, zanurzając je pięć razy w zlewce zawierającej 100 ml wody destylowanej.
  21. Indywidualnie zmontuj kratki z poplamionymi sekcjami na pudełku z uchwytem na próbki TEM.
  22. Oglądaj przekroje z transmisyjnym mikroskopem elektronowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mikroby to organizmy mikroskopijne, których nie można dostrzec gołym okiem. Ich oddziaływanie może jednak prowadzić do wystąpienia obserwowalnych klinicznie chorób, takich jak zakażenia skóry. Podczas badania określonych aspektów mikrobów, od ich morfologii, przez produkty przemiany materii, aż po interakcje, kluczowe znaczenie ma możliwość przedstawienia dowodów w formie obrazów i nagrań wideo.

W pierwszej kolejności podjęto pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule z powodzeniem zastosowano różne techniki, aby ujawnić możliwy wynik, który może wystąpić, gdy ameba wchodzi w interakcję z komórkami kryptokoki. Byliśmy również zainteresowani pokazaniem wpływu 3-hydroksykwasów tłuszczowych na wynik interakcji Cryptococcus-ameba.

Pierwszą zastosowaną techniką była mikroskopia konfokalna, która pozwalała na renderowanie nieruchomych obrazów. Główną wadą tej techniki było to, że dawała nam tylko informacje, które są ograniczone do określonego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Praca została wsparta grantem z Narodowej Fundacji Badawczej Południowej Afryki (numer grantu: UID 87903) oraz Uniwersytetu Wolnego Państwa. Jesteśmy również wdzięczni za usługi i pomoc oferowaną przez Pietera van Wyka i Hanlie Grobler podczas naszych badań mikroskopowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,4-diazabicyklo-[2.2.2]-oktanowaplastikowa tubka Sigma-AldrichD27802-1,5
ml Thermo Fisher Scientific69715-15-mL
Probówka wirówkowa Thermo Fisher Scientific
7252018-50 ml Thermo Fisher Scientific
1132017-8-Well zjeżdżalnia komorowaThermo Fisher Scientific1109650-Aceton
Merck
SAAR1022040LC-Amoeba szczepATCCÒ 30234TM-
ATCC średni 712ATCCÒ 712TMAmoeba medium
96-dołkowa płytka do mikromiareczkowaniaThermo Fisher Scientific
152089-WirówkaHermle--
ChloroformSigma-AldrichC2432-Mikroskop
konfokalnyNikonNikon TE 2000-Żywica
epoksydowa:
[1] NSA[1] ALS[1] R1054-
[2] DER 736[2] ALS[2] R1073-
[3] Żywica ERL Y221[3] ALS[3] R1047R-
[4] S1 (2-dimetyloaminoetanol)[4] ALS [4] R1067-Izotiocyjanian
fluoresceinySigma-AldrichF4274-Kwas
mrówkowySigma-Aldrich
489441-Fluoroskan Ascent FLThermo Fisher Scientific374-91038CCzytnik mikropłytek
GlukozaSigma-AldrichG8270-Aldehyd
glutarowyALSR1009-
HemocytometrBoeco--
Cytrynian ołowiuALSR1209-Chromatografia
cieczowa Spektrometr masowyThermo FisherScientific-Methanol
Sigma-AldrichR 34,860-Wytrząsarka
orbitalnaLasec --
Tetratlenek osmuALSR1015-pHrodo
Green Zymosan A BioParticlesLife TechnologiesP35365Jest to barwnik wrażliwy na pH
Fizjologiczny roztwór buforowySigma-AldrichP4417-50TAB-Wytrząsarka
obrotowaLabcon-
-Bufor fosforanu sodu:
[1] Wodoroortofosforan sodu dwuwodny [1] Merck[1] 106580-
[2] di-wodorortofosforan sodu dwuwodny[2] Merck [2] 106345
Transmisyjny mikroskop elektronowyPhilipsPhilips EM 100 -
Błękit trypanowy Sigma-AldrichT8154-Ultramikrotom
LeicaEM UC7-Octan
uranyluALSR1260A-Eksykator
próżniowyLasec -
-FiolkaSigma-Aldrich29651-U-YNB
Lasec 239210-YPD
agarSigma-AldrichY-1500-
Probówka wirówkowa

Bibliografia

  1. Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
  2. Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
  3. Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629(2014).
  4. Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
  5. Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
  6. Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
  7. Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
  8. Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
  9. Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
  10. Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
  11. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1(2015).
  12. Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
  13. Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196(2013).
  14. Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
  15. Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351(2015).
  16. Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
  17. Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
  19. Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
  20. Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
  21. Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
  22. Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
  23. van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
  24. Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
  25. Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
  26. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
  27. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
  28. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
  29. Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
  30. Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
  31. Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765(2017).
  32. Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459(2018).
  33. Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia konfokalnatransmisyjna mikroskopia elektronowatest fagocytozybarwienie pHrodohodowla kom rek grzyb wywotno amebprzygotowanie kokulturyanaliza ultrastrukturalna
Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.