Ustalenie linii komórkowych z nadekspresją DR3 w celu oceny odpowiedzi apoptotycznej na terapie antymitotyczne

Podsumowanie

Ustanowienie stabilnej linii komórkowej z nadekspresją interesującego genu do badania funkcji genu może być przeprowadzone przez stabilną transfekcję i selekcję pojedynczych klonów po ich transfekcji poprzez infekcję retrowirusową. Tutaj pokazujemy, że wygenerowane w ten sposób linie komórkowe HT29-DR3 wyjaśniają mechanizmy, za pomocą których receptor śmierci 3 (DR3) przyczynia się do apoptozy wywołanej antymitozą.

Streszczenie

Badanie funkcji interesującego genu można osiągnąć poprzez manipulowanie jego poziomem ekspresji, na przykład zmniejszając jego ekspresję za pomocą linii komórkowych knockdown lub zwiększając jego ekspresję za pomocą linii komórkowych z nadekspresją. Transfekcja przejściowa i stabilna to dwie metody, które są często stosowane do egzogennej ekspresji genów. Transfekcja przejściowa jest przydatna tylko do krótkotrwałej ekspresji, podczas gdy transfekcja stabilna umożliwia integrację genów egzogennych z genomem komórki gospodarza, gdzie będzie ona ulegać ciągłej ekspresji. W rezultacie, stabilna transfekcja jest zwykle stosowana do badań nad długoterminową regulacją genetyczną. Tutaj opisujemy prosty protokół generowania stabilnej linii komórkowej z nadekspresją znakowanego receptora śmierci 3 (DR3) w celu zbadania funkcji DR3. Wybraliśmy pojedyncze klony po infekcji retrowirusowej, aby zachować jednorodność i czystość stabilnych linii komórkowych. Stabilne linie komórkowe wygenerowane przy użyciu tego protokołu sprawiają, że komórki HT29 z niedoborem DR3 są wrażliwe na leki antymitotyczne, odtwarzając w ten sposób odpowiedź apoptotyczną w komórkach HT29. Co więcej, znacznik FLAG na DR3 kompensuje niedostępność dobrego przeciwciała DR3 i ułatwia biochemiczne badanie mechanizmu molekularnego, za pomocą którego środki antymitotyczne indukują apoptozę.

Wprowadzenie

Heterologiczna ekspresja genów jest często wykorzystywana do badania funkcji genów będących przedmiotem zainteresowania. Dwie metody, transfekcja przejściowa i stabilna, są powszechnie stosowane w komórkach i biologii molekularnej do wstawiania segmentu DNA lub RNA do komórki gospodarza^1,2. Przejściowo transfekowane DNA lub RNA nie mogą być przekazywane komórkom potomnym, więc zmiana genetyczna może zostać zachowana tylko przez krótki okres czasu. Z drugiej strony, w stabilnie transfekowanych komórkach egzogenne geny są zintegrowane z genomem komórki gospodarza, podtrzymując jej ekspresję w linii komórkowej. Tak więc stabilna transfekcja jest metodą, która jest zwykle zarezerwowana dla badań nad długoterminową regulacją genetyczną. Stabilna linia komórkowa może być również przeszczepiona w postaci ksenoprzeszczepów do modeli mysich do badania in vivo³. Stabilną transfekcję można podzielić na dwie kategorie: wirusową i niewirusową. W porównaniu z transfekcją niewirusową, infekcja wirusowa może przenosić geny do szerszej gamy komórek ludzkich z większą wydajnością^4,5^,6,7. Co więcej, stabilna linia komórkowa z pojedynczego klonu oferuje zaletę jednorodności i czystości klonalnej

.

Niekontrolowany wzrost i podział komórek to najbardziej charakterystyczne cechy raka. W warunkach klinicznych leki przeciwmitotyczne są podstawowym sposobem leczenia wielu typów nowotworów⁸. Nie można jednak ignorować pewnych istotnych ograniczeń środków antymitotycznych. Po pierwsze, te chemioterapie mogą również zabijać normalne komórki wraz z niepożądanymi komórkami rakowymi, a tym samym mogą powodować poważne skutki uboczne⁸. Po drugie, leki antytubulinowe nie są skuteczne przeciwko wszystkim typom nowotworów, pomimo wszechobecnej ekspresji tubuliny w wielu różnych tkankach jako białko cytoszkieletu^9,10. Nie jest jasne, dlaczego leki antytubulinowe wykazały obiecującą skuteczność przeciwko rakowi jajnika, płuc i nowotworom hematologicznym w leczeniu klinicznym, ale nie w raku nerki, okrężnicy lub trzustki¹¹. Wreszcie, nawet pacjenci z tym samym typem guza mogą reagować na leki przeciwmitotyczne w różny sposób w nieprzewidywalny sposób. Może istnieć kluczowa cząsteczka efektorowa, która wpływa na wrażliwość różnych pacjentów na środki antymitotyczne, co skutkuje różnorodnymi wynikami obserwowanymi w leczeniu klinicznym¹². W związku z tym należy wziąć pod uwagę potencjalną różnicę wrażliwości pacjentów na leczenie antymitotyczne w celu optymalizacji interwencji terapeutycznych¹³.

Wysokoprzepustowe badanie biblioteki siRNA całego genomu wykazało, że knockdown DR3 może uczynić wrażliwe komórki odpornymi na leki antymitotyczne, co sugeruje rolę DR3 w apoptozie wywołanej chemioterapią¹⁴. Jako członek nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworów (TNFR), DR3 pośredniczy w apoptozie komórek w różnych układach^15,16,17,18. Dlatego postanowiliśmy ustalić stabilne linie komórkowe z nadekspresją DR3, aby zbadać mechanizmy molekularne, za pomocą których leki antymitotyczne indukują apoptozę. Odpowiedni model komórkowy do badania nadekspresji DR3 może dostarczyć ludzka linia komórkowa raka jelita grubego HT29, u której stwierdzono niedobór DR3. Dodatkowo, w klinice, rak jelita grubego jest niewrażliwy na leki antymitotyczne¹⁹.

W tym artykule opisujemy metodę, która pozwala na wytworzenie stabilnej linii komórkowej HT29-DR3 poprzez infekcję retrowirusową. Ponadto pokazujemy, jak zwalidować ekspresję DR3 w tych komórkach za pomocą western blotting i jak ocenić wrażliwość na środki antymitotyczne za pomocą testu żywotności komórek i obserwacji morfologicznej. Komórki są amplifikowane z pojedynczych klonów, a zatem mają przewagę w postaci jednorodnego tła genetycznego. Ponadto znacznik FLAG na DR3 pozwolił na wizualizację komórkowego DR3 za pomocą mikroskopii oraz analizę ekspresji genów i interakcji białek za pomocą podejść biochemicznych. Co więcej, komórki mogą być ksenoprzeszczepowane u myszy w celu dalszej analizy progresji guza w odpowiedzi na leki antymitotyczne in vivo¹⁴.

Prezentowany tutaj system komórkowy HT29-DR3 oferuje skuteczne narzędzie do badania molekularnych mechanizmów zabijania komórek nowotworowych przez antymitotyki¹⁴. Ponieważ nadekspresja i knockdown linie komórkowe są powszechnymi narzędziami do badania funkcji genów, protokół ten można łatwo dostosować do innych interesujących genów lub innych linii komórkowych, a tym samym przekształcić w szeroko stosowane podejście.

Protokół

Proszę zauważyć, że wszystkie opisane tutaj eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Tsinghua.

1. Generowanie linii komórkowych nadekspresji DR3

1. Skonstruuj plazmid do ekspresji DR3 (pMXs-IRES-DR3-FLAG), wprowadzając cDNA DR3 o pełnej długości z 3x FLAG na końcu C do wektora retrowirusowego pMXs-IRES-Blasticidyna w miejscach restrykcyjnych BamHI / XhoI.
2. Hoduj komórki Plat-A w 60-milimetrowych szalkach z 4 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco. Następnego dnia, gdy komórki osiągną 80% - 90% konfluencji, należy przetransfekować komórki 2 μg plazmidu pMXs-IRES-DR3-FLAG za pomocą odczynnika do transfekcji (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcją producenta²⁰.
3. Po 72 godzinach zebrać supernatant, przefiltrować pożywkę za pomocą sterylnego filtra 0,45 μm i utrzymać zawiesinę wirusa w ciemności w temperaturze 4 °C.
4. Hodować komórki HT29 w DMEM w naczyniu o średnicy 60 mm i inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
5. Następnego dnia, gdy komórki osiągną 30% - 50% zbiegu, należy zainfekować komórki 2 ml zawiesiny wirusa w obecności 8 μg polimetabromidu 1,5-dimetylo-1,5-diazaundekametylomylu na mililitr zawiesiny wirusa. Po 4-6 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C odessać zawiesinę wirusa, dodać 4 ml świeżego DMEM i włożyć szalkę z powrotem do inkubatora.
6. Wyrzuć pożywkę z naczyń 24 godziny po zakażeniu i ostrożnie umyj komórki 2 ml podgrzanego PBS. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
7. Po zaobserwowaniu pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu, że większość komórek odłączyła się, przerwij trypsynizację za pomocą 2 ml kompletnego DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml DMEM. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół. Rozcieńczyć komórki przez czynniki 30, 100 i 300. Zasiać komórki w szalkach o średnicy 150 mm z 20 ml DMEM zawierającego 1 μg/ml blasticydyny. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez ~1 - 2 tygodnie.
9. W tym okresie obserwuj kolonie codziennie za pomocą odwróconego mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu. Zaznacz dobrze odizolowane kolonie na dnie naczynia, gdy średnica kolonii wynosi około 1 - 2 mm.
10. Odessać pożywkę i przemyć komórki 3 ml wstępnie podgrzanego PBS. Dodaj 2 mililitry trypsyny-EDTA do naczynia o średnicy 60 mm. Użyj sterylnych kleszczyków, aby podnieść autoklawowane sterylne cylindry do klonowania i umieść je w naczyniu o średnicy 60 mm. Podnieś butelki zawierające trypsynę-EDTA i delikatnie umieść je na zaznaczonych koloniach. Upewnij się, że każdy cylinder do klonowania zawiera tylko jedną kolonię i unikaj zanieczyszczenia pobliskimi koloniami.
11. Włóż naczynie z powrotem do inkubatora na 3 minuty.
12. Po 3 minutach sprawdź komórki pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu, aby zobaczyć, czy się odczepiły. Gdy komórki się podniosą, dodaj 70 μl pożywki hodowlanej do każdego cylindra, aby dezaktywować trypsynę. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Upewnij się, że nie przesuwasz cylindra podczas tego procesu.
13. Przenieś zawiesinę komórkową z każdej kolonii na dwie 24-dołkowe płytki zawierające 1 ml DMEM na studzienkę. Dodać 30 μl zawiesiny komórek na dołek na płytce A i 70 μl do odpowiednich dołków w płytce B. Odpowiednio oznaczyć płytki i umieścić je z powrotem w inkubatorze.

2. Weryfikacja linii komórkowej nadekspresji DR3

1. Gdy komórki na płytce B osiągną 90% zbieżności, usuń pożywkę i ostrożnie umyj komórki 1 ml PBS. Całkowicie usuń PBS i zlicz komórki za pomocą 50 μl bufora ładującego 1x SDS-PAGE. Przenieść lizaty komórkowe z płytki 24-dołkowej do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i gotować próbki przez 10 minut w temperaturze 100 °C.
2. Próbki należy uruchomić na 10% żelu dodecylosiarczanu sodu (SDS) przy stałym napięciu 80 V przez 15 minut, a następnie przy napięciu 120 V przez 1 godzinę.
3. Przenieść białko do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) metodą transferu na mokro przy stałym prądzie 400 mA przez 2 godziny.
4. Przetestuj ekspresję DR3 w różnych klonach z przeciwciałem anty-FLAG, używając komórek HT29 typu dzikiego jako kontroli negatywnej (Rysunek 1). Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe 5 000 razy w 5% beztłuszczowym mleku, które rozpuszcza się w TBST (sól fizjologiczna buforowana trisem zawierająca 0,1% Tween-20). Inkubować błonę z przeciwciałem FLAG w temperaturze 4 °C przez noc.
5. Umyj membranę TBST, potrząsając nią na wytrząsarce odbarwiającej z prędkością 200 obr./min przy RT. Odświeżaj TBST co 5 minut, aby uzyskać łączny czas prania 15 minut.
6. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko myszom rozcieńczonym 10 000 razy w 5% beztłuszczowym mleku w temperaturze 4 °C przez 5-6 godzin.
7. Ponownie umyj membranę zgodnie z opisem w kroku 2.5.
8. Wykryj ekspresję FLAG za pomocą substratu zachodniej wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i zobrazuj membranę za pomocą systemu dokumentacji żelu (patrz tabela materiałów). Zidentyfikuj klony wykazujące ekspresję DR3 jako klony dodatnie.
9. Przenieś klony z płytki A, które odpowiadają dodatnim klonom z płytki B, na płytkę 6-dołkową i kontynuuj amplifikację komórek, aż wyhodują je na 10-centymetrowych szalkach. Przygotować zamrożone zapasy komórek wyrastających z dodatnich klonów i przechowywać je w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

3. Ocena odpowiedzi apoptotycznej komórek na środki antymitotyczne

UWAGA: Diazonamid to nowa klasa naturalnych produktów morskich, która wykazuje niezwykłą aktywność w hamowaniu wzrostu komórek rakowych, co odzwierciedla inne czynniki destabilizujące tubulinę²¹. Jednak jego sposób działania pozostaje niejasny. Aby przetestować odpowiedź komórkową komórek na środki antymitotyczne, paklitaksel i diazonamid zastosowano w leczeniu komórek HT29 typu dzikiego i komórek HT29-DR3. Leki rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu wytworzenia 10 mM zapasów, a następnie rozcieńczono do różnych stężeń: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1000 nM, 3000 nM i 10 000 nM w DMSO.

1. Zbierz komórki HT29 i HT29-DR3 przez trypsynizację. Zmierz gęstość komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Następnie zasiej komórki na 12-dołkowych płytkach w DMEM o gęstości 3 x 10⁴ komórki na dołek. Następnego dnia dodaj 10 nM diazonamidu i użyj 1% DMSO jako kontroli negatywnej. Po 48 godzinach leczenia zobrazuj komórki pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu (Ryc. 2).
2. Komórki HT29 i HT29-DR3 należy zasiać na płytkach 96-dołkowych w DMEM o gęstości 3 x 10³ komórek na dołek i pozostawić do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C. Następnie dodać zwiększające dawkę stężenia diazonamidu 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM i 100 nM do każdego dołka, używając 1% DMSO jako kontroli ujemnej.
3. Po 48 godzinach leczenia należy zmierzyć żywotność komórek za pomocą zestawu do oznaczania żywotności komórek na bazie luminescencji zgodnie z instrukcją producenta.
   1. Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i odstawić ją w temperaturze pokojowej na około 30 minut. Następnie dodać 50 μl odczynników do oznaczania do każdej studzienki, wstrząsnąć płytką w temperaturze pokojowej przez 2 minuty w celu lizy komórek i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut. Określ luminescencję każdej studzienki za pomocą czytnika mikropłytek (Rysunek 3).
      UWAGA: Żywotność komórek reprezentuje względną intensywność luminescencji każdej studzienki w stosunku do intensywności dobrze potraktowanej 1% DMSO.
4. Użyj sześciotygodniowych samic nagich myszy BALB/c do badania in vivo¹⁴.
   UWAGA: Myszy utrzymywano w określonych warunkach wolnych od patogenów.
   1. Trypsynizować komórki HT29 i HT29-DR3, a następnie zatrzymać trypsynizację za pomocą DMEM wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C. Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml i odwirować komórki z prędkością 1,000 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce DMEM bez FBS. Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS.
   2. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i rozcieńcz komórki do stężenia 2,5 x 10⁷ komórek/ml za pomocą PBS. Wygeneruj guzy poprzez podskórne wstrzyknięcie 200 μl zawiesiny komórek HT29 lub HT29-DR3 w prawą flankę każdej myszy (5 x 10⁶ komórek/mysz)²².
   3. Mierz objętość guza (TV) za pomocą suwmiarki co 2 dni po przeszczepie. Oblicz telewizor za pomocą następującego wzoru: TV = 1/2L x W x W (tutaj W: szerokość guza, L: długość guza). Gdy średnia objętość guza osiągnie około 100 mm³, losowo przydziel myszy do grupy kontrolnej lub leczonej (n = 6 na grupę) i rozpocznij leczenie.
   4. Przygotować roztwór paklitakselu w następujący sposób. Najpierw całkowicie rozpuścić paklitaksel w etanolu w stężeniu 5% całkowitej objętości, a następnie dodać 5% końcowej objętości uwodornionego oleju rycynowego polioksylo-35. Na koniec uzupełnić pozostałe 90% objętości za pomocą D5W (5% dekstrozy w wodzie, pH 7,4).
   5. Paklitaksel należy wstrzykiwać dożylnie w dawce 20 mg/kg mc. 3 razy w tygodniu przez dwa tygodnie. Mierz objętość guza i masę ciała 3 razy w tygodniu¹⁴. Zakończ eksperyment i poddaj zwierzęta eutanazji, jeśli masa ciała zmniejszy się o 20% lub objętość guza osiągnie około 2000 mm³.

Wyniki

Charakterystyka komórek HT29 stabilnie eksponujących DR3 została przedstawiona na Rysunku 1. Klony wykazują zróżnicowane poziomy ekspresji DR3, podczas gdy komórki typu dzikiego, służące jako kontrola negatywna, nie wykazują ekspresji egzogennego genu. Przedstawiono tutaj tylko pięć klonów, spośród których klon 1 i 5 wykazują najwyższy poziom ekspresji DR3. Do dalszych eksperymentów wybrano klon 1 i 5.

Dyskusja

W tym manuskrypcie opisujemy metodę generowania stabilnych linii komórkowych HT29-DR3. Komórki HT29-DR3 stanowią model do badania mechanizmów molekularnych, za pomocą których DR3 przyczynia się do apoptozy indukowanej przez środki antymitotyczne. Takie podejście jest wszechstronne i powtarzalne. Aby zapewnić powodzenie procedury, należy wziąć pod uwagę cztery kluczowe etapy protokołu. Po pierwsze, w celu wytworzenia wystarczająco wysokiego miana wirusa, zaleca się wykonanie transfekcji DNA, gdy komórki Plat-A znajdują si...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	C11965500BT	uzupełniony o 10% FBS i 1% penicyny/streptomycyny
Test żywotności komórek luminescencyjnych	Promega	G7571
Paklitaksel	Selleck	S1150
pMXs-IRES-Blasicidin	Cell Biolabs	RTV-016
Dimetylosulfotlenek	Sigma	D2650
PBS	Invitrogen	C14190500BT
Trypsin-EDTA (0,25%)	Invitrogen	25200056
1,5-dimetylo-1,5-diazaundekametylopolimethobromide	Santa Cruz	sc-134220
Odczynnik do transfekcji	Promega	E2311
Przeciwciało wtórne przeciw myszom	Jackson ImmumoResearch	115-035-166
przeciwciało anty-Flag	Sigma	F-3165
Linia komórkowa HT29 Linia komórkowa	ATCC	HTB-38
plat-A	Komórka Biolabs	RV-102
PVDF Immobilon-P	Millipore	IPVH00010
Cylinder klonujący	Sigma	C1059
Czytnik wielomodowy do obrazowania komórek
CKX53	Olympus	CKX53
12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych	Gniazdo	712001
Płytki do hodowli komórkowych 60 mm	Gniazdo	705001
probówki wirówkowe 15 ml	Gniazdo
0,22 μ m filtr sterylny	Millipore	SLGP033RB
Wirówka 5810 R	Eppendorf	5810000327
96 Well Biała mikropłytka polistyrenowa	Corning	3903
Western Podłoże ECL	BIO-RAD	1705060
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare ImageQuant	LAS 4000
Wytrząsarka odbarwiająca	HINOTECH	TS-2000A
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl-1
Automatyczny licznik komórek	BIO-RAD	TC 20
Opti-MEM I Obniżona surowica	Medium Thermo Fisher	31985070

Mikroskop odwrócony Biotek BTCYT3MV 601052