Artykuł metodologiczny

Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9

DOI:

10.3791/58710

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tumor Initiation and Maintenance Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 3Department of Bioengineering, University of California, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje metodę opartą na CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) do prostego i szybkiego badania roli wielu genów kandydujących w równoległej proliferacji komórek ostrej białaczki szpikowej (AML). Technika ta jest skalowalna i może być stosowana również w innych liniach komórek nowotworowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad zaburzeniami genów były szeroko wykorzystywane do badania roli poszczególnych genów w patogenezie AML. Aby osiągnąć całkowite rozerwanie genów, w wielu z tych badań wykorzystano złożone modele nokautu genów. Podczas gdy te badania na myszach z nokautem oferują elegancki i sprawdzony system do badania zależności między genotypem a fenotypem, szybka i skalowalna metoda oceny genów kandydujących, które odgrywają rolę w proliferacji komórek AML lub przeżyciu w modelach AML, pomoże przyspieszyć równoległe badanie wielu genów kandydujących. Niedawne postępy w technologiach edycji genomu znacznie zwiększyły naszą zdolność do wykonywania perturbacji genetycznych na niespotykaną dotąd skalę. Jednym z takich systemów edycji genomu jest metoda oparta na CRISPR-Cas9, która może być stosowana do wprowadzania szybkich i skutecznych zmian w genomie komórki docelowej. Łatwość i skalowalność delecji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 sprawia, że jest to jedna z najbardziej atrakcyjnych technik badania dużej liczby genów w testach fenotypowych. W tym miejscu przedstawiamy prosty test wykorzystujący zakłócenie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w połączeniu z wysokoprzepustowymi testami konkurencji opartymi na cytometrii przepływowej w celu zbadania roli genów, które mogą odgrywać ważną rolę w proliferacji lub przetrwaniu ludzkich i mysich linii komórkowych AML.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku dekad byliśmy świadkami licznych badań mających na celu określenie udziału kluczowych szlaków molekularnych w patogenezie ostrej białaczki szpikowej (AML). Tradycyjnie, zakłócenie genów w komórkach AML przeprowadzono przy użyciu myszy z warunkowym nokautem lub RNA z krótką spinką do włosów (shRNA). Podczas gdy myszy z nokautem oferują wyrafinowany system czasoprzestrzennej kontroli delecji genów, generowanie myszy z nokautem genów jest pracochłonne, czasochłonne i kosztowne. Co więcej, nokaut genów przy użyciu strategii rekombinacji nie jest łatwo skalowalny; Strategie te nie nadają się dobrze do równoległego badania kilku genów. Po odkryciu metod interferencji RNA w celu wyeliminowania endogennych mRNA za pomocą małego interferującego RNA (siRNA) lub shRNA, wiele grup zaczęło stosować techniki interferencji RNA w celu zbadania roli określonych genów w AML. Ponieważ zarówno mysie, jak i ludzkie komórki AML są notorycznie trudne do transfekcji przy użyciu tradycyjnych metod transfekcji opartych na lipidach, w większości badań wykorzystywano shRNA kodowane lentiwirusowo lub retrowirusowo do badania funkcji genów w komórkach AML. Niedawne odkrycie zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) i związanych z nimi nukleaz Cas (CRISPR-Cas9) zrewolucjonizowało technologie celowania w geny1,2,3. Korzystając z CRISPR-Cas9, określone geny lub regiony genomu mogą być usuwane, edytowane lub oznaczane z wydajnością i łatwością. Edycja genów oparta na CRISPR-Cas9 staje się obecnie metodą z wyboru do badania relacji między genotypem a fenotypem w różnych typach komórek ze względu na prostotę, skuteczność i szerokie zastosowanie tej techniki. Metody oparte na CRISPR-Cas9 stają się również metodą z wyboru w AML, nie tylko do badania pojedynczych genów, ale także jako sposób na celowanie w wiele genów w macierzowanych lub zbiorczych badaniach genetycznych, mających na celu równoległe badanie kilku genów jako potencjalnych zależności AML4,5,6.

W tym manuskrypcie opisujemy prosty test konkurencyjnego wzrostu do pomiaru wpływu zaburzeń genów na wzrost komórek AML, oparty na stabilnej edycji genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9, a następnie wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej. Metoda ta jest prosta, wydajna i skalowalna do średnioprzepustowych eksperymentów w celu zbadania roli kilku genów równolegle w komórkach AML.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie klonów linii komórkowych AML z wysoką ekspresją stabilnego i aktywnego Cas9

  1. Produkcja lentiwirusa Cas9
    1. Dzień 0: Płytka 4 x 106 komórek 293T w 10 ml DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) oraz penicyliną i L-glutaminą w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w kapturze do hodowli komórkowej z certyfikatem bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2). Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. Dzień 1: Posiane komórki 293T powinny być zlewające się w 70–80% w dniu 1. Po południu należy wykonać transfekcję zgodnie z następującym protokołem.
    3. Ogrzej pożywkę do transfekcji, pożywkę hodowlaną i odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej. Rozmrozić wszystkie plazmidy wymagane do transfekcji.
    4. Wymieszaj 9 μg psPAX2, 0,9 μg pMD2.G i 9 μg plazmidów pLenti-Cas9 z 500 μl pożywki do transfekcji w probówce o pojemności 5 ml.
    5. Dodać 1,7 ml pożywki do transfekcji do probówki o okrągłym dnie o pojemności 14 ml. Dodać 57 μl odczynnika do transfekcji bezpośrednio do pożywki do transfekcji w probówce, aby uniknąć dotykania ścianki probówki.
    6. Delikatnie dodaj całą mieszaninę plazmidu do roztworu odczynnika do transfekcji i wymieszaj, delikatnie stukając w probówkę z boku. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20–30 minut. W międzyczasie zmień podłoże z talerza 293T z nasionami.
    7. Dodaj mieszankę transfekcyjną kroplami na talerz i delikatnie kołysz płytką na boki, aby uzyskać wydajne mieszanie. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    8. Dzień 2: Delikatnie odessać supernatant z płytki transfekcyjnej, tak aby komórki nie zostały naruszone lub usunięte z płytki. Odrzucić supernatant. Dodaj 10 ml świeżej pożywki 10% DMEM, delikatnie zsuwając się z boków płytki, aby uniknąć przemieszczenia komórek.
    9. Dzień 3: Powoli pobrać supernatant zawierający wirusa z płytki do transfekcji, pobierając go do sterylnej strzykawki o średnicy 10 cm. Po zebraniu supernatantu do strzykawki należy przymocować sterylny filtr 0,45 μM do strzykawki i trzymać strzykawkę i filtr nad świeżą, sterylną probówką stożkową z polipropylenu o pojemności 15 ml. Delikatnie zanurzyć strzykawkę, aby przefiltrować supernatant zawierający wirusa przez filtr 0,45 μM do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
    10. Przechowywać pożywkę kondycjonowaną wirusem w porcjach po 2 ml każdy, w 2 ml kriowiałach w temperaturze -80 °C.
  2. Transdukcja linii komórkowych AML
    1. Dzień -1: Rozcieńczyć 1 mg/ml rekombinowanego materiału z fragmentów ludzkiej fibronektyny do 10 μg/ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Pokryj 6-dołkową płytkę poddaną hodowli nietkankowej 2 ml rekombinowanego roztworu roboczego z fragmentu ludzkiej fibronektyny o stężeniu 10 μg/ml w kapturze do hodowli komórkowej zatwierdzonym przez BSL2. Zawiń talerz w folię spożywczą, aby uniknąć strat podczas parowania i przechowuj przez noc w temperaturze pokojowej.
    2. Dzień 0: Rozmrozić supernatant wirusa zawierający Cas9. Całkowicie odessać roztwór rekombinowanego fragmentu ludzkiej fibronektyny z powlekanej płytki tuż przed nanieczyszczeniem. Dodać 2 ml pożywki kondycjonowanej wirusowo z Cas9 do płytki i wirować w temperaturze 1 300 x g przez 90 minut w temperaturze 35 °C. Pomaga to cząsteczkom wirusa dobrze przyczepiać się do zainfekowanego.
    3. W międzyczasie policz komórki do transdukcji i odwiruj 2 x 106 komórek w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml świeżej pożywki hodowlanej.
    4. Po infekcji usuń cały supernatant wirusa z zainfekowanego dołka i wyrzuć. Cząstki retrowirusowe z supernatantu są przyczepione do dna studni zainfekowanej. Do tego dołka dodaj 2 x 106 komórek zawieszonych w 2 ml pożywki z powyższego kroku.
    5. Ponownie zakręć płytką w temperaturze 1 300 x g bardzo krótko (1-2 min) na tyle, aby komórki osiadły na dnie. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze i pozostaw na noc w celu transdukcji z zainfekowanymi cząstkami wirusa przyczepionymi do studzienki.
    6. Dzień 1: W zależności od gęstości komórek, dodaj więcej pożywki do transdukowanych komórek, aby uniknąć przerostu.
    7. Dzień 2: Ponieważ plazmid pLenti-Cas9 ma marker oporności na blasticydynę, dodaj blastycydynę w dawce 10 μg / ml do transdukowanych i nietransdukowanych (kontrolnych) komórek białaczkowych MOLM13 lub mysich MLL-AF9 w celu selekcji komórek eksprymujących Cas9.
      nuta: Wybór blastycydyny komórek białaczkowych MOLM13 lub MLL-AF9 transdukowanych Cas9 uważa się za zakończony, gdy wszystkie nietransdukowane komórki kontrolne zostały wyeliminowane. W przypadku linii komórkowych innych niż białaczka MOLM13 i MLL-AF9, przed tym eksperymentem należy wykonać krzywą dawka-odpowiedź, aby można było zastosować optymalną dawkę. Miareczkowanie supernatantu wirusa można również przeprowadzić w przypadku niskich szybkości transdukcji.
  3. Klonuj selekcję komórek o wysokiej ekspresji Cas9.
    nuta: Zauważyliśmy, że w niektórych liniach komórkowych AML selekcja klonów może nie być konieczna: większość wyselekcjonowanej populacji Cas9-Blasticidin ma już wysoką wydajność edycji genomu. W takim przypadku możliwe jest pominięcie kroku 1.3 i przejście do kroku 1.4, aby ocenić ekspresję Cas9 w masowych komórkach AML Cas9-blasticidyny za pomocą western blot. Nadal ważne byłoby przeprowadzenie oceny skuteczności edycji genów w tych masowych komórkach Cas9-AML (krok 1.5) przed przystąpieniem do testów konkursowych. Przypuszczamy, że wybór pojedynczych klonów o wysokiej zawartości Cas9 zmniejsza zmienność edycji genomu, co jest szczególnie ważne w przypadku testowania wielu różnych pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNA).
    1. Wykonaj jednokomórkowy sortowanie wybranych przez Cas9-blasticidynę komórek białaczkowych MOLM13 i MLL-AF9, zwanych odtąd odpowiednio komórkami MOLM13-Cas9 i MLL-AF9-Cas9, używając sortera FACS zawartego w okapie zatwierdzonym przez BSL2. Sortowanie można przeprowadzić na 5–10 okrągłodennych płytkach 96-dołkowych poddanych działaniu kultur nietkankowych.
    2. Po wybraniu pojedynczych klonów MOLM13-Cas9 i MLL-AF9-Cas9 i ich indywidualnym nazwaniu, należy rozprowadzić 10–20 klonów za pomocą 10 μg/ml blasticydyny w pożywkach hodowlanych, aby zapewnić utrzymanie ekspresji Cas9.
  4. Kontrola ekspresji stabilnego białka Cas9 za pomocą immunoblottingu.
    1. Wykonaj ekstrakty jądrowe ze wszystkich wybranych klonów białaczki MOLM13 i MLL-AF9 Blasticidin za pomocą zestawu do ekstrakcji jądrowej zgodnie z protokołem producenta. Sprawdź ekspresję białka Cas9 za pomocą przeciwciała anty-Flag M2, ponieważ Cas9 w plazmidzie pLenti-Cas9 jest połączony z N-końcowym epitopem Flag.
    2. Załaduj 50 μg całkowitego białka z każdego ekstraktu jądrowego na 10% żel Bis-Tris i uruchom żel pod napięciem 120 V, aż górne pasma zostaną dobrze oddzielone.
    3. Zablokować membranę 5% roztworem mleka w buforze TBST na 1 godzinę.
    4. Inkubować błonę w rozcieńczeniu 1:1 000 przeciwciała anty-Flag M2 o końcowym stężeniu 1 μg/ml w temperaturze 4 °C przez noc.
    5. Następnego dnia przemyć błonę buforem TBST i inkubować z sprzężonym z HRP drugorzędowym przeciwciałem anty-mysim w rozcieńczeniu 1:5 000 (końcowe stężenie 0,16 μg/ml) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    6. Dokładnie umyj membranę za pomocą TBST i rozprowadź blot za pomocą podłoża ECL.
    7. Wybierz 3-4 klony z najwyższą ekspresją białka Cas9, jak widać za pomocą Western blotting, do dalszej analizy funkcjonalnej (Rysunek 1).
  5. Zapewnienie wysokiej aktywności Cas9 w wybranych klonach
    1. Przygotować supernatant lentiwirusowy z wektora kodującego sgRNA z sgRNA ukierunkowanymi na ludzki lub mysi locus bezpiecznej przystani AAVS1, jak opisano w kroku 1.1.
    2. Transdukować górne klony białaczki MOLM13 lub MLL-AF9 z ekspresją Cas9 za pomocą supernatantu lentiwirusowego anty-AAVS1 sgRNA przy użyciu metody spinfekcji opisanej powyżej. Stosować 2,5 μg/ml Puromycyny przez 4 dni.
    3. Oczyść genomowe DNA z klonów białaczki MOLM13-Cas9 lub MLL-AF9-Cas9 po selekcji Puromycyny wraz z odpowiednimi kontrolami typu dzikiego za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj 50 ng DNA jako matrycy do przeprowadzenia PCR z AAVS1_test_primers przy użyciu 2x głównej mieszanki polimerazy Taq i programu PCR wymienionego w Tabeli 1.
    4. Uruchom produkt PCR na 2% żelu agarozowym i oczyść żelem pasmo 268 par zasad za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta. Sanger sekwencjonuje żel oczyszczony produkt PCR za pomocą podkładu AAVS1_target-frag_F.
    5. Oceń wydajność edycji, porównując sekwencje edytowane i dzikie AAVS1 za pomocą narzędzi internetowych online (Rysunek 2).

2. Klonowanie i transdukcja sgRNA w komórkach AML-Cas9

  1. Średnioprzepustowe klonowanie sgRNA
    1. Zaprojektuj 4-6 sgRNA dla interesującego genu za pomocą internetowego oprogramowania do projektowania CRISPR. W Internecie dostępnych jest wiele narzędzi do projektowania CRISPR, takich jak http://crispr.mit.edu/, które generują sekwencje sgRNA na podstawie wejściowej sekwencji DNA.
      1. Uzupełnij odpowiednie informacje w polach z gwiazdkami. Kliknij genom docelowy, aby zaprojektować sgRNA. Wklej sekwencję docelową w polu Sekwencja i kliknij przycisk Prześlij.
    2. W celu klonowania w plazmidzie ekspresyjnym pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W sgRNA, przed zamówieniem należy poprzedzić nukleotydy "CACC" oligo zmysłowego i "AAAC" odwrotnie uzupełniony oligo antysensowny. Zamów wstępnie zmieszane oligonukleotydy sensowne i antysensowne na 96-dołkowej płytce oznaczonej jako Oligo-Mix od firmy zajmującej się syntezą oligonukleotydów.
      nuta: Użyliśmy plazmidu pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W, który ma miejsce restrykcyjne BbsI do klonowania sgRNA. W przypadku stosowania innych plazmidów ekspresyjnych sgRNA, zwisy stosowane dla oligonukleotydów sgRNA muszą zostać odpowiednio zmienione.
    3. Weź oddzielną 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U oznaczoną jako płytka do wyżarzania. Przygotować mieszankę wzorcową składającą się z 1 μl T4 PNK, 1 μl 10x buforu ligacyjnego T4 DNA i 6 μl wody na reakcję wyżarzania.
    4. Dodać 8 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka płyty wyżarzającej. Dodać 1 μl po 100 μM każdy, oligo sensowny i antysensowny (lub 2 μl mieszanych oligonukleotydów sensowo-antysensownych) do mieszanki wzorcowej. Delikatnie odpipetować 2-3 razy, aby dobrze wymieszać, krótko obrócić płytkę, aby mieszanki znalazły się na dnie studzienek.
    5. Użyj następującego programu wyżarzania na maszynie PCR: 30 min w 37 °C, 2 min 30 s w 95 °C, a następnie powolne chłodzenie do 22 °C z szybkością 0.1 °C/s. Po wyżarzaniu należy pobrać świeżą 96-dołkową płytkę oznaczoną jako Rozcieńczony OligoMix. Na tej płytce rozcieńczyć ufosforylowane i wyżarzane oligonukleotydy z powyższej reakcji wodą (1:200) za pomocą pipety wielokanałowej.
    6. Trawić 5 μg wektora pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W z 1,5 μl enzymu restrykcyjnego BbsI (10 000 jednostek/ml) przy użyciu odpowiedniego buforu w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby następnie zlinearyzować go do ligacji.
    7. Weź świeżą 96-dołkową płytkę oznaczoną płytką ligacyjną i dodaj 20 ng trawionego przez BbsI wektora pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W do jednego dołka na pożądaną ligację sgRNA. Do tego należy dodać 2 μl fosforylowanych, wyżarzonych oligonukleotydów z rozcieńczonej płytki OligoMix.
    8. Dodać 1 μl 10x buforu ligazy T4 i 1 μl enzymu ligazy DNA T4. Delikatnie odpipetować pipetą wielokanałową i inkubować mieszaninę ligacyjną w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
      nuta: Mieszaniny ligacyjne mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do późniejszego etapu przemiany.
    9. W międzyczasie rozmrozić 90 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli na lodzie 10 minut przed końcem etapu ligacji.
    10. Za pomocą pipety wielokanałowej pobrać 10 μl porcji właściwych komórek do każdego dołka na oddzielnej płytce 96-dołkowej.
    11. Dodać mieszaninę do podwiązania z etapu 2.1.8 do studzienki zawierającej właściwe komórki, delikatnie pipetować w górę i w dół i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Odpipetować 5 μl mieszaniny bakteria-DNA bezpośrednio z powyższej reakcji do 6-dołkowej płytki zawierającej LB-agar ze 100 μg/ml ampicyliny. Powtórz dla każdej z reakcji przemiany.
    13. Każdą reakcję przemiany należy poddać na płytkę oddzielnie znakowaną na płytce 6-dołkowej. Dodaj około 5-8 szklanych kulek do każdej studzienki i potrząśnij całą 6-dołkową płytką 8-10 razy okrężnymi ruchami.
    14. Za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 20 μl należy wybrać 1–2 pojedyncze kolonie z każdej studzienki i rozprowadzić je w starannie oznaczonym miejscu na sterylnej 10-centymetrowej szalce Petriego z agarem LB i 100 μg/ml ampicyliny. Po wbiciu smug do płytki LB wystarczy wysunąć końcówkę używaną do tworzenia smug klonowania do 3 ml pożywki zawierającej LB-Ampicylinę w 14 ml probówce z okrągłym dnem oznaczonej odpowiednim numerem klonu bakteryjnego.
    15. Wyślij płytkę bakteryjną bezpośrednio do sekwencjonowania Sangera za pomocą startera do przodu ludzkiego promotora U6
      16. .
    16. Po potwierdzeniu sekwencji sklonowanych sgRNA, oczyść DNA z odpowiedniej probówki o pojemności 14 ml za pomocą mini-zestawu przygotowawczego zgodnie z instrukcjami producenta.
    17. Zmierz stężenie i jakość każdego z mini-preparatów za pomocą spektrofotometru. Normalizować każdy mini-preparat do stężenia 15 ng / μL i pipetować do 96-dołkowej płytki oznaczonej sgRNA Clones Plate.
      nuta: Płytka ta może być przechowywana w temperaturze -20 °C lub używana bezpośrednio do przygotowania wirusa.
  2. Wirusowa produkcja konstruktów sgRNA i transdukcja
    1. W celu produkcji cząstek lentiwirusa sgRNA w formacie 96-dołkowym należy postępować zgodnie z protokołem "shRNA/sgRNA/ORF High Throughput Viral Production (96 well)" z Genetic Perturbation Platform (GPP web Portal) of the Broad Institute (URL: https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols).
    2. Przenieść 200 μl supernatantu wirusa do sterylnych probówek i natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C.
    3. Dzień -1: Pokryj płaską płytkę 96-dołkową poddaną hodowli nietkankowej 100 μl rekombinowanego fragmentu ludzkiej fibronektyny o stężeniu 10 μg/ml w kapturze do hodowli komórkowej BSL2. Owiń talerz folią spożywczą, aby uniknąć utraty parowania i pozostaw go na noc na ławce.
    4. Dzień 0: Usuń rekombinowany fragment ludzkiej fibronektyny z każdej studzienki. Rozmrozić wirusowy supernatant każdego sgRNA w temperaturze pokojowej. Dodać 50 μl supernatantu wirusa z każdej probówki do każdego powlekanego dołka płytki transdukcyjnej. Obracać płytkę transdukcyjną o wymiarach 1 300 x g przez 90 minut w temperaturze 35 °C.
    5. Pod koniec infekcji policzyć komórki MOLM13-Cas9 (klon B3) z kolby hodowlanej. Użyj 10 000 komórek na studzienkę w objętości 100 μl. Policz komórki we wszystkich studzienkach transdukcyjnych, biorąc pod uwagę objętość martwą.
    6. Po 90-minutowej filtracji usunąć supernatant ze wszystkich studzienek za pomocą wielokanałowej pipety dostosowanej powoli do 50 μl, przechylając płytkę. Dodać 100 μl kultury komórek B3 klonu MOLM13-Cas9 do każdej studzienki, powoli zsuwając się z brzegu.
    7. Obracać płytkę o masie 1 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 35 °C, aby komórki osiadły na dnie. Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C.
    8. Dzień 1: Dodaj 100 μl świeżej pożywki do każdej studzienki zawierającej komórki białaczkowe Cas9-MOLM13 lub Cas9-MLL-AF9 transdukowane sgRNA, tak aby końcowa objętość pożywki wynosiła 200 μl.

3. Test wzrostu konkurencyjnego

  1. Dzień 3: 72 godziny (dzień 3) po transdukcji sprawdzić procent komórek sgRNA zawierających BFP dodatnich w każdym dołku za pomocą cytometrii przepływowej (FACS). Użyj barwnika żywotności komórek, aby oznaczyć i wykluczyć martwe komórki z analizy.
  2. Kontynuuj ponowne posiewanie części komórek do nowych studzienek ze świeżą pożywką po każdej analizie FACS, aby uniknąć przerostu podczas testu.
  3. Powtarzaj analizę FACS co 2-3 dni, aby sprawdzić względną proporcję komórek dodatnich BFP (BFP+ve) w porównaniu z odpowiednikami BFP ujemnymi (BFP-ve) (Rysunek 3). Przeanalizuj procent komórek dodatnich BFP dla każdego punktu czasowego (za pomocą FlowJo lub podobnego oprogramowania do analizy FACS).
    1. Przeciągnij pliki Fcs dla każdej próbki do oprogramowania FlowJo. Kliknij dwukrotnie dowolny plik próbki i wykreśl kropkę plamy rozproszenia do przodu (FSC) w funkcji rozproszenia bocznego (SSC) z FSC na osi X i SSC na osi Y. Bramka we wszystkich komórkach.
    2. Kliknij dwukrotnie bramkowane komórki i wykreśl je na plamie żywotności (na osi Y) w porównaniu z wysokością FSC (H) lub obszarem (A) kropkowym plamą. Bramka żywotności barwi ujemne (żywe) komórki.
    3. Kliknij dwukrotnie bramkowane aktywne komórki i wykreśl BFP (na osi Y) w porównaniu z FSC (A) na osi X. Bramka BFP+ve komórek. Zastosuj wszystkie te bramki do wszystkich próbek, przeciągając wybraną próbkę do pozycji Wszystkie próbki na karcie Grupa.
    4. Kliknij Edytor tabel, aby utworzyć tabelę analizy wszystkich próbek. Przeciągnij liczbę BFP+ve z jednej próbki do tabeli i kliknij przycisk Wyświetl w edytorze tabel, aby utworzyć raport wsadowy wszystkich próbek z tabelą wyświetlającą procent komórek BFP+ve. Zapisz tabelę jako plik xls.
  4. Oblicz proporcjonalny wzrost lub spadek % komórek dodatnich BFP w populacji żywych komórek w czasie i porównaj ten stosunek ze stosunkiem komórek dodatnich BFP w kontrolnych sgRNA (takich jak lucyferaza, jajecznica lub GFP sgRNA).
  5. Wykreśl stosunek komórek dodatnich BFP dla różnych sgRNA, w tym genów będących przedmiotem zainteresowania, a także kontroli, przyjmując dzień 3 jako punkt odniesienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszym badaniu najpierw przeprowadziliśmy transdukcję ludzkiej linii komórkowej AML MOLM13, która posiada translokację MLL-AF9, wirusem o wysokim mianie, kodującym plazmid lentiwirusowy Cas9-blasticidyny. W naszych rękach masowo niesortowane komórki MOLM13-Cas9 nie wykazywały wysokiego poziomu ekspresji Cas9 przez Western blotting, a także nie działały dobrze, gdy były testowane pod kątem efektywnej edycji genów - przy użyciu metody opisanej wcześniej7. Dlatego p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym manuskrypcie opisujemy szczegółowy protokół przeprowadzania testu wzrostu konkurencyjnego opartego na CRISPR-Cas9 w celu zbadania roli genów kandydujących w liniach komórkowych AML za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich / mysich komórkach AML (Figura 5). Celem testu jest zidentyfikowanie wpływu delecji genu na utrzymanie proliferacji komórek AML przez dwa do trzech tygodni w skali średnioprzepustowej. Należy uważnie wykonać kilka krytycznych kroków, aby ułatwić skalowanie opisane...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.D jest konsultantem A2A Pharmaceuticals (New Jersey) i Salgomed Therapeutics (San Diego). Inni autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmid pCW-Cas9 był prezentem od Erica Landera i Davida Sabatini (plazmid Addgene #50661) oraz plazmid pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W z laboratorium Yusa (plazmid Addgene #67974. Chcielibyśmy podziękować ośrodkowi cytometrii przepływowej w SBP Medical Discovery Institute za szybką pomoc w analizie i sortowaniu przepływu. Chcielibyśmy podziękować za wsparcie Lady Tata Memorial Foundation dla A.D. Chcielibyśmy również podziękować za wsparcie następujących źródeł finansowania: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center Sponsored Grant, V-Foundation oraz San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FLAG-M2 Przeciwciałosigma-aldrichF3165, lot # SLBS3530V
Przeciwciało przeciw myszomInvitrogen31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maksymalna czułość PodłożeThermo Fisher34095
System obrazowania ChemiDocWirówka BIO RAD17001401
Sorvall Legend RTThermo Scientific
BlasticidinThermo FisherR21001
SYTOX RedThermo FisherS34859
Opti-MEMThermo Fisher31985062
DMEMThermo Fisher11965-092
RPMIThermo Fisher11875-093
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher15140122
L-glutamina (200 mM)Thermo Fisher25030081
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SAFC12303C
pojedynczy wektor gRNAAddgene #67974pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Zestaw do ekstrakcji jądrowejsigma-alorichNXTRACT
XtremeGENE 9sigma-alorich6365787001
RetronectinTakaraT100B
Cytometr przepływowyBD Biosciences
T4 PNKNEBioLabsM0201S
T4 bufor do ligacji DNANEBioLabsB0202S
T4 Enzym ligazy DNANEBioLabsM0202S
AmpicillinFisher scientificBP1760-25
Agar LBFisher scientificBP9724-500
LB BulionFisher scientificBP9731-500
Zestaw do mini-przygotowania QiagenQiagen27104
Spektrofotometr NanoDropThermo FisherNanoDrop One
Rekombinowana mysia IL-3Peprotech213-13
Rekombinowana mysia IL-6Peprotech216-16
Rekombinowany mysi M-CSFPeprotech315-02
Stabilne kompetentne komórkiNEBiolabsC3040I
10 cm Naczynia do hodowli tkankowychFisher Scientific353003
Roztwór do lizy komórekQiagen158906
Roztwór do wytrącania białekQiagen158910
Roztwór do hydratacji DNAQiagen158914
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
BbSINew England BioLabsR0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix KitGenessee Scientific42-138
PuromycinFisher scientificBP2956100
50 ml polipropylenowe probówkistożkoweFisher scientific1495949A
stożkoweFisher scientific1495970C
15 ml polipropylenowe rurki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  3. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  4. Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
  5. Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
  6. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  7. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  8. Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).
  9. Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
  10. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
  11. Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
  12. Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
  13. Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
  14. Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
  15. Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
  16. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  17. Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CRISPR Cas9Flow CytometryCompetition AssayGene KnockoutAML Cell LinesSingle Guide RNALentiviral TransductionBFP Positive CellsFlow Cytometry AnalysisGenetic Dependencies

Powiązane artykuły