Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Streszczenie

Monitorowanie produktów pośrednich kwasów nukleinowych podczas replikacji wirusa dostarcza wglądu w efekty i mechanizmy działania związków przeciwwirusowych i białek komórek gospodarza na syntezę DNA wirusa. W tym miejscu zajmiemy się brakiem testu komórkowego o wysokim pokryciu i wysokiej rozdzielczości, który byłby w stanie zdefiniować retrowirusowe produkty pośrednie odwrotnej transkrypcji w fizjologicznym kontekście infekcji wirusowej. Opisana metoda wychwytuje 3'-końce powstających cząsteczek komplementarnego DNA (cDNA) w komórkach zakażonych wirusem HIV-1 w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Protokół obejmuje pobieranie DNA całej komórki, ukierunkowane wzbogacanie DNA wirusa poprzez wychwytywanie hybrydowe, ligację adaptora, frakcjonowanie wielkości poprzez oczyszczanie żelu, amplifikację PCR, głębokie sekwencjonowanie i analizę danych. Kluczowym krokiem jest skuteczna i bezstronna ligacja cząsteczek adaptorowych w celu otwarcia końców 3'-DNA. Zastosowanie opisanej metody pozwala na określenie liczebności odwrotnych transkryptów o każdej określonej długości w danej próbce. Dostarcza również informacji o (wewnętrznej) zmienności sekwencji w odwrotnych transkryptach, a tym samym o wszelkich potencjalnych mutacjach. Ogólnie rzecz biorąc, test jest odpowiedni dla wszelkich pytań związanych z przedłużeniem DNA 3', pod warunkiem, że znana jest sekwencja matrycy.

Wprowadzenie

Aby w pełni przeanalizować i zrozumieć replikację wirusa, potrzebne są coraz bardziej wyrafinowane techniki wychwytywania produktów pośrednich replikacji. W szczególności dokładna definicja wirusowych kwasów nukleinowych w kontekście zakażonych komórek może dostarczyć nowych informacji, ponieważ do tej pory zbadano wiele mechanizmów replikacji wirusa w izolowanych reakcjach in vitro. Doskonałym przykładem jest proces odwrotnej transkrypcji w retrowirusach, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności1 (HIV-1). Różne etapy odwrotnej transkrypcji HIV-1, podczas których enzym wirusowy odwrotna transkryptaza (RT) kopiuje jednoniciowy genom RNA do dwuniciowego DNA, były badane głównie w testach rozszerzenia starterów z oczyszczonymi białkami i kwasami nukleinowymi1^,2,3,4,5. Chociaż ustalono podstawowe zasady, takie testy nie obejmują wszystkich składników wirusowych i komórkowych i mogą nie odzwierciedlać biologicznie istotnych stechiometrii zaangażowanych czynników. Dlatego zaprojektowaliśmy potężną technikę określania widm produktów pośrednich odwrotnej transkrypcji z ich precyzyjnymi końcami cDNA 3' (tj. określając ich dokładną długość) i sekwencjami nukleotydowymi w kontekście infekcji żywych komórek⁶. Gromadzenie danych z eksperymentów w czasie może być wykorzystane do porównania profilu transkryptów w różnych warunkach, takich jak obecność cząsteczek lub białek przeciwwirusowych, które mogą wpływać na wydajność i procesywność syntezy i akumulacji DNA. Pozwala to na bardziej szczegółowe zrozumienie naturalnego cyklu życiowego patogenu, który często stanowi podstawę do projektowania ukierunkowanych leków i skutecznej interwencji terapeutycznej.

Odwrotna transkrypcja HIV-1 składa się z serii następujących po sobie zdarzeń zainicjowanych przez wyżarzanie startera tRNA do matrycy genomowego RNA, która jest następnie przedłużana przez RT w celu wytworzenia krótkiego, jednoniciowego transkryptu cDNA zwanego minus-nicią strong-stop (-sss) (patrz Rysunek 1). Następnie cDNA -sss jest przenoszone z 5'-długiego końcowego powtórzenia (LTR) do 3'-LTR genomowego RNA, gdzie wyżarza się i służy jako starter do dalszego wydłużania nici ujemnej DNA za pośrednictwem RT (patrz recenzje na temat odwrotnej transkrypcji^1,2,3,4). Ten pierwszy transfer nici jest jednym z etapów ograniczających szybkość odwrotnej transkrypcji; w związku z tym wiadomo, że cDNA -sss się gromadzi. Podstawowy przepływ pracy i projekt biblioteki do przechwytywania produktów odwrotnej transkrypcji w zainfekowanych komórkach przedstawiono na rysunku 2a. Specyficzne startery i ustawienia analizy, które są używane w protokole i wymienione w tabeli 1, są ukierunkowane na wszystkie wczesne produkty pośrednie cDNA z odwrotną transkrypcją w zakresie długości od 23 do ~ 650 nt, który obejmuje DNA 180-182 nt -sss. Jednak odpowiednie drobne dostosowania strategii pozwolą na zastosowanie nie tylko do późnych produktów odwrotnej transkrypcji, ale także do innych wirusów i systemów, których celem jest wykrycie końcówek DNA zawierających 3'-OH. Ważne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę, obejmują zakres długości końcowego produktu PCR w bibliotece; W szczególności szablony, w których odległość między adapterem na otwartym końcu 3' a miejscem startera górnego przekracza ~1000 NT, będą prawdopodobnie mniej efektywnie sekwencjonowane, co potencjalnie wprowadzi wprowadzające w błąd błędy techniczne podczas przygotowywania biblioteki (zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej szczegółów i sugestie dotyczące adaptacji).

Wcześniej opisywane techniki systematycznego oznaczania 3'-końców nici kwasu nukleinowego koncentrowały się na cząsteczkach RNA, a nie DNA. Jednym z przykładów jest 3' RACE (szybka amplifikacja końców cDNA)⁷, która opiera się na poliadenylacji mRNA. Ponadto opracowano strategie oparte na ligacji adaptorowej z wykorzystaniem ligaz RNA, które obejmowały RLM-RACE (RACE, w którym pośredniczy ligaza RNA)⁸ lub LACE (amplifikacja końców cDNA oparta na ligacji)⁹. Ważne jest, aby podkreślić, że amplifikacje oparte na ligacji są wrażliwe na wszelkie odchylenia wprowadzone przez samą reakcję ligacji. Na przykład ligacja może być mniej lub bardziej wydajna w zależności od konkretnego nukleotydu w pozycji 3', sekwencji, całkowitej długości cząsteczki lub lokalnej struktury. Takie preferencje ligazy prowadzą do niepełnego wychwytywania cząsteczek i błędnej reprezentacji w odczycie, co zaobserwowaliśmy my i inni^9,10. Aby zminimalizować błąd systematyczny ligacji podczas etapów dodawania adaptera w opisanym tutaj protokole, przetestowaliśmy szereg strategii ligacji i znaleźliśmy zastosowanie ligazy DNA T4 z jednoniciowym adapterem DNA typu spinka do włosów (zgodnie z opisem Kwok i wsp.¹¹) jako jedyna procedura z niemal ilościową ligacją, która nie powodowała istotnych różnic w skuteczności ligacji, gdy była oceniana za pomocą specjalnie wybranego zestawu kontrolnych oligonukleotydów6. Wybór tej strategii podwiązywania jest zatem kluczową cechą sukcesu tego protokołu.

Do tej pory, monitorowanie progresji HIV-1 RT w zakażonych komórkach było głównie realizowane poprzez pomiar produktów odwrotnej transkrypcji o różnej długości za pomocą ilościowego PCR (qPCR) przy użyciu zestawów starter-probe, które jednoznacznie mierzą krótsze lub dłuższe (odpowiednio wczesne i późne) produkty cDNA^12,13,14. Chociaż to podejście qPCR jest odpowiednie do określenia wewnętrznej skuteczności procesu odwrotnej transkrypcji w systemach komórkowych, dane wyjściowe mają stosunkowo niską rozdzielczość, bez uzyskiwania informacji o sekwencji. Nasze nowe podejście, oparte na zoptymalizowanej ligacji adaptora, generowaniu bibliotek za pośrednictwem PCR i głębokim sekwencjonowaniu, wypełnia lukę technologiczną i oferuje możliwość monitorowania odwrotnej transkrypcji podczas zakażenia HIV-1 ilościowo i z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Zilustrowaliśmy użyteczność tej metody w badaniu, które rozróżniało dwa proponowane modele zdolności czynnika ograniczającego HIV-1 APOBEC3G (apolipoproteiny B mRNA edytującego enzym katalityczny polipeptyd podobny do 3G) do zakłócania produkcji wirusowych odwrotnych transkryptów⁶.

Protokół

UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi odczynnikami i sprzętem używanym w tym protokole.

1. Produkcja wirusa i infekcja komórkowa

UWAGA: Zakaźny HIV-1 powinien być stosowany tylko w zatwierdzonych laboratoriach bezpieczeństwa biologicznego.

UWAGA: Produkcja cząsteczek HIV-1 przez przejściową transfekcję komórek 293T ludzkiej embrionalnej nerki (HEK), jak opisano w kroku 1.1, jest standardową procedurą i została opisana wcześniej^15,16. Ogólne procedury hodowli komórkowej są opisane wcześniej¹⁷.

1. Produkcja wirusa HIV-1.
   1. Utrzymuj komórki 293T w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (pełne DMEM) w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁷.
   2. W standardowym kapturze do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym usuń pożywkę wzrostową i dodaj 3 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) trypsyny do prawie zlewającej się 10-centymetrowej płytki do hodowli komórkowej (~1,2 x 10⁷ komórek) z komórkami 293T. Włóż naczynie z powrotem do inkubatora na 2-3 minuty.
   3. Wyjąć szalkę z inkubatora z powrotem do okapu do hodowli tkankowej i dodać 7 ml pełnej pożywki. Kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół w naczyniu, aby ponownie zawiesić komórki. Podziel komórki w stosunku 1:4, dodając 2,5 ml zawiesiny komórek do nowego 10-centymetrowego naczynia i napełnij je 7,5 ml pełnej pożywki.
   4. Następnego dnia zmieszaj 10 μg prowirusowego plazmidowego DNA HIV-1 (takiego jak pNL4.3) z 1 ml minimalnej pożywki niezbędnej bez surowicy i dodaj roztwór polietyleniminy (PEI) (25 000 mW, 1 mg/ml pH 7) w 4,5 μl na 1 μg DNA. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i dodawać kroplami do komórek 293T.
   5. 24 godziny po transfekcji usunąć pożywkę i zastąpić ją 6 ml pełnego DMEM zawierającego DNazę wolną od RNaz w pożywce 20 U/ml. Po 6 godzinach zastąp pożywkę 10 ml pełnego DMEM.
   6. 48 godzin po transfekcji zebrać supernatant i przefiltrować go przez filtr 0,22 μm, używając strzykawki o pojemności 10 ml, do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
   7. Dodaj 2 ml sterylnej 20% sacharozy w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do otwartej cienkościennej probówki ultrawirówkowej. Powoli nałożyć sacharozę na supernatant z przefiltrowanych komórek.
   8. Wirować przez 1 h 15 min przy 134 000 x g w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki.
   9. Ostrożnie wyjmij probówki z ultrawirówki. Powoli zdjąć zarówno sklaraty, jak i sacharozę za pomocą ssania lub pipety. Użyj mniejszej pipety i przechyl probówkę podczas wyjmowania ostatniego roztworu sacharozy. Pozostawić granulowany wirus na dnie probówki.
      UWAGA: Pellet nie będzie widoczny.
   10. Dodać 200 μl 1x PBS, pozostawić w lodówce na 4 do 12 godzin, zawiesić i zamrozić w 20 μl porcji w temperaturze -80 °C.
   11. Określ zawartość^{p24 Gag} za pomocą zestawu ELISA antygenu p24 HIV-1 (zgodnie z instrukcjami producenta).
2. Zakażenie linią komórek T.
   1. Hodowla unieśmiertelnionej linii komórek T (np. komórek CEM-SS) w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny (pełne RPMI). Policz komórki za pomocą hemocytometru¹⁸ i zasiej 1 dołek na próbkę z 1 ml pełnego RPMI z 2 x 10⁶ komórek/ml na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej.
   2. Dodać cząstki HIV-1 odpowiadające 150 ng p24^Gag i umieścić płytkę w wahadłowym wiadrze wirówkowym z pokrywkami bioizolacyjnymi w celu odwirowania przez wirowanie w wirówce stołowej przez 2 godziny przy 2 000 x g w temperaturze 30 °C.
   3. Wyjąć płytkę z wirówki i pozostawić ją na 1 godzinę w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   4. Aby zmyć wirusa wejściowego, należy zebrać komórki, przenosząc zawiesiny komórek do probówek do mikrowirówek i odwirowując w mikrowirówce przy RT (RT) przy 500 x g przez 2 minuty. Zdjąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
   5. Zawiesić granulki komórkowe w 1 ml wstępnie podgrzanego (37 °C), sterylnego 1x PBS. Powtórz etapy wirowania, usuwania sklarowanego osadu i ponownego zawieszania jeszcze dwa razy.
   6. Ponownie odwirować, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 1 ml pełnej prędkości obrotowej. Dodać każdą zawiesinę do jednego dołka w nowej płytce 12-dołkowej.
   7. Po 6 godzinach od początkowego dodania wirusa (4 godziny po odwirowaniu) należy pobrać komórki przez odwirowanie, jak to opisano w kroku 1.2.4. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Granulki komórkowe można zamrozić w temperaturze -80 °C lub przetworzyć bezpośrednio w celu ekstrakcji DNA.

2. Ekstrakcja DNA, kwantyfikacja DNA HIV-1 i wzbogacanie przez wychwytywanie hybrydowe

1. Ekstrahuj DNA całych komórek za pomocą zestawu do ekstrakcji całkowitego DNA krwi i tkanek, postępując zgodnie z instrukcją zestawu dla komórek do hodowli tkankowych. Jedyną zmianą jest elucja w 200 μl H₂O wolnej od nukleaz zamiast dostarczonego buforu elucyjnego.
   UWAGA: Po dodaniu buforu do lizy chaotropowej ("bufor AL") i proteinazy, próbki mogą zostać usunięte z laboratorium zabezpieczającego bezpieczeństwo biologiczne i przetwarzane w laboratorium o standardowym poziomie bezpieczeństwa do końca protokołu.
2. Określ liczbę kopii cDNA HIV-1 za pomocą qPCR.
   1. Pobrać 17 μl eluatu z kroku 2.1 i dodać 2 μl 10-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego wraz z 1 μl enzymu restrykcyjnego DpnI. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu usunięcia wszelkich potencjalnych pozostałości wejściowego plazmidowego DNA z transfekcji.
   2. Przeprowadzić qPCR dla cDNA o nici ujemnej przy użyciu następującego zestawu sond starterowych: oHC64 (5′-taactagggaacccactgc-3′) i oHC65 (5′-gctagagattttccacactg-3′) i sondy oHC66 (5′-FAM- acacaacagacgggcacacacta-TAMRA-3′). Konfiguracja qPCR i dokładne warunki można znaleźć w referencji^6,13. Nosić ze sobą próbki z seryjnym rozcieńczeniem plazmidu prowirusowego pNL4.3 jako krzywą standardową w celu określenia liczby kopii cząsteczek cDNA.
      UWAGA: Zobacz dyskusję, aby zapoznać się z oczekiwanymi ilościami.
3. Wzbogacanie DNA HIV-1 metodą wychwytywania hybrydowego.
   UWAGA: Z tego punktu widzenia zaleca się stosowanie probówek do mikrowirówek o niskich właściwościach wiązania kwasów nukleinowych, a także końcówek do pipet z filtrem aerozolowym do wszystkich próbek DNA. Jeśli to możliwe, pracuj na stacji roboczej PCR. Wszystkie kroki i odczynniki są w RT (RT), chyba że zaznaczono inaczej.
   1. Aby przygotować wzorcową mieszaninę magnetycznych kulek streptawidyny, należy pobrać pipetę po 100 μl kulek na próbkę do pojedynczej probówki do mikrowirówki. Umieść probówkę na magnesie odpowiednim do probówek do mikrowirówek.
   2. Po tym, jak kulki osiądą po stronie magnesu rurki (~1 min), zdejmij bufor magazynujący, wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś kulki w 500 μl buforu do wiązania i płukania (bufor BW, 5 mM Tris-HCL pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) do umycia.
   3. Umieść probówkę z powrotem na magnesie, usuń supernatant i dodaj 500 μl roztworu kazeiny. Zdjąć magnes, zawiesić ponownie i inkubować przez 10 minut w temperaturze suchej masy, a następnie przemyć buforem BW.
      UWAGA: Mycie odnosi się do umieszczenia rurki na magnesie, usunięcia supernatantu, zdjęcia rurki z magnesu, dodania bufora i ponownego zawieszenia.
   4. Umieść probówkę z powrotem na magnesie, zdejmij supernatant i ponownie zawieś kulki w 500 μl buforu BW. Dodać 50 pmol każdego wychwytującego biotynylowanych oligonukleotydów (patrz tabela 1, w tym przypadku trzy oligonukleotydy) na próbkę. (Na przykład, jeśli ma zostać przetworzonych 5 próbek DNA, należy użyć 500 μl kulek magnetycznych z kroku 2.3.1 i 250 pmol każdego oligonukleotydu).
   5. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, kołysząc się w mikserze typu end-over-end.
   6. Przemyć kulki z unieruchomionymi oligonukleotydami dwukrotnie 500 μL buforu 1x TEN (10 mM Tris HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl).
   7. Zawiesić kulki w 10 μl buforu 1x TEN na próbkę.
   8. Do każdej próbki należy oznaczyć jedną probówkę do mikrowirówek i dodać 10 μl zawiesiny kulek, 170 μl DNA (od kroku 2.1) i 90 μl buforu 3x TEN. Inkubować w suchym bloku grzewczym w temperaturze 92 °C przez 2 minuty w celu denaturacji DNA.
   9. Przenieś probówki do innego bloku suchego ciepła, który jest ustawiony na 52 °C, i inkubuj przez 1 godzinę. Odwróć, aby regularnie mieszać (~ co 10 minut) podczas tej inkubacji.
   10. Przemyć raz 500 μl 1x buforu TEN i ponownie zamieszać w 35 μl H₂O bez nukleaz.
   11. Aby wymyć, inkubować probówki w temperaturze 92 °C w suchym bloku grzewczym przez 2 minuty. Następnie szybko przesuń rurki na magnes (po jednej rurce na raz). Gdy koraliki zostaną przywiązane do boku probówki, przenieś supernatant zawierający DNA HIV-1 do nowej probówki.
   12. Opcjonalnie: Powtórz qPCR (jak w kroku 2.2.2) w celu oznaczenia odzyskanego cDNA HIV-1.
       UWAGA: Zobacz dyskusję, aby zapoznać się z oczekiwanymi ilościami.

3. Podwiązanie adaptera

1. Przygotowanie adaptera
   1. Zawiesić liofilizowany adapter (patrz Tabela 1 "pełny Kwok + MiSeq") przy 100 μM w H₂O wolnym od nukleaz.
   2. Na próbkę plus jedną próbkę kontrolną połącz 0,45 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 4 μl adaptera i 0,05 μl H₂O. Podgrzewaj do 92 °C przez 2 minuty i pozwól każdemu z nich powoli ostygnąć.
      UWAGA: Jeśli opcja jest dostępna, użyj maszyny do PCR z regulowaną szybkością chłodzenia (użyj szybkości 2%). Trwa to około 30 minut od 92 °C do 16 °C. Alternatywnie użyj suchego bloku grzewczego o temperaturze 92 °C i wyłącz. Wyjmij adapter mastermix, gdy blok grzewczy wróci do RT. Ma to na celu umożliwienie adapterowi uformowania struktury spinki do włosów (patrz Rysunek 2b).
2. Przygotować reakcję kontrolną z zestawem zsyntetyzowanych oligonukleotydów (patrz Tabela 2) zamiast DNA wyekstrahowanego z komórek.
   1. Zrób zapasy po 100 μM każdego oligonukleotydu. Zmieszać po 1 μl każdego z 17 oligonucelotydów i dodać 8 μl_H2O, aby uzyskać stosunek równomolowy w końcowej objętości 25 μl.
   2. Rozcieńczyć mieszaninę w stosunku 1:2,500 w H₂O wolnym od nukleaz w seryjnym rozcieńczeniu. Połączyć 1 μl mieszaniny z 17,3 μl H₂O bez nukleaz w celu użycia w próbce kontrolnej ligacji w kroku 3.3.1 tak, aby każdy oligonukleotyd był obecny w ilości 1,6 fmol (co odpowiada 0,026 nM w reakcji 60 μl).
3. Zakładanie podwiązań
   1. W przypadku 60 μl reakcji objętości końcowej w probówkach PCR połącz 6 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 24 μl 40% PEG, 6 μl 5 M betainy, 4,5 μl (400 pmol) adaptera (wyżarzanie wstępne, jak w kroku 3.1.2), 1,2 μl ligazy DNA T4 (2 000 000 jednostek/ml) i 18,3 μl DNA (z kroku 2.3.11)
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność w przypadku lepkich roztworów, takich jak 40% PEG, aby utrzymać dokładne objętości. Nie rób mastermixu.
   2. Przeprowadzić tę samą reakcję, jak w kroku 3.3.1, ale z kontrolną mieszaniną oligonukleotydów przygotowaną w kroku 3.2.2.
   3. Dobrze wymieszać reakcje i inkubować w maszynie do PCR w temperaturze 16 °C przez noc.

4. Demontaż adaptera i separacja rozmiarów

1. Elektroforeza żelowa denaturująca
   1. Dodać 30 μl buforu ładującego żel DNA zawierający formamid do każdej reakcji ligacji. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
   2. Podgrzewać przez 2 minuty w temperaturze 94 °C w maszynie do PCR, a następnie natychmiast umieścić na lodzie.
   3. Umieść prefabrykowany 6% żel mocznikowo-poliakryloamidowy 6% Tris/boran/EDTA (TBE) (10-dołkowy grzebień) w odpowiednim zbiorniku na żel. Dodaj 1x TBE (89 mM Tris-zasada, 89 mM kwas borowy, 2 mM EDTA) bufor do pracy i uruchom żel przez 20 minut przy stałym napięciu 250 V/max.
   4. Umyj kieszenie żelowe za pomocą buforu bieżącego za pomocą strzykawki i igły 21G.
   5. Załaduj każdą próbkę o objętości 90 μl do trzech dołków (30 μl na studzienkę) i uruchom przez 20 minut (250 V/max), aż ciemnoniebieski czoło barwnika znajdzie się mniej więcej w połowie żelu.
2. Barwienie i cięcie kwasów nukleinowych z żelu
   1. Przygotuj 3 małe probówki do mikrowirówek (0,5 ml) na próbkę, robiąc otwory w dnie za pomocą igły strzykawkowej 21 G (zachowaj ostrożność podczas pracy z ostrymi narzędziami). Włóż każdą z przygotowanych probówek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml i oznacz je nazwą próbki oraz "niską", "średnią" lub "wysoką".
   2. Wyjmij i podważ kasetę z żelem. Przetnij żel pionowo żyletką, aby obficie wyciąć pasek z 3 dołkami załadowanych próbek. Dodaj pasek żelu do pojemnika z 1x TBE (około 30 ml) i 5 μl barwienia cyjaninowym kwasem nukleinowym. Inkubować przez 3-5 min.
      UWAGA: Etap ekstrakcji żelu jest szczególnie wrażliwy na zanieczyszczenie krzyżowe. Zaleca się stosowanie tylko 1 próbki na żel i używanie oddzielnego, czystego pojemnika do każdego barwienia żelu. Rękawice należy zmienić, jeśli cząsteczki żelu stykają się z palcami w rękawiczkach.
   3. Dokładnie oczyść powierzchnię transiluminatora światła niebieskiego za pomocą ddH₂O. Wyjmij kawałek żelu z pojemnika do barwienia i dodaj go do pudełka świetlnego.
   4. Włącz kaseton świetlny i sprawdź poplamione kwasy nukleinowe przez pomarańczowy filtr.
      UWAGA: Adapter zazwyczaj wydaje się przeciążony i działa jako duża "plama" z ligowanym DNA HIV-1 biegnącym powyżej jako smuga.
   5. Za pomocą nowej żyletki odetnij boki żelu, jeśli są obszary, w których nie ma jeszcze załadowanej próbki. Następnie przetnij tuż nad adapterem, aby usunąć adapter i dolne części żelu. Na koniec odetnij samą górę żelu, w tym około 1 mm kieszeni żelowych, które często mają ostry, intensywny sygnał DNA o większej masie cząsteczkowej.
   6. Podzielić pozostały kawałek żelu zawierający próbkę, która zwykle ma rozmiar ~2 x 3 cm, poziomo na trzy równe części: obszary o "niskiej", "średniej" i "wysokiej" masie cząsteczkowej.
      UWAGA: Każdy element będzie teraz traktowany osobno [tj. będą trzy probówki (niska, średnia i wysoka)] na oryginalną próbkę.
   7. Pokrój każdy z trzech fragmentów żelu na mniejsze kawałki (cząstki ~2 x 2 mm) i przenieś je do przygotowanych probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml (krok 4.2.1).
   8. Wiruj z maksymalną prędkością z otwartymi pokrywkami przez 1 minutę, aby wycisnąć kawałki żelu przez otwór do probówki o pojemności 2 ml, aby utworzyć żelową breję. Jeśli na dnie probówki o pojemności 0,5 ml pozostaną jakiekolwiek cząstki żelu, należy je ręcznie przenieść do probówki o pojemności 2 ml za pomocą igły lub końcówki pipety.
3. Ekstrakcja DNA
   1. Dodać 1 ml buforu ekstrakcyjnego do żelu mocznikowego (0,5 M NH₄CH_{, 3}CO₂, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) do błota pośniegowego. Obracaj rurki przez co najmniej 3 godziny (dopuszczalna jest noc) w temperaturze pokojowej za pomocą miksera typu end-over-end.
   2. Użyj czystego zestawu pęsety, aby dodać jeden mały okrągły filtr z włókna szklanego do kolumn wirówek z filtrami membranowymi z octanu celulozy (0,2 μm), co pozwala uniknąć zatkania membrany. Umieść filtr na miejscu z odwróconą końcówką pipety.
   3. Krótko odwirować probówki o pojemności 2 ml z błotem pośniegowym i buforem ekstrakcyjnym w mikrowirówce i przenieść 700 μl supernatantu do przygotowanych kolumn filtracyjnych. Utrzymuj żel w postaci błota pośniegowego i pozostałego supernatantu.
   4. Odwirować kolumny filtracyjne w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Przenieść przepływ do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml.
   5. Ponownie załaduj kolumny pozostałym supernatantem. Postaraj się uzyskać jak najwięcej płynu z błota pośniegowego. Przenoszenie kawałków żelu nie stanowi problemu. Ponownie odwirować i połączyć przepływy tych samych próbek ekstrakcyjnych.
4. Wytrącanie DNA
   1. Dodać 3 μl poliA RNA (1 μg/μL; jako nośnik), 1 μl glikogenu i 0,7 ml izopropanolu do przepływu z kroku 4.3.5. Krótko zwirować i zamrozić w temperaturze -80 °C przez noc.
   2. Próbki należy wyjąć z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostawić do krótkiego rozmrożenia. Umieścić je w schłodzonej (4 °C) mikrowirówce i wirować przez 30 minut na najwyższych obrotach.
   3. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Bądź bardzo ostrożny, aby nie usunąć granulki. Pozostawić od 30 do 50 μl płynu, jeśli nie ma pewności, że w przeciwnym razie osadek zostałby usunięty.
      UWAGA: Zazwyczaj wszystkie "wysokie" próbki wykazują bardziej widoczną osadówkę niż próbki "średnie" i "niskie".
   4. Dodaj 800 μl 80% etanolu. Odwróć rurki i ponownie wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Usuń większość etanolu za pomocą pipety, ponownie krótko zakręć probówkami i usuń więcej etanolu za pomocą pipety o mniejszej objętości.
   5. Pozwól, aby pozostały etanol odparował, umieszczając probówki z otwartą pokrywką w suchym bloku grzewczym o temperaturze 55 °C. Gdy próbki wyschną (2-4 min), dodaj 20 μl H_2Obez nukleaz i rozprowadź na dnie probówki, aby upewnić się, że osad DNA jest rozpuszczony. Próbka DNA może być przechowywana w temperaturze -20 °C.

5. Amplifikacja PCR i przygotowanie biblioteki

1. Przeprowadzić reakcję PCR o objętości 40 μl z 20 μl wstępnego miksu polimerazy DNA, 18 μl wytrąconego i ponownie rozpuszczonego DNA z kroku 4.4.5, 1 μl startera "MP1.0 + 22HIV" (10 μM) (patrz Tabela 1) i 1 μl multipleksowych starterów oligogologicznych (startery indeksowe od 1 do 24) (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Przeprowadź trzy reakcje (niską, średnią, wysoką) każdej próbki w oddzielnych reakcjach PCR, ale z tym samym indeksowanym starterem. Użyj innego indeksu dla każdej z oryginalnych próbek infekcji.
   1. Reakcje PCR należy przeprowadzić w następujących warunkach: 2 minuty przy denaturacji w temperaturze 94 °C, następnie 18 cykli 3-etapowej reakcji PCR; 15 s w temperaturze 94 °C denaturacji, 15 s wyżarzania w temperaturze 55 °C i 30 s przedłużenia w temperaturze 68 °C.
2. Jako opcja kontroli jakości, analizuj reakcje PCR za pomocą zautomatyzowanego systemu elektroforezy żelowej o wysokiej czułości. Weź 2 μl niskiej, średniej i wysokiej próbki, aby uruchomić zgodnie z instrukcją producenta.
   UWAGA: Oba podkłady powinny być widoczne i często przebiegać na obliczonej długości około 45 i 95 nt (rzeczywista długość jest różna). Dodatkowo DNA powinno być wykrywane w zakresie od 150 do 500 nt. Jeśli nie ma żadnego sygnału, zaleca się dodanie dodatkowych cykli PCR, od 2 do 10 dodatkowych cykli. Nie należy dodawać dodatkowych cykli dla próbek kontrolnych oligonukleotydów utworzonych w kroku 3.3.2.
3. Aby usunąć startery, użyj paramagnetycznego systemu czyszczenia PCR na bazie kulek.
   1. Pobrać 20 μl każdej reakcji PCR i połączyć próbki razem (w tym momencie wymieszać wszystkie próbki). Pozostałe 20 μl reakcji zamrozić jako kopie zapasowe w temperaturze -20 °C.
   2. Pozwól, aby kulki paramagnetyczne dotarły do RT i wymieszaj połączone reakcje PCR z 1,8-krotnością objętości roztworu kulek. Mieszać pipetując i inkubować przez 5 min.
      UWAGA: Na przykład, jeśli przygotowano 4 próbki, z których każda ma niską, średnią i wysoką reakcję, objętość wynosiłaby 4 x 3 x 20 μL = 240 μL reakcji PCR z 432 μl roztworu kulek.
   3. Umieść probówki na magnesie w probówce do mikrowirówki, pozwól kulkom związać się przez ~1 minutę i zdejmij supernatant do wyrzucenia. Pozostaw rurki na magnesie i dodaj 500 μl 80% etanolu.
   4. Pozostaw etanol na 30 s, a następnie dokładnie zdejmij i pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu przez ~5 minut. Dodaj 40 μl H_2Obez nukleaz, zdejmij rurki z magnesu i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół.
   5. Pozostaw zawiesinę na 5 minut. Umieść probówkę z powrotem na magnesie, pozwól kulkom osiąść na bok i przenieś supernatant do nowej probówki. To jest biblioteka. Pobrać 10 μl porcji do kontroli jakości, a resztę zamrozić w temperaturze -20 °C.

6. Ocena biblioteki

1. Określ jakość, stężenie i molowość biblioteki.
   1. Należy zastosować metodę fluorometrycznej kwantyfikacji. Zmierz 1 μl i 3 μl biblioteki za pomocą zestawu do oznaczania dsDNA o wysokiej czułości zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Typowe stężenia wynoszą od 1 do 10 ng/μl.
   2. Zmierz widmo masy cząsteczkowej DNA z biblioteki za pomocą automatycznej elektroforezy żelowej o wysokiej czułości, jak opisano powyżej (krok 5.2).
   3. Użyj automatycznej analizy elektroforezy żelowej, aby określić średnią masę cząsteczkową biblioteki i obliczyć, aby rozcieńczyć bibliotekę w wolnym od nukleaz_H2Odo 4 nM. Można połączyć kilka bibliotek, o ile wszystkie indeksy są unikalne.
2. Opcjonalna kontrola jakości o niskiej przepustowości
   1. Podporządkuj bibliotekę DNA klonowaniu TA¹⁹, aby wstawić cząsteczki biblioteki do wektorów w celu amplifikacji. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, wyhoduj ~10-20 kolonii i wyekstrahuj DNA za pomocą protokołów miniprep, jak opisano tutaj²⁰.
   2. Sekwencjonuj wektor przy użyciu lokalnych usług sekwencjonowania i sprawdź, czy wstawki zawierają żądane sekwencje pochodzące z HIV-1 i adaptery specyficzne dla biblioteki.

7. Sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

1. Utwórz przykładowy arkusz sekwencjonowania za pomocą komercyjnego oprogramowania dostarczonego z platformą sekwencjonowania.
   1. Wskaż wybrany zestaw do sekwencjonowania. Zazwyczaj wybiera się zestaw na 150 cykli, ale inne są odpowiednie w zależności od pożądanej długości odczytu.
   2. Wybierz "Tylko Fastq" jako przepływ pracy aplikacji. Wybierz jeden z szablonów, który zawiera 24 indeksy obecne w zestawach oligonukleotydów multipleksowych (wskazane w instrukcji zestawu).
   3. Wybierz "25 nt" dla Read1 i "125 nt" dla Read2. Zachowaj 6 nt dla pojedynczego indeksu read.
      UWAGA: W analizie wewnętrznej używany jest tylko Read2 w analizie. Utrzymuj Read1 na poziomie co najmniej 25 nt dla celów algorytmu platformy sekwencjonowania.
2. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby przygotować i skonfigurować bibliotekę przed uruchomieniem. Zdecyduj się na maksymalne stężenie 20 pM i użyj 15% skoku PhiX, ponieważ biblioteka ma bardzo niską złożoność.

8. Analiza danych

1. Sprawdź, czy procent filtra przepustowego i średni wynik jakości Q30 są dopuszczalne zgodnie z wytycznymi producenta platformy sekwencjonowania.
   UWAGA: Filtr przepustki wynosi zazwyczaj > 90%, a wyniki Q30 zwykle wynoszą > 80%.
2. Pobierz pliki .fastq.gz z centrum sekwencjonowania producenta.
3. Konfigurowanie skryptu sekwencjonowania
   1. Utwórz nowy katalog (folder) o nazwie "AnalysisXYZ" i przejdź do https://github.com/malimlab/seqparse, aby pobrać wszystkie pliki kodu źródłowego (parse_sam.pl, rc_extract.pl, parse.sh) do tego katalogu.
   2. Pobierz nakładkę do krótkiego odczytu Bowtie w wersji 1.1.2 z http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml do tego samego katalogu.
   3. Pobranie tworzy podkatalog w "AnalysisXYZ" o nazwie "Bowtie-1.1.2". W tym katalogu otwórz podkatalog "Indeksy" i pobierz dostarczone sekwencje szablonów składające się z 6 plików z rozszerzeniami .ebwt.
   4. Pobierz zestaw narzędzi do wstępnego przetwarzania skrótów FASTQ/A fastx-0.0.13 z http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html do katalogu "AnalysisXYZ".
   5. Pobierz zarówno Samtools (https://sourceforge.net/projects/samtools/files/), jak i bam-readcount (https://github.com/genome/bam-readcount) do katalogu "Dokumenty".
4. Przenieś pliki .fastq.gz, pobrane w kroku 8.2, wszystkich odczytanych liczb 2 (kończących się na ..._R2_001.fastq.gz) do katalogu "AnalysisXYZ".
5. Otwórz konsolę poleceń/terminal. Przejdź do "AnalysisXYZ" jako bieżącego katalogu za pomocą poleceń cd. Wpisz "./parse.sh ", aby uruchomić skrypty.
6. Znajdź pliki .csv z podsumowaniami dla wszystkich próbek pod względem łącznej liczby odczytów, dostosowaną długością liczby odczytów i normalizowaną liczbą odczytów, a także pliki z odmianą podstawową dla każdej próbki w katalogu o nazwie parse_results w katalogu "Analiza XYZ".
   UWAGA: Więcej informacji na temat procesu analizy można znaleźć w dyskusji. Skrypt zwraca pliki csv z łączną liczbą odczytów dla każdego nukleotydu wzdłuż sekwencji silnego zatrzymania HIV-1_NL4.3 i transferu pierwszej nici aż do nukleotydu 635. Jako wskazówkę, zwykle obserwuje się od 50 000 do 100 000 unikalnych odczytów w próbkach z infekcji ze wskazaną liczbą komórek i inokulacją wirusową oraz bez białek lub związków przeciwwirusowych. Próbka kontrolna oligonukleotydów zwykle daje od 100 000 do 200 000 odczytów.

Wyniki

Technika opisana w tym artykule została zastosowana do szerszego badania mającego na celu zbadanie mechanizmów leżących u podstaw hamowania odwrotnej transkrypcji wirusa HIV-1 przez antyretrowirusową ludzką APOBEC3G białkową (A3G)⁶. Rysunek 3 pokazuje reprezentatywne wyniki uzyskane po zastosowaniu protokołu w próbkach z limfocytów T CEM-SS zakażonych HIV-1 z niedoborem vif, przy braku lub obecności A3G. Całkowita liczba unikalnych odczytów uzyskanych z każdej próbki po odfiltrowaniu wszelkich duplikatów PCR, które mają ten sam kod kreskowy 6 nt i tę samą długość (wykonaną przez dostarczone oprogramowanie analityczne) jest wykreślana w Rysunek 3a. Rosnące poziomy A3G zmniejszają całkowitą liczbę odczytów, odzwierciedlając hamujący wpływ A3G na syntezę cDNA za pośrednictwem RT, wcześniej opisaną i zmierzoną za pomocą qPCR^6,13,21,22. W Rysunek 3b, pokazana jest frakcja cząsteczek o każdej możliwej długości w ciągu pierwszych 182 nt. W przypadku zakażenia HIV-1 przy braku A3G najliczniejszym gatunkiem jest sama główna cząsteczka 180 nt strong-stop, z pewną akumulacją odczytów w krótszym zakresie (23 do 40 nt) (górny wykres, niebieskie histogramy). Dodanie A3G zmienia ten profil, ponieważ wykrywany jest gwałtowny wzrost krótszych, skróconych cząsteczek cDNA w kilku bardzo specyficznych, powtarzalnych pozycjach (środkowy i dolny wykres). Ponieważ A3G jest deaminazą cytydyny, mutacje cytozyny-urydyny (identyfikowane jako C-do-T) w cDNA występują, gdy A3G jest obecny w infekujących wirionach^21,23,24. Korzystając z uzyskanych informacji o sekwencjonowaniu, na tym samym wykresie wykreślono procent mutacji C-to-T (czerwona linia przerywana). Należy zauważyć, że profil mutacji jest uzyskiwany ze wszystkich unikalnych odczytów łącznie, a pokrycie każdego nukleotydu będzie się różnić. Jednakże, w razie potrzeby, informacje o sekwencji można powiązać z każdą cząsteczką i skorelować z określonym końcem 3'. Dostarczone dane zostały zaczerpnięte od Pollpeter et al.⁶ i wykazano, że korelacja między profilami mutacji a długością cDNA wynika z wykrywania i rozszczepienia zdeaminowanego cDNA przez maszynerię naprawy DNA komórkowego.

Pozytywna kontrola dla podejścia mapowania 3' może być łatwo uzyskana poprzez przetworzenie puli syntetycznych oligonukleotydów o znanej sekwencji, długości i stężeniu. Ten element sterujący jest dodawany podczas ligacji adaptera w kroku 3.3.2 i zaleca się, aby był uwzględniany we wszystkich bibliotekach multipleksowanych. Dane uzyskane z próbki kontrolnej powinny zawierać wszystkie oligonukleotydy w oczekiwanych proporcjach wejściowych, z bardzo niewielkimi odczytami tła. Rysunek 4 pokazuje wyniki pozytywnego zestawu kontrolnego 17 chemicznie syntetyzowanych oligonukleotydów (dla sekwencji, patrz Tabela 2), które były mieszane w proporcjach równomolowych. Zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie cząsteczki pojawiają się w prawie równej obfitości z niewielkimi zmianami (górny wykres). Podczas gdy większość pozycji w sekwencji DNA -sss, które nie były reprezentowane przez oligonukleotyd, zwraca zerową liczbę odczytów, zaobserwowaliśmy mniejsze gatunki, które są o 1 lub 2 nt krótsze niż rzeczywiste oligonukleotydy kontrolne. Nie badaliśmy dalej tych rzadkich gatunków, ale zakładamy, że reprezentują one zdegradowane lub niekompletne produkty potencjalnie obecne w dostarczonych zapasach oligonukleotydów przy zakupie (oligonukleotydy zostały zamówione jako oczyszczone metodą HPLC, dla których producent wskazuje > czystość 80%). Dolny wykres przedstawia próbkę kontrolną z innej serii biblioteki, gdzie zmienność jest nieco wyższa między 17 oligonukleotydami i koreluje z całkowitą długością, ponieważ dłuższe cząsteczki kontrolne są wykrywane skuteczniej niż krótsze. Może to być spowodowane niewielkim odchyleniem w reakcjach PCR lub grupowaniem podczas sekwencjonowania MiSeq, które ma optymalny rozmiar wkładki i może wystąpić w przypadku bibliotek zawierających szczególnie szerokie zakresy wkładek. Podstawowym sposobem rozwiązania tego odchylenia jest zastosowanie współczynnika normalizacyjnego opartego na nachyleniu, który wskazuje odchylenie skorelowane z długością cząsteczki (różowa linia). Wymagane obliczenia są zawarte w programie analitycznym (patrz krok 8.3 w protokole).

Rysunek 1: Diagram przedstawiający pierwsze etapy odwrotnej transkrypcji HIV-1. Proces rozpoczyna się od wyżarzania tRNA(Lys,3) (kolor pomarańczowy) do miejsca wiązania startera (PBS) w genomowym wirusowym RNA (etap 1), co umożliwia inicjację i wydłużenie wirusowego cDNA (niebieski, etap 2). Jednocześnie matrycowy genomowy RNA jest degradowany przez aktywność RNaseH RT (etap 3). Pierwszym pełnym produktem pośrednim w procesie odwrotnej transkrypcji jest cDNA o nici ujemnej (-)sss, które jest kompletne, gdy polimeryzacja katalizowana przez RT dociera do końca 5' regionu powtórzeń gRNA (R) (krok 3). Półprodukt (-)sss jest przenoszony do 3'-końca matrycy genomowego RNA poprzez wyżarzanie do komplementarnego regionu R o długości 3' końcowego powtórzenia (LTR). Od tego momentu polimeryzacja jest kontynuowana (krok 4). W opisanej metodzie progresję odwrotnej transkrypcji określa się poprzez odwzorowanie dokładnej długości powstającego wirusowego cDNA (kolor niebieski). PPT, trakt polipurynowy; U5, unikalna sekwencja 5'; U3, unikalna sekwencja 3'. Ten rysunek został ponownie opublikowany z poprzedniej publikacji⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zarys przepływu pracy i schematy strategii ligacji adaptera i amplifikacji PCR. (a) Przebieg pracy przedstawiający główne etapy opisanej techniki w celu określenia 3'-końców odwrotnych transkryptów HIV-1 w zakażonych komórkach. Rysunek został zaczerpnięty z poprzedniej publikacji⁶. b) Schemat strategii ligacji adaptorowej i amplifikacji PCR. Powstające cząsteczki cDNA o różnej długości, które zostały oczyszczone w poprzednich etapach, są ligowane do jednoniciowego adaptera DNA za pomocą ligazy DNA T4. Projekt adaptera spinki do włosów (o nazwie "full Kwok + MiSeq", patrz Tabela 1) został zainspirowany przez Kwok et al. ¹¹. Adapter posiada losową sekwencję kodów kreskowych 6 nt, która pozwala na parowanie zasad w celu ułatwienia ligacji i jednocześnie służy jako identyfikator dla unikalnych odczytów. Na końcach 3' adaptera znajduje się przekładka (SpC3), która zapobiega samoligaturacji. Ligowane produkty są oddzielane od nadmiaru adaptera przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Kwasy nukleinowe w żelu są barwione i cięte na trzy oddzielne, równej wielkości kawałki żelu w obszarze od góry adaptera do studni, jak zrobiono w²⁵. Po elucji, wytrąceniu i ponownym zawieszeniu, produkty są amplifikowane metodą PCR za pomocą starterów wyżarzających do znanej sekwencji adaptera (starter 1, zestaw multipleksowych oligonukleotydów, patrz tabela materiałów) i startera przenoszącego pierwsze 22 nt sekwencji HIV-1 5'-LTR bezpośrednio po tRNA (starter 2, MP1.0 + 22HIV). 5'-końce wybranych starterów zawierają adaptery dla wybranej platformy sekwencjonowania (P5 i P7), a także sekwencję indeksową w celu rozróżnienia poszczególnych próbek przebiegniętych w tej samej bibliotece. Wskazane są punkty początkowe sekwencjonowania odczytywanych starterów. Niebieskie pole wskazuje obszar zainteresowania w celu określenia oryginalnych 3'-końców wychwyconej cząsteczki. Ten rysunek jest adaptacją poprzedniej publikacji⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki. (a) Całkowita liczba odczytów reprezentatywnych próbek przetworzonych za pomocą opisanego protokołu. Obejmuje to wszystkie sekwencje, które zostały zidentyfikowane jako unikalne odczyty cząsteczek HIV-1 z ich końcami 3' w obrębie pierwszych 635 nt nici ujemnej cDNA (do PPT, patrz Rysunek 1). Zakażenie wirusem HIV-1, który nie jest nosicielem A3G, powoduje największą liczbę odczytów, podczas gdy A3G hamuje syntezę cDNA, a tym samym zmniejsza całkowitą liczbę odczytów. Niezakażone komórki służyły jako kontrola negatywna, podczas gdy zestaw syntetycznych oligonukleotydów zapewnia kontrolę pozytywną. b) Względna obfitość cDNA dla każdej długości między pozycjami nt 23 i 182 (cDNA o pełnej długości -sss wynosi od 180 do 182 nt) sekwencji_{HIV-1 NL4.3} (oś x) jest pokazana na niebieskich histogramach (skala na lewej osi y). Względną obfitość cDNA obliczono na podstawie bezwzględnej liczby sekwencji kończących się na danym nukleotydzie w sekwencji cDNA -sss podzielonej przez sumę wszystkich odczytów o wartości 182nt lub mniejszej. Czerwonymi liniami przerywanymi pokazany jest procent odczytów niosących mutacje C-to-T/U w odpowiedniej pozycji (skala na prawej osi y). Rysunek 3b jest ponownie opublikowany z poprzedniej publikacji⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki próbek kontrolnych. Pokazano dwa profile dla pul zawierających równomolowe ilości 17 syntetycznych oligonukleotydów o różnej długości. Te oligonukleotydy mają sekwencje z_{HIV-1 NL4.3} i zostały wybrane tak, aby pokrywały różne długości i prezentowały wszystkie 4 zasady jako 3'-nukleotyd (patrz tabela 2). Górny wykres przedstawia próbkę kontroli dodatniej z Rysunek 3a. Nie wykryto znaczącego odchylenia w kierunku długości cząsteczki ani otwartych 3'-końców. Dolny wykres przedstawia inny przebieg biblioteki, który spowodował niewielkie odchylenie długości w sekwencjonowaniu. W takim przypadku zaleca się zastosowanie współczynnika normalizacji, który jest uzyskiwany na podstawie nachylenia (pokazanego na różowo), które reprezentuje odchylenie rozmiaru. Ten rysunek został ponownie opublikowany z poprzedniej publikacji⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt.

Nazwa oligo

Długość w nt

Sekwencja

Przeznaczenie

Producent (Oczyszczanie)

pełny Kwok + MiSeq

61

5'-PHO-tgaagagcctagtcgctgttcannnnnnctgcccatagagagatcggaagagcacacgtct-SpC3-3'

Adapter

Technologie DNA IDT (HPLC)

2xBiotyna SS przynęta

Rozdział 40

5'-biotyna-cagtgtggaaaatctctagcagtggccccgaacagggac-biotyna-3'

Przechwytywanie hybrydowe

MWG Eurofins (HPLC)

Biotyna 1-16 ss

22 Rozdział 22

5'-cagtgtggaaaatctctagcag-BiTEG-3'

Przechwytywanie hybrydowe

MWG Eurofins (HPLC

Biotyna tRNA + KTG

16

5'-cagtggcgcccgaaca-BITEG-3'

Przechwytywanie hybrydowe

MWG Eurofins (HPLC)

MP1.0 + 22HIV

Rozdział 82

5'-aatgatacggcgaccaccgagatctactacactctttccctacacgacgctcttccgatctcactgctagagattttccacactg-3'

Amplifikacja PCR

MWG Eurofins (HPLC

Tabela 1: Tabela oligonukleotydów, w tym długość, sekwencje i modyfikacje, które są wykorzystywane w opisanym protokole. Tabela została zaadaptowana z poprzedniej publikacji⁶. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę jako plik Excel.

szt.

Nazwa oligo

Długość w nt

Sekwencja

Producent (Oczyszczanie)

HTP con long C

120

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacacacaacagacgggcacacactttgagcactcaaggcaagcaagctttattgaggcttaagc-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con long G

Rozdział 119

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacacaacagaccacaacacactttgagcactcaaggcaagcaagctttattgaggcttaag-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con long T

Rozdział 116

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacacacaacagacggcacactttgagcactcaaagcaagctttattgaggctt-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con long A

Rozdział 118

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaaagggtctgagggatctctctagttaccagagtcacacacaacagacgagcactcaaggcaagcaagctttattgaggcttaa-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con mid C

76 Rozdział 76

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaaggctctgagggatctcatcatcaacagacgggcacac-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con mid G (a)

71 Rozdział 71

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaaagggtctgagggatctctctttagttaccagagtcacacaacagacg-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con mid G (b)

72 Rozdział 72

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaaagggtctgagggatctttagttaccagagtcacaacagacgg-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con mid A

Rozdział 69

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaaaaggctctgagggatctctctttagttaccagagtcacacaacaga-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con mid T

Rozdział 85

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaaaaggctctgagggatctctttagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactt-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con short A

Rozdział 40

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagga-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con short T

33 Rozdział 33

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggt-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con short G

Rozdział 41

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaaagggtctgaggg-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP con short C

Rozdział 34

5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtc-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP Con 46 (T)

Rozdział 46

5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctct-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP Con 83 (C)

Rozdział 83

5'-ctgctagagattttccacactg actaaaaggctgagggatcttagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactac-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP Con 103 (C)

Rozdział 103

5'-ctgctagagattttccacactg actaaaaggctgagggatctctctagttaccagagtcacacacaacagacggcacacactttgagcactcaaggcaagc-3'

MWG Eurofins (HPLC)

HTP Con 107 (A)

Rozdział 107

5'-ctgctagagattttccacactg actaaaaggctctgagggatctctagttaccagagtcacacacaacagacggcacacactttgagcactcaaggcaagcttta-3'

MWG Eurofins (HPLC)

Tabela 2: Tabela 17 syntetycznych oligonukleotydów kontrolnych stosowanych jako dodatnia próbka kontrolna. 13 pierwszych oligonukleotydów zostało wybranych na podstawie rozmiaru [długi (116 do 120 nt), średni (69 do 85 nt), krótki (33 do 41 nt)], a także ich 3'-końca. Tabela została zaadaptowana z poprzedniej publikacji⁶. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę jako plik Excel.

Dyskusja

Dostępność szybkiego, niezawodnego i opłacalnego głębokiego sekwencjonowania zrewolucjonizowała wiele aspektów w dziedzinie nauk przyrodniczych, umożliwiając bardzo szczegółowe analizy oparte na sekwencjonowaniu. Pozostałym wyzwaniem pozostaje innowacyjne zaprojektowanie i stworzenie reprezentatywnych bibliotek sekwencjonowania. W tym miejscu opisujemy protokół wychwytywania powstających cząsteczek cDNA wirusa, w szczególności produktów pośrednich procesu odwrotnej transkrypcji HIV-1.

Najważniejszym krokiem w tej strategii jest podwiązanie adaptera do otwartych końców 3' w sposób ilościowy i bezstronny. Skuteczność ligacji między dwoma końcami ssDNA, zarówno międzycząsteczkowymi, jak i wewnątrzcząsteczkowymi, została zbadana i zoptymalizowana pod kątem różnych zastosowań 11,26,27,28,29. Wybór użycia adaptera spinki do włosów z ligazą DNA T4 w warunkach opisanych w kroku 3.3 jest wynikiem optymalizacji empirycznej, w której oceniliśmy różne ligazy, adaptory i odczynniki do ligacji syntetycznych oligonukleotydów reprezentujących sekwencje HIV-1 (tabela 2) (dane nie pokazane). W tych reakcjach badań in vitro potwierdziliśmy, że ligacja adaptera spinki do włosów za pośrednictwem ligazy DNA T4, jak opisano przez Kwok i wsp. ¹¹, ma bardzo niskie odchylenie i osiąga prawie całkowitą ligację cząsteczek akceptora, gdy adapter jest używany w nadmiarze. Na wydajność ligacji nie miało wpływu dodanie sekwencji nukleotydów, aby adapter był kompatybilny z systemem starterów multipleksowych (patrz rysunek 4). Dla porównania, stwierdziliśmy, że termostabilna ligaza 5'DNA / RNA ("Ligaza A", patrz Tabela materiałów dla dokładnych ligaz porównanych tutaj), która jest zmodyfikowaną ligazą RNA, która została opracowana częściowo w celu poprawy wydajności ligacji z ssDNA jako akceptorem²⁷, była rzeczywiście bardziej skuteczna w ligowaniu dwóch cząsteczek ssDNA niż ligaza RNA ("Ligaza B"), ale miała znaczne odchylenie, z dużymi różnicami w skuteczności ligacji nawet między oligonukleotydami o pojedynczych różnicach długości zasad [tab. 2; HTP con mid G (a) i (b)]. Co więcej, znaleźliśmy tylko minimalne odchylenie w reakcjach z "Ligazą C" w połączeniu z adaptorem przenoszącym losowe 5'-końce (strategia stosowana do kompensacji znanego odchylenia nukleotydowego "Ligazy C"; patrz na przykład Ding i wsp.^Jednak ligacje międzycząsteczkowe, w których pośredniczy "ligaza C", były niekompletne, co sprawiało, że system ligazy DNA T4 był lepszym wyborem.

Kilka etapów kontroli jakości w trakcie trwania protokołu oraz włączenie kontroli pozytywnych i ujemnych pozwala na wykrycie potencjalnych problemów przed kontynuacją testu i zapewnia wskazówki dotyczące działań związanych z rozwiązywaniem problemów. Oznaczanie ilościowe qPCR w etapach 2.2.2 i 2.3.12 zapewnia, że ilość materiału wejściowego jest wystarczająca. Typowa liczba kopii cDNA w elucji 200 μl (od kroku 2.1) waha się od około 10 000 do 300 000 na μl. Etap wychwytywania hybrydowego może spowodować pewną utratę całkowitej ilości cDNA HIV-1, ale powinien skutkować silnym wzbogaceniem specyficznego cDNA HIV-1 w stosunku do DNA komórkowego, co można określić przy użyciu odpowiednich starterów do ilościowego określenia genomowego DNA przed i po wzbogaceniu przez qPCR lub poprzez pomiar całkowitego stężenia DNA. Odzyskane cDNA HIV-1 po etapach wychwytywania hybrydowego powinno stanowić co najmniej 10% danych wejściowych. Niski poziom materiału wyjściowego może w przeciwnym razie wyjaśniać udaną kontrolę dodatnią oligonukleotydów (zob. etap 3.3.2), ale tylko ograniczone odczyty uzyskane w próbkach. Niska ogólna liczba odczytów może być również wyjaśniona przeszacowaniem koncentracji w bibliotece z powodu obecności nieistotnych gatunków DNA bez adapterów MiSeq. Skutkowałoby to niską gęstością klastrów i można je poprawić, określając stężenie sekwencji HIV-1 w bibliotece za pomocą qPCR oprócz całkowitej ilości DNA za pomocą testów fluorometrycznych. Ze względu na bardzo czuły charakter metody, należy zachować szczególną ostrożność w celu uniknięcia nawet niskiego poziomu zanieczyszczenia, zarówno z innych próbek (w szczególności z kontrolnych zapasów oligonukleotydów o wysokim stężeniu), jak i ze sprzętu laboratoryjnego. Praca na stanowisku do sterylizacji UV PCR jest pod tym względem korzystna. Zautomatyzowana elektroforeza żelowa w bibliotece końcowej (krok 6.1.2) jest kolejnym środkiem kontroli jakości. Zwykle obserwowany zakres wielkości kwasów nukleinowych wynosi od 150 do 500 nt. Startery, które można wykryć w opcjonalnej kontroli po PCR i przed oczyszczeniem (patrz uwaga w kroku 5.2), powinny być teraz nieobecne. W reprezentatywnym wyniku krzywa intensywności próbki ma pik około 160 do 170 nt i drugi ostrzejszy pik około 320 do 350 nt. Prawdopodobnie odzwierciedla to często obserwowaną większą obfitość zarówno w stosunkowo krótkich (1 do 20 nt długości wkładki) odwrotnych transkrypcjach, jak i pełnometrażowych strong-stop (180 do 182 nt długości insertu) (Figura 3b).

Chociaż przedstawiony protokół i wybrane startery są specyficzne dla wczesnych konstruktów odwrotnej transkrypcji HIV-1, metoda ta ma ogólne zastosowanie w każdym badaniu mającym na celu określenie otwartych 3'-końców DNA. Głównymi modyfikacjami wymaganymi w innych kontekstach będą metoda wychwytywania hybrydowego oraz strategia projektowania podkładów. Na przykład, jeśli cel ma być przystosowany do późnych transkryptów HIV-1, wskazana byłaby większa liczba różnych wychwytujących biotynylowanych oligonukleotydów wyżarzających się na całej długości cDNA, co prawdopodobnie zmniejszy straty na etapie wychwytywania hybrydy. Jak wspomniano we wprowadzeniu, ważne jest, aby wziąć pod uwagę ograniczenia podczas projektowania zakresu, w którym mają być wykrywane 3'-końce, aby uniknąć różnych źródeł odchylenia. Po pierwsze, może wystąpić błąd systematyczny w reakcjach PCR, jeśli matryce z adapterem mają znacznie różną długość. Po drugie, zastosowana tutaj platforma sekwencjonowania (np. MiSeq) ma preferowany zakres długości wkładek dla optymalnego grupowania, a znacznie krótsze i dłuższe produkty mogą nie być sekwencjonowane z taką samą wydajnością. Częściowo można temu zaradzić obliczeniowo, tak jak to zrobiono, obliczając współczynnik korekcyjny dla liniowego odchylenia długości (patrz rysunek 4, dolny wykres). Jeśli jednak obszar, w którym pożądane jest mapowanie 3'-końców, jest długi (> 1000 nt), bardziej wskazane jest podzielenie reakcji za pomocą ligowanych transkryptów i użycie wielu starterów w górę do oceny 3'-końców w sekcjach.

Program analityczny został napisany wewnętrznie w konkretnym celu analizy zarówno ostatniego nukleotydu sekwencji HIV-1 sąsiadującego z ustaloną sekwencją adaptorową, jak i zmienności zasad wszystkich zasad w celu zidentyfikowania wszelkich mutacji. Poszczególne kroki obejmują następujące kroki: po pierwsze, sekwencje adapterów są przycinane za pomocą zestawu narzędzi fastx-0.0.13; Następnie wszystkie sekwencje, które są zduplikowane (co oznacza identyczne sekwencje, w tym kod kreskowy), są usuwane. Wszystkie pozostałe unikalne odczyty są następnie wyrównywane do sekwencji HIV-1 za pomocą muszki (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) z maksymalnym niedopasowaniem ustawionym na trzy podstawy. Sekwencja matrycy składa się z pierwszych 635 nt cDNA HIV-1 (szczep NL4.3), który obejmuje sekwencję -sss i produkt transferu pierwszej nici do ścieżki polipurynowej (U5-R-U3-PPT; patrz rysunek 1). W związku z tym dostarczone oprogramowanie i szablony są bezpośrednio odpowiednie tylko wtedy, gdy metoda jest stosowana do tego samego zastosowania (wykrywanie wczesnych odwrotnych transkryptów HIV-1_NL4.3). Konieczne będzie wprowadzenie zmian w przypadku innych sekwencji docelowych. Pozycje 3'-końcówek dla każdego odczytu zostały określone przez pozycję w wyrównaniu. Wywołania bazowe dla każdej pozycji są rejestrowane, a współczynniki mutacji są obliczane na podstawie całkowitego pokrycia każdej zasady, które jest różne, ponieważ odczyty mają różną długość, a długie wstawki mogą nie być w pełni pokryte przez sekwencjonowanie 125 zasad w Read2.

Podsumowując, uważamy, że opisana metoda jest cennym narzędziem dla wielu rodzajów badań. Oczywiste zastosowania obejmują badania mechanizmów leżących u podstaw hamowania odwrotnej transkrypcji przez leki przeciwretrowirusowe lub czynniki restrykcyjne komórkowe. Jednak tylko stosunkowo niewielkie dostosowania powinny być konieczne w celu dostosowania systemu do mapowania 3'-końców w obrębie innych jednoniciowych produktów pośrednich wirusa DNA, które są obecne, na przykład, w replikacji parwowirusa. Co więcej, zasada działania metody, a w szczególności jej zoptymalizowany etap ligacji, może stanowić kluczową część projektu przygotowania biblioteki do charakteryzowania dowolnych rozszerzeń 3'-DNA, w tym elongacji katalizowanych przez komórkowe dwuniciowe polimerazy DNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki 293T	ATCC	CRL-3216
Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco	Gibco	31966-021
Penicylina/Streptomycyna	Gibco	15150-122
Surowica bydlęca płodu	Gibco	10270-106
Inkubator CO2 HeraCell Vios 250i	Thermo Scientific	51030966
Laminar okap przepływowy - CAS BioMAT2	Wolflabs	CAS001-C2R-1800
Naczynie hodowlane z TC 10 mm	Corning	430167
TrypLE™ Ekspresowy (1x), Stabilny enzym zastępujący trypsynę	Gibco	12605-010
OptiMEM® (Minimalny niezbędny nośnik)	Gibco	31985-047
HIV-1 NL4-3 Zakaźny klon molekularny (pNL4-3)	NIH Program odczynników AIDS	114
Polietylenimina (PEI) - MW: 25000	PolySciences Inc	23966-2	rozpuszczony w 1 mg / ml i dostosowany do pH7
RQ1- Filtr Dnazy Promega		M6101
0,22 i mu; m	Triple Red Limited	FPE404025
15 ml probówki polipropylenowe	Corning	CLS430791
Sacharoza	Calbiochem	573113
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (1x)	Gibco	14190-094
Probówki do ultrawirówek	Beckman Coulter	344060
Ultrawirówka	Sorval	WX Ultra Series	Wirnik TH-641
Antygen ELISA Alliance HIV-1 p24	zestaw Perkin Elmer	NEK050001KT
Komórki CEM-SS	NIH Program odczynników na AIDS	776
Roswell Park Memorial Institute Medium	Gibco	31870-025
CoStar® Płytki wielodołkowe poddane działaniu TC	Corning	CLS3513-50EA
Wirówka stołowa: Heraus & trade; Multifuge ™ X3 FR	Thermo Scientific	75004536
TX-1000 Wahadłowy wirnik kubełkowy	Mikrowirówka Thermo Scientific	75003017
: 5424R		DNA Eppendorf
(zestaw do krwi i tkanek DNeasy)	Qiagen	69504
Bez nukleazy H2O	Ambion	AM9937
Bufor	CutsmartNew England Biolabs (część enzymu DpnI)	R0176S
Enzym restrykcyjny DpnI	New England Biolabs	R0176S
Oligonukleotydy do qPCR	MWG Eurofins	N/A	HPSF Purification
TaqMan PCR Universal Mastermix	Thermo	4304437
LoBind Eppendorf® probówki	Eppendorf	30108078
Axygen i handel; Końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 1000 μ L	Fisher Scientific	TF-000-R-S
Axygen™ końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 200 μ L	Fisher Scientific	TF-200-R-S
Axygen™ końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 20 μ L	Fisher Scientific	TF-20-R-S
Axygen™ końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 10 μ L	Fisher Scientific	TF-10-R-S
PCR czysty kaptur	LabCaire	Model PCR-62
DynaMag&handel; 2-magnes	Thermo	12321D
Streptawidyna MagneSphere® cząstki paramagnetyczne	Promega	Z5481
Kazeina	Thermo Scientific	37582
Rotator typu end over end, Rewolwer™ 360°	Labnet	H5600
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152-5
Kwas solny	Sigma	H1758-100ML
EDTA sól disodowa dwuwodna	Electran (VWR)	443885J
Chlorek sodu	Sigma	S3014
Dri-Block® Analogowa grzałka blokowa	Techne	UY-36620-13
Probówki do PCR i wypukłe nakrętki	Maszyna do PCR Thermo Scientific	AB0266
	Eppendorf	Mastercycler® seria
T4 Ligaza DNA	New England Biolabs	M0202M
40% roztwór glikolu polietylenowego (PEG) w H2O, MW: 8000	Sigma	P1458-25ML
Betaina roztwór, 5M	Sigma	B0300-1VL
Bufor ładujący żel II (bufor formamidowy)	Thermo Scientific	AM8546G
Prefabrykowane żele mocznikowe 6% TBE	Invitrogen	EC6865BOX
System elektroforezy komórkowej	Invitrogen, Novex	XCell SureLock™
Roztwór Tris/Boranu/EDTA (10x)	Fisher Scientific	10031223
Igła 21 G x1 1/2	VWR	613-2022
SYBR Gold barwnik kwasu nukleinowego (10000x)	Life Technologies	S11494
Dark Reader Nadajnik DR46B	Fisher Scientific	NC9800797
Octan amonu	Merck	101116
Roztwór SDS 20% (w/v)	Biorad	161-0418
Filtr probówkowy do wirówek	Appleton Woods	BC591
Filtr Włókno szklane Gf/D 10mm	Whatman (VWR)	512-0427
kwas poliadenylowy (poliA) RNA	Sigma	10108626001
Glikogen, klasa biologii molekularnej	Thermo Scientific	R0561
Izopropanol (2-propanol)	Fisher Scientific	15809665
Etanol, klasa biologii molekularnej	Fisher Scientific	10041814
Accuprime™ Supermix I (premiks polimerazy DNA)	Life Technologies	12342-010
NEBNext® Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 i 2)	New England Biolabs	E7335S; E7500S
Tapestation D1000 Taśma ekranowa o wysokiej czułości	Agilent Technologies	5067- 5584
Odczynniki Tapestation D1000	Agilent Technologies	5067- 5585
2200 Tapestation - zautomatyzowany system elektroforezy żelowej	Agilent Technologies	G2965AA
Agencourt® AMPure® koraliki XP	Beckman Coulter	A63880
Qubit™ dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
Qubit™ 2.0 Fluorometr	Invitrogen	Q32866
Topo™ Zestaw do klonowania TA	Invitrogen	450071
Platforma sekwencjonowania: MiSeq System	Illumina
Experiment Manager (oprogramowanie do pobierania próbek)	Illumina	Uwaga: Użyj TruSeq LT jako szablonu
Miseq™ Zestaw odczynników V3 (150 cykli)	Illumina	MS-102-3001
Koncentrator sekwencjonowania: Basespace	Illumina	https://basespace.illumina.com
Ligase A: Termostabilny 5' App DNA/RNA ligaza	NEB	M0319S	Nie używany w tym protokole, ale testowany w procesie optymalizacji z wynikami opisanymi w dyskusji.
Ligaza B: Ligaza RNA T4 1	NEB	M0204	Nie stosowana w tym protokole, ale testowana w procesie optymalizacji z wynikami opisanymi w dyskusji.
Ligaza C: CircLigase	Epicentre	CL4111K	Nie jest używany w tym protokole, ale testowany w procesie optymalizacji z wynikami opisanymi w dyskusji.