Artykuł metodologiczny

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58715

⸱

30 stycznia 2019

 ,  , 
1Department of Infectious Diseases, School of Immunology & Microbial Sciences, King's College London

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Streszczenie

Monitorowanie produktów pośrednich kwasów nukleinowych podczas replikacji wirusa dostarcza wglądu w efekty i mechanizmy działania związków przeciwwirusowych i białek komórek gospodarza na syntezę DNA wirusa. W tym miejscu zajmiemy się brakiem testu komórkowego o wysokim pokryciu i wysokiej rozdzielczości, który byłby w stanie zdefiniować retrowirusowe produkty pośrednie odwrotnej transkrypcji w fizjologicznym kontekście infekcji wirusowej. Opisana metoda wychwytuje 3'-końce powstających cząsteczek komplementarnego DNA (cDNA) w komórkach zakażonych wirusem HIV-1 w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Protokół obejmuje pobieranie DNA całej komórki, ukierunkowane wzbogacanie DNA wirusa poprzez wychwytywanie hybrydowe, ligację adaptora, frakcjonowanie wielkości poprzez oczyszczanie żelu, amplifikację PCR, głębokie sekwencjonowanie i analizę danych. Kluczowym krokiem jest skuteczna i bezstronna ligacja cząsteczek adaptorowych w celu otwarcia końców 3'-DNA. Zastosowanie opisanej metody pozwala na określenie liczebności odwrotnych transkryptów o każdej określonej długości w danej próbce. Dostarcza również informacji o (wewnętrznej) zmienności sekwencji w odwrotnych transkryptach, a tym samym o wszelkich potencjalnych mutacjach. Ogólnie rzecz biorąc, test jest odpowiedni dla wszelkich pytań związanych z przedłużeniem DNA 3', pod warunkiem, że znana jest sekwencja matrycy.

Wprowadzenie

Aby w pełni przeanalizować i zrozumieć replikację wirusa, potrzebne są coraz bardziej wyrafinowane techniki wychwytywania produktów pośrednich replikacji. W szczególności dokładna definicja wirusowych kwasów nukleinowych w kontekście zakażonych komórek może dostarczyć nowych informacji, ponieważ do tej pory zbadano wiele mechanizmów replikacji wirusa w izolowanych reakcjach in vitro. Doskonałym przykładem jest proces odwrotnej transkrypcji w retrowirusach, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności1 (HIV-1). Różne etapy odwrotnej transkrypcji HIV-1, podczas których enzym wirusowy odwrotna transkryptaza (RT) kopiuje jednoniciowy genom RNA do dwuniciowego DNA, były badane głównie w testach rozszerzenia starterów z oczyszczonymi białkami i kwasami nukleinowymi1,2,3,4,5. Chociaż ustalono podstawowe zasady, takie testy nie obejmują wszystkich składników wirusowych i komórkowych i mogą nie odzwierciedlać biologicznie istotnych stechiometrii zaangażowanych czynników. Dlatego zaprojektowaliśmy potężną technikę określania widm produktów pośrednich odwrotnej transkrypcji z ich precyzyjnymi końcami cDNA 3' (tj. określając ich dokładną długość) i sekwencjami nukleotydowymi w kontekście infekcji żywych komórek6. Gromadzenie danych z eksperymentów w czasie może być wykorzystane do porównania profilu transkryptów w różnych warunkach, takich jak obecność cząsteczek lub białek przeciwwirusowych, które mogą wpływać na wydajność i procesywność syntezy i akumulacji DNA. Pozwala to na bardziej szczegółowe zrozumienie naturalnego cyklu życiowego patogenu, który często stanowi podstawę do projektowania ukierunkowanych leków i skutecznej interwencji terapeutycznej.

Odwrotna transkrypcja HIV-1 składa się z serii następujących po sobie zdarzeń zainicjowanych przez wyżarzanie startera tRNA do matrycy genomowego RNA, która jest następnie przedłużana przez RT w celu wytworzenia krótkiego, jednoniciowego transkryptu cDNA zwanego minus-nicią strong-stop (-sss) (patrz Rysunek 1). Następnie cDNA -sss jest przenoszone z 5'-długiego końcowego powtórzenia (LTR) do 3'-LTR genomowego RNA, gdzie wyżarza się i służy jako starter do dalszego wydłużania nici ujemnej DNA za pośrednictwem RT (patrz recenzje na temat odwrotnej transkrypcji1,2,3,4). Ten pierwszy transfer nici jest jednym z etapów ograniczających szybkość odwrotnej transkrypcji; w związku z tym wiadomo, że cDNA -sss się gromadzi. Podstawowy przepływ pracy i projekt biblioteki do przechwytywania produktów odwrotnej transkrypcji w zainfekowanych komórkach przedstawiono na rysunku 2a. Specyficzne startery i ustawienia analizy, które są używane w protokole i wymienione w tabeli 1, są ukierunkowane na wszystkie wczesne produkty pośrednie cDNA z odwrotną transkrypcją w zakresie długości od 23 do ~ 650 nt, który obejmuje DNA 180-182 nt -sss. Jednak odpowiednie drobne dostosowania strategii pozwolą na zastosowanie nie tylko do późnych produktów odwrotnej transkrypcji, ale także do innych wirusów i systemów, których celem jest wykrycie końcówek DNA zawierających 3'-OH. Ważne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę, obejmują zakres długości końcowego produktu PCR w bibliotece; W szczególności szablony, w których odległość między adapterem na otwartym końcu 3' a miejscem startera górnego przekracza ~1000 NT, będą prawdopodobnie mniej efektywnie sekwencjonowane, co potencjalnie wprowadzi wprowadzające w błąd błędy techniczne podczas przygotowywania biblioteki (zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej szczegółów i sugestie dotyczące adaptacji).

Wcześniej opisywane techniki systematycznego oznaczania 3'-końców nici kwasu nukleinowego koncentrowały się na cząsteczkach RNA, a nie DNA. Jednym z przykładów jest 3' RACE (szybka amplifikacja końców cDNA)7, która opiera się na poliadenylacji mRNA. Ponadto opracowano strategie oparte na ligacji adaptorowej z wykorzystaniem ligaz RNA, które obejmowały RLM-RACE (RACE, w którym pośredniczy ligaza RNA)8 lub LACE (amplifikacja końców cDNA oparta na ligacji)9. Ważne jest, aby podkreślić, że amplifikacje oparte na ligacji są wrażliwe na wszelkie odchylenia wprowadzone przez samą reakcję ligacji. Na przykład ligacja może być mniej lub bardziej wydajna w zależności od konkretnego nukleotydu w pozycji 3', sekwencji, całkowitej długości cząsteczki lub lokalnej struktury. Takie preferencje ligazy prowadzą do niepełnego wychwytywania cząsteczek i błędnej reprezentacji w odczycie, co zaobserwowaliśmy my i inni9,10. Aby zminimalizować błąd systematyczny ligacji podczas etapów dodawania adaptera w opisanym tutaj protokole, przetestowaliśmy szereg strategii ligacji i znaleźliśmy zastosowanie ligazy DNA T4 z jednoniciowym adapterem DNA typu spinka do włosów (zgodnie z opisem Kwok i wsp.11) jako jedyna procedura z niemal ilościową ligacją, która nie powodowała istotnych różnic w skuteczności ligacji, gdy była oceniana za pomocą specjalnie wybranego zestawu kontrolnych oligonukleotydów6. Wybór tej strategii podwiązywania jest zatem kluczową cechą sukcesu tego protokołu.

Do tej pory, monitorowanie progresji HIV-1 RT w zakażonych komórkach było głównie realizowane poprzez pomiar produktów odwrotnej transkrypcji o różnej długości za pomocą ilościowego PCR (qPCR) przy użyciu zestawów starter-probe, które jednoznacznie mierzą krótsze lub dłuższe (odpowiednio wczesne i późne) produkty cDNA12,13,14. Chociaż to podejście qPCR jest odpowiednie do określenia wewnętrznej skuteczności procesu odwrotnej transkrypcji w systemach komórkowych, dane wyjściowe mają stosunkowo niską rozdzielczość, bez uzyskiwania informacji o sekwencji. Nasze nowe podejście, oparte na zoptymalizowanej ligacji adaptora, generowaniu bibliotek za pośrednictwem PCR i głębokim sekwencjonowaniu, wypełnia lukę technologiczną i oferuje możliwość monitorowania odwrotnej transkrypcji podczas zakażenia HIV-1 ilościowo i z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Zilustrowaliśmy użyteczność tej metody w badaniu, które rozróżniało dwa proponowane modele zdolności czynnika ograniczającego HIV-1 APOBEC3G (apolipoproteiny B mRNA edytującego enzym katalityczny polipeptyd podobny do 3G) do zakłócania produkcji wirusowych odwrotnych transkryptów6.

Protokół

UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi odczynnikami i sprzętem używanym w tym protokole.

1. Produkcja wirusa i infekcja komórkowa

UWAGA: Zakaźny HIV-1 powinien być stosowany tylko w zatwierdzonych laboratoriach bezpieczeństwa biologicznego.

UWAGA: Produkcja cząsteczek HIV-1 przez przejściową transfekcję komórek 293T ludzkiej embrionalnej nerki (HEK), jak opisano w kroku 1.1, jest standardową procedurą i została opisana wcześniej15,16. Ogólne procedury hodowli komórkowej są opisane wcześniej17.

  1. Produkcja wirusa HIV-1.
    1. Utrzymuj komórki 293T w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (pełne DMEM) w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 zgodnie z wcześniejszym opisem17.
    2. W standardowym kapturze do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym usuń pożywkę wzrostową i dodaj 3 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) trypsyny do prawie zlewającej się 10-centymetrowej płytki do hodowli komórkowej (~1,2 x 107 komórek) z komórkami 293T. Włóż naczynie z powrotem do inkubatora na 2-3 minuty.
    3. Wyjąć szalkę z inkubatora z powrotem do okapu do hodowli tkankowej i dodać 7 ml pełnej pożywki. Kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół w naczyniu, aby ponownie zawiesić komórki. Podziel komórki w stosunku 1:4, dodając 2,5 ml zawiesiny komórek do nowego 10-centymetrowego naczynia i napełnij je 7,5 ml pełnej pożywki.
    4. Następnego dnia zmieszaj 10 μg prowirusowego plazmidowego DNA HIV-1 (takiego jak pNL4.3) z 1 ml minimalnej pożywki niezbędnej bez surowicy i dodaj roztwór polietyleniminy (PEI) (25 000 mW, 1 mg/ml pH 7) w 4,5 μl na 1 μg DNA. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i dodawać kroplami do komórek 293T.
    5. 24 godziny po transfekcji usunąć pożywkę i zastąpić ją 6 ml pełnego DMEM zawierającego DNazę wolną od RNaz w pożywce 20 U/ml. Po 6 godzinach zastąp pożywkę 10 ml pełnego DMEM.
    6. 48 godzin po transfekcji zebrać supernatant i przefiltrować go przez filtr 0,22 μm, używając strzykawki o pojemności 10 ml, do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
    7. Dodaj 2 ml sterylnej 20% sacharozy w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do otwartej cienkościennej probówki ultrawirówkowej. Powoli nałożyć sacharozę na supernatant z przefiltrowanych komórek.
    8. Wirować przez 1 h 15 min przy 134 000 x g w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki.
    9. Ostrożnie wyjmij probówki z ultrawirówki. Powoli zdjąć zarówno sklaraty, jak i sacharozę za pomocą ssania lub pipety. Użyj mniejszej pipety i przechyl probówkę podczas wyjmowania ostatniego roztworu sacharozy. Pozostawić granulowany wirus na dnie probówki.
      UWAGA: Pellet nie będzie widoczny.
    10. Dodać 200 μl 1x PBS, pozostawić w lodówce na 4 do 12 godzin, zawiesić i zamrozić w 20 μl porcji w temperaturze -80 °C.
    11. Określ zawartośćp24 Gag za pomocą zestawu ELISA antygenu p24 HIV-1 (zgodnie z instrukcjami producenta).
  2. Zakażenie linią komórek T.
    1. Hodowla unieśmiertelnionej linii komórek T (np. komórek CEM-SS) w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny (pełne RPMI). Policz komórki za pomocą hemocytometru18 i zasiej 1 dołek na próbkę z 1 ml pełnego RPMI z 2 x 106 komórek/ml na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej.
    2. Dodać cząstki HIV-1 odpowiadające 150 ng p24Gag i umieścić płytkę w wahadłowym wiadrze wirówkowym z pokrywkami bioizolacyjnymi w celu odwirowania przez wirowanie w wirówce stołowej przez 2 godziny przy 2 000 x g w temperaturze 30 °C.
    3. Wyjąć płytkę z wirówki i pozostawić ją na 1 godzinę w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    4. Aby zmyć wirusa wejściowego, należy zebrać komórki, przenosząc zawiesiny komórek do probówek do mikrowirówek i odwirowując w mikrowirówce przy RT (RT) przy 500 x g przez 2 minuty. Zdjąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
    5. Zawiesić granulki komórkowe w 1 ml wstępnie podgrzanego (37 °C), sterylnego 1x PBS. Powtórz etapy wirowania, usuwania sklarowanego osadu i ponownego zawieszania jeszcze dwa razy.
    6. Ponownie odwirować, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 1 ml pełnej prędkości obrotowej. Dodać każdą zawiesinę do jednego dołka w nowej płytce 12-dołkowej.
    7. Po 6 godzinach od początkowego dodania wirusa (4 godziny po odwirowaniu) należy pobrać komórki przez odwirowanie, jak to opisano w kroku 1.2.4. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Granulki komórkowe można zamrozić w temperaturze -80 °C lub przetworzyć bezpośrednio w celu ekstrakcji DNA.

2. Ekstrakcja DNA, kwantyfikacja DNA HIV-1 i wzbogacanie przez wychwytywanie hybrydowe

  1. Ekstrahuj DNA całych komórek za pomocą zestawu do ekstrakcji całkowitego DNA krwi i tkanek, postępując zgodnie z instrukcją zestawu dla komórek do hodowli tkankowych. Jedyną zmianą jest elucja w 200 μl H2O wolnej od nukleaz zamiast dostarczonego buforu elucyjnego.
    UWAGA: Po dodaniu buforu do lizy chaotropowej ("bufor AL") i proteinazy, próbki mogą zostać usunięte z laboratorium zabezpieczającego bezpieczeństwo biologiczne i przetwarzane w laboratorium o standardowym poziomie bezpieczeństwa do końca protokołu.
  2. Określ liczbę kopii cDNA HIV-1 za pomocą qPCR.
    1. Pobrać 17 μl eluatu z kroku 2.1 i dodać 2 μl 10-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego wraz z 1 μl enzymu restrykcyjnego DpnI. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu usunięcia wszelkich potencjalnych pozostałości wejściowego plazmidowego DNA z transfekcji.
    2. Przeprowadzić qPCR dla cDNA o nici ujemnej przy użyciu następującego zestawu sond starterowych: oHC64 (5′-taactagggaacccactgc-3′) i oHC65 (5′-gctagagattttccacactg-3′) i sondy oHC66 (5′-FAM- acacaacagacgggcacacacta-TAMRA-3′). Konfiguracja qPCR i dokładne warunki można znaleźć w referencji6,13. Nosić ze sobą próbki z seryjnym rozcieńczeniem plazmidu prowirusowego pNL4.3 jako krzywą standardową w celu określenia liczby kopii cząsteczek cDNA.
      UWAGA: Zobacz dyskusję, aby zapoznać się z oczekiwanymi ilościami.
  3. Wzbogacanie DNA HIV-1 metodą wychwytywania hybrydowego.
    UWAGA: Z tego punktu widzenia zaleca się stosowanie probówek do mikrowirówek o niskich właściwościach wiązania kwasów nukleinowych, a także końcówek do pipet z filtrem aerozolowym do wszystkich próbek DNA. Jeśli to możliwe, pracuj na stacji roboczej PCR. Wszystkie kroki i odczynniki są w RT (RT), chyba że zaznaczono inaczej.
    1. Aby przygotować wzorcową mieszaninę magnetycznych kulek streptawidyny, należy pobrać pipetę po 100 μl kulek na próbkę do pojedynczej probówki do mikrowirówki. Umieść probówkę na magnesie odpowiednim do probówek do mikrowirówek.
    2. Po tym, jak kulki osiądą po stronie magnesu rurki (~1 min), zdejmij bufor magazynujący, wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś kulki w 500 μl buforu do wiązania i płukania (bufor BW, 5 mM Tris-HCL pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) do umycia.
    3. Umieść probówkę z powrotem na magnesie, usuń supernatant i dodaj 500 μl roztworu kazeiny. Zdjąć magnes, zawiesić ponownie i inkubować przez 10 minut w temperaturze suchej masy, a następnie przemyć buforem BW.
      UWAGA: Mycie odnosi się do umieszczenia rurki na magnesie, usunięcia supernatantu, zdjęcia rurki z magnesu, dodania bufora i ponownego zawieszenia.
    4. Umieść probówkę z powrotem na magnesie, zdejmij supernatant i ponownie zawieś kulki w 500 μl buforu BW. Dodać 50 pmol każdego wychwytującego biotynylowanych oligonukleotydów (patrz tabela 1, w tym przypadku trzy oligonukleotydy) na próbkę. (Na przykład, jeśli ma zostać przetworzonych 5 próbek DNA, należy użyć 500 μl kulek magnetycznych z kroku 2.3.1 i 250 pmol każdego oligonukleotydu).
    5. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, kołysząc się w mikserze typu end-over-end.
    6. Przemyć kulki z unieruchomionymi oligonukleotydami dwukrotnie 500 μL buforu 1x TEN (10 mM Tris HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl).
    7. Zawiesić kulki w 10 μl buforu 1x TEN na próbkę.
    8. Do każdej próbki należy oznaczyć jedną probówkę do mikrowirówek i dodać 10 μl zawiesiny kulek, 170 μl DNA (od kroku 2.1) i 90 μl buforu 3x TEN. Inkubować w suchym bloku grzewczym w temperaturze 92 °C przez 2 minuty w celu denaturacji DNA.
    9. Przenieś probówki do innego bloku suchego ciepła, który jest ustawiony na 52 °C, i inkubuj przez 1 godzinę. Odwróć, aby regularnie mieszać (~ co 10 minut) podczas tej inkubacji.
    10. Przemyć raz 500 μl 1x buforu TEN i ponownie zamieszać w 35 μl H2O bez nukleaz.
    11. Aby wymyć, inkubować probówki w temperaturze 92 °C w suchym bloku grzewczym przez 2 minuty. Następnie szybko przesuń rurki na magnes (po jednej rurce na raz). Gdy koraliki zostaną przywiązane do boku probówki, przenieś supernatant zawierający DNA HIV-1 do nowej probówki.
    12. Opcjonalnie: Powtórz qPCR (jak w kroku 2.2.2) w celu oznaczenia odzyskanego cDNA HIV-1.
      UWAGA: Zobacz dyskusję, aby zapoznać się z oczekiwanymi ilościami.

3. Podwiązanie adaptera

  1. Przygotowanie adaptera
    1. Zawiesić liofilizowany adapter (patrz Tabela 1 "pełny Kwok + MiSeq") przy 100 μM w H2O wolnym od nukleaz.
    2. Na próbkę plus jedną próbkę kontrolną połącz 0,45 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 4 μl adaptera i 0,05 μl H2O. Podgrzewaj do 92 °C przez 2 minuty i pozwól każdemu z nich powoli ostygnąć.
      UWAGA: Jeśli opcja jest dostępna, użyj maszyny do PCR z regulowaną szybkością chłodzenia (użyj szybkości 2%). Trwa to około 30 minut od 92 °C do 16 °C. Alternatywnie użyj suchego bloku grzewczego o temperaturze 92 °C i wyłącz. Wyjmij adapter mastermix, gdy blok grzewczy wróci do RT. Ma to na celu umożliwienie adapterowi uformowania struktury spinki do włosów (patrz Rysunek 2b).
  2. Przygotować reakcję kontrolną z zestawem zsyntetyzowanych oligonukleotydów (patrz Tabela 2) zamiast DNA wyekstrahowanego z komórek.
    1. Zrób zapasy po 100 μM każdego oligonukleotydu. Zmieszać po 1 μl każdego z 17 oligonucelotydów i dodać 8 μlH2O, aby uzyskać stosunek równomolowy w końcowej objętości 25 μl.
    2. Rozcieńczyć mieszaninę w stosunku 1:2,500 w H2O wolnym od nukleaz w seryjnym rozcieńczeniu. Połączyć 1 μl mieszaniny z 17,3 μl H2O bez nukleaz w celu użycia w próbce kontrolnej ligacji w kroku 3.3.1 tak, aby każdy oligonukleotyd był obecny w ilości 1,6 fmol (co odpowiada 0,026 nM w reakcji 60 μl).
  3. Zakładanie podwiązań
    1. W przypadku 60 μl reakcji objętości końcowej w probówkach PCR połącz 6 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 24 μl 40% PEG, 6 μl 5 M betainy, 4,5 μl (400 pmol) adaptera (wyżarzanie wstępne, jak w kroku 3.1.2), 1,2 μl ligazy DNA T4 (2 000 000 jednostek/ml) i 18,3 μl DNA (z kroku 2.3.11)
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność w przypadku lepkich roztworów, takich jak 40% PEG, aby utrzymać dokładne objętości. Nie rób mastermixu.
    2. Przeprowadzić tę samą reakcję, jak w kroku 3.3.1, ale z kontrolną mieszaniną oligonukleotydów przygotowaną w kroku 3.2.2.
    3. Dobrze wymieszać reakcje i inkubować w maszynie do PCR w temperaturze 16 °C przez noc.

4. Demontaż adaptera i separacja rozmiarów

  1. Elektroforeza żelowa denaturująca
    1. Dodać 30 μl buforu ładującego żel DNA zawierający formamid do każdej reakcji ligacji. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
    2. Podgrzewać przez 2 minuty w temperaturze 94 °C w maszynie do PCR, a następnie natychmiast umieścić na lodzie.
    3. Umieść prefabrykowany 6% żel mocznikowo-poliakryloamidowy 6% Tris/boran/EDTA (TBE) (10-dołkowy grzebień) w odpowiednim zbiorniku na żel. Dodaj 1x TBE (89 mM Tris-zasada, 89 mM kwas borowy, 2 mM EDTA) bufor do pracy i uruchom żel przez 20 minut przy stałym napięciu 250 V/max.
    4. Umyj kieszenie żelowe za pomocą buforu bieżącego za pomocą strzykawki i igły 21G.
    5. Załaduj każdą próbkę o objętości 90 μl do trzech dołków (30 μl na studzienkę) i uruchom przez 20 minut (250 V/max), aż ciemnoniebieski czoło barwnika znajdzie się mniej więcej w połowie żelu.
  2. Barwienie i cięcie kwasów nukleinowych z żelu
    1. Przygotuj 3 małe probówki do mikrowirówek (0,5 ml) na próbkę, robiąc otwory w dnie za pomocą igły strzykawkowej 21 G (zachowaj ostrożność podczas pracy z ostrymi narzędziami). Włóż każdą z przygotowanych probówek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml i oznacz je nazwą próbki oraz "niską", "średnią" lub "wysoką".
    2. Wyjmij i podważ kasetę z żelem. Przetnij żel pionowo żyletką, aby obficie wyciąć pasek z 3 dołkami załadowanych próbek. Dodaj pasek żelu do pojemnika z 1x TBE (około 30 ml) i 5 μl barwienia cyjaninowym kwasem nukleinowym. Inkubować przez 3-5 min.
      UWAGA: Etap ekstrakcji żelu jest szczególnie wrażliwy na zanieczyszczenie krzyżowe. Zaleca się stosowanie tylko 1 próbki na żel i używanie oddzielnego, czystego pojemnika do każdego barwienia żelu. Rękawice należy zmienić, jeśli cząsteczki żelu stykają się z palcami w rękawiczkach.
    3. Dokładnie oczyść powierzchnię transiluminatora światła niebieskiego za pomocą ddH2O. Wyjmij kawałek żelu z pojemnika do barwienia i dodaj go do pudełka świetlnego.
    4. Włącz kaseton świetlny i sprawdź poplamione kwasy nukleinowe przez pomarańczowy filtr.
      UWAGA: Adapter zazwyczaj wydaje się przeciążony i działa jako duża "plama" z ligowanym DNA HIV-1 biegnącym powyżej jako smuga.
    5. Za pomocą nowej żyletki odetnij boki żelu, jeśli są obszary, w których nie ma jeszcze załadowanej próbki. Następnie przetnij tuż nad adapterem, aby usunąć adapter i dolne części żelu. Na koniec odetnij samą górę żelu, w tym około 1 mm kieszeni żelowych, które często mają ostry, intensywny sygnał DNA o większej masie cząsteczkowej.
    6. Podzielić pozostały kawałek żelu zawierający próbkę, która zwykle ma rozmiar ~2 x 3 cm, poziomo na trzy równe części: obszary o "niskiej", "średniej" i "wysokiej" masie cząsteczkowej.
      UWAGA: Każdy element będzie teraz traktowany osobno [tj. będą trzy probówki (niska, średnia i wysoka)] na oryginalną próbkę.
    7. Pokrój każdy z trzech fragmentów żelu na mniejsze kawałki (cząstki ~2 x 2 mm) i przenieś je do przygotowanych probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml (krok 4.2.1).
    8. Wiruj z maksymalną prędkością z otwartymi pokrywkami przez 1 minutę, aby wycisnąć kawałki żelu przez otwór do probówki o pojemności 2 ml, aby utworzyć żelową breję. Jeśli na dnie probówki o pojemności 0,5 ml pozostaną jakiekolwiek cząstki żelu, należy je ręcznie przenieść do probówki o pojemności 2 ml za pomocą igły lub końcówki pipety.
  3. Ekstrakcja DNA
    1. Dodać 1 ml buforu ekstrakcyjnego do żelu mocznikowego (0,5 M NH4CH, 3CO2, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) do błota pośniegowego. Obracaj rurki przez co najmniej 3 godziny (dopuszczalna jest noc) w temperaturze pokojowej za pomocą miksera typu end-over-end.
    2. Użyj czystego zestawu pęsety, aby dodać jeden mały okrągły filtr z włókna szklanego do kolumn wirówek z filtrami membranowymi z octanu celulozy (0,2 μm), co pozwala uniknąć zatkania membrany. Umieść filtr na miejscu z odwróconą końcówką pipety.
    3. Krótko odwirować probówki o pojemności 2 ml z błotem pośniegowym i buforem ekstrakcyjnym w mikrowirówce i przenieść 700 μl supernatantu do przygotowanych kolumn filtracyjnych. Utrzymuj żel w postaci błota pośniegowego i pozostałego supernatantu.
    4. Odwirować kolumny filtracyjne w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Przenieść przepływ do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml.
    5. Ponownie załaduj kolumny pozostałym supernatantem. Postaraj się uzyskać jak najwięcej płynu z błota pośniegowego. Przenoszenie kawałków żelu nie stanowi problemu. Ponownie odwirować i połączyć przepływy tych samych próbek ekstrakcyjnych.
  4. Wytrącanie DNA
    1. Dodać 3 μl poliA RNA (1 μg/μL; jako nośnik), 1 μl glikogenu i 0,7 ml izopropanolu do przepływu z kroku 4.3.5. Krótko zwirować i zamrozić w temperaturze -80 °C przez noc.
    2. Próbki należy wyjąć z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostawić do krótkiego rozmrożenia. Umieścić je w schłodzonej (4 °C) mikrowirówce i wirować przez 30 minut na najwyższych obrotach.
    3. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Bądź bardzo ostrożny, aby nie usunąć granulki. Pozostawić od 30 do 50 μl płynu, jeśli nie ma pewności, że w przeciwnym razie osadek zostałby usunięty.
      UWAGA: Zazwyczaj wszystkie "wysokie" próbki wykazują bardziej widoczną osadówkę niż próbki "średnie" i "niskie".
    4. Dodaj 800 μl 80% etanolu. Odwróć rurki i ponownie wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Usuń większość etanolu za pomocą pipety, ponownie krótko zakręć probówkami i usuń więcej etanolu za pomocą pipety o mniejszej objętości.
    5. Pozwól, aby pozostały etanol odparował, umieszczając probówki z otwartą pokrywką w suchym bloku grzewczym o temperaturze 55 °C. Gdy próbki wyschną (2-4 min), dodaj 20 μl H2Obez nukleaz i rozprowadź na dnie probówki, aby upewnić się, że osad DNA jest rozpuszczony. Próbka DNA może być przechowywana w temperaturze -20 °C.

5. Amplifikacja PCR i przygotowanie biblioteki

  1. Przeprowadzić reakcję PCR o objętości 40 μl z 20 μl wstępnego miksu polimerazy DNA, 18 μl wytrąconego i ponownie rozpuszczonego DNA z kroku 4.4.5, 1 μl startera "MP1.0 + 22HIV" (10 μM) (patrz Tabela 1) i 1 μl multipleksowych starterów oligogologicznych (startery indeksowe od 1 do 24) (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Przeprowadź trzy reakcje (niską, średnią, wysoką) każdej próbki w oddzielnych reakcjach PCR, ale z tym samym indeksowanym starterem. Użyj innego indeksu dla każdej z oryginalnych próbek infekcji.
    1. Reakcje PCR należy przeprowadzić w następujących warunkach: 2 minuty przy denaturacji w temperaturze 94 °C, następnie 18 cykli 3-etapowej reakcji PCR; 15 s w temperaturze 94 °C denaturacji, 15 s wyżarzania w temperaturze 55 °C i 30 s przedłużenia w temperaturze 68 °C.
  2. Jako opcja kontroli jakości, analizuj reakcje PCR za pomocą zautomatyzowanego systemu elektroforezy żelowej o wysokiej czułości. Weź 2 μl niskiej, średniej i wysokiej próbki, aby uruchomić zgodnie z instrukcją producenta.
    UWAGA: Oba podkłady powinny być widoczne i często przebiegać na obliczonej długości około 45 i 95 nt (rzeczywista długość jest różna). Dodatkowo DNA powinno być wykrywane w zakresie od 150 do 500 nt. Jeśli nie ma żadnego sygnału, zaleca się dodanie dodatkowych cykli PCR, od 2 do 10 dodatkowych cykli. Nie należy dodawać dodatkowych cykli dla próbek kontrolnych oligonukleotydów utworzonych w kroku 3.3.2.
  3. Aby usunąć startery, użyj paramagnetycznego systemu czyszczenia PCR na bazie kulek.
    1. Pobrać 20 μl każdej reakcji PCR i połączyć próbki razem (w tym momencie wymieszać wszystkie próbki). Pozostałe 20 μl reakcji zamrozić jako kopie zapasowe w temperaturze -20 °C.
    2. Pozwól, aby kulki paramagnetyczne dotarły do RT i wymieszaj połączone reakcje PCR z 1,8-krotnością objętości roztworu kulek. Mieszać pipetując i inkubować przez 5 min.
      UWAGA: Na przykład, jeśli przygotowano 4 próbki, z których każda ma niską, średnią i wysoką reakcję, objętość wynosiłaby 4 x 3 x 20 μL = 240 μL reakcji PCR z 432 μl roztworu kulek.
    3. Umieść probówki na magnesie w probówce do mikrowirówki, pozwól kulkom związać się przez ~1 minutę i zdejmij supernatant do wyrzucenia. Pozostaw rurki na magnesie i dodaj 500 μl 80% etanolu.
    4. Pozostaw etanol na 30 s, a następnie dokładnie zdejmij i pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu przez ~5 minut. Dodaj 40 μl H2Obez nukleaz, zdejmij rurki z magnesu i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół.
    5. Pozostaw zawiesinę na 5 minut. Umieść probówkę z powrotem na magnesie, pozwól kulkom osiąść na bok i przenieś supernatant do nowej probówki. To jest biblioteka. Pobrać 10 μl porcji do kontroli jakości, a resztę zamrozić w temperaturze -20 °C.

6. Ocena biblioteki

  1. Określ jakość, stężenie i molowość biblioteki.
    1. Należy zastosować metodę fluorometrycznej kwantyfikacji. Zmierz 1 μl i 3 μl biblioteki za pomocą zestawu do oznaczania dsDNA o wysokiej czułości zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Typowe stężenia wynoszą od 1 do 10 ng/μl.
    2. Zmierz widmo masy cząsteczkowej DNA z biblioteki za pomocą automatycznej elektroforezy żelowej o wysokiej czułości, jak opisano powyżej (krok 5.2).
    3. Użyj automatycznej analizy elektroforezy żelowej, aby określić średnią masę cząsteczkową biblioteki i obliczyć, aby rozcieńczyć bibliotekę w wolnym od nukleazH2Odo 4 nM. Można połączyć kilka bibliotek, o ile wszystkie indeksy są unikalne.
  2. Opcjonalna kontrola jakości o niskiej przepustowości
    1. Podporządkuj bibliotekę DNA klonowaniu TA19, aby wstawić cząsteczki biblioteki do wektorów w celu amplifikacji. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, wyhoduj ~10-20 kolonii i wyekstrahuj DNA za pomocą protokołów miniprep, jak opisano tutaj20.
    2. Sekwencjonuj wektor przy użyciu lokalnych usług sekwencjonowania i sprawdź, czy wstawki zawierają żądane sekwencje pochodzące z HIV-1 i adaptery specyficzne dla biblioteki.

7. Sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

  1. Utwórz przykładowy arkusz sekwencjonowania za pomocą komercyjnego oprogramowania dostarczonego z platformą sekwencjonowania.
    1. Wskaż wybrany zestaw do sekwencjonowania. Zazwyczaj wybiera się zestaw na 150 cykli, ale inne są odpowiednie w zależności od pożądanej długości odczytu.
    2. Wybierz "Tylko Fastq" jako przepływ pracy aplikacji. Wybierz jeden z szablonów, który zawiera 24 indeksy obecne w zestawach oligonukleotydów multipleksowych (wskazane w instrukcji zestawu).
    3. Wybierz "25 nt" dla Read1 i "125 nt" dla Read2. Zachowaj 6 nt dla pojedynczego indeksu read.
      UWAGA: W analizie wewnętrznej używany jest tylko Read2 w analizie. Utrzymuj Read1 na poziomie co najmniej 25 nt dla celów algorytmu platformy sekwencjonowania.
  2. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby przygotować i skonfigurować bibliotekę przed uruchomieniem. Zdecyduj się na maksymalne stężenie 20 pM i użyj 15% skoku PhiX, ponieważ biblioteka ma bardzo niską złożoność.

8. Analiza danych

  1. Sprawdź, czy procent filtra przepustowego i średni wynik jakości Q30 są dopuszczalne zgodnie z wytycznymi producenta platformy sekwencjonowania.
    UWAGA: Filtr przepustki wynosi zazwyczaj > 90%, a wyniki Q30 zwykle wynoszą > 80%.
  2. Pobierz pliki .fastq.gz z centrum sekwencjonowania producenta.
  3. Konfigurowanie skryptu sekwencjonowania
    1. Utwórz nowy katalog (folder) o nazwie "AnalysisXYZ" i przejdź do https://github.com/malimlab/seqparse, aby pobrać wszystkie pliki kodu źródłowego (parse_sam.pl, rc_extract.pl, parse.sh) do tego katalogu.
    2. Pobierz nakładkę do krótkiego odczytu Bowtie w wersji 1.1.2 z http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml do tego samego katalogu.
    3. Pobranie tworzy podkatalog w "AnalysisXYZ" o nazwie "Bowtie-1.1.2". W tym katalogu otwórz podkatalog "Indeksy" i pobierz dostarczone sekwencje szablonów składające się z 6 plików z rozszerzeniami .ebwt.
    4. Pobierz zestaw narzędzi do wstępnego przetwarzania skrótów FASTQ/A fastx-0.0.13 z http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html do katalogu "AnalysisXYZ".
    5. Pobierz zarówno Samtools (https://sourceforge.net/projects/samtools/files/), jak i bam-readcount (https://github.com/genome/bam-readcount) do katalogu "Dokumenty".
  4. Przenieś pliki .fastq.gz, pobrane w kroku 8.2, wszystkich odczytanych liczb 2 (kończących się na ..._R2_001.fastq.gz) do katalogu "AnalysisXYZ".
  5. Otwórz konsolę poleceń/terminal. Przejdź do "AnalysisXYZ" jako bieżącego katalogu za pomocą poleceń cd. Wpisz "./parse.sh ", aby uruchomić skrypty.
  6. Znajdź pliki .csv z podsumowaniami dla wszystkich próbek pod względem łącznej liczby odczytów, dostosowaną długością liczby odczytów i normalizowaną liczbą odczytów, a także pliki z odmianą podstawową dla każdej próbki w katalogu o nazwie parse_results w katalogu "Analiza XYZ".
    UWAGA: Więcej informacji na temat procesu analizy można znaleźć w dyskusji. Skrypt zwraca pliki csv z łączną liczbą odczytów dla każdego nukleotydu wzdłuż sekwencji silnego zatrzymania HIV-1NL4.3 i transferu pierwszej nici aż do nukleotydu 635. Jako wskazówkę, zwykle obserwuje się od 50 000 do 100 000 unikalnych odczytów w próbkach z infekcji ze wskazaną liczbą komórek i inokulacją wirusową oraz bez białek lub związków przeciwwirusowych. Próbka kontrolna oligonukleotydów zwykle daje od 100 000 do 200 000 odczytów.

Wyniki

Technika opisana w niniejszym artykule została zastosowana w szerszym badaniu mającym na celu wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw inhibicji odwrotnej transkrypcji HIV-1 przez ludzkie białko antyretrowirusowe APOBEC3G (A3G)6. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wyniki uzyskane po zastosowaniu protokołu w próbkach limfocytów T CEM-SS zainfekowanych wirusem HIV-1 z deficytem vif w obecności lub przy braku A3G. Całkowita liczba unikalnych odczytów uzyskanych z każdej próbki po odfiltrowaniu duplikatów PCR posiadających ten sam 6 nt kod kreskowy oraz tę samą długość (wykonane przez dostarczone oprogramowanie analityczne) została przedstawiona na Rysunku 3a. Wzrost poziomu A3G redukuje całkowitą liczbę odczytów, co odzwierciedla hamujący wpływ A3G na syntezę cDNA zapośredniczoną przez RT, opisany i zmierzony wcześniej za pomocą qPCR6,13,21,22. Na Rysunku 3b przedstawiono frakcję cząsteczek o każdej możliwej długości w obrębie pierwszych 182 nt. W przypadku infekcji HIV-1 przy braku A3G najliczniejszym gatunkiem jest sama główna cząsteczka strong-stop o długości 180 nt, z pewną akumulacją odczytów w krótszym zakresie (23 do 40 nt) (wykres górny, histogramy niebieskie). Dodanie A3G zmienia ten profil, gdyż wykrywany jest gwałtowny wzrost liczby krótszych, utrąconych cząsteczek cDNA w kilku bardzo specyficznych, powtarzalnych pozycjach (wykresy środkowy i dolny). Ponieważ A3G jest cytidyno-deaminazą, mutacje cytozyny na urydynę (identyfikowane jako C-to-T) w cDNA występują, gdy A3G jest obecne w zakaźnych wirionach21,23,24. Wykorzystując uzyskane informacje z sekwencjonowania, procent mutacji C-to-T naniesiono na ten sam wykres (czerwona linia przerywana). Należy zauważyć, że profil mutacyjny został wyprowadzony ze wszystkich połączonych unikalnych odczytów, a pokrycie każdego nukleotydu będzie się różnić. Jednakże, jeśli jest to wymagane, informacje o sekwencji mogą zostać powiązane z każdą cząsteczką i skorelowane z konkretnym końcem 3'. Przedstawione dane pochodzą z pracy Pollpeter et al.6, a wykazano, że korelacja między profilami mutacyjnymi a długością cDNA wynika z wykrywania i rozcinania deaminowanego cDNA przez komórkowy aparat naprawy DNA.

Kontrolę pozytywną dla metody mapowania końców 3' można łatwo przygotować, przetwarzając pulę syntetycznych oligonukleotydów o znanej sekwencji, długości i stężeniu. Kontrolę tę dodaje się podczas ligacji adapterów w kroku 3.3.2 i zaleca się jej uwzględnienie we wszystkich bibliotekach multipleksowanych. Dane uzyskane z próbki kontrolnej powinny wykazać wszystkie oligonukleotydy w oczekiwanych stosunkach wejściowych, przy bardzo niskim poziomie odczytów tła. Rycina 4 przedstawia wyniki zestawu kontroli pozytywnej składającego się z 17 chemicznie syntetyzowanych oligonukleotydów (sekwencje podano w Tabeli 2), które zostały zmieszane w stosunkach ekimolarnych. Zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie cząsteczki występują w niemal jednakowej liczebności z jedynie niewielkimi odchyleniami (wykres górny). Podczas gdy większość pozycji w sekwencji DNA -sss, które nie były reprezentowane przez oligonukleotyd, zwraca zerową liczbę odczytów, zaobserwowaliśmy niewielką ilość produktów, które są o 1 lub 2 nt krótsze od rzeczywistych oligonukleotydów kontrolnych. Nie badaliśmy dalej tych produktów pobocznych, przyjmując, że reprezentują one produkty zdegradowane lub niekompletne, które potencjalnie znajdowały się w dostarczonych zapasach oligonukleotydów w momencie zakupu (oligonukleotydy zamówiono jako oczyszczone metodą HPLC, dla których producent wskazał czystość > 80%). Wykres dolny przedstawia próbkę kontrolną z innego przebiegu biblioteki, gdzie zmienność między 17 oligonukleotydami jest nieco większa i koreluje z całkowitą długością – dłuższe cząsteczki kontrolne są wykrywane wydajniej niż krótsze. Może to wynikać z niewielkiego błędu (bias) w reakcjach PCR lub podczas klastrowania w sekwencjonowaniu MiSeq, które posiada optymalną wielkość insertu i może wystąpić w bibliotekach o szczególnie szerokim zakresie wielkości insertów. Podstawowym sposobem na skorygowanie tego błędu jest zastosowanie czynnika normalizacji opartego na nachyleniu linii, która wskazuje błąd korelujący z długością cząsteczki (różowa linia). Wymagane obliczenia są zawarte w programie analitycznym (patrz krok 8.3 w protokole).

figure-results-1
Rycina 1: Schemat przedstawiający pierwsze etapy odwrotnej transkrypcji HIV-1. Proces rozpoczyna się od hybrydyzacji tRNA(Lys,3) (pomarańczowy) z miejscem wiązania startera (PBS) w wirusowym RNA genomicznym (krok 1), co umożliwia inicjację i elongację wirusowego cDNA (niebieski, krok 2). Jednocześnie matrycowe RNA genomiczne jest degradowane przez aktywność RNaseH odwrotnej transkryptazy (RT) (krok 3). Pierwszym pełnym produktem pośrednim w procesie odwrotnej transkrypcji jest cDNA silnego stopu nici minus (-)sss, który powstaje, gdy polimeryzacja katalizowana przez RT osiąga koniec 5' regionu powtórzeń (R) gRNA (krok 3). Pośrednik (-)sss jest przenoszony na koniec 3' matrycy RNA genomicznego poprzez hybrydyzację z komplementarnym regionem R długiego powtórzenia końcowego (LTR) 3'. Stąd polimeryzacja jest kontynuowana (krok 4). W opisanym metodzie postęp odwrotnej transkrypcji jest określany poprzez mapowanie dokładnej długości nowo powstałego wirusowego cDNA (niebieski). PPT, trakt polipurynowy; U5, unikalna sekwencja 5'; U3, unikalna sekwencja 3'. Rycina została przedrukowana z wcześniejszej publikacji6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat przebiegu prac oraz schemat strategii ligacji adapterów i amplifikacji PCR. (a) Schemat przebiegu prac przedstawiający główne etapy opisanej techniki służącej do wyznaczania końców 3' transkryptów odwrotnych HIV-1 w zainfekowanych komórkach. Rysunek został zaadaptowany z wcześniejszej publikacji6. (b) Schemat strategii ligacji adapterów i amplifikacji PCR. Nowo powstałe cząsteczki cDNA o różnej długości, które zostały oczyszczone w poprzednich etapach, są ligowane z jednoniciowym adapterem DNA przy użyciu ligazy T4 DNA. Projekt adaptera w formie spinki do włosów (nazwanego „full Kwok + MiSeq”, patrz Tabela 1) był inspirowany pracami Kwok et al.11. Adapter zawiera losową 6 nt sekwencję kodu kreskowego (barcode), która umożliwia parowanie zasad ułatwiające ligację i jednocześnie służy jako identyfikator dla unikalnych odczytów. Końce 3' adaptera posiadają łącznik (SpC3) w celu zapobiegania samoligacji. Produkty ligacji są oddzielane od nadmiaru adaptera za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (PAGE). Kwasy nukleinowe w żelu są barwione i wycinane w trzech oddzielnych, równych fragmentach żelu w obszarze od poziomu powyżej adaptera do studzienki, zgodnie z metodą opisaną w25. Po elucji, wytrąceniu i resuspensji, produkty są amplifikowane metodą PCR z użyciem starterów przyłączających się do znanej sekwencji adaptera (starter 1, zestaw oligonukleotydów multipleksowych, patrz Tabela materiałów) oraz startera zawierającego pierwsze 22 nt sekwencji 5'-LTR HIV-1 bezpośrednio następującej po tRNA (starter 2, MP1.0 + 22HIV). Końce 5' wybranych starterów zawierają adaptery dla wybranej platformy sekwencjonowania (P5 i P7) oraz sekwencję indeksową w celu rozróżnienia poszczególnych próbek analizowanych w tej samej bibliotece. Oznaczono punkty startowe starterów odczytu sekwencjonowania. Niebieska ramka wskazuje region zainteresowania w celu wyznaczenia oryginalnych końców 3' uchwyconej cząsteczki. Rysunek ten został zaadaptowany z wcześniejszej publikacji6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3Reprezentatywne wyniki. (a) Całkowita liczba odczytów reprezentatywnych próbek przetworzonych zgodnie z opisanym protokołem. Obejmuje to wszystkie sekwencje zidentyfikowane jako unikalne odczyty cząsteczek HIV-1, których końce 3' znajdowały się w obrębie pierwszych 635 nt cDNA nici minus (do PPT, patrz Rycina 1). Zakażenie wirusem HIV-1 nieprzenoszącym A3G daje najwyższą liczbę odczytów, podczas gdy A3G hamuje syntezę cDNA, a tym samym zmniejsza całkowitą liczbę odczytów. Niezakażone komórki posłużyły jako kontrola negatywna, natomiast zestaw syntetycznych oligonukleotydów stanowi kontrolę pozytywną. b) Względna liczebność cDNA dla każdej długości między pozycjami nukleotydowymi 23 a 182 (pełnowymiarowe cDNA sss ma od 180 do 182 nt) HIV-1NL4.3 sekwencja (oś X) jest przedstawiona na niebieskich histogramach (skala na lewej osi Y). Względną obfitość cDNA obliczono, dzieląc bezwzględną liczbę sekwencji kończących się na danym nukleotydzie w obrębie sekwencji cDNA -sss przez sumę wszystkich odczytów o długości 182 nt lub mniejszej. Czerwone linie przerywane przedstawiają procent odczytów z mutacjami C-na-T/U w odpowiedniej pozycji (skala na prawej osi Y)-osie). Rycina 3b zostało przedrukowane z poprzedniej publikacji6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki próbek kontrolnych. Przedstawiono dwa profile dla pul zawierających ekimolowe ilości 17 syntetycznych oligonukleotydów o różnych długościach. Oligonukleotydy te mają sekwencje pochodzące z HIV-1NL4.3 i zostały dobrane tak, aby obejmowały różne długości oraz prezentowały wszystkie 4 zasady jako nukleotyd 3'-końcowy (patrz Tabela 2). Górny wykres przedstawia próbkę kontrolną pozytywną z Rysunku 3a. Nie stwierdzono istotnego odchylenia w zależności od długości cząsteczek lub otwartych końców 3'. Dolny wykres przedstawia inny przebieg sekwencjonowania biblioteki, który spowodował niewielkie odchylenie długości w sekwencjonowaniu. W takim przypadku zaleca się zastosowanie współczynnika normalizacji, który jest wyprowadzony z nachylenia (zaznaczonego na różowo) reprezentującego odchylenie wielkości. Rysunek ten został przedrukowany z wcześniejszej publikacji6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Nazwa oligonukleotyduDługość w ntSekwencjaCelProducent (oczyszczanie)
pełny Kwok + MiSeq615’-PHO-tgaagagcctagtcgctgttcannnnnnctgcccatagagagatcggaagagcacacgtct-SpC3-3’AdapterTechnologie DNA IDT (HPLC)
Przynęta 2xBiotin SS405’-biotyna-cagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggac-biotyna-3’Wzbogacanie hybrydyzacyjneMWG Eurofins (HPLC)
Biotyna 1-16 ss225’-cagtgtggaaaatctctagcag-BiTEG-3’Hybrydyzacyjne wychwytywanieMWG Eurofins (HPLC)
Biotynilowany tRNA + CTG165’-cagtggcgcccgaaca-BITEG-3’Hybrydowe wychwytywanieMWG Eurofins (HPLC)
MP1.0 + 22HIV825’-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctcactgctagagattttccacactg-3’Amplifikacja PCRMWG Eurofins (HPLC

Tabela 1: Tabela oligonukleotydów zawierająca długość, sekwencje oraz modyfikacje wykorzystywane w opisanym protokole. Tabela została opracowana na podstawie wcześniejszej publikacji6. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę jako plik excel.

Nazwa oligonuDługość w ntSekwencjaProducent (Oczyszczanie)
HTP con long C1205’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagc-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con long G1195’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaag-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con long T1165’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggctt-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con long A1185’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaa-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con mid C765’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcac-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con mid G (a)715’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacg-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con mid G (b)725’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgg-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con mid A 695’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacaga-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con mid T855’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactt-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con short A405’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggga-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con short T335’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggt-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con short G415’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggg-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP con short C345’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtc-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP Con 46 (T)465’-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctct-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP Con 83 (C)835’-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactac-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP Con 103 (C)1035’-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagc-3’MWG Eurofins (HPLC)
HTP Con 107 (A)1075’-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagcttta-3’MWG Eurofins (HPLC)

Tabela 2: Tabela 17 syntetycznych oligonukleotydów kontrolnych użytych jako próbka kontrolna dodatnia. Pierwsze 13 oligonukleotydów wybrano na podstawie wielkości [długie (116 do 120 nt), średnie (69 do 85 nt), krótkie (33 do 41 nt)] oraz ich końców 3'. Tabela została opracowana na podstawie wcześniejszej publikacji6.  Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę jako plik excel.

Dyskusja

Dostępność szybkiego, niezawodnego i opłacalnego głębokiego sekwencjonowania zrewolucjonizowała wiele aspektów w dziedzinie nauk przyrodniczych, umożliwiając bardzo szczegółowe analizy oparte na sekwencjonowaniu. Pozostałym wyzwaniem pozostaje innowacyjne zaprojektowanie i stworzenie reprezentatywnych bibliotek sekwencjonowania. W tym miejscu opisujemy protokół wychwytywania powstających cząsteczek cDNA wirusa, w szczególności produktów pośrednich procesu odwrotnej transkrypcji HIV-1.

Najważniejszym krokiem w tej strategii jest podwiązanie adaptera do otwartych końców 3' w sposób ilościowy i bezstronny. Skuteczność ligacji między dwoma końcami ssDNA, zarówno międzycząsteczkowymi, jak i wewnątrzcząsteczkowymi, została zbadana i zoptymalizowana pod kątem różnych zastosowań 11,26,27,28,29. Wybór użycia adaptera spinki do włosów z ligazą DNA T4 w warunkach opisanych w kroku 3.3 jest wynikiem optymalizacji empirycznej, w której oceniliśmy różne ligazy, adaptory i odczynniki do ligacji syntetycznych oligonukleotydów reprezentujących sekwencje HIV-1 (tabela 2) (dane nie pokazane). W tych reakcjach badań in vitro potwierdziliśmy, że ligacja adaptera spinki do włosów za pośrednictwem ligazy DNA T4, jak opisano przez Kwok i wsp. 11, ma bardzo niskie odchylenie i osiąga prawie całkowitą ligację cząsteczek akceptora, gdy adapter jest używany w nadmiarze. Na wydajność ligacji nie miało wpływu dodanie sekwencji nukleotydów, aby adapter był kompatybilny z systemem starterów multipleksowych (patrz rysunek 4). Dla porównania, stwierdziliśmy, że termostabilna ligaza 5'DNA / RNA ("Ligaza A", patrz Tabela materiałów dla dokładnych ligaz porównanych tutaj), która jest zmodyfikowaną ligazą RNA, która została opracowana częściowo w celu poprawy wydajności ligacji z ssDNA jako akceptorem27, była rzeczywiście bardziej skuteczna w ligowaniu dwóch cząsteczek ssDNA niż ligaza RNA ("Ligaza B"), ale miała znaczne odchylenie, z dużymi różnicami w skuteczności ligacji nawet między oligonukleotydami o pojedynczych różnicach długości zasad [tab. 2; HTP con mid G (a) i (b)]. Co więcej, znaleźliśmy tylko minimalne odchylenie w reakcjach z "Ligazą C" w połączeniu z adaptorem przenoszącym losowe 5'-końce (strategia stosowana do kompensacji znanego odchylenia nukleotydowego "Ligazy C"; patrz na przykład Ding i wsp.Jednak ligacje międzycząsteczkowe, w których pośredniczy "ligaza C", były niekompletne, co sprawiało, że system ligazy DNA T4 był lepszym wyborem.

Kilka etapów kontroli jakości w trakcie trwania protokołu oraz włączenie kontroli pozytywnych i ujemnych pozwala na wykrycie potencjalnych problemów przed kontynuacją testu i zapewnia wskazówki dotyczące działań związanych z rozwiązywaniem problemów. Oznaczanie ilościowe qPCR w etapach 2.2.2 i 2.3.12 zapewnia, że ilość materiału wejściowego jest wystarczająca. Typowa liczba kopii cDNA w elucji 200 μl (od kroku 2.1) waha się od około 10 000 do 300 000 na μl. Etap wychwytywania hybrydowego może spowodować pewną utratę całkowitej ilości cDNA HIV-1, ale powinien skutkować silnym wzbogaceniem specyficznego cDNA HIV-1 w stosunku do DNA komórkowego, co można określić przy użyciu odpowiednich starterów do ilościowego określenia genomowego DNA przed i po wzbogaceniu przez qPCR lub poprzez pomiar całkowitego stężenia DNA. Odzyskane cDNA HIV-1 po etapach wychwytywania hybrydowego powinno stanowić co najmniej 10% danych wejściowych. Niski poziom materiału wyjściowego może w przeciwnym razie wyjaśniać udaną kontrolę dodatnią oligonukleotydów (zob. etap 3.3.2), ale tylko ograniczone odczyty uzyskane w próbkach. Niska ogólna liczba odczytów może być również wyjaśniona przeszacowaniem koncentracji w bibliotece z powodu obecności nieistotnych gatunków DNA bez adapterów MiSeq. Skutkowałoby to niską gęstością klastrów i można je poprawić, określając stężenie sekwencji HIV-1 w bibliotece za pomocą qPCR oprócz całkowitej ilości DNA za pomocą testów fluorometrycznych. Ze względu na bardzo czuły charakter metody, należy zachować szczególną ostrożność w celu uniknięcia nawet niskiego poziomu zanieczyszczenia, zarówno z innych próbek (w szczególności z kontrolnych zapasów oligonukleotydów o wysokim stężeniu), jak i ze sprzętu laboratoryjnego. Praca na stanowisku do sterylizacji UV PCR jest pod tym względem korzystna. Zautomatyzowana elektroforeza żelowa w bibliotece końcowej (krok 6.1.2) jest kolejnym środkiem kontroli jakości. Zwykle obserwowany zakres wielkości kwasów nukleinowych wynosi od 150 do 500 nt. Startery, które można wykryć w opcjonalnej kontroli po PCR i przed oczyszczeniem (patrz uwaga w kroku 5.2), powinny być teraz nieobecne. W reprezentatywnym wyniku krzywa intensywności próbki ma pik około 160 do 170 nt i drugi ostrzejszy pik około 320 do 350 nt. Prawdopodobnie odzwierciedla to często obserwowaną większą obfitość zarówno w stosunkowo krótkich (1 do 20 nt długości wkładki) odwrotnych transkrypcjach, jak i pełnometrażowych strong-stop (180 do 182 nt długości insertu) (Figura 3b).

Chociaż przedstawiony protokół i wybrane startery są specyficzne dla wczesnych konstruktów odwrotnej transkrypcji HIV-1, metoda ta ma ogólne zastosowanie w każdym badaniu mającym na celu określenie otwartych 3'-końców DNA. Głównymi modyfikacjami wymaganymi w innych kontekstach będą metoda wychwytywania hybrydowego oraz strategia projektowania podkładów. Na przykład, jeśli cel ma być przystosowany do późnych transkryptów HIV-1, wskazana byłaby większa liczba różnych wychwytujących biotynylowanych oligonukleotydów wyżarzających się na całej długości cDNA, co prawdopodobnie zmniejszy straty na etapie wychwytywania hybrydy. Jak wspomniano we wprowadzeniu, ważne jest, aby wziąć pod uwagę ograniczenia podczas projektowania zakresu, w którym mają być wykrywane 3'-końce, aby uniknąć różnych źródeł odchylenia. Po pierwsze, może wystąpić błąd systematyczny w reakcjach PCR, jeśli matryce z adapterem mają znacznie różną długość. Po drugie, zastosowana tutaj platforma sekwencjonowania (np. MiSeq) ma preferowany zakres długości wkładek dla optymalnego grupowania, a znacznie krótsze i dłuższe produkty mogą nie być sekwencjonowane z taką samą wydajnością. Częściowo można temu zaradzić obliczeniowo, tak jak to zrobiono, obliczając współczynnik korekcyjny dla liniowego odchylenia długości (patrz rysunek 4, dolny wykres). Jeśli jednak obszar, w którym pożądane jest mapowanie 3'-końców, jest długi (> 1000 nt), bardziej wskazane jest podzielenie reakcji za pomocą ligowanych transkryptów i użycie wielu starterów w górę do oceny 3'-końców w sekcjach.

Program analityczny został napisany wewnętrznie w konkretnym celu analizy zarówno ostatniego nukleotydu sekwencji HIV-1 sąsiadującego z ustaloną sekwencją adaptorową, jak i zmienności zasad wszystkich zasad w celu zidentyfikowania wszelkich mutacji. Poszczególne kroki obejmują następujące kroki: po pierwsze, sekwencje adapterów są przycinane za pomocą zestawu narzędzi fastx-0.0.13; Następnie wszystkie sekwencje, które są zduplikowane (co oznacza identyczne sekwencje, w tym kod kreskowy), są usuwane. Wszystkie pozostałe unikalne odczyty są następnie wyrównywane do sekwencji HIV-1 za pomocą muszki (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) z maksymalnym niedopasowaniem ustawionym na trzy podstawy. Sekwencja matrycy składa się z pierwszych 635 nt cDNA HIV-1 (szczep NL4.3), który obejmuje sekwencję -sss i produkt transferu pierwszej nici do ścieżki polipurynowej (U5-R-U3-PPT; patrz rysunek 1). W związku z tym dostarczone oprogramowanie i szablony są bezpośrednio odpowiednie tylko wtedy, gdy metoda jest stosowana do tego samego zastosowania (wykrywanie wczesnych odwrotnych transkryptów HIV-1NL4.3). Konieczne będzie wprowadzenie zmian w przypadku innych sekwencji docelowych. Pozycje 3'-końcówek dla każdego odczytu zostały określone przez pozycję w wyrównaniu. Wywołania bazowe dla każdej pozycji są rejestrowane, a współczynniki mutacji są obliczane na podstawie całkowitego pokrycia każdej zasady, które jest różne, ponieważ odczyty mają różną długość, a długie wstawki mogą nie być w pełni pokryte przez sekwencjonowanie 125 zasad w Read2.

Podsumowując, uważamy, że opisana metoda jest cennym narzędziem dla wielu rodzajów badań. Oczywiste zastosowania obejmują badania mechanizmów leżących u podstaw hamowania odwrotnej transkrypcji przez leki przeciwretrowirusowe lub czynniki restrykcyjne komórkowe. Jednak tylko stosunkowo niewielkie dostosowania powinny być konieczne w celu dostosowania systemu do mapowania 3'-końców w obrębie innych jednoniciowych produktów pośrednich wirusa DNA, które są obecne, na przykład, w replikacji parwowirusa. Co więcej, zasada działania metody, a w szczególności jej zoptymalizowany etap ligacji, może stanowić kluczową część projektu przygotowania biblioteki do charakteryzowania dowolnych rozszerzeń 3'-DNA, w tym elongacji katalizowanych przez komórkowe dwuniciowe polimerazy DNA.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony członków laboratorium Malim, Luisa Apolonii, Jernej Ule i Rebecci Oakey. Autorzy dziękują Mattowi Arno z King's College London Genomic Centre i Debbie Hughes z University College London (UCL), Institute for Neurology Next Generation Sequencing Facility, za pomoc w sekwencjonowaniu MiSeq. Prace były wspierane przez brytyjską Radę ds. Badań Medycznych (G1000196 i MR/M001199/1 do M.M.), Wellcome Trust (106223/Z/14/Z do M.M.), Siódmy Program Ramowy Komisji Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr. PIIF-GA-2012-329679 (do DP) oraz Departament Zdrowia za pośrednictwem nagrody National Institutes for Health Research Comprehensive Biomedical Research Center dla Guy's and St. Thomas' NHS Foundation Trust we współpracy z King's College London i King's College Hospital NHS Foundation Trust.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki 293TATCCCRL-3216
Zmodyfikowane podłoże orła firmy DulbeccoGibco31966-021
Penicylina/StreptomycynaGibco15150-122
Surowica bydlęca płoduGibco10270-106
Inkubator CO2 HeraCell Vios 250iThermo Scientific51030966
Laminar okap przepływowy - CAS BioMAT2WolflabsCAS001-C2R-1800
Naczynie hodowlane z TC 10 mmCorning430167
TrypLE™ Ekspresowy (1x), Stabilny enzym zastępujący trypsynęGibco12605-010
OptiMEM® (Minimalny niezbędny nośnik)Gibco31985-047
HIV-1 NL4-3 Zakaźny klon molekularny (pNL4-3)NIH Program odczynników AIDS114
Polietylenimina (PEI) - MW: 25000PolySciences Inc23966-2rozpuszczony w 1 mg / ml i dostosowany do pH7
RQ1- Filtr Dnazy PromegaM6101
0,22 i mu; mTriple Red LimitedFPE404025
15 ml probówki polipropylenoweCorningCLS430791
SacharozaCalbiochem573113
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (1x)Gibco14190-094
Probówki do ultrawirówekBeckman Coulter344060
UltrawirówkaSorvalWX Ultra SeriesWirnik TH-641
Antygen ELISA Alliance HIV-1 p24zestaw Perkin ElmerNEK050001KT
Komórki CEM-SSNIH Program odczynników na AIDS776
Roswell Park Memorial Institute MediumGibco31870-025
CoStar® Płytki wielodołkowe poddane działaniu TCCorningCLS3513-50EA
Wirówka stołowa: Heraus & trade; Multifuge ™ X3 FRThermo Scientific75004536
TX-1000 Wahadłowy wirnik kubełkowyMikrowirówka Thermo Scientific75003017
: 5424RDNA Eppendorf
(zestaw do krwi i tkanek DNeasy)Qiagen69504
Bez nukleazy H2OAmbionAM9937
BuforCutsmartNew England Biolabs (część enzymu DpnI)R0176S
Enzym restrykcyjny DpnINew England BiolabsR0176S
Oligonukleotydy do qPCRMWG EurofinsN/AHPSF Purification
TaqMan PCR Universal MastermixThermo4304437
LoBind Eppendorf® probówkiEppendorf30108078
Axygen i handel; Końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 1000 μ LFisher ScientificTF-000-R-S
Axygen™ końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 200 μ LFisher ScientificTF-200-R-S
Axygen™ końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 20 μ LFisher ScientificTF-20-R-S
Axygen™ końcówki do pipet z filtrem aerozolowym, 10 μ LFisher ScientificTF-10-R-S
PCR czysty kapturLabCaireModel PCR-62
DynaMag&handel; 2-magnesThermo12321D
Streptawidyna MagneSphere® cząstki paramagnetycznePromegaZ5481
KazeinaThermo Scientific37582
Rotator typu end over end, Rewolwer™ 360°LabnetH5600
Tris-BaseFisher ScientificBP152-5
Kwas solnySigmaH1758-100ML
EDTA sól disodowa dwuwodnaElectran (VWR)443885J
Chlorek soduSigmaS3014
Dri-Block® Analogowa grzałka blokowaTechneUY-36620-13
Probówki do PCR i wypukłe nakrętkiMaszyna do PCR Thermo ScientificAB0266
EppendorfMastercycler® seria
T4 Ligaza DNANew England BiolabsM0202M
40% roztwór glikolu polietylenowego (PEG) w H2O, MW: 8000SigmaP1458-25ML
Betaina roztwór, 5MSigmaB0300-1VL
Bufor ładujący żel II (bufor formamidowy)Thermo ScientificAM8546G
Prefabrykowane żele mocznikowe 6% TBEInvitrogenEC6865BOX
System elektroforezy komórkowejInvitrogen, NovexXCell SureLock™
Roztwór Tris/Boranu/EDTA (10x)Fisher Scientific10031223
Igła 21 G x1 1/2VWR613-2022
SYBR Gold barwnik kwasu nukleinowego (10000x)Life TechnologiesS11494
Dark Reader Nadajnik DR46BFisher ScientificNC9800797
Octan amonuMerck101116
Roztwór SDS 20% (w/v)Biorad161-0418
Filtr probówkowy do wirówekAppleton WoodsBC591
Filtr Włókno szklane Gf/D 10mmWhatman (VWR)512-0427
kwas poliadenylowy (poliA) RNASigma10108626001
Glikogen, klasa biologii molekularnejThermo ScientificR0561
Izopropanol (2-propanol)Fisher Scientific15809665
Etanol, klasa biologii molekularnejFisher Scientific10041814
Accuprime™ Supermix I (premiks polimerazy DNA)Life Technologies12342-010
NEBNext® Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 i 2)New England BiolabsE7335S; E7500S
Tapestation D1000 Taśma ekranowa o wysokiej czułościAgilent Technologies5067- 5584
Odczynniki Tapestation D1000Agilent Technologies5067- 5585
2200 Tapestation - zautomatyzowany system elektroforezy żelowejAgilent TechnologiesG2965AA
Agencourt® AMPure® koraliki XPBeckman CoulterA63880
Qubit™ dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ32851
Qubit™ 2.0 FluorometrInvitrogenQ32866
Topo™ Zestaw do klonowania TAInvitrogen450071
Platforma sekwencjonowania: MiSeq SystemIllumina
Experiment Manager (oprogramowanie do pobierania próbek)IlluminaUwaga: Użyj TruSeq LT jako szablonu
Miseq™ Zestaw odczynników V3 (150 cykli)IlluminaMS-102-3001
Koncentrator sekwencjonowania: BasespaceIlluminahttps://basespace.illumina.com
Ligase A: Termostabilny 5' App DNA/RNA ligazaNEBM0319SNie używany w tym protokole, ale testowany w procesie optymalizacji z wynikami opisanymi w dyskusji.
Ligaza B: Ligaza RNA T4 1NEBM0204Nie stosowana w tym protokole, ale testowana w procesie optymalizacji z wynikami opisanymi w dyskusji.
Ligaza C: CircLigaseEpicentreCL4111KNie jest używany w tym protokole, ale testowany w procesie optymalizacji z wynikami opisanymi w dyskusji.
bez rnazy Zestaw do ekstrakcji całkowitego 5404000060

Bibliografia

  1. Herschhorn, A., Hizi, A. Retroviral reverse transcriptases. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (16), 2717-2747 (2010).
  2. Hu, W. S., Hughes, S. H. HIV-1 reverse transcription. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), (2012).
  3. Levin, J. G., Mitra, M., Mascarenhas, A., Musier-Forsyth, K. Role of HIV-1 nucleocapsid protein in HIV-1 reverse transcription. RNA Biology. 7 (6), 754-774 (2010).
  4. Menendez-Arias, L., Sebastian-Martin, A., Alvarez, M. Viral reverse transcriptases. Virus Research. , (2016).
  5. Telesnitsky, A., Goff, S. P. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
  6. Pollpeter, D., et al. Deep sequencing of HIV-1 reverse transcripts reveals the multifaceted antiviral functions of APOBEC3G. Nature Microbiology. 3 (2), 220-233 (2018).
  7. Frohman, M. A., Dush, M. K., Martin, G. R. Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (23), 8998-9002 (1988).
  8. Liu, X., Gorovsky, M. A. Mapping the 5' and 3' ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE). Nucleic Acids Research. 21 (21), 4954-4960 (1993).
  9. Ince, I. A., Ozcan, K., Vlak, J. M., van Oers, M. M. Temporal classification and mapping of non-polyadenylated transcripts of an invertebrate iridovirus. Journal of General Virology. 94, Pt 1 187-192 (2013).
  10. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
  11. Kwok, C. K., Ding, Y., Sherlock, M. E., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C. A hybridization-based approach for quantitative and low-bias single-stranded DNA ligation. Analytical Biochemistry. 435 (2), 181-186 (2013).
  12. Abram, M. E., Tsiang, M., White, K. L., Callebaut, C., Miller, M. D. A cell-based strategy to assess intrinsic inhibition efficiencies of HIV-1 reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (2), 838-848 (2015).
  13. Bishop, K. N., Verma, M., Kim, E. Y., Wolinsky, S. M., Malim, M. H. APOBEC3G inhibits elongation of HIV-1 reverse transcripts. PLoS Pathogens. 4 (12), 1000231(2008).
  14. Zack, J. A., Haislip, A. M., Krogstad, P., Chen, I. S. Incompletely reverse-transcribed human immunodeficiency virus type 1 genomes in quiescent cells can function as intermediates in the retroviral life cycle. Journal of Virology. 66 (3), 1717-1725 (1992).
  15. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. Journal of Virology. 59 (2), 284-291 (1986).
  16. Shah, V. B., Aiken, C. In vitro uncoating of HIV-1 cores. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
  17. JoVE Science Education Database. Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  18. JoVE Science Education Database. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology: Using a Hemocytometer to Count Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  19. Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
  20. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  21. Mangeat, B., et al. Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts. Nature. 424 (6944), 99-103 (2003).
  22. Gillick, K., et al. Suppression of HIV-1 infection by APOBEC3 proteins in primary human CD4(+) T cells is associated with inhibition of processive reverse transcription as well as excessive cytidine deamination. Journal of Virology. 87 (3), 1508-1517 (2013).
  23. Harris, R. S., et al. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell. 113 (6), 803-809 (2003).
  24. Zhang, H., et al. The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-1 DNA. Nature. 424 (6944), 94-98 (2003).
  25. Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  26. Troutt, A. B., McHeyzer-Williams, M. G., Pulendran, B., Nossal, G. J. Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (20), 9823-9825 (1992).
  27. Zhelkovsky, A. M., McReynolds, L. A. Structure-function analysis of Methanobacterium thermoautotrophicum RNA ligase - engineering a thermostable ATP independent enzyme. BMC Molecular Biology. 13 (24), (2012).
  28. Li, T. W., Weeks, K. M. Structure-independent and quantitative ligation of single-stranded DNA. Analytical Biochemistry. 349 (2), 242-246 (2006).
  29. Gansauge, M. T., et al. Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase. Nucleic Acids Research. 45 (10), 79(2017).
  30. Ding, Y., Kwok, C. K., Tang, Y., Bevilacqua, P. C., Assmann, S. M. Genome-wide profiling of in vivo RNA structure at single-nucleotide resolution using structure-seq. Nature Protocols. 10 (7), 1050-1066 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza nowo powstałego cDNAmapowanie końców 3'wzbogacenie metodą hybrydowego wychwytuligacja adaptorówoczyszczanie żelowegłębokie sekwencjonowanieligaza DNA T4denaturująca elektroforeza żelowarozdzielczość pojedynczego nukleotydu
Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.