Method Article

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

DOI:

10.3791/58731

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), w tym egzosomy, to wyspecjalizowane błoniaste nano-duże pęcherzyki znajdujące się w płynach ustrojowych, które są konstytutywnie uwalniane z wielu typów komórek i odgrywają kluczową rolę w regulacji komunikacji między komórkami i różnorodnych procesów biologicznych. Opisano wiele różnych metod charakteryzacji pojazdów elektrycznych. Jednak większość z tych metod ma tę wadę, że przygotowanie i charakterystyka próbek są bardzo czasochłonne lub niezwykle trudna jest analiza konkretnych markerów będących przedmiotem zainteresowania ze względu na ich mały rozmiar i brak dyskretnych populacji. Chociaż metody analizy EV zostały znacznie ulepszone w ciągu ostatniej dekady, nadal nie ma ustandaryzowanej metody charakteryzowania pojedynczych EV. Tutaj demonstrujemy półautomatyczną metodę charakteryzowania pojedynczych EV za pomocą analizy śledzenia nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawiony protokół rozwiązuje powszechny problem wielu badaczy w tej dziedzinie i zapewnia kompletny przepływ pracy w celu szybkiej izolacji EV i charakterystyki za pomocą PKH67, ogólnego łącznika błony komórkowej, a także specyficznych markerów powierzchniowych, takich jak CD63, CD9, wimentyna i białko błonowe związane z lizosomem 1 (LAMP-1). Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności, potwierdzony innymi metodami, takimi jak Western blotting. W przeprowadzonych eksperymentach użyliśmy wyłącznie EV wyizolowanych z próbek surowicy ludzkiej, ale metoda ta nadaje się również do osocza lub innych płynów ustrojowych i może być dostosowana do charakterystyki EV z supernatantów z hodowli komórkowych. Niezależnie od przyszłego postępu badań nad biologią EV, przedstawiony tutaj protokół zapewnia szybką i niezawodną metodę szybkiej charakterystyki pojedynczych EV z określonymi markerami.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), w tym egzosomy, to wyspecjalizowane błoniaste nano-rozmiarowe pęcherzyki (20-150 nm) zawierające pewne kombinacje lipidów, adhezji i międzykomórkowych cząsteczek sygnałowych, a także inne funkcjonalne składniki cytozolowe, takie jak mikroRNA (miRNA) i mRNA, i odgrywają kluczową rolę w regulacji komunikacji komórka-komórka1,2. EV są uwalniane w swoim środowisku z wielu różnych typów komórek, np. komórek śródbłonka, komórek odpornościowych i komórek nowotworowych, i mogą być wykryte w płynach ustrojowych, takich jak nasienie surowicy, mocz, mleko matki, ślina lub płyn mózgowo-rdzeniowy3,4. Coraz więcej badań podkreśla zróżnicowany wkład EV jako potencjalnych biomarkerów do wczesnej diagnozy wielu chorób i/lub przewidywania postępu choroby5,6. Egzosomy są często opisywane przez obecność cząsteczek, z którymi są specyficznie związane, niezależnie od typu komórki, z której pochodzą7. Na przykład egzosomy zawierają różne tetraspaniny (CD9, CD63, CD81), cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (MHC I), różne białka transbłonowe, typowe białka cytozolowe (tubulina i aktyna), cząsteczki biorące udział w biogenezie ciał wielopęcherzykowych (MVB) (TSG101 i alix), białka szoku cieplnego (HSP 70 i HSP 90) oraz białka uczestniczące w transdukcji sygnału (kinazy białkowe)8.

Opisano wiele różnych metod charakteryzacji EVs9. Najczęstszymi i najbardziej rozpowszechnionymi metodami stosowanymi do analizy EV są cytometria przepływowa10, skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)11. Najbardziej znaną i powszechnie stosowaną metodą biochemicznej charakterystyki zawartości EV jest Western blotting12,13. Podczas gdy SEM i TEM pozwalają na wykrywanie EV w całym spektrum wielkości, bardzo ograniczona identyfikacja specyficznych białek powierzchniowych jest szczególną wadą tych metod. Natomiast cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem do identyfikacji określonych znaczników powierzchniowych EV, ale próg tej metody ogranicza analizę do EV o wielkości większej niż 500 nm. W związku z tym analiza izolowanych EV z detekcją określonych markerów powierzchniowych nie jest obecnie dostępna za pomocą żadnej z tych trzech dobrze znanych metod. Wcześniej opisaliśmy inną bardzo czułą metodę wizualizacji i analizy EV, analizę śledzenia nanocząstek (NTA)14. Krótko mówiąc, metoda ta łączy w sobie dwie różne zasady fizyczne. Po pierwsze, cząstki rozpraszają światło, gdy są naświetlane wiązką laserową, a druga zasada, znana jako ruchy Browna, oznacza, że dyfuzja różnych cząstek w ciekłej zawiesinie jest odwrotnie proporcjonalna do ich wielkości. Półautomatyczny stacjonarny przyrząd do analizy nanocząstek dla próbek cieczy składa się z analizatora śledzenia cząstek z analizą opartą na oprogramowaniu, w której rejestrowane są cyfrowe obrazy rozproszonego światła z pojedynczych cząstek. Cząstki i ruch cząstek są wykrywane przez laserowy mikroskop rozpraszający z kamerą wideo. Wiązka lasera jest zorientowana pionowo, podczas gdy oś optyczna jest pozioma i skupiona w kanale komórkowym wypełnionym próbką. Dane dostarczone przez wykresy rozproszonych plam świetlnych i ich prędkości ruchu umożliwiają określenie całkowitej liczby cząstek i rozkładu wielkości. Po naświetleniu przez laser cząstki rozpraszają światło, które jest rejestrowane przez cyfrową kamerę wideo za pomocą mikroskopu14. Postępem w stosunku do naszej poprzedniej metody jest wprowadzenie filtra odcinającego o długości fali 500 nm (LWP) między laserem (długość fali 488 nm) a kanałem komórkowym, który umożliwia bezpośrednią analizę cząstek znakowanych fluorescencją (rysunek 1). Nasz protokół jest odpowiedzią na powszechne zapotrzebowanie wielu badaczy w tej dziedzinie na szybką charakterystykę pojedynczych pojazdów elektrycznych, np. zgodnie z ich pochodzeniem rodzicielskim. W tym protokole opisujemy pełny proces szybkiego izolowania EV z ludzkiej krwi pełnej i szybkiej charakterystyki określonych markerów za pomocą analizy śledzenia nanocząstek opartej na fluorescencji. EV można wykryć poprzez barwienie za pomocą PKH67, ogólnego łącznika błony komórkowej, a także za pomocą określonych markerów egzosomalnych, np. CD63, CD9 i wimentyny. Nasz protokół jest również odpowiedni dla EDTA i osocza cytrynianowego, a także innych płynów ustrojowych i supernatantów z kultur komórkowych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Instytucjonalna komisja etyczna Uniwersytetu w Düsseldorfie zatwierdziła eksperymenty przedstawione w tej pracy (Numer referencyjny: 3381).

1. Izolacja EV z ludzkiej krwi pełnej

  1. Wyizoluj EV za pomocą roztworu do wytrącania egzosomów.
    1. Zebrać 2 ml ludzkiej krwi pełnej w probówkach do oddzielania surowicy (SST) przez nakłucie dożylne i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT), aż do zakończenia krzepnięcia.
    2. Odwirować SST przy 1 700 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia komórek od surowicy i przenieść 1 ml surowicy do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Odwirować osocze bogatopłytkowe (PRP) o stężeniu 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia płytek krwi i przenieść 100 μl osocza ubogiego w płytki krwi (PPP) do nowej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodać 25 μl roztworu do wytrącania egzosomów (4 części PPP, 1 część roztworu do wytrącania egzosomów) i dokładnie wymieszać. Inkubować próbkę przez 30 minut na lodzie. Trzymaj probówkę w pozycji pionowej i nie obracaj ani nie mieszaj probówki w okresie inkubacji.
    4. Odwirować próbkę o masie 1 500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia EVs. Po odwirowaniu EV pojawiają się jako beżowe lub białe granulki na dnie naczynia. Odessać supernatant i odwirować próbkę o masie 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Usunąć wszelkie ślady płynu i ponownie zawiesić osad w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), często pipetując w górę i w dół. Zawiesinę EV należy przechowywać w temperaturze -80 °C, gdy analiza nie jest wykonywana natychmiast.
      Uwaga: Podczas izolowania EV z osocza, fibrynogen i fibryna mogą utrudniać skuteczną regenerację, a ponowne zawieszenie jest cięższe i zajmuje więcej czasu.
  2. Izoluj pojazdy elektryczne za pomocą ultrawirowania.
    1. Wyjmij wstępnie schłodzony wirnik (TLA-55 o stałym kącie) z lodówki i ostudź ultrawirówkę przed użyciem.
    2. Przenieść 1,25 ml PPP (przygotowanego w kroku 1.1) do odpowiedniej 1,5 ml probówki do ultrawirówki z nakrętką i odwirować próbkę przy 110 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C. Przed rozpoczęciem upewnij się, że obciążenie wirnika jest zrównoważone.
    3. Zdekantować supernatant i umieścić probówkę do góry nogami na ręczniku papierowym na 2 minuty. Ponownie zawiesić osad w 500 μl PBS i odwirować próbkę przy 110 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl PBS.
      Uwaga: Używaj wyłącznie wirników i akcesoriów przeznaczonych do używanej ultrawirówki. Wstępnie przetestuj rurki w wirniku za pomocą wody, ponieważ wytrzymałość rurek może się różnić w zależności od partii.

2. Barwienie próbek

  1. Próbki barwienia za pomocą PKH67.
    1. Przygotować roztwór barwiący, dodając 1 μl etanolowego roztworu barwnika PKH67 do 50 μl rozcieńczalnika C (dołączonego do zestawu) w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i dokładnie wymieszać.
    2. Przenieść 10 μl roztworu barwiącego do 20 μl zawiesiny EV (przygotowanej w kroku 1.1) do probówki reakcyjnej, dokładnie wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    3. Rozcieńczyć 50 μl zabarwionej zawiesiny EV w 2,5 ml wody destylowanej w probówce reakcyjnej o pojemności 15 ml, dokładnie wymieszać i użyć tej końcowej zawiesiny do pomiaru cząstek.
      Uwaga: Bardzo ważne jest, aby używać wody jako rozcieńczalnika do zawiesiny EV, ponieważ inne rozcieńczalniki (np. PBS) mogą pogorszyć pomiar. W przypadku korzystania z przechowywanej zawiesiny EV należy rozmrozić próbki na lodzie i dokładnie wymieszać przed barwieniem.
  2. Barwienie próbek specyficznymi przeciwciałami.
    1. Rozcieńczyć 10-20 μl zawiesiny EV (przygotowanej w kroku 1.1) 50 μl wody destylowanej w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i dokładnie wymieszać.
    2. Dodać 2,5-5 μl specyficznego przeciwciała (tabela 1) do probówki reakcyjnej, dokładnie wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    3. Przenieść 50 μl zabarwionej zawiesiny EV do 2,5-10 ml wody destylowanej (Tabela 1) w probówce reakcyjnej o pojemności 15 ml, dokładnie wymieszać i użyć tej końcowej zawiesiny do pomiaru cząstek.
      Uwaga: W pewnych okolicznościach stężenie zastosowanego przeciwciała musi zostać dostosowane (tabela 1).

3. Przetwarzanie próbek

Uwaga: Podstawy tej metody zostały wcześniej obszernie opisane, a poniżej protokół skupia się na konkretnych krokach potrzebnych do analizy EVs znakowanych fluorescencyjnie14.

  1. Wykonaj procedurę uruchamiania.
    1. Wepchnij filtr fluorescencyjny w ścieżkę optyczną mikroskopu i kamery. Uruchom program i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby uzyskać automatyczną implementację.
    2. Wybierz właściwy numer komórki (Z158_C1149_Fluor) w zakładce "Sprawdzanie komórek" (definicja komórki) do pomiaru fluorescencji. Wybierz pozycję odniesienia dla optyki, aby upewnić się, że laser i mikroskop znajdują się w tej samej ostrości (laser i mikroskop automatycznie przesuwają się do tej pozycji).
    3. Przepłukać kanał komórkowy strzykawką wypełnioną 10 ml wody destylowanej. Upewnij się, że cela pomiarowa jest wolna od pęcherzyków powietrza i nie wstrzykuj pęcherzyków powietrza do systemu.
    4. Przygotować zawiesinę kalibracyjną zawierającą jednolite cząstki polistyrenu znakowane fluorescencyjnie o wielkości 200 nm, które mają na swojej powierzchni grupy karboksylowe. Rozcieńczyć 10 μl cząstek w 990 μl wody destylowanej. Następnie rozcieńczyć 10 μl tego roztworu cząstek w probówce o pojemności 15 ml z 10 ml wody destylowanej, aby uzyskać wymagane stężenie.
    5. Wstrzyknij 2.5 ml rozcieńczonego roztworu cząstek do kanału komórkowego i kliknij "Optymalizuj ostrość", aby dostosować kamerę.
  2. Zmierzyć próbkę.
    1. Przed każdym pomiarem próbki kilkakrotnie przepłukać kanał komórkowy strzykawką wypełnioną 10 ml wody destylowanej. Wstrzyknąć zabarwioną zawiesinę EV (przygotowaną w kroku 2) do kanału komórkowego.
    2. W razie potrzeby dostosuj następujące parametry kamery głównej w zakładce "Cell Check" w oprogramowaniu (Tabela 2). Użyj pozycji odniesienia lub pozycji 0.41193, aby dostosować parametry.
      1. Aby uzyskać czułość, znajdź optymalny zakres czułości, klikając przycisk "Liczba cząstek w funkcji czułości", aby wyświetlić krzywą zmierzonych cząstek na ekran dla różnych poziomów czułości.
        Nuta:
      2. W przypadku migawki dostosuj czas, przez jaki aparat przepuszcza światło w określonym przedziale czasu.
      3. W przypadku parametrów po akwizycji wybierz minimalną jasność 20, minimalny rozmiar 20 nm i maksymalny rozmiar 500 nm do pomiaru.
    3. Zwróć uwagę na liczbę wykrytych cząstek zliczonych w polu widzenia z wyświetlacza. Pasek rozpraszania musi mieścić się w zakresie od zielonego do pomarańczowego (50-300 cząstek). Jeśli pasek rozpraszania jest czerwony, rozproszenie połączy pojedyncze cząstki i są one liczone jako jedna cząstka, co prowadzi do fałszywych wyników. W takim przypadku należy dodatkowo rozcieńczyć próbkę, aby uniknąć nakładania się cząstek lub zmniejszenia czułości.
    4. Kliknij "Sprawdź dryft cząstek przy 0 V" w zakładce "Cell Check" przed rozpoczęciem pomiaru. Jeśli dryft jest większy niż 5 μm/s, poczekaj, aż próbka przestanie płynąć, aby kontynuować pomiar.
      Uwaga: Jeśli dryft jest zbyt duży na początku pomiaru, powtarzane pomiary mogą się różnić i zaawansować wyniki. Ze względu na podstawowe zasady NTA, odpowiedni dryft może mieć wpływ na wyznaczoną wielkość cząstek, obliczoną przez oprogramowanie.
    5. Kliknij "Uruchom akwizycję wideo" w zakładce "Pomiar". Wybierz liczbę eksperymentów (3-5) i opóźnienie czasowe między nimi (0 min).
    6. Określ liczbę pozycji (poszczególnych podobjętości) (11) i liczbę cykli (pomiaru) (10) w każdym położeniu pomiarowym, w którym cząstki powinny być analizowane
    7. Wybierz folder, utwórz nową nazwę pliku i kliknij "OK", aby rozpocząć pomiar.

4. Interpretacja wyników

  1. Wyświetl wyniki i parametry w zakładce "Analiza" po zakończeniu pomiaru. Po analizie przed oczyszczeniem kanału komórkowego należy sprawdzić następujące parametry: średnią liczbę cząstek na pozycję, całkowitą liczbę śledzonych cząstek i stężenie cząstek, szerokość rozkładu cząstek (wartości x10, x50 i x90), wartość średniej i odchylenie standardowe. W razie potrzeby powtórzyć pomiar próbki.
    Uwaga: Wyniki są również zapisywane jako plik .pdf lub .txt.
  2. Kliknij zakładkę "Analiza", aby wyświetlić wykres obliczony po pomiarze, który pokazuje rozkład wykrytych cząstek według wielkości. Kliknij "Wyświetlanie" w zakładce "Analiza" i za pomocą ikon dostosuj i zmień ustawienia wykresu dla poszczególnych wymagań.

5. Walidacja za pomocą wykrywania EV przez Western Blotting

  1. Rozpuścić osad EV (przygotowany w kroku 1) w buforze do lizy i ekstrakcji RIPA, dokładnie odpipetować i inkubować na lodzie przez 30 minut. Odwirować próbkę o sile 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu sklarowania lizatu i przenieść supernatant do nowej probówki.
  2. Zmierz całkowite białko za pomocą zestawu do oznaczania białek Lowry'ego. Rozcieńczyć 1 μl wyizolowanej zawiesiny EV 49 μl buforu RIPA i użyć 5 μl w trzech egzemplarzach do analizy. Rozcieńczyć zawiesinę EV 2x buforem nasycającym Laemmli do końcowego stężenia 2 μg/μL i podgrzewać przez 10 minut w temperaturze 95 °C.
  3. Załaduj 20 μg białka do dołka. Oddziel i przenieś białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i blottingu w zbiorniku zgodnie ze standardowymi protokołami.
  4. Blokować błonę (0,2 μm polifluorku winylidenu) mlekiem krowim w proszku (5%) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubować błonę ze specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi (CD9, CD63 i wimentyna) przez noc w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Przeciwciała pierwszorzędowe stosuje się w rozcieńczeniu 1:1,000.
  5. Przemyć błonę TBST 3x 5 min i inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) (1:20 000 w TBST) przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Przemyć membranę TBST 3x 5 min i wykryć białka metodą chemiluminescencji roztworem substratu o wysokiej czułości w systemie obrazowania.
    Uwaga: Ponieważ antygen CD63 jest intensywnie i zmiennie glikozylowany, masa cząsteczkowa może się różnić, a prążki mogą pojawiać się między 40-65 kDa.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EVs zostały wyizolowane z pełnej krwi i scharakteryzowane analizą śledzenia nanocząstek za pomocą odczynników fluoryzujących. Optymalna czułość pomiaru niebarwionych cząstek została określona na poziomie 70% podczas naszych eksperymentów. Koraliki fluorescencyjne używane do regulacji i kalibracji pomiaru wykazały optymalne ustawienie przy czułości 85% (Rysunek 2A). Pomiędzy czułością od 70% do 90% liczba wykrywanych cząstek gwałtownie wzrastała, podczas gdy dalsze zwiększanie czułości może prowadzić do pogorszenia rozkładu wielkości cząstek, w którym liczba cząstek ponownie spada. Ustawienia kamery wyświetlały ostry obraz (Rysunek 2B), a powtarzane pomiary wykazywały niskie odchylenie standardowe (Rysunek 2C). W związku z tym protokół przetwarzania próbek EV został dostosowany tak, aby wszystkie pomiary mogły być przeprowadzane przy tych samych ustawieniach (tabela 2). Szerokość rozkładu jest definiowana przez trzy wartości na osi x: x10, x50 i x90. x50, czyli mediana wielkości cząstek, to średnica, przy której połowa populacji znajduje się poniżej tej wartości. Podobnie, x10 i x90 wskazują średnicę, przy której 10% i 90% wykrytych cząstek znajduje się poniżej podanego rozmiaru. Barwienie za pomocą zestawu łączników komórek PKH67, w tym fluorescencyjnego łącznika komórek, który zawiera zielony barwnik fluorescencyjny z długimi alifatycznymi ogonami do lipidowych regionów błony komórkowej, wykazało silną korelację między czułością a liczbą mierzonych cząstek (Rysunek 3A). PKH67 jest często używany do monitorowania proliferacji, ale okazał się również przydatny do monitorowania wychwytu egzosomów lub liposomów, a także do transportu komórek in vivo. Ze względu na niespecyficzne oznakowanie PKH67, można etykietować i wykrywać szeroką gamę pojazdów elektrycznych. Rozkład cząstek mieścił się w zakresie od 266 nm (x10) do 1946 nm (x90) z maksimum przy 857 nm (x50) i z niskim odchyleniem standardowym między pomiarami (28,1 nm). LAMP-1, znana również jako glikoproteina błonowa 1 związana z lizosomami i CD107a, znajdują się głównie w błonach lizosomalnych. Po barwieniu specyficznym przeciwciałem przeciwko LAMP-1 znakowanym Alexa Fluor 488, rozkład cząstek waha się od 220 nm (x10) do 1145 nm (x90) z maksimum szczytowym przy 541 nm (x50) i odchyleniem standardowym 11,7 nm (Rysunek 3B). Do scharakteryzowania EV użyliśmy przeciwciał znakowanych Alexa Fluor 488 przeciwko powszechnym markerom egzosomalnym i potwierdziliśmy nasze odkrycia za pomocą Western blot. Po barwieniu przeciwciałem CD9 znakowanym Alexa Fluor 488, rozkład cząstek waha się od 251 nm (x10) do 1139 nm (x90) z maksimum piku przy 548 nm i drugim mniejszym piku przy około 25 nm (Rysunek 4A). Barwienie za pomocą Alexa Fluor 488 oznaczonego CD63 (Rysunek 4B) i wimentyny (Rysunek 4C) dało podobne wyniki. Analiza Western blot potwierdziła nasz pozytywny wynik dla zastosowanych tutaj przeciwciał. Wielokrotne pomiary wykazały powtarzalne wyniki dla wszystkich przeciwciał użytych w tym raporcie. Jako grupa kontrolna zabarwiliśmy wodę pozbawioną pęcherzyków odpowiednimi przeciwciałami (Figura 5A), gdzie przeciwciała PKH67 i LAMP1 praktycznie nie wykryły EV do czułości bliskiej 100%. Posługując się przykładem wimentyny, wysoka czułość zwiększyła liczbę pojawiających się artefaktów, nawet jeśli próbka jest zasadniczo wolna od cząstek. Jeśli pomiar rozpoczyna się, gdy dryft jest jeszcze zbyt wysoki (> 5 μm/s), poszczególne powtórzenia wyraźnie różnią się między sobą (Rysunek 5B). Podobnie jak w przypadku trzech różnych przeciwciał, ważne jest, aby dryft był jak najmniejszy przed rozpoczęciem pomiaru. Zgodnie z naszym doświadczeniem, użycie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) jako fluorochromu powoduje, że pomiary nie są dokładne i powtarzalne, ponieważ FITC jest podatny na szybkie wybielanie zdjęć (Rysunek 5C). Dlatego zalecamy stosowanie wyłącznie przeciwciał znakowanych Alexa Fluor 488 do charakterystyki EV. W tym protokole EV wyizolowano za pomocą roztworu wytrącającego egzosomy na bazie polimeru zawierającego glikol polietylenowy. Aby upewnić się, że nasze wyniki nie zostaną zafałszowane przez zastosowaną metodę izolacji, scharakteryzowaliśmy EV po izolacji za pomocą ultrawirowania. Jak przedstawiono w przypadku PKH67 i dwóch różnych przeciwciał (CD63 i LAMP-1), wyniki zastosowanej przez nas izolacji roztworem do wytrącania egzosomów (Rysunek 6A) są porównywalne z EV wyizolowanymi za pomocą ultrawirowania ( Figura 6B). Niestety, ze względu na słabą wydajność EV po ultrawirowaniu, początkowy zestaw surowicy do izolacji musi być wyraźnie wyższy w porównaniu z izolacją roztworem do wytrącania egzosomów.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny układ analizy śledzenia nanocząstek. Oś mikroskopu/wideo i wiązka laserowa są zorientowane prostopadle do siebie, krzyżując się w przekroju poprzecznym kanału komórkowego. Filtr fluorescencyjny umieszcza się między kanałem komórkowym a mikroskopem. Światło rozproszone przez cząstki jest wyświetlane w oknie "podglądu na żywo" oprogramowania. Po akwizycji wyniki są wyświetlane jako układ współrzędnych krzywej rozkładu rozmiaru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Kalibracja za pomocą kulek znakowanych fluorescencyjnie. (A) Krzywa liczby cząstek w funkcji czułości wyświetla cząstki w jednej pozycji w jednym momencie podczas automatycznego skanowania czułości. (B) Wizualizacja cząstek na ekranie podglądu na żywo. (C) Rozkład wielkości cząstek po wielokrotnych pomiarach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki po barwieniu za pomocą PKH67 i LAMP-1. Liczba cząstek w funkcji krzywej czułości (1), wizualizacja cząstek na ekranie podglądu na żywo (2) oraz rozkład wielkości cząstek (3) po barwieniu za pomocą PKH67 (A) i LAMP-1 (B). Obserwuje się podobny rozkład wielkości cząstek, natomiast zmiany w ustawieniu czułości prowadzą do podobnej, ale jeszcze nie do końca identycznej zmiany wykrywanych cząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki po barwieniu Alexa Fluor 488 oznaczonym CD9, CD63 i wimentyną. Liczba cząstek w funkcji krzywej czułości (1), wizualizacja cząstek na ekranie podglądu na żywo (2), rozkład wielkości cząstek (3) i reprezentatywne Western blot dwóch różnych zawiesin EV (4) dla CD9 (24-27 kDa, A), CD63 (26 kDa, B) i wimentyny (54 kDa, C). Późne występowanie sygnałów cząstek wzdłuż rosnącej czułości (oś x) koreluje z niższą intensywnością sygnału w analizie Western blot, potwierdzając niższą ilość odpowiedniego znacznika powierzchni cząstek (np. wimentyna vs. CD63). Zwróć uwagę na prawie identyczne krzywe reprezentatywnych pomiarów dla wszystkich analizowanych markerów, co wskazuje na wysoką odtwarzalność (3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki dla zastosowanych kontrolek i możliwych źródeł błędów. (A) Woda bez pęcherzyków zabarwiona PKH67 (1), LAMP-1 (2) i wimentyną (3) jako kontrole. (B) Reprezentatywne rozkłady wielkości cząstek po barwieniu LAMP-1 (1), CD63 (2) i CD9 (3) oraz pomiary wykonane, gdy dryft zawiesiny jest jeszcze zbyt wysoki. (C) Liczba cząstek w funkcji krzywej czułości (1) i rozkład wielkości cząstek (2) po barwieniu przeciwciałem CD63 znakowanym FITC. Po każdym pomiarze obserwuje się wyraźny efekt wybielania, co skutkuje stopniowo obniżającą się liczbą cząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Porównanie różnych metod izolacji pojazdów elektrycznych. Rozkład wielkości cząstek EV wyizolowanych roztworem wytrącającym egzosomy (A) i ultrawirowaniem (B) po barwieniu PKH67 (1), LAMP-1 (2) i CD63 (3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział
LAMPA-1Płyta CD9Płyta CD63Vimentin
Przeciwciało (μL)52,5-52,5-55
Zawieszenie EV (μL)10201010
H2O (μL) do barwienia50505050
Objętość końcowa (ml)5-102,5-5510

Tabela 1: Lista użytych przeciwciał i zakres rozcieńczeń próbek.

Rozdział szt. Rozdział
Parametry akwizycji
Czułość (%)Rozdział 85
okiennica70
Min. Jasność20
Max. Rozmiar (nm)500
Min. Rozmiar (nm)20
biegunowośćMinus
napięcieod
Dryft cząstek przy 0 V (μm/s)< 5
Pozycji11
Cykli10
Wielokrotne przejęcia3-5
Opóźnienie czasowe (min)0

Tabela 2: Parametry akwizycji do analizy śledzenia nanocząstek.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstrujemy szczegółowy protokół izolacji EV z krwi pełnej i szybkiej charakterystyki specyficznych markerów powierzchniowych za pomocą analizy śledzenia nanocząstek opartej na fluorescencji. W przeprowadzonych eksperymentach użyliśmy wyłącznie EV wyizolowanych z próbek surowicy, ale metoda ta jest również odpowiednia dla kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i osocza cytrynowego, a także może być rozszerzona na inne płyny ustrojowe, takie jak mocz, mleko matki, ślina, płyn mózgowo-rdzeniowy i nasienie. Co więcej, protokół ten można dostosować do charakterystyki EV z supernatantów z hodowli komórkowych. W tym protokole zawiesinę EV wygenerowano ze 100 μl surowicy przy użyciu odczynnika do wytrącania egzosomów, który zawiera zastrzeżony polimer, który delikatnie wytrąca egzosomy i EV zgodnie z wielkością krwinki w zakresie od 30 nm do 200 nm, przy czym 10-20 μl EV wyznaczono do scharakteryzowania każdego markera powierzchniowego. Niestety, etap izolacji jest nieunikniony, ponieważ duża ilość białka w próbkach surowicy (np . albuminy i globuliny) zakłóca procedurę barwienia przeciwciał i skutkuje wysokim poziomem tła i wyrafinowanymi wynikami. Ponadto, w oparciu o biologiczną dostępność egzosomów w próbkach, ilość zastosowanej zawiesiny EV, jak również rozcieńczenie przed przetwarzaniem muszą być dostosowane do innych materiałów źródłowych. Aby porównać wiele próbek, konieczne jest ustandaryzowane podejście do rozcieńczania próbek, a także spójne parametry akwizycji (czułość, migawka itp.). Kolejną ważną kwestią jest to, że pomiary nie rozpoczynają się, dopóki dryft nie jest niski (w naszych rękach < 5 μm/s). Jeśli dryft był zbyt wysoki, wielokrotne pomiary próbki dawały wysokie odchylenie standardowe między sobą, ale przy niskim dryfcie uzyskane dane były wysoce spójne i potwierdzały wysoki poziom odtwarzalności. Ważne jest, aby wybrane przeciwciała miały odpowiedni fluorochrom. Przeciwciała muszą być sprzężone z Alexa Fluor 488, ponieważ FITC ma wysoki wskaźnik fotowybielania. Być może bardziej stabilne fluofory z pewnością doprowadzą do zwiększenia stabilności testu w przyszłości. Zwykle wielu badaczy używa PBS jako rozcieńczalnika do EV. W tym protokole kluczowe znaczenie ma użycie wody destylowanej jako rozcieńczalnika do zawiesin EV. Gdy EV są znakowane barwnikami fluorescencyjnymi, wysoka osmolalność i stężenie jonów innych rozcieńczalników, takich jak PBS, może zakłócać pomiar i prowadzić do zmiany wyników.

Chociaż metody analizy EV zostały znacznie ulepszone w ciągu ostatniej dekady, nadal nie ma znormalizowanej metody izolacji i charakterystyki EV. Główną wadą cytometrii przepływowej, w której EV są często związane z kulkami, aby zapewnić większą powierzchnię, jest to, że wiele EV dokuje do powierzchni, aby zapewnić silny i wykrywalny sygnał10. SEM i TEM mają tę wadę, że przygotowanie próbek jest czasochłonne, a EV można odróżnić tylko na podstawie ich wielkości i morfologii11. Do tej pory najbardziej ugruntowaną i powszechnie stosowaną metodą jakościowej (tj. biochemicznej) charakterystyki EV jest Western blotting, w którym białka mogą być analizowane za pomocą specyficznych przeciwciał12,13. Wady wszystkich tych metod polegają jednak na braku możliwości analizy pojedynczych EV dla określonych znaczników powierzchniowych. Co więcej, długie czasy przetwarzania i długie procedury mycia/izolacji stosowane w wielu obecnych protokołach obejmują pracochłonne etapy, co sprawia, że nie nadają się one do wysokiej przepustowości próbek i charakterystyki pojedynczych EV. Nasz protokół zapewnia kompletny przepływ pracy do szybkiej izolacji i charakteryzacji pojedynczych EV z określonymi znacznikami powierzchni, takimi jak CD63, CD9, wimentyny i CD107a, i może być rozszerzony o szerokie spektrum innych markerów powierzchniowych w celu określenia pochodzenia uwolnionych EVs. Ze względu na ciągły postęp techniczny urządzenia NTA, potwierdziliśmy nasze ustalenia we współpracy z producentem najnowszym analizatorem. Niezależnie od przyszłego postępu badań nad biologią EV, w szczególności w odniesieniu do egzosomów, przedstawiony tutaj protokół zapewni szybką i wiarygodną metodę charakterystyki pojedynczych EV ze specyficznymi markerami. Ponieważ agregacja EV podczas procedury izolacji i barwienia jest jak dotąd nieunikniona, przyszłe badania powinny skupić się na opracowaniu metod zapobiegających agregacji EV i umożliwiających dokładne określenie wielkości EV znakowanych fluorescencyjnie.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Particle Metrix GmbH za częściowe pokrycie kosztów publikacji tej pracy.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówka do separacji surowicyBD366882BD Vacutainer
Ampuwa wodaFresenius Kabi10060
Sulbecco's soli fizjologicznej buforowanej fosforanamiSigma56064C
Falcon probówka, 15 mlGreiner Bio One188271
Falcon, 50 mlMikrowirówka Greiner Bio One227270
probówka, 1,5 mlEppendorf30120086Specjalistyczne probówki do ultra wirowania
Probówka z nakrętką zatrzaskową 1,5 mlBeckman Coulter357448
Polybeads Mikrosfery 0,2 i mikro; mPolysciences, Inc.7304Roztwór wyrównujący
Fluoresbrite YG Karboksylan Mikrosfery Koraliki 0,2 i mikro; mPolysciences, Inc.09834-10z roztworem wyrównującym
, 2 mlBraun4606027V
, 10 mlBraun4606728V
ExoquickSBIEXOQ20A-1EV roztwór do wytrącania
Bufor do próbek Laemmli (2x)1610737
BioRad DC IITest prteinowyBioRad5000112
PKH67 Zestaw łącznika komórek zielonej fluorescencjiSigmaPKH67GL-1KTDo ogólnego znakowania błon
Alexa Fluor 488 anty-ludzkie przeciwciało CD107aBioLegend328609Białko błonowe związane z lizosomami-1 (LAMP-1)
Ludzkie CD9-Alexa Fluor 488R& Systemy DFAB1880G
przeciwciało anty-CD9SBIEXOAB-CD9A-1
CD63-Alexa Fluor 488ThermoFisherMA5-18149
FITC przeciwciało anty-ludzkie CD63BioLegend353005
CD63. Przeciwciało, poliklonalneSantaCruzSc-15363
Alexa Fluor 488 Przeciwciało anty-wimentynoweBioLegend677809
Przeciwciało anty-wimentynoweSBIEXOAB-VMTN-1
Kozia anty mysie IgG + IgMJackson Immuno315-035-048
Koza anty królik IgGDianova111-035-003
SuperSignal West Femto Maksymalna czułość PodłożeThermoFisher34094
ZetaViewParticle MetrixPMX 100, typ
WirówkaEppendorf5804R
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima MAX-XP
TermoluminescencjaHealthcareAmersham Imager 600
Strzykawka Strzykawka Zestaw do oznaczania białek Lowry'ego, GE

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ibrahim, A., Marban, E. Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology. Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).
  2. Su, S. A., et al. Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling. Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).
  3. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9, 9(2011).
  4. Li, M., et al. Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers. Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  5. Lin, J., et al. Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis. The Scientific World Journal. 2015, 657086(2015).
  6. Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. Exosomes: the future of biomarkers in medicine. Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).
  7. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  8. De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203(2015).
  9. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
  10. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  11. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
  12. Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes. Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).
  13. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).
  14. Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments. (95), 50974(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesNanoparticle Tracking AnalysisFluorescence based CharacterizationSingle EV AnalysisHuman Blood EVsPKH67 StainingCD63 CD9 MarkersLAMP 1 VimentinSerum Isolation ProtocolFluorescent Bead Calibration

Related Articles