Artykuł metodologiczny

Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

DOI:

10.3791/58735

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, 3Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy użycie ilościowego immunoblottingu do walidacji histologii immunofluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu jako sposobu ilościowego oznaczania interesującego białka w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE). Nasze wyniki wskazują na przydatność histologii immunofluorescencyjnej do ustalania względnej ilości białek biomarkerowych w rutynowych próbkach biopsji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja interesujących białek w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) jest ważna w zastosowaniach klinicznych i badawczych. Optymalna metoda oznaczania ilościowego jest dokładna, ma szeroki liniowy zakres dynamiczny i utrzymuje integralność strukturalną próbki, aby umożliwić identyfikację poszczególnych typów komórek. Obecne metody, takie jak immunohistochemia (IHC), spektrometria mas i immunoblotting, nie spełniają tych wymagań ze względu na ich kategoryczny charakter lub konieczność homogenizacji próbki. Jako alternatywną metodę proponujemy zastosowanie immunofluorescencji (IF) i analizy obrazu w celu określenia względnej obfitości białka będącego przedmiotem zainteresowania w tkankach FFPE. W tym miejscu pokazujemy, że metoda ta jest łatwa do optymalizacji, daje szeroki zakres dynamiki i jest liniowo kwantyfikowalna w porównaniu ze złotym standardem ilościowego immunoblottingu. Ponadto metoda ta pozwala na zachowanie integralności strukturalnej próbki i pozwala na rozróżnienie różnych typów komórek, co może mieć kluczowe znaczenie w zastosowaniach diagnostycznych. Ogólnie rzecz biorąc, jest to solidna metoda względnej kwantyfikacji białek w próbkach FFPE i może być łatwo dostosowana do potrzeb klinicznych lub badawczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potrzeba ilościowego oznaczania białek w próbkach biopsji tkanek z użyciem utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (FFPE) istnieje w wielu dziedzinach klinicznych. Na przykład, kwantyfikacja białek biomarkerów w rutynowych próbkach biopsyjnych jest wykorzystywana do wyjaśnienia rokowania i informowania o leczeniu pacjentów z rakiem1. Jednak obecne metody są zazwyczaj subiektywne i nie mają walidacji.

Immunohistochemia (IHC) jest rutynowo stosowana w laboratoriach patologicznych i zazwyczaj zależy od pierwszorzędowego przeciwciała skierowanego na docelowe białko i drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z etykietą enzymatyczną, taką jak peroksydaza chrzanowa2. Konwencjonalny IHC jest czuły, może wykorzystywać drobne próbki i zachowuje integralność morfologiczną próbek tkanek, umożliwiając w ten sposób ocenę ekspresji białka w odpowiednim kontekście histologicznym. Ponieważ jednak sygnał chromogeniczny generowany przez IHC jest subtraktywny, cierpi z powodu stosunkowo wąskiego zakresu dynamiki i oferuje ograniczony potencjał multipleksowania2,3,4. Obrazowanie metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MSI) zachowuje integralność morfologiczną. Jednak ta rozwijająca się technologia wiąże się ze skromną rozdzielczością morfologiczną i wymaga znacznej kalibracji i normalizacji, co pogarsza jej wykonalność do rutynowego użytku klinicznego5,6,7. Alternatywne techniki ilościowego oznaczania białka w próbkach tkanek obejmują immunoblotting8, spektrometria mas9,10,11 oraz test immunoenzymatyczny (ELISA)12, z których każdy rozpoczyna się od homogenizowanego lizatu próbki tkanki. Pierwotne próbki tkanek są niejednorodne, ponieważ zawierają wiele typów komórek. W związku z tym techniki, które pociągają za sobą homogenizację próbek, nie pozwalają na ilościowe określenie białka w określonej populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak komórki rakowe.

Podobnie jak IHC, IF ma zastosowanie do małych próbek FFPE i pozwala na zachowanie integralności histologicznej13. Jednak dzięki addytywnemu charakterowi sygnałów fluorescencyjnych, IF jest podatny na stosowanie wielu przeciwciał pierwszorzędowych i znaczników fluorescencyjnych. W związku z tym białko będące przedmiotem zainteresowania może być względnie określone ilościowo w określonych komórkach lub przedziałach komórkowych (na przykład jądro kontra cytoplazma) zdefiniowanych przy użyciu innych przeciwciał. Sygnały fluorescencyjne mają również tę zaletę, że mają większy zakres dynamiki13,14. Wykazano wyższość, odtwarzalność i potencjał multipleksowania IF zastosowanego do próbek FFPE13,14,15.

Tutaj opisujemy użycie ilościowego immunoblottingu przy użyciu ustalonych linii komórkowych jako złotego standardu do ustalenia ilościowego charakteru IF w połączeniu z komputerowo wspomaganą analizą obrazu w określaniu względnej obfitości interesującego białka w histologicznych skrawkach z próbek tkanek FFPE. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę w podejściu multipleksowym do ilościowego oznaczania białek biomarkerów w próbkach biopsji klinicznej16,17,18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodę na użycie pierwotnych próbek tkanek ludzkich uzyskano od Rady Etyki Badań Nauk o Zdrowiu i Stowarzyszonych Szpitali Klinicznych (HSREB) na Queen's University.

1. Budowa mikromacierzy tkankowej linii komórkowej (TMA)

  1. Zbierz i umyj komórki.
    UWAGA: Protokół ten został przetestowany na różnych uwiecznionych liniach komórkowych (np. HeLa, Jurkat, RCH-ACV).
    1. W przypadku komórek przylegających zbierz około 1,3 x 107 komórek, gdy osiągną około 80% konfluencji. Odłącz komórki za pomocą odczynnika odpowiedniego dla tej linii komórkowej.
      UWAGA: Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) jest ogólnie preferowany w stosunku do trypsyny w celu zmniejszenia ryzyka degradacji białek powierzchniowych. Jeśli używasz trypsyny, zneutralizuj trypsynę za pomocą płodowej surowicy bydlęcej (FBS) natychmiast po pobraniu komórek.
    2. W przypadku komórek zawiesinowych należy zebrać około 8 x 107 komórek w fazie logarytmicznej wzrostu.
    3. Zebrać zebrane/oderwane komórki, wirując przez 5 minut przy 225 x g w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    4. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Wirować przez 5 minut przy 225 x g i zdekantować supernatant.
      UWAGA: 1X PBS składa się z 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 w wodzie destylowanej; dostosować pH do 7,4.
  2. Umocuj komórki w formalinie i zapakuj je.
    1. Zawiesić osad komórkowy w stożkowej probówce w 10 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF).
      UWAGA: NBF można przygotować, rozcieńczając 1 ml 37% roztworu podstawowego formaldehydu w 9 ml 1X PBS.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z formaliną i formaldehydem. Użyj dygestorium do kroków związanych z formaliną i formaldehydem.
    2. Inkubować komórki na kołysku z prędkością 24 obr./min w temperaturze pokojowej przez noc (około 17 godzin).
    3. Przygotować 1% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w PBS (0,01 g agarozy na 1 ml PBS).
      1. Przygotować wystarczającą ilość na 500 μl roztworu agarozy na próbkę linii komórkowej.
      2. Rozpuścić agarozę w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C lub bloku grzewczym, od czasu do czasu mieszając przez 2-5 minut. Po rozpuszczeniu roztwór należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub bloku grzewczym, aby zapobiec stwardnieniu.
    4. Osadzać utrwalone komórki z kroku 1.2.2 przez odwirowywanie przez 5 minut przy 225 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl 1x PBS.
    5. Przenieść komórki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i osadzać przez odwirowywanie przez 5 minut przy 290 x g. Odessać cały supernatant.
  3. Odlać komórki w agarozie.
    1. Dodać ~500 μl 1% roztworu agarozy (z kroku 1.2.3) do każdej probówki zawierającej komórki. Delikatnie, ale szybko, pipetuj mieszaninę w górę i w dół za pomocą mikropipety P-1000 do mieszania.
      UWAGA: Odetnij koniec końcówki pipety, aby powiększyć otwór i uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Roztwór agarozy roboczej należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec stwardnieniu.
    2. Pozostawić roztwór agarozy do stwardnienia (5-10 min) w temperaturze pokojowej. Dodać 1 ml 10% NBF do każdej probówki mikrowirówki zawierającej próbkę i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu zatopienia parafiny (do 24 godzin).
  4. Przygotuj korek agarozowy do zatopienia w parafinie.
    1. Odessać NBF z próbki.
    2. Wyjmij zatyczkę komórkową za pomocą żyletki, aby przeciąć probówkę mikrowirówki, umieść zatyczkę w plastikowej kasecie na chusteczki. Kasety należy przechowywać w 10% NBF w temperaturze pokojowej.
  5. Próbki należy przetwarzać przez noc ręcznie lub za pomocą automatycznego procesora tkanek i zatapiać w wosku parafinowym przy użyciu standardowych metod histologicznych.
    UWAGA: Patrz Fischer i wsp. 19 dla przykładowego protokołu.
  6. Za pomocą specjalistycznego przyrządu do tworzenia matryc tkankowych należy pobrać zduplikowane rdzenie o średnicy 0,6 mm z bloku parafinowego z każdej linii komórkowej i umieścić je w rzędach w pustym bloku parafiny biorcy w celu utworzenia linii komórkowej TMA.
    UWAGA: Należy stosować standardowe metody, takie jak te opisane w Fedor i De Marzo20.
  7. Włączyć rdzenie z próbek pierwotnych reprezentujących 2-3 dodatkowe typy tkanek (np. migdałki, okrężnicę, jądra itp.) jako kontrole dodatnie lub ujemne do TMA. Wybierz tkanki, które są odpowiednie dla interesującego Cię białka.
  8. Za pomocą mikrotomu przygotować dwa skrawki histologiczne linii komórkowej TMA o grubości około 4 do 6 μm. Zamontuj wycinek na szkiełku histologicznym, wysusz go i odparafinowaj (zgodnie z opisem w Fedor i De Marzo20).

2. Barwienie próbki metodą immunofluorescencji

  1. Zoptymalizuj rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego.
    UWAGA: Istnieją standardowe protokoły optymalizacji IHC lub IF dla skrawków tkanek FFPE, takich jak w Kajimura i wsp.21. Krótki opis tego podejścia znajduje się tutaj.
    1. Przygotuj 4-5 rozcieńczeń pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białemu będącemu przedmiotem zainteresowania, kierując się instrukcjami producenta.
    2. Zidentyfikuj typ tkanki kontrolnej ze źródła zwierzęcego lub ludzkiego, który wyraża białko będące przedmiotem zainteresowania w morfologicznie rozpoznawalnych populacjach komórek. Przygotuj skrawki tkanki i zamontuj je na szkiełku podstawowym zgodnie ze standardową procedurą immunohistochemiczną, taką jak w Fedor i De Marzo20.
      UWAGA: Wymagana liczba sekcji to liczba rozcieńczeń przeciwciał pierwszorzędowych plus jedno dodatkowe.
    3. Korzystając z automatycznego lub ręcznego systemu immunohistologicznego, należy przetestować rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych z kroku 2.1.1 na szkiełku podstawowym z kroku 2.1.2. Pomiń aplikację przeciwciała pierwszorzędowego z dodatkowego szkiełka i użyj go jako kontroli negatywnej.
    4. Podczas procesu barwienia wybarwić wszystkie szkiełka 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) jako przeciwbarwnikiem jądrowym i fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym. Jeśli wymagana jest większa czułość, należy użyć sprzężonego z HRP (peroksydaza chrzanowa) przeciwciała drugorzędowego i systemu wzmacniania sygnału opartego na tyramidzie (patrz Stack i wsp.13).
      UWAGA: Podczas multipleksowania przeciwciał pierwszorzędowych dla każdego białka stosuje się inny znacznik fluorescencyjny.
    5. Zeskanuj preparaty wybarwione immunologicznie za pomocą odpowiedniego przyrządu zdolnego do wygenerowania cyfrowego pliku obrazu przy użyciu długości fal wzbudzenia i detekcji odpowiednich dla użytych fluoroforów.
    6. Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby wyświetlić obrazy cyfrowe i empirycznie wybrać pierwotne rozcieńczenie przeciwciała, które optymalizuje intensywność sygnału w stosunku do fluorescencji tła.
      UWAGA: W razie potrzeby optymalizacja ta może nastąpić przy użyciu przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z HRP, 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) i mikroskopii jasnego pola.
  2. Wykonaj barwienie IF na linii komórkowej TMA.
    1. Użyj automatycznego lub ręcznego systemu immunohistologicznego, aby wybarwić szkiełko linii komórkowej TMA za pomocą zoptymalizowanego rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych (jak określono w kroku 2.1). Pomiń stosowanie przeciwciała pierwszorzędowego z drugiego szkiełka i użyj go jako kontroli ujemnej.
    2. Podczas procesu barwienia wybarwić wszystkie szkiełka 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) jako przeciwbarwieniem jądrowym oraz przeciwciałem drugorzędowym i tyramidem, jak w kroku 2.1.4.
    3. Zeskanuj preparaty wybarwione immunologicznie za pomocą odpowiedniego przyrządu zdolnego do wygenerowania cyfrowego pliku obrazu przy użyciu długości fal wzbudzenia i detekcji odpowiednich dla użytych fluoroforów.
    4. Użyj pakietu oprogramowania do analizy obrazu, aby zidentyfikować interesujący przedział komórkowy (tj. cytoplazmę w porównaniu z jądrem) i określić ilościowo średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla każdej linii komórkowej.
      UWAGA: W tym celu można używać różnych pakietów oprogramowania, a wiele z nich omówiono w Stack i wsp.13.

3. Ilościowe immunoblotting linii komórkowych

  1. Przygotuj lizaty komórek.
    1. Zbierz 2 miliony komórek z każdej linii komórkowej, zgodnie z opisem w krokach od 1.1.1 do 1.1.3.
    2. Wiruj komórki przez 5 minut w temperaturze 650 x g w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zdekantować supernatant.
    3. Umyj komórki 10 ml lodowatego PBS. Zawiesić ponownie w 1 ml lodowatego PBS i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować zgodnie z krokiem 3.1.2, zdekantować i pozostawić komórki na lodzie.
    4. Dodać około 200 μl zimnego buforu do lizy radioimmunoprecypitacji (RIPA) z inhibitorami proteazy (10 μl 100-krotnych inhibitorów na ml buforu do lizy RIPA) do komórek, wirować i inkubować na lodzie przez 15 min.
      UWAGA: Ilość buforu do lizy wymagana do skutecznej lizy różni się w zależności od linii komórkowej i można ją określić empirycznie. Bufor RIPA składa się ze 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, 0,5% deoksycholanu sodu, 0,1% SDS w wodzie destylowanej.
    5. Aby zapewnić względnie równomierne obciążenie immunoblotów, należy określić ilościowo całkowite białko w próbce 20 μl z każdego lizatu przy użyciu odpowiedniej metody, takiej jak test Bradforda. Dodać około 40 μl buforu do lizy 6X Laemmli do reszty (około 180 μl) każdego lizatu komórkowego i gotować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym lub łaźni wodnej przez 5 min.
      UWAGA: Bufor 6X Laemmli składa się z 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w/v) SDS, 60% glicerolu, 0,6% (w/v) błękitu bromofenolowego, 50 mM ditiotreitolu (DTT) w wodzie destylowanej.
    6. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do dwóch tygodni.
  2. Wykonaj immunoblot wszystkich linii komórkowych, aby określić, która linia komórkowa ma najliczniejsze białko będące przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w Mahmood, T. i Yang, PC. 22, z następującymi modyfikacjami.
    1. Podwielokrotny lizat komórkowy (przygotowany w kroku 3.1) zawierający 10-50 μg białka (w zależności od obfitości białka będącego przedmiotem zainteresowania) do probówek do mikrowirówek. Dodać 2,5 μl buforu 6X Laemmli i wystarczającą ilość buforu do lizy RIPA, aby uzyskać objętość do 15 μl.
    2. Załadować 5% układanie w stos i odpowiednie stężenie rozdzielcze (np. 10% dla białek między 15-100 kDa) żel SDS-PAGE z drabinką białkową i próbkami z kroku 3.2.1. Załaduj 1X bufor Laemmli do pustych studzienek. Uruchom zasilacz przy odpowiednich ustawieniach, zwykle 125 V, na 80 minut lub do momentu, gdy niebieski barwnik bromofenolowy dotrze do dna płytki.
    3. Wykonać półsuchy transfer białka zgodnie z opisem w Wiedemann i wsp.23.
      UWAGA: W celu uzyskania reprezentatywnych wyników zastosowano membranę nitrocelulozową (która nie musi być moczona w metanolu) oraz zimny bufor transferowy Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN). Bufor BSN składa się z 48 mM Tris, 39 mM glicyny, 20% metanolu w wodzie destylowanej.
    4. Po przeniesieniu użyj żyletki, aby przeciąć błonę poziomo, aby oddzielić część zawierającą białko będące przedmiotem zainteresowania od odpowiedniego białka kontroli wewnętrznej, takiego jak GAPDH.
    5. Przystąpić do inkubacji blokującej i inkubacji przeciwciał przy użyciu buforu blokującego zalecanego przez producenta przeciwciał pierwszorzędowych.
      UWAGA: Optymalne rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych mogą się znacznie różnić w zależności od obfitości i wrażliwości białka. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki poniżej, przeciwciało przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania wymagało rozcieńczenia 1:1,000, podczas gdy kontrola GAPDH wymagała rozcieńczenia 1:40,000. Rozcieńczenie zastosowanych przeciwciał drugorzędowych wynosiło 1:3 000.
    6. Po inkubacji przeciwciał i umyciu błony należy umieścić paski membrany w przezroczystej plastikowej osłonce, takiej jak torebka na kanapki.
    7. Przygotować mieszaninę ze wzmocnioną chemiluminescencją (ECL) zgodnie z instrukcjami producenta. Za pomocą pipety P-1000 pokryć membranę mieszaniną ECL, zamknąć osłonę i inkubować paski membrany z mieszaniną w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty.
    8. Umieść osłonę membrany na cyfrowej platformie obrazowania. Użyj chemagluminescencji i detekcji markerów kolorymetrycznych, aby uchwycić różne ekspozycje membrany.
      UWAGA: Czasy ekspozycji będą się różnić w zależności od ilości załadowanego białka, obfitości białka docelowego, powinowactwa przeciwciał itp. Rozpocznij od automatycznej ekspozycji (zwykle kilka sekund) i przetestuj czasy ekspozycji powyżej i poniżej w krokach co kilka sekund.
    9. Empirycznie lub za pomocą oprogramowania do analizy obrazu określ, która linia komórkowa wykazuje największą ekspresję białka docelowego.
  3. Znajdź liniowy zakres dynamiczny każdego przeciwciała pierwszorzędowego za pomocą rozcieńczenia szeregowego.
    1. Wykonać kroki 3.2.1-3.2.8, stosując serię seryjnych rozcieńczeń z linii komórkowej, która wyraża najwyższe stężenie białka docelowego (zidentyfikowane w kroku 3.2.9).
    2. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ, aby wykonać densytometrię na obrazach ekspozycji.
      1. Na przykład, korzystając z ImageJ, użyj narzędzia Prostokątne zaznaczenia, aby wybrać pierwszy pas żelu do określenia ilościowego. Przejdź do Analizy| Żele| Wybierz pierwszy pas. Użyj myszy, aby przesunąć powstały prostokąt na następny pas ruchu. Przejdź do Analizy| Żele| Wybierz pozycję Następny pas. Kilkakrotnie przesuwaj prostokąt na następny pas ruchu i wybierz pas dla pozostałych pasów.
      2. Przejdź do Analizy| Żele| Działka: Pasy ruchu. Użyj narzędzia Linia prosta, aby narysować linie u podstaw każdego szczytu, aby usunąć szum tła. Użyj narzędzia Różdżka, aby wybrać każdy pik i zebrać gęstość każdego piku, odtąd nazywaną intensywnością pasma, w oknie Wyniki.
    3. Użyj danych wyjściowych densytometrii, aby utworzyć wykres rozrzutu intensywności pasma w funkcji ilości całkowitego białka załadowanego dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego. Korzystając z linii najlepszego dopasowania i kontroli wzrokowej, określ lokalizację (zakres intensywności) liniowego zakresu dynamiki każdego przeciwciała.
    4. Wybierz stężenie białka, które generuje wartość na górnym końcu zakresu liniowego, która ma być stężeniem poruszającym się naprzód dla wszystkich linii komórkowych.
      UWAGA: Ponieważ stężenie to jest poniżej poziomu nasycenia w linii komórkowej największą ilością tego białka, nie powinno być niebezpieczeństwa prześwietlenia prążków dla innych linii komórkowych.
  4. Wykonać immunoblot przy użyciu stężenia białka wybranego w kroku 3.3.4 dla wszystkich linii komórkowych i powtórzyć kroki 3.2.1-3.2.8.
    1. Wykonaj densytometrię na skanach cyfrowych, jak w kroku 3.3.2. Wybierz obrazy ekspozycji, które dają sygnały w zakresach liniowych dla każdego przeciwciała zidentyfikowanego w kroku 3.3.3.
    2. Korzystając z sygnałów intensywności pasma z idealnych ekspozycji z ppkt 3.4.1, obliczyć stosunek intensywności pasma białka docelowego do intensywności pasma kontrolnego obciążenia dla każdej linii komórkowej. Te wartości współczynnika wskazują względną obfitość docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania.
    3. Wykonaj test korelacji Pearsona (można go wykonać przy użyciu pakietu oprogramowania statystycznego), aby skorelować wartości uzyskane z analizy obrazu barwienia IF (krok 2.2) z wartościami uzyskanymi z immunoblottingu (krok 3.4.2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został wykorzystany do potwierdzenia zdolności IF do określenia względnej ilości białka antyapoptotycznego Bcl-2 w liniach komórkowych przekształconych w bloki tkankowe FFPE. Selektywne oznaczanie ilościowe Bcl-2 w komórkach nowotworowych może wyjaśnić mechanizmy onkogenne i może być przydatne w diagnostyce patologicznej oraz w podejmowaniu decyzji dotyczących postępowania klinicznego24. Mówiąc dokładniej, Bcl-2 odgrywa rolę w prawidłowym rozwoju limfo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy metodę, która wykorzystuje ilościowe immunoblotting (IB) w celu wykazania użyteczności immunofluorescencji (IF) do ustalenia względnej obfitości białka docelowego w próbkach tkanek FFPE. Obecne metody oznaczania ilościowego białek są ograniczone ze względu na ich kategoryczny charakter, taki jak chromogenny IHC 2,3, lub ze względu na konieczność homogenizacji próbek, co uniemożliwia badanie struktury próbki i populacji komórek, jak w przypadku IB i spe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Fredrick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarship (A.M.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
697DSMZACC 42Linia komórkowa
JeKo-1ATCCCRL-3006Linia komórkowa
JurkatATCCTIB-152Linia komórkowa
RCH-ACVDSMZACC 548Linia
komórkowa Granta-519DSMZACC 342Linia komórkowa
REHDSMZACC 22Linia
komórkowa RajiATCCCCL-86Linia komórkowa
HeLaATCCCCL-2Linia komórkowa
Roztwór trypsyny/EDTAInvitrogenR001100Do oddzielania komórek adhezyjnych
Surowica bydlęca płodu (FBS)Żubry Inc.81150Aby zneutralizować trypsynę
Neutralna buforowana formalinaProtokół245-684Do mocowania granulek komórkowych
UltraPure agaroza o niskiej temperaturze topnieniaInvitrogen15517-022Do odlewania granulek komórkowych
Mysie monoklonalne przeciwciało anty-ludzkie Bcl-2, klon 124Dako (Agilent)kat#: M088729-2, RRID: 2064429Do wykrywania Bcl-2 metodą immunofluorencji i immunoblot (lot#:  00095786
Ventana Discovery XTRoche-Doautomatyzacji barwienia immunofluorescencyjnego
System EnVision+- Polimer znakowany HRP (anty-mysz)Dako (Agilent)K4000Do immunofluorescencyjnego wzmocnienia sygnału
System EnVision+- Polimer znakowany HRP (anty-królik)Dako (Agilent)K4002Do immunofluorescencyjnego wzmacniania sygnału
Cyjanina 5 odczynnik tyramiduPerkin Elmer NEL745001KTDo immunofluorescencji wzmocnienia sygnału
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-Abywyświetlić zeskanowane slajdy
Oprogramowanie do analizy obrazu HALOIndica Labs-Dokwantyfikacji immunofluorescencyjnych
inhibitorów proteazy (koktajl inhibitorów proteazy Halt, 100X)Thermo Scientific1862209Aby dodać do Bufor RIPA
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)BioShopEDT001Dla bufora RIPA
NP-40BDH Limited56009Dla bufora RIPA
Deoksycholan soduSigma-AldrichD6750Dla buforu RIPA
GlicerolFisherBiotechBP229Dla bufora Laemlli
Bromofenol niebieskiBioShopBRO777Do buforu Laemlli
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad161-0611Do buforu Laemlli
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)BioShopALB001Do płukania immunoblot
Drabinka białkowa (Precision Plus Protein Dual Color Standards)Bio-Rad161-0374Do biegania żelu białkowego
Bibuła filtracyjna (bardzo gruba bibuła)Bio-Rad1703969Do bibuły transfer
Membrana nitrocelulozowaBio-Rad162-0115Do transferu bibuły
Półsucha komórka transferowa Trans-blot SDBio-Rad1703940Do transferu półsuchego
Odtłuszczone mleko w proszku (beztłuszczowe mleko w proszku)Technologia sygnalizacji komórkowej9999SDo blokowania bufora
Tween 20BioShopTWN510Do bufora myjącego
GAPDH królik przeciwciało monoklonalne Epitomics2251-1Pierwszorzędowe przeciwciało białka kontrolnego (lot#: YE101901C)
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (skoniugowane HRP)abcamcat#: ab6789, RRID: AB_955439Przeciwciało drugorzędowe dla immunoblot
Goat anty-rabbit IgG (HRP sprzężone)abcamcat#: ab6721, RRID: AB_955447Drugorzędowe przeciwciało przeciwko immunoblot (parti#: GR3192725-5)
Clarity Western Substraty ECLBio-Rad1705060Do wykrywania sygnału immunoblot
Amersham Imager 600GE Healthcare Nauki przyrodnicze29083461Do wykrywania sygnału immunoblot
OprogramowanieImageJ Freeware, NIH-Doanalizy densytometrycznej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
  4. Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
  5. Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
  6. Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
  7. Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
  8. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  9. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  10. Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
  11. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
  12. Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
  13. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  14. Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
  15. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
  16. AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
  17. Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
  18. Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
  19. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
  20. Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
  21. Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
  22. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  23. Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
  24. Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
  25. Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
  26. Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
  27. Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
  28. The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
  29. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  30. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).
  31. Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
  32. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
  33. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunofluorescence AssayCell Line ValidationProtein Biomarker QuantificationFFPE Tissue AnalysisImage Analysis SoftwareWestern Blot ProtocolFluorescence Intensity MeasurementLinear Dynamic RangePearson Correlation Test

Powiązane artykuły