Artykuł metodologiczny

Wizualizacja poziomów gibereliny komórkowej za pomocą biosensora rezonansowego transferu energii (FRET) nlsGPS1 Förster

DOI:

10.3791/58739

⸱

12 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Sainsbury Laboratory, University of Cambridge

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czujnik percepcji gibereliny 1 (GPS1) jest pierwszym biosensorem opartym na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru poziomów komórkowych fitohormonów gibereliny z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Protokół ten przedstawia metodę wizualizacji i ilościowego określania poziomów gibereliny komórkowej przy użyciu genetycznie kodowanego biosensora nlsGPS1 w hipokotylach Arabidopsis i wierzchołkach korzeni.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fitohormon giberelina (GA) to mała, mobilna cząsteczka sygnałowa, która odgrywa kluczową rolę w kiełkowaniu nasion, wydłużaniu komórek i przemianach rozwojowych roślin. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) to pierwszy biosensor oparty na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET), który umożliwia monitorowanie komórkowych poziomów GA in vivo. Mierząc współczynnik emisji fluorescencji jądrowej zlokalizowanej GPS1 (nlsGPS1), możliwe jest czasoprzestrzenne mapowanie endogennych i egzogennie dostarczanych gradientów GA w różnych typach tkanek w skali komórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób obrazować współczynniki emisji nlsGPS1 w trzech przykładowych eksperymentach: w stanie ustalonym, przed i po leczeniu egzogenną gibereliną A4 (GA4) oraz w trakcie leczenia. Udostępniamy również metody analizy wskaźników emisji nlsGPS1 przy użyciu zarówno Fidżi, jak i komercyjnego oprogramowania do trójwymiarowej (3D) wizualizacji i analizy mikrograficznej (3D) oraz wyjaśniamy ograniczenia i prawdopodobne pułapki związane z użyciem nlsGPS1 do ilościowego określania poziomów gibereliny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hormony roślinne odgrywają fundamentalną rolę we wzroście i rozwoju roślin. Te małe, ruchome cząsteczki sygnałowe są zazwyczaj regulowane na kilku poziomach, takich jak biosynteza, katabolizm oraz transport na krótkie i długie odległości1,2,3,4. Wiedza na temat hormonalnych szlaków sygnałowych i dalszych odpowiedzi transkrypcyjnych wyostrzyła się na przestrzeni lat. Jednak, aby powiązać różnorodne odpowiedzi komórkowe hormonalnych szlaków sygnałowych z bodźcami regulacyjnymi kierującymi dystrybucją hormonów, potrzebujemy czasoprzestrzennej kwantyfikacji poziomów hormonów w skali komórkowej. Bioczujniki oparte na FRET, które mogą wykrywać fitohormony, mogą zwiększyć zdolność naukowców do ilościowego określania poziomów hormonów w skali komórkowej. Bioczujniki oparte na FRET składają się z pary FRET (białka fluorescencyjne donora i akceptora) połączonej z domeną czuciową, która wiąże określony ligand lub reaguje na bodziec biologiczny. W przypadku biosensorów małocząsteczkowych wiązanie ligandów wyzwala zmianę konformacyjną domeny czuciowej, która powoduje zmianę odległości i/lub orientacji między dwoma białkami fluorescencyjnymi pary FRET. Analiza ratiometryczna biosensora FRET jest przeprowadzana poprzez wzbudzenie dawcy i pomiar stosunku emisji fluorescencji akceptora do donora5,6. Wiązanie liganda jest wykrywalne jako zmiana tego współczynnika emisji7.

Niedawno opracowaliśmy oparty na FRET biosensor dla hormonu roślinnego GA. GA to klasa hormonów, które mogą promować kiełkowanie nasion, wydłużanie komórek i rozwojowe przejście od fazy wegetatywnej do fazy kwitnienia. Bioczujnik nlsGPS1 jest zlokalizowany jądrowo i zapewnia czasoprzestrzenny wgląd w dynamikę GA w różnych tkankach roślinnych. W komórkach rzodkiewnika GA wiąże się z rozpuszczalnymi receptorami, karłem niewrażliwym na giberelinę (GID), a kompleks indukuje degradację białek DELA, które działają jako negatywne regulatory sygnalizacji GA2. Domena czuciowa GA nlsGPS1 składa się z receptora GA Arabidopsis (AtGID1C) połączonego z 74-aminokwasowym skróceniem białka DELLA (AtGAI) i pary FRET składającej się ze wzmocnionych wariantów dimeryzacji Cerulean jako dawcy białka fluorescencyjnego i Afrodyty (Wenus zróżnicowana kodonem) jako akceptora białka fluorescencyjnego8. Biosensor nlsGPS1 jest czujnikiem o wysokim powinowactwie do bioaktywnego GA4 (Kd = 24 nM dla GA4) i może być stosowany w różnych typach tkanek do mapowania i ilościowego określania gradientów GA. Aby uniknąć błędnej interpretacji poziomów GA rzodkiewnika in vivo, opracowaliśmy również niereagujący wariant nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) do stosowania jako kontrola negatywna. Białko nlsGPS1-NR przenosi mutacje w kieszeni wiążącej GA, które zakłócają wiązanie GA oraz mutacje w białku DELA, które zakłócają interakcję z białkami receptora GID7,9. Wzorce współczynników emisji lub zmiany obserwowane zarówno w liniach nlsGPS1, jak i nlsGPS1-NR można uznać za artefakty niezwiązane bezpośrednio ze zdarzeniami wiążącymi GA. Ważne jest również, aby zauważyć, że wiązanie nlsGPS1 z GA4 nie jest szybko odwracalne, a zatem współczynniki emisji komórkowych nlsGPS1 powinny być interpretowane jako reprezentujące najwyższe niedawne stężenie GA w danym jądrze, a nie poziomy w stanie ustalonym w czasie rzeczywistym. W związku z tym analiza spadających poziomów GA nie jest możliwa za pomocą nlsGPS1.

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystania biosensora nlsGPS1 w komórkach modelowej rośliny Arabidopsis, przy użyciu metod opartych na obrazowaniu konfokalnym w wysokiej rozdzielczości. Protokół dostarcza informacji na temat obrazowania korzeni roślin i hipokotyli zarówno w stanie stacjonarnym, jak i w czasie. Czujnik nlsGPS1 może być potencjalnie wykorzystany w różnych typach tkanek, a także u różnych gatunków roślin, do mapowania i ilościowego określania rozkładu GA.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowania

  1. Przygotuj 1/2 agaru Murashige i Skoog o pH 5,7 bez sacharozy (1 l).
    1. Rozpuścić 2,2 g podłoża podstawowego Murashige and Skoog (MS) w 950 ml ultraczystej wody. Dostosuj pH do 5,7 za pomocą 5 M KOH.
    2. Uzupełnić roztwór do końcowej objętości 1 l wodą ultraczystą. Podziel go na dwie butelki o pojemności 500 ml, z których każda zawiera 1% agaru roślinnego. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 min.
  2. Przygotuj 1/4 MS płynu o pH 5,7 bez sacharozy (1 l).
    1. Rozpuść 1,1 g MS w 950 ml ultraczystej wody. Dostosuj pH do 5,7 za pomocą 5 M KOH. Uzupełnić roztwór do końcowej objętości 1 l wodą ultraczystą. Podziel go na dwie butelki o pojemności 500 ml. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 min.
  3. Przygotuj GA4.
    1. Rozpuścić GA4 w etanolu 70%, aby uzyskać końcowe stężenie 100 mM GA4 zapasów.
    2. Aby przygotować roztwór roboczy, rozcieńczyć materiał podstawowy GA4 do 0,1–1 μM w 1/4 MS cieczy o pH 5,7.

2. Wzrost roślin

  1. Wysterylizuj nasiona Arabidopsis.
    1. Pracuj przy użyciu okapu chemicznego. Podwielokrotne nasiona (około 200 nasion) do probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml. Użyj markera z atramentem odpornym na chlor i umieść probówki z otwartymi pokrywkami w naczyniu sterylizacyjnym (dużym pudełku, które można zamknąć).
    2. Umieścić zlewkę o pojemności 250 ml zawierającą 50 ml ultraczystej wody i 50 ml roztworu podchlorynu sodu w naczyniu sterylizacyjnym.
    3. Dodać 3 ml stężonego kwasu solnego (HCl) do zlewki. Natychmiast uszczelnij naczynie i pozwól na sterylizację chlorem gazowym przez 6–16 godzin.
    4. Po rozszczelnieniu naczynia zamknij pokrywy wszystkich probówek do mikrowirówek w stojaku na nasiona. Wysterylizowane nasiona można przechowywać w suchym stanie do czasu poszycia.
  2. Zasiej około 20 wysterylizowanych nasion Arabidopsis na kwadratowych płytkach agarowych o pojemności 1/2 MS. Uszczelnij płytki porowatą taśmą chirurgiczną i owiń je folią aluminiową. Inkubować je w temperaturze 4 °C przez 1–3 dni w celu rozwarstwienia.
  3. W celu obrazowania korzeni przenieś płytki do komory wzrostowej w pozycji pionowej na 3 dni w następujących warunkach wzrostu: warunki długiego dnia (LD, 16 h światła/8 h ciemności); natężenie światła 120 μmol⋅m-2 s-1; temperatura 22 °C (podczas cyklu światła) lub 18 °C (podczas cyklu ciemnego), 65% wilgotności względnej (RH).
  4. W przypadku ciemnego hipokotylu: przenieś płytki do komory wzrostowej na impuls świetlny trwający 1–4 godziny, aby zsynchronizować kiełkowanie. Owiń płytki folią aluminiową i umieść je w komorze wzrostowej w pozycji pionowej na 3 dni.

3. Przygotowanie próbki

  1. Pomiary w stanie ustalonym (Rysunek 1A)
    1. Na czysty szkiełko mikroskopowe dodaj 50 μl 1/4 MS płynu (od teraz określanego jako roztwór makietyczny). Delikatnie przenieś sadzonki wyrażające nlsGPS1 z płytki na szkiełko.
    2. Weź czyste szkiełko nakrywkowe i umieść kroplę tłuszczu próżniowego w każdym rogu szkiełka nakrywkowego. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na sadzonkach i ostrożnie dodaj dodatkowy roztwór imitujący, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
  2. Leczenie GA4: eksperyment z wymianą chemiczną (Rysunek 1B).
    1. Przed podaniem GA4 za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml wypełnionej smarem próżniowym (dołączonej do końcówki pipety) narysuj prostokąt (długość: 3,5 cm, wysokość: 2,5 cm) z jednolitą warstwą tłuszczu próżniowego na czystym szkiełku podstawowym (Rysunek 1B). Aby umożliwić uzyskanie cienkiej linii smaru próżniowego, końcówkę pipety należy przyciąć tak, aby miała otwór o średnicy 1 mm.
    2. Dodać 50 μl roztworu makiety do szkiełka podstawowego. Za pomocą czystych kleszczy zbierz sadzonki nlsGPS1 i delikatnie umieść je na pozorowanym roztworze. Aby zapobiec uszkodzeniom, przenieś sadzonki, podpierając spód liścieni bez chwytania sadzonki kleszczami.
    3. Weź czyste szkiełko nakrywkowe i umieść kroplę tłuszczu próżniowego w każdym rogu szkiełka nakrywkowego. Za pomocą kleszczy umieść szkiełko nakrywkowe na środku prostokąta smaru próżniowego. Teraz szkiełko nakrywkowe jest uszczelnione z dwóch stron odpowiadających długim krawędziom prostokąta smaru próżniowego.
    4. Ostrożnie dodaj dodatkowy roztwór imitujący, aby napełnić zbiornik i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze zbiornika, nie naruszając znajdującej się w środku sadzonki (sadzonek
      5. ).
    5. Pozyskaj obrazy przed zabiegiem GA4 za pomocą mikroskopu konfokalnego. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 4 niniejszego protokołu.
    6. W przypadku zabiegu GA4 należy zdjąć szkiełko mikroskopowe ze stolika konfokalnego. Ustaw minutnik na 20 minut.
    7. Po uruchomieniu timera należy wymienić roztwór buforowy na 1/4 MS cieczy zawierającej 1 μM GA4. Dodać roztwór GA4 (około 50 μl) z lewej strony szkiełka nakrywkowego i usunąć poprzedni (imitowany) roztwór z prawej strony. Kontynuuj wymianę roztworu, aby całkowicie zastąpić próbny roztwór, co zajmuje około 10 minut (Rysunek 1B).
    8. Umieść szkiełko z powrotem na stoliku mikroskopu. Odczekaj kolejne 10 minut przed uzyskaniem obrazu po GA.
  3. Ustalanie przebiegu czasowego dla tkanki będącej przedmiotem zainteresowania
    nuta: Tkanką będącą przedmiotem zainteresowania mogą być na przykład hipokotyle lub korzenie. Rutynowo przeprowadzamy kursy czasowe obrazowania biosensora nlsGPS1 przy użyciu komercyjnego systemu perfuzyjnego (Rysunek 1C, patrz tabela materiałów) lub RootChip7,10,11.
    1. Dodać 200 μl roztworu makiety do środka kanału perfuzyjnego szkiełka samoprzylepnego (patrz tabela materiałów). Delikatnie zbierz sadzonki nlsGPS1 i umieść je na makiecie roztworu w szkiełku samoprzylepnym.
    2. Za pomocą kleszków delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe i używając tylnej strony kleszczyków, delikatnie dociśnij zewnętrzne krawędzie szkiełka nakrywkowego, tak aby utworzyło silne połączenie z lepkim materiałem na obrzeżach szkiełka samoprzylepnego.
    3. Za pomocą dwóch łączników kolankowych Luer (o średnicy wewnętrznej [ID] 0,8 mm) i silikonowej rurki (o średnicy wewnętrznej 0,8 mm), podłącz szkiełko samoprzylepne do strzykawki o pojemności 20 ml i do pojemnika wylotowego zbierającego roztwór odpływowy. Użyj złącza Luer lock (o średnicy wewnętrznej 0,8 mm), aby podłączyć strzykawkę do silikonowej rurki.
    4. Delikatnie nacisnąć ręcznie strzykawkę zawierającą makietę roztworu, aby przepuścić wystarczającą ilość roztworu przez komorę, tak aby w komorze nie pozostały pęcherzyki powietrza. Umieścić i przytrzymać strzykawkę na programowalnej pompie strzykawkowej.
    5. Ustawić parametry pompy specyficzne dla używanej strzykawki (tj. średnicę i objętość) wraz z natężeniem przepływu zgodnie z instrukcją dołączoną do pompy.
      UWAGA: W tym protokole zastosowano natężenie przepływu 1–3 ml/h, które można zmienić w zależności od wymagań eksperymentalnych. Zainicjuj bieg czasu, uruchamiając pompę.
    6. W przypadku leczenia GA4 podczas cyklu czasowego (Rysunek 1C), zatrzymaj perfuzję, zatrzymując pompę i zmień strzykawkę na nową zawierającą 1/4 MS płynu uzupełnionego GA4. Kontynuuj obrazowanie konfokalne, jak pokazano w następnym rozdziale.

4. Mikroskopia

UWAGA: Wykonujemy konfokalną mikroskopię laserową.

  1. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w lasery do wykonywania obrazowania FRET.
    UWAGA: W przypadku nlsGPS1 obrazowane są warianty białka cyjanowej fluorescencji (CFP) i białka żółtej fluorescencji (YFP). W tym protokole mikroskopy komercyjne (patrz Tabela materiałów, wymienione jako mikroskopy 1 i 2) są używane z 10-krotnymi lub 20-krotnie suchymi obiektywami PLAN APO o składzie 0,70 harmonicznej.
  2. W przypadku mikroskopu 1 użyj laserów o długości fali 448 nm i 514 nm, aby wzbudzić odpowiednio CFP i YFP. Pobieranie skanów sekwencyjnych. Ustaw detektory (np. HyD SMD) tak, aby wykrywały 460–500 nm dla CFP (emisja donorowa) i 525–560 nm dla YFP (emisja FRET) po wzbudzeniu CFP. Korzystając z drugiej sekwencji, ustaw detektor tak, aby wykrywał 525–560 nm dla YFP (emisja YFP) po wzbudzeniu YFP.
    UWAGA: Ta fluorescencja YFP jest używana jako kontrola ekspresji, a także do segmentacji jąder, do generowania powierzchni za pomocą komercyjnego oprogramowania do wizualizacji i analizy mikrograficznej 3D.
  3. W przypadku mikroskopu 2 użyj linii laserowych o długości fali 440 nm i 514 nm, aby wzbudzić odpowiednio CFP i YFP. Zdobądź dwie ścieżki. Dla ścieżki 1 należy ustawić detektory (np. ChS) tak, aby wykrywały 464–500 nm dla CFP (emisja donorowa) i 526–562 nm dla YFP (emisja FRET) po wzbudzeniu CFP. Dla ścieżki 2 ustaw detektor tak, aby wykrywał 526–562 nm dla YFP (emisja YFP) po wzbudzeniu YFP.
    UWAGA: Ta fluorescencja YFP jest używana jako kontrola ekspresji, a także do segmentacji jąder, do generowania powierzchni w oprogramowaniu do wizualizacji i analizy 3D.
  4. Uzyskuj obrazy w formacie 512 x 512 pikseli i rozdzielczości 12 bitów.
  5. Wzmocnienie musi być dostosowane do empirycznie określonej wartości, która pozwala na uzyskanie dobrego sygnału bez nasycania pikseli. Wzmocnienie nie powinno być zmieniane między emisją CFP i FRET w trakcie eksperymentu. Ustaw otwór na 1 jednostkę przewiewną (AU). Umieść szkiełko samoprzylepne IBIDI na etapie mikroskopu konfokalnego i kontynuuj obrazowanie, jak pokazano wcześniej.
  6. W oprogramowaniu mikroskopu 1, podczas aktywnego skanowania na żywo, użyj funkcji Blask nad/pod znajdującej się w lewym górnym rogu ekranu obrazu, aby określić niedoświetlenie i nasycenie obszaru zainteresowania. W oprogramowaniu mikroskopu 2 użyj wskaźnika zasięgu znajdującego się w dolnej części ekranu obrazu, aby określić niedoświetlenie i nasycenie obszaru zainteresowania. W przypadku każdej ilościowej analizy obrazu nie powinno być nasycenia pikseli.
  7. Ustaw stosy z krokiem o wielkości 1 μm. Rozmiar kroku można zmniejszyć, aby uzyskać większą rozdzielczość z lub zwiększyć, aby zwiększyć szybkość akwizycji lub zwiększyć liczbę pozycji/próbek, które można obrazować. Dla automatycznego przebiegu czasu ustaw czas wraz ze stosami z (tryb xyzt z zakładki trybu akwizycji), aby uzyskać obrazy w określonych odstępach czasu.

5. Analiza obrazu za pomocą Fidżi

UWAGA: Za pomocą ImageJ (Fidżi) możliwe jest przetwarzanie danych obrazowych i tworzenie dwuwymiarowych (2-D) obrazów współczynnika emisji nlsGPS1 u siewek rzodkiewnika. Przykłady obrazów można znaleźć w Rysunek 2A, 2C, 2E, 2G i 3A. W ImageJ możliwe jest znalezienie każdego polecenia tego protokołu za pomocą funkcji wyszukiwania. Naciśnij spację i L na klawiaturze komputera. Otworzy się nowe okno; Wpisz wymagane polecenie w polu wyszukiwania.

  1. Przeciągnij plik (pliki .lif lub .lsm) na Fidżi (obraz J) i otwórz obrazy jako hyper-stack.
  2. Z menu głównego wybierz opcję Obraz > stos > projekt Z i wybierz opcję Sumuj wycinki, aby przechwycić wszystkie piksele, a nie tylko najjaśniejsze piksele, jak w przypadku projekcji maksymalnej.
  3. Z menu głównego wybierz opcję Przetwarzaj > Odejmij tło i ustaw promień toczącej się piłki na 50 pikseli. Usuń zaznaczenie innych opcji i przetwórz wszystkie trzy obrazy. Ten krok usuwa tło za pomocą algorytmu "toczącej się piłki".
    UWAGA: 50 pikseli zostało empirycznie określone, aby uwzględnić jądra jako pierwszy plan.
  4. Z menu głównego wybierz Obraz > Kolor > Podziel kanały. Otworzą się trzy nowe okna: C1-SUM (kanał CFP); C2-SUM (kanał FRET) i C3-SUM (kanał YFP).
  5. Wybierz okno C3-SUM i z menu głównego wybierz opcję Process > Filters (Przetwarzaj filtry > Rozmycie gaussowskie) i zastosuj rozmycie gaussowskie o wartości 1, aby zredukować szum obrazu.
  6. Z menu głównego wybierz Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast i wybierz auto.
  7. Z menu głównego wybierz opcję Process > Enhance Contrast (Zwiększ kontrast) i ustaw wartość Nasycenie = 0,35.
  8. Z menu głównego wybierz Obraz > Wpisz > 8-bitowy i przekonwertuj stosy na obraz 8-bitowy.
  9. Z menu głównego wybierz opcję Image > Adjust > Auto-Local Threshold (Dostosuj Auto-Local Threshold). W polu Próg autolokalny wybierz następujące parametry: metoda Phansalkar, promień = 15, parametr 1 = 0, parametr 2 = 0 i biały stos. W tym kroku stosy YFP są używane do tworzenia maski binarnej.
  10. Wybierz okno C2-SUM i z menu głównego wybierz opcję Process > Filters (Przetwarzaj filtry > Rozmycie gaussowskie) i zastosuj rozmycie gaussowskie o wartości 1.
  11. Wybierz okno C1-SUM i z menu głównego wybierz opcję Process > Filters (Przetwarzaj filtry > Rozmycie gaussowskie) i zastosuj rozmycie gaussowskie o wartości 1.
  12. Aby utworzyć stos współczynnika emisji z dwóch kanałów, z menu głównego wybierz opcję Process > Image Calculator (Przetwarzaj Kalkulator obrazu). W nowym oknie, które się pojawi, wybierz pozycję C2-SUMA jako obraz 1, wybierz pozycję Podziel jako operator, a następnie wybierz pozycję Suma C1 jako obraz 2.
  13. Upewnij się, że wybrano opcję Utwórz nowe okno i format 32-bitowy. Pojawi się nowe okno o nazwie Wynik C2-SUM.
  14. Z menu głównego wybierz Image > Lookup table (Obraz tabela przeglądowa) > LUT 16_colors.
  15. Z menu głównego wybierz opcję Process > Image Calculator (Przetwarzaj Kalkulator obrazów). W nowym oknie, które się pojawi, wybierz Wynik C2-SUM jako obraz 1, wybierz Pomnóż jako operator i wybierz C3-SUM jako obraz 2. W tym kroku maska binarna YFP jest mnożona przez stos YFP/CFP, aby pokazać tylko piksele obecne w kanale kontrolnym YFP.
  16. Z menu głównego wybierz Process > Math > Divide (Przetwarzaj matematyczną dziel) i ustaw wartość na 255. W nowym oknie, które zostanie otwarte, wybierz opcję Tak, aby przeanalizować wszystkie obrazy w stosie. Pojawi się nowy obraz o nazwie Wynik wyniku sumy C2.
  17. Z menu głównego wybierz Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast i wybierz Auto.
  18. Z menu głównego wybierz opcję Przetwarzaj > Zwiększ kontrast, a następnie wybierz opcję Typ nasycony = 0,35.
  19. Z menu głównego wybierz Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast, a następnie ustaw wartości minimalne i maksymalne, aby uchwycić rozkład GA. Opcjonalny krok: z menu głównego wybierz Analizuj narzędzia > > pasku kalibracji i Pokaż pasek kalibracji LUT, a następnie zapisz wynik wyniku C2-SUM jako plik .tiff.
  20. Aby uzyskać wartości wskaźników emisji, z menu głównego wybierz Analizuj > Ustaw pomiar, a następnie wybierz Średnia wartość szarości i Odchylenie standardowe.
  21. Wybierz kształt prostokąta z paska narzędzi i narysuj obszar zainteresowania (ROI). Z menu głównego wybierz opcję Analizuj > Mierz. W nowym oknie zostanie wyświetlona średnia wartość z wybranego ROI.
  22. Skopiuj i wklej uzyskane wartości do arkusza kalkulacyjnego (np. Excel lub OriginPro) i utwórz histogram dla eksperymentu leczenia GA4 przed i po lub wykres liniowy dla eksperymentu z przebiegiem czasu.

6. Analiza obrazu za pomocą oprogramowania do wizualizacji i analizy 3D

UWAGA: Zaletą korzystania z wybranego oprogramowania (patrz Tabela materiałów) jest segmentacja obiektów (np. jąder) i tworzenie obrazów 3D z konfokalnego stosu z. Przykłady obrazów można znaleźć w Rysunek 2B, 2D, 2F, 2H i 3B.

  1. Otwórz oprogramowanie i zaimportuj plik (pliki .lif lub .lsm).
  2. Segmentować jądra na podstawie kontrolnego kanału emisyjnego YFP za pomocą kreatora Powierzchnie. Obiekty podzielone na segmenty nazywane są "powierzchniami". Ten etap segmentacji pozwala na analizę wszystkich wokseli w jądrze jako jednego obiektu, jednocześnie eliminując tło z wokseli poza jądrem.
  3. W kreatorze Powierzchnie ustaw odejmowanie tła (kontrast lokalny) na 3 μm, a próg na domyślny. Zamaskuj kanały emisji CFP (emisja donora wzbudzenia donora [DxDm]) i emisji FRET (emisja akceptora wzbudzenia donora [DxAm]) w oparciu o powierzchnie utworzone za pomocą kanału emisji YFP (emisja akceptora wzbudzenia [AxAm]).
  4. Użyj rozszerzenia XT Średni współczynnik intensywności, aby obliczyć stosunek emisji akceptora wzbudzenia donora podzielony przez emisję donorową wzbudzenia donora (DxAm/DxDm) między średnimi wartościami intensywności poszczególnych powierzchni w dwóch kanałach.
    UWAGA: To rozszerzenie jest dostępne do pobrania online.
  5. Aby pokolorować poszczególne powierzchnie za pomocą współczynnika emisji nlsGPS1, wybierz opcję Kodowanie kolorami ze statystykami, która jest reprezentowana jako ikona koła kolorów. Wybierz opcję Średni współczynnik intensywności jako typ statystyki.
  6. Wyeksportuj współczynniki poszczególnych wartości z tabeli, która znajduje się pod ikoną Statystyki.
  7. Skopiuj i wklej wartości do arkusza kalkulacyjnego i utwórz histogram dla eksperymentów terapeutycznych GA4 przed i po lub wykres liniowy dla eksperymentów z przebiegiem czasu.

7. Analiza statystyczna

UWAGA: Zobacz Rysunek 3D dla roju pszczół i wykresu pudełkowego wskaźników emisji nlsGPS1.

  1. Otwórz oprogramowanie i wklej współczynnik emisji powierzchni jąder jako kolumny Y.
  2. Wybierz interesujące Cię kolumny, a następnie wybierz pozycję Statystyka > Opis statystyk > Test normalności, aby dowiedzieć się, czy próbki mają rozkład normalny. Uruchom test normalności, a otworzy się nowe okno i poda wyniki.
  3. Jeżeli próbki mają rozkład normalny, należy użyć testu t jako testu statystycznego. Wybierz pozycję Statystyka > testowanie hipotez > Test t dla dwóch prób w wierszach i uruchom test t.
  4. Jeśli próbki nie mają rozkładu normalnego, wybierz opcję Statystyka > Testowanie hipotezy statystycznej > Test dwóch prób dla wariancji, aby wiedzieć, czy wariancja między próbkami nie różni się znacząco.
  5. Jeśli wariancja nie różni się znacząco, należy użyć testu U Manna-Whitneya jako testu statystycznego. Wybierz opcję Statystyka > Test nieparametryczny > Test Manna-Whitneya i uruchom test.
  6. Jeśli wariancja jest znacząco inna, użyj testu ANOVA Kruskala Wallisa jako testu statystycznego. Wybierz opcję Statystyka > Test nieparametryczny > Test ANOVA Kruskala Wallisa i uruchom test.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z nlsGPS1, można zmierzyć poziomy GA4 w tkankach podatnych na obrazowanie fluorescencyjne, w tym w wierzchołkach korzeni i ciemnych hipokotylach (Rysunek 2). W korzeniu rzodkiewnika gradient współczynnika emisji nlsGPS1 wskazuje na niskie poziomy GA w strefach merystematycznych i podziałowych oraz wysokie poziomy GA w strefie późnej elongacji (Rysunek 2A i 2B). W przeciwieństwie do tego, gradient współczynnika emisji nie został zaobserwowany w korzeniach nlsGPS1-NR, co sugeruje, że endogenny gradient GA nie jest artefaktem (Rysunek 2C i 2D). Gradient współczynnika emisji nlsGPS1 powstał również u ciemnych hipokotylów, z niskimi poziomami w liścieniach i haku wierzchołkowym oraz wysokimi poziomami w szybko wydłużającym się obszarze podstawnym hipokotylu (Rysunek 2E i 2F). W przeciwieństwie do tego, gradient współczynnika emisji nie został zaobserwowany w hipokotylach nlsGPS1-NR (Rysunek 2G i 2H). Zarówno w korzeniach Arabidopsis, jak i w ciemnych komórkach hipokotylowych, endogenna akumulacja GA korelowała z szybkością wydłużania komórek.

Ponadto, egzogenicznie zaopatrzony GA4 akumuluje się preferencyjnie w strefie elongacji w porównaniu do strefy podziału korzenia Arabidopsis (Rysunek 3), co wskazuje, że nlsGPS1 może być używany do badania endogennych i egzogenicznych wzorców GA.

Podczas eksperymentów w czasie, sadzonki nlsGPS1 umieszczono w komorach z lepkim szkiełkiem i poddano perfuzji płynem 1/4 MS, a następnie potraktowano 0,1 μM GA4 przez 30 minut. Film pokazuje szybszą akumulację egzogennego GA4 w strefie wydłużenia korzenia w porównaniu ze strefą podziału (Wideo 1).

figure-results-1
Rycina 1: Przygotowanie próbki do obrazowania konfokalnego. Panele te pokazują schematyczne przedstawienie przygotowania próbki dla (A) eksperymentu w stanie ustalonym, (B) przed i po egzogennym leczeniu GA4 oraz dla (C) eksperymentu z przebiegiem leczenia w czasie leczenia przy użyciu szkiełek samoprzylepnych (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Gradient GA w korzeniach Arabidopsis i ciemno rosnących hipokotylach. Dwuwymiarowe obrazy korzeni (A) nlsGPS1 i (C) nlsGPS1-NR analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ, a trójwymiarowe obrazy (B) nlsGPS1 i (D) nlsGPS1-NR analizowano za pomocą komercyjnego oprogramowania do analizy obrazów trójwymiarowych. Obie analizy wykazały endogenny gradient GA4 w korzeniach rzodkiewnika. Dwuwymiarowe obrazy (E) nlsGPS1 i (G) nlsGPS1-NR ciemno wyhodowanego hipokotylu analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ, a trójwymiarowe obrazy (F) nlsGPS1 i (H) nlsGPS1-NR analizowano za pomocą komercyjnego oprogramowania do analizy obrazów trójwymiarowych. Obie analizy wykazały endogenny gradient GA4 u ciemnych hipokotylach. Pasek LUT wyświetla fałszywe zabarwienie współczynników emisji nlsGPS1. Obrazy YFP są zgłaszane jako kontrolki wyrażeń. Obrazy hipokotylu uzyskano przy użyciu dwóch pozycji etapowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Egzogenny gradient GA w korzeniach. Pierwsze dwa panele pokazują (A) dwuwymiarowe i (B) trójwymiarowe obrazy korzenia nlsGPS1 przed i 20 minut po leczeniu egzogennym GA4 (1 μM). Obrazy YFP są zgłaszane jako kontrolki wyrażeń. Ostatnie dwa panele pokazują (C) średnią i odchylenie standardowe oraz (D) wykres roju pszczół i wykres pudełkowy wskaźników emisji nlsGPS1 dla jąder strefy elongacji (obszaru, który jest zdefiniowany białą ramką). W strefie wydłużenia współczynnik emisji nlsGPS1 był istotnie wyższy po leczeniu GA4 (test U Manna-Whitneya, *** wartość P < 0,0001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Wideo 1: Eksperyment perfuzyjny korzenia nlsGPS1 przy użyciu sticky-slide. Ten film pokazuje trójwymiarowe obrazy nlsGPS1 perfundowanego cieczą 1/4 MS i traktowanego 0,1 μM GA4 przez 30 minut. W przebiegu czasowym obrazowanie wykonywano co 10 minut przez 3 godziny w następujących odstępach: 30 minut roztworu próbnego (ramka t = 1, t = 2, t = 3), 30 minut zabiegu GA4 (ramka t = 4, t = 5, t = 6), 2 godziny roztworu próbnego (ramka t = 7 do t = 18). Przed pobraniem próbkę perfundowano roztworem imitującym przez 2 godziny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oparty na FRET bioczujnik GA nlsGPS1 zapewnia ilościową metodę raportowania i pomiaru gradientów hormonu GA w roślinach wielokomórkowych. Bioczujniki oparte na FRET mogą określać ilościowo dynamikę z lepszą rozdzielczością czasoprzestrzenną w porównaniu z bezpośrednim wykrywaniem za pomocą spektrometrii mas i pomiarem pośrednim za pomocą reporterów transkrypcyjnych lub metod opartych na degradacji białek sygnałowych12,13. Obrazowanie komórkowe w wysokiej rozdzielczości w różnych typach tkanek może dostarczyć znaczącego wglądu w biologię GA i zainicjować nowe hipotezy dotyczące regulacji i funkcji akumulacji GA w kontekście wielokomórkowym. Na przykład monitorowanie zmian w biosensorze nlsGPS1 w określonych mutantach biosyntetycznych, katabolicznych i transportowych GA, a także podczas perturbacji wywołanych czasoprzestrzennie, może być bardzo pouczające w celu zbadania, w jaki sposób gradienty GA są ustalane w korzeniu i dotyczą odpowiedzi komórek korzenia na gradienty GA. Czujnik może być wykorzystany w innych modelach i gatunkach roślin uprawnych do testowania zachowania mechanizmów, które kontrolują kontrolę kiełkowania nasion, wydłużania komórek i kwitnienia za pośrednictwem GA.

Kluczowe etapy obrazowania biosensora nlsGPS1 w oparciu o FRET są następujące: 1) piksele nie powinny być nasycone podczas ilościowej analizy FRET, 2) parametry obrazowania, takie jak "wzmocnienie detektora", powinny być utrzymywane na stałym poziomie dla akwizycji emisji donorowej (DxDm) i emisji akceptorowej (DxAm), 3) należy użyć kontrolnych linii nlsGPS1-NR w celu wykluczenia artefaktów, oraz 4) próbki powinny być przygotowane w celu zminimalizowania problemów z dryftem i zmianą ogniskowej. Ponadto warunki środowiskowe, w których próbki są hodowane, są ważne do kontrolowania, ponieważ poziomy GA są wrażliwe na warunki środowiskowe, takie jak czas trwania światła i natężenie światła 14,15,16,17. Kluczowym ograniczeniem tego typu analizy jest to, że do obrazowania wymagany jest wysoki stosunek sygnału do szumu ze względu na wzrost szumu nieodłącznie związany z obrazowaniem ratiometrycznym. W związku z tym obrazowanie nlsGPS1 nie będzie przydatne w przypadku tkanek i narządów, które nie są podatne na ratiometryczną mikroskopię fluorescencyjną z użyciem cyjanu i żółtych białek fluorescencyjnych - na przykład głębszych tkanek, w których białka fluorescencyjne są słabo wykrywane. Z drugiej strony, odczyty ratiometryczne są często preferowane w stosunku do odczytów intensiometrycznych, ponieważ kontrola wewnętrzna jest pomocna w wykluczeniu artefaktów wynikających ze zmian w ekspresji, stabilności, jasności lub wykrywalności biosensorów w danej komórce, tkance lub stanie. Na przykład obrazowanie biosensorem FRET i analizy obrazu zostały również wykorzystane do badania różnych ligandów w różnych tkankach 5,6,18,19,20,. Przedstawione tu eksperymenty obrazowe i analizy obrazów mogą być modyfikowane w celu dostosowania do nowych metod obrazowania, takich jak mikroskopia arkuszowa, które mogą dostarczyć nowych informacji, na przykład na temat głębszych typów tkanek korzeniowych.

Biosensor nlsGPS1 pierwszej generacji to czujnik o wysokim powinowactwie, który zapewnia mapę gradientów GA o wysokiej rozdzielczości, która może również informować o wewnątrzkomórkowym wzroście GA po egzogennym leczeniu GA. Jednym z obecnych ograniczeń nlsGPS1 jest to, że czujnik nie jest szybko odwracalny, a zatem informuje nie o poziomach GA w stanie ustalonym, ale prawdopodobnie o maksymalnym niedawnym stężeniu GA w roztworze będącym przedmiotem zainteresowania. Dokładna szybkość obrotu czujnika również nie jest znana, co w połączeniu z niską odwracalnością wyklucza wykrycie endogennych niedoborów GA, które mogą wystąpić w ciągu kilku minut do kilku godzin w niektórych typach tkanek. Ważne jest również, aby zauważyć, że nlsGPS1 ma wysokie powinowactwo do GA4 (Kd = 24 nM) w porównaniu z innymi formami GA (GA3 Kd = 240 nM, GA1 Kd = 110 nM) podczas obrazowania innych bioaktywnych GA7. Przyszłe generacje bioczujników GA mogą być zaprojektowane tak, aby zwiększyć odwracalność przy zachowaniu wysokiego powinowactwa lub wykazywać różną specyficzność dla różnych prekursorów, bioaktywnych lub katabolitycznych GA.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca otrzymała dofinansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa o grant nr 759282).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
nlsGPS1 Col0 Nasiona ArabidopsisNASCN2107734
nlsGPS-NR Col0 Nasiona ArabidopsisNASCN2107735
Gibberellin A4 (GA4)SigmaG7276rozpuścić w EtH 70% i utrzymać na poziomie -20 ° C
roztwór podchlorynu sodu (wybielacz)Fisher S/5040HSRA 064
Klolowodor HClSigma31434
Taśma mikroporowa3M1530-1
ibidi sticky-slideIbidi81128Luer 0,1 do obrazowania korzeni
Ibidi sticky-slideIbidi80168Luer 0,2 do obrazowania
hipokotyluSzkiełko nakrywkowe szklane do szkiełek samoprzylepnychIbidi10812
Złącza kolankowe LuerIbidi10802
rurki silikonoweIbidi108401
Złącze Luer Lock ProgramowalnaIbidi10826
World Precision InstrumentsAL-1000
Smar próżniowySigma18405
Murashige and Skoog Basal SaltsDuchefaM0221
Roślina agarowa, 1 kgMelfordP1001
Szkiełko mikroskopowe szlifowane krawędzie, 76 mm x 26 mm, grubość od 1,0 mm do 1,2 mmFisher Scientific12383118
Szkiełko nakrywkowe nr 1 1/2 szklane 22 mm x 22 mmFisher Scientific12363138
Strzykawka Luer-slip 20 mlFisher Scientific
Taśma chirurgiczna 3M MicroporFisher Scientific12787597
Wodorotlenek potasu, 500 gSigma Aldrich221473-500G-D
Absolutny etanolFisher Scientific10428671
Kleszcze Zegarmistrz 5 StSteelScientific Scientific Laboratory SuppliesINS4340
Nożyczki, 125 mm, stal nierdzewnaFisher Scientific12338099
0,5 do 1,6Ibidi10829
Leica SP8Konfokalny mikroskop laserowy 1
Konfokalny mikroskop laserowyZeiss LSM 780
Oprogramowanie do wizualizacji i analizy 3DImarisBitplane
Oprogramowanie do analizy obrazuFidżi
Oprogramowanie do analizy statystycznejOriginProOrigin Lab
pompa strzykawkowa 10785126Reduktor dopasowania 2

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
  2. Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103(2008).
  3. Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
  4. Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073(2015).
  5. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
  6. Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
  7. Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
  8. Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
  9. Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
  10. Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290(2012).
  11. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  12. Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
  13. Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
  14. Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
  15. De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
  16. Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
  17. Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
  18. Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  19. Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
  20. Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Gibberellin BiosensorFRET ImagingnlsGPS1 ExpressionConfocal MicroscopyRatiometric AnalysisGA4 TreatmentArabidopsis Seedlings3D Image AnalysisFluorescence RatioPlant Hormone Imaging

Powiązane artykuły