Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja i analiza tajwańskiego zielonego propolisu

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58743

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół użycia etanolu jako rozpuszczalnika do ekstrakcji i charakteryzowania tajwańskiego zielonego propolisu, który wykazuje działanie przeciwbakteryjne.

Streszczenie

Tajwański zielony propolis jest bogaty w prenylowane flawonoidy i wykazuje szeroki zakres aktywności biologicznej, takiej jak przeciwutleniające, przeciwbakteryjne i przeciwnowotworowe. Związkami bioaktywnymi tajwańskiego zielonego propolisu są propoliny, a mianowicie C, D, F i G. Stężenie propoliny w tajwańskim zielonym propolisie różni się w zależności od pory roku i położenia geograficznego. Dlatego tak ważne jest ustalenie standardowej i powtarzalnej procedury określania jakości tajwańskiego zielonego propolisu. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który wykorzystuje ekstrakcję na bazie etanolu, wysokowydajną chromatografię cieczową i analizę aktywności przeciwbakteryjnej w celu scharakteryzowania jakości tajwańskiego zielonego propolisu. Metoda ta wskazuje, że ekstrakcje etanolem w 95% i 99,5% osiągają maksymalny uzysk suchej masy z zielonego propolisu tajwańskiego, uzyskując tym samym najwyższe stężenia propolinów, które mają właściwości przeciwbakteryjne. Zgodnie z tymi ustaleniami, obecny protokół jest uważany za wiarygodny i powtarzalny w określaniu jakości tajwańskiego zielonego propolisu.

Wprowadzenie

Propolis to naturalna mieszanka żywiczna wytwarzana przez gatunek pszczół Apis mellifera. Propolis jest szeroko stosowany od czasów starożytnych w medycynie ludowej. Badanie wykazało niedawno, że propolis jest korzystny w zapobieganiu infekcjom bakteryjnym i stanom zapalnym1. Liczne badania wykazały, że głównymi związkami bioaktywnymi w propolisie są flawonoidy, estry kwasu fenolowego, prenylowane kwasy p-kumarowe i kwasy diterpenowe2,3. Do tej pory za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) zidentyfikowano 10 prenylowanych pochodnych flawanonu z tajwańskiego zielonego propolisu 4,5,6,7. Najliczniejszymi z nich są propoliny C, D, F i G5,7. Znaczące efekty biologiczne tajwańskiego zielonego propolisu są skorelowane z jego wysoką zawartością propolin8.

Stężenia związków bioaktywnych w propolisie różnią się znacznie w zależności od pory roku i lokalizacji geograficznej, z której propolis jest pozyskiwany. Europejski propolis zawiera głównie flawonoid, aglikon i kwasy fenolowe9. Głównymi związkami bioaktywnymi w propolisie z Brazylii są prenylowane kwasy p-kumarowe, takie jak artepillin C10. Badanie wykazało, że pora roku jest krytycznym czynnikiem określającym całkowitą zawartość propoliny w tajwańskim zielonym propolisie11. Zawartość propoliny w tajwańskim zielonym propolisie jest najwyższa latem (maj - lipiec), a najniższa zimą11. Właściwości przeciwbakteryjne propolisu są powszechnie uważane za wskaźnik aktywności biologicznej. Ogólnie rzecz biorąc, próbki propolisu pobrane z różnych regionów wykazywały podobne właściwości przeciwbakteryjne; Na przykład jest ogólnie skuteczny przeciwko prawie wszystkim bakteriom Gram-dodatnim i wykazuje ograniczone działanie przeciwbakteryjne przeciwko bakteriom Gram-ujemnym10,< klasa SUP = "xref">12,< klasa SUP = "Xref">13. Wykazano, że synergiczne interakcje między flawonoidami w propolisie mają działanie przeciwbakteryjne14. Podobnie, doniesiono, że tajwański zielony propolis ma działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko bakteriom Gram-dodatnim15. Co więcej, w jednym z badań zidentyfikowano również działanie przeciwdrobnoustrojowe wynikające z interakcji propoliny w tajwańskim zielonym propolisie8.

Charakterystyka związków bioaktywnych w propolisie jest trudna, ponieważ jego skład chemiczny może się różnić w zależności od źródła pochodzenia. Dlatego konieczne jest ustalenie wykonalnej i powtarzalnej metody określania jakości tajwańskiego zielonego propolisu. Nie ustalono jednak standardowej procedury ekstrakcji tajwańskiego zielonego propolisu i późniejszej analizy funkcjonalnej. Zaproponowano kilka metod, które w różny sposób stosują rozpuszczalniki organiczne i nieorganiczne do ekstrakcji propolisu16,17,18,19,20. Ponieważ propolis jest mieszaniną lipofilową, badania wykazały, że ekstrakcja organiczna jest lepsza niż ekstrakcja nieorganiczna8,18,19. Całkowite stężenie propoliny w tajwańskim zielonym propolisie i jego właściwości przeciwbakteryjne są kluczowymi wskaźnikami jakości tajwańskiego zielonego propolisu. W związku z tym celem niniejszego badania jest przedstawienie protokołu stosowania etanolu jako rozpuszczalnika do ekstrakcji i scharakteryzowania właściwości przeciwbakteryjnych tajwańskiego zielonego propolisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie związków ekstrahowanych etanolem

  1. Zważ 10 g mrożonego tajwańskiego zielonego propolisu, który został zebrany z uli na Tajwanie od maja do lipca, i zmiel go za pomocą młynka do przypraw. Upewnij się, że całe kawałki tajwańskiego zielonego propolisu są zmielone na drobny proszek bez dużych cząstek.
  2. Dodaj 100 ml etanolu o różnych stężeniach (60%, 70%, 80%, 95% i 99,5%) i wodę do oddzielnych kolb i wymieszaj każde stężenie z 10 g zmielonego propolisu.
  3. Inkubować w temperaturze 25 °C i wytrząsać kolbę z prędkością 250 obr./min przez 48 godzin.
  4. Przefiltrować ekstrakty etanolu przez bibułę filtracyjną o porach o wielkości porów 25 μm.
  5. Rozpuścić filtraty do ich pierwotnej objętości (100 ml) w 95% etanolu przy użyciu kolby miarowej.
  6. Przechowywać ekstrakty etanolu w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Przygotowanie ekstraktów etanolowych do HPLC

  1. Zagęścić 10 ml ekstraktów etanolowych przez odparowanie próżniowe w temperaturze 40 °C przez 15 minut.
  2. Suchą masę piec w temperaturze 45 °C przez 24 godziny.
  3. Rozpuść suchą masę w 10 ml 95% etanolu.
  4. Przefiltrować 1 ml ekstraktów etanolowych za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,45 μm.
  5. Ponownie przefiltruj ekstrakty etanolowe za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,22 μm. Przesącz jest zbierany i może być bezpośrednio analizowany za pomocą HPLC.

3. Analiza zawartości Propolin za pomocą HPLC

  1. Wyznaczanie krzywych standardowych propoliny
    1. Przygotować 1 l fazy ruchomej roztworu metanol:woda o proporcji 88,8:11,2 (v/v).
    2. Przygotować seryjne rozcieńczenia standardowych stężeń propoliny (C, D, F i G) (odpowiednio 15,625 mg/ml, 31,25 mg/mL, 62,5 mg/ml i 125 mg/ml) przy użyciu roztworu fazy ruchomej jako rozpuszczalnika.
    3. Wstrzyknąć 20 μl wzorcowych stężeń propoliny do kolumny z odwróconymi fazami, kolejno od niskiego stężenia do wysokiego stężenia.
    4. Ustawić kolumnę HPLC na 30 °C i natężenie przepływu na 1 ml/min.
    5. Ustaw długość fali detektora UV na 280 nm, a czas rejestratora na 20 min.
    6. Przeanalizuj standardy co najmniej 3 razy.
    7. Wykreśl odpowiedź pomiaru (oś y) w stosunku do stężenia (oś x) za pomocą oprogramowania arkusza obliczeniowego i utwórz krzywą standardową z równaniem i wartością R-kwadrat.
  2. Analiza ekstraktu etanolowego s
    1. Wstrzyknąć 20 μl ekstraktów etanolowych otrzymanych w kroku 2.5 do kolumny z odwróconymi fazami.
    2. Ustawić kolumnę HPLC na 30 °C i natężenie przepływu na 1 ml/min.
    3. Ustaw długość fali detektora UV na 280 nm, a czas rejestratora na 20 min.
    4. Przeanalizuj standardy co najmniej 3 razy.
    5. Obliczyć stężenie propoliny w ekstrakcie etanolu, korzystając z równania dla krzywej wzorcowej otrzymanej z kroku 3.1.7, w którym wykorzystuje się powierzchnię piku dla każdej propoliny.

4. Analiza minimalnego stężenia hamującego i minimalnego stężenia bakteriobójczego

UWAGA: Metoda mikrorozcieńczenia służy do oceny skuteczności przeciwbakteryjnej propoliny ekstrahowanej etanolem z tajwańskiego zielonego propolisu.

  1. Przygotowanie organizmów badanych
    1. Rozmrozić szczepy bakterii, Staphylococcus aureus i Escherichia coli, a następnie wyhodować je odpowiednio w bulionie sojowym tryptycznym i bulionie odżywczym w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    2. Przejść S. aureus za pomocą tryptycznego bulionu sojowego i E. coli za pomocą bulionu odżywczego przez dwa pokolenia, a następnie obliczyć jednostki tworzące kolonie, licząc poszczególne kolonie na płytce agarowej.
  2. Przygotowanie ekstraktów etanolowych do badania aktywności przeciwbakteryjnej
    1. Zagęścić ekstrakty etanolowe otrzymane z etapu 1.5 przez odparowanie próżniowe w temperaturze 40 °C przez 15 minut.
    2. Rozpuścić suchą masę za pomocą dimetylosulfotlenku (DMSO) i dostosować stężenie ekstraktu do 12,8 mg/ml.
    3. Wykonać seryjne rozcieńczanie (stężenia: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 i 640 μg/ml) ekstraktów etanolowych za pomocą bulionu.
  3. Badania minimalnego stężenia hamującego
    1. Dodać 10 μl rozcieńczonych ekstraktów etanolowych w zakresie od 0,156 do 640,0 μg/ml do płytki 96-dołkowej.
    2. Używając bulionu, dostosuj objętość do 100 μl i utrzymuj 5% DMSO we wszystkich rozcieńczeniach.
    3. Zaszczepić 100 μl kultury bakteryjnej (1 x 106/ml) do płytki 96-dołkowej.
    4. Inokulum hodowlane zawierające ekstrakty etanolowe o różnych stężeniach w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
    5. Przeanalizować wzrost bakterii pod kątem zmętnienia i przy użyciu gęstości optycznej (czytnik mikropłytek) przy 590 nm w celu określenia minimalnego stężenia hamującego (MIC).
  4. Badania minimalnych stężeń bakteriobójczych
    1. Zaszczepić 10 μl płynnej kultury z każdej studzienki testu MIC, która nie wykazywała wzrostu, na płytce agarowej.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    3. Określ aktywność bakteriobójczą, identyfikując najniższe stężenie, które nie wykazało widocznego wzrostu bakterii. Stężenie, które całkowicie eliminuje wzrost komórek, jest uważane za minimalne stężenie bakterii (MBC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykładowe wyniki pozytywne dla ekstrakcji etanolem przedstawiono w Tabeli 1. Uzysk suchej masy z zielonego propolisu z Tajwanu był powiązany dodatnio z stężeniem etanolu. Ekstrakty etanolem o stężeniu 95% i 99,5% charakteryzowały się najwyższym uzyskiem suchej masy z zielonego propolisu z Tajwanu. Najniższy uzysk suchej masy z zielonego propolisu z Tajwanu uzyskano, gdy jako rozpuszczalnik ekstrakcyjny użyto wody. Wyniki te wskazują, że rozpuszczalnik organiczny, taki j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie wykazało, że maceracja przy użyciu różnych stężeń etanolu może być stosowana do ekstrakcji brazylijskiego propolisu17; Proces ten był jednak czasochłonny17. Ekstrakcja związków bioaktywnych, takich jak zawartość fenoli, z brazylijskiego propolisu17 zajęła co najmniej 10 dni. Alternatywnie, ekstrakcja etanolem w połączeniu z ogrzewaniem w temperaturze 37 °C, 50 °C lub 70 °C przez 30 minut została zaproponowana do ekstrakcji brazylijskiego prop...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Podziękowania

Ten rękopis został zredagowany przez Wallace Academic Editing.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
etanolSigma-AldrichE7023
Whatman nr 4 bibuła filtracyjnaSigma-AldrichWHA1004125
metanolSigma-Aldrich34860
kolumna odwróconej fazy RP-18Phenomenex Inc.00G-0234-E0
Staphylococcus aureusATCCBCRC 10780
Escherichia coliATCCBCRC 10675
tryptyczny bulion sojowySigma-Aldrich22092
pożywny bulionSigma-Aldrich70122
dimetylosulfotlenekSigma-AldrichD2650
młynekdo przyprawWaringWSG60K
Czytnik mikropłytekUrządzenia molekularneSystem EMAX PLUS
HPLCAgilent1200 Series
odparowywanie próżnioweBÜ CHIRotavapor R-215

Bibliografia

  1. Zabaiou, N., et al. Biological properties of propolis extracts: Something new from an ancient product. Chemistry and Physics of Lipids. 207 (Pt B), 214-222 (2017).
  2. Bankova, V. B., De Castro, S. L., Marcucci, M. C. Propolis: Recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie. 31 (1), 3-15 (2000).
  3. Park, Y. K., Alencar, S. M., Aguiar, C. L. Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (9), 2502-2506 (2002).
  4. Chen, C. N., Wu, C. L., Shy, H. S., Lin, J. K. Cytotoxic prenylflavanones from Taiwanese propolis. Journal of Natural Products. 66 (4), 503-506 (2003).
  5. Chen, C. N., Weng, M. S., Wu, C. L., Lin, J. K. Comparison of radical scavenging activity, cytotoxic effects and apoptosis induction in human melanoma cells by Taiwanese propolis from different sources. Evidence-Based Complementary and Alternative. 1 (2), 175-185 (2004).
  6. Chen, C. N., Wu, C. L., Lin, J. K. Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwanese propolis. Cancer Letters. 24 (1-2), 218-231 (2007).
  7. Huang, W. J., et al. Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese propolis, induces caspase-dependent apoptosis in brain cancer cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (18), 7366-7376 (2007).
  8. Chen, Y. W., Ye, S. R., Ting, C., Yu, Y. H. Antibacterial activity of propolins from Taiwanese green propolis. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 761-768 (2018).
  9. Hegazi, A. G., Abd El Hady, F. K., Abd Allah, F. A. M. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Zeitschrift für Naturforschung. 55 (1-2), 70-75 (2000).
  10. Sforcin, J. M., Fernandes, A., Lopes, C. A. M., Bankova, V., Funari, S. R. C. Seasonal effect on Brazilian propolis antibacterial activity. Journal of Ethnopharmacology. 73 (1-2), 243-249 (2000).
  11. Chen, Y. W., et al. Characterization of Taiwanese propolis collected from different locations and seasons. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88 (3), 412-419 (2008).
  12. Grange, J. M., Davey, R. W. Antibacterial properties of propolis (bee glue). Journal of the Royal Society of Medicine. 83 (3), 159-160 (1990).
  13. Kujumgiev, A., et al. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis from different geographic origins. Journal of Ethnopharmacology. 64 (3), 235-240 (1999).
  14. Krol, W., Scheller, S., Shani, J., Pietsz, G., Czuba, Z. Synergistic effect of ethanol extract of propolis and antibiotics in the growth of Staphylococcus aureus. Drug Research. 43 (5), 607-609 (1993).
  15. Lu, L. C., Chen, Y. W., Chou, C. C. Antibacterial and DPPH free radical-scavenging activities of the ethanol extract of propolis collected in Taiwan. Journal of Food and Drug Analysis. 11 (4), 277-282 (2003).
  16. Tosi, B., Donini, A., Romagnoli, C., Bruni, A. Antimicrobial activity of some commercial extracts of propolis prepared with different solvents. Phytotherapy Research. 10 (4), 335-336 (1996).
  17. Cunha, I. B. S., et al. Factors that influence the yield and composition of Brazilian propolis extracts. Journal of the Brazilian Chemical Society. 15 (6), 964-970 (2004).
  18. Woo, S. O., Hong, I. P., Han, S. M. Extraction properties of propolis with ethanol concentration. Journal of Apicultural Research. 30 (3), 211-216 (2015).
  19. Park, Y. K., Ikegaki, M. Preparation of water and ethanolic extracts of propolis and evaluation of the preparations. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (11), 2230-2232 (1998).
  20. Ramanauskienė, K., Inkėnienė, A. M. Propolis oil extract: quality analysis and evaluation of its antimicrobial activity. Natural Product Research. 25 (15), 1463-1468 (2011).
  21. Machado, B. A., et al. Chemical composition and biological activity of extracts obtained by supercritical extraction and ethanolic extraction of brown, green and red propolis derived from different geographic regions in brazil. PLoS One. 11 (1), e0145954(2016).
  22. Monroy, Y. M., et al. Brazilian green propolis extracts obtained by conventional processes and by processes at high pressure with supercritical carbon dioxide, ethanol and water. The Journal of Supercritical Fluids. 130, 189-197 (2017).
  23. Popova, M., Chen, C. N., Chen, P. Y., Huang, C. Y., Bankova, V. A validated spectrophotometric method for quantification of prenylated flavanones in pacific propolis from Taiwan. Phytochemical Analysis. 21 (2), 186-191 (2010).
  24. Chen, L. H., et al. Taiwanese green propolis ethanol extract delays the progression of type 2 diabetes mellitus in rats treated with streptozotocin/high-fat diet. Nutrients. 10 (4), e503(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja etanolemwysokosprawna chromatografia cieczowaanaliza aktywności przeciwbakteryjnejstężenie propolinwydajność suchej masyminimalne stężenie hamująceHPLC w fazie odwróconejdetektor UV przy 280 nmtest mikrorozcieńczeń w pożywce płynnej
Ekstrakcja i analiza tajwańskiego zielonego propolisu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.