Wykorzystanie Ustilago maydis jako konia trojańskiego do dostarczania białek kukurydzianych in situ

Podsumowanie

Ta praca opisuje klonowanie szczepu konia trojańskiego Ustilago maydis w celu dostarczania in situ wydzielanych białek kukurydzy do trzech różnych typów tkanek kukurydzy.

Streszczenie

Zainspirowani mitem o koniu trojańskim Homera, zaprojektowaliśmy patogen kukurydzy Ustilago maydis, aby dostarczał wydzielane białka do apopplastu kukurydzy, umożliwiając analizę fenotypową in vivo. Metoda ta nie opiera się na transformacji kukurydzy, ale wykorzystuje genetykę drobnoustrojów i zdolności wydzielnicze patogenów. W ten sposób umożliwia inspekcję in vivo wydzielanych białek dostarczanych z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w różnych rodzajach miejsc infekcji i tkanek. Strategia konia trojańskiego może być wykorzystana do przejściowego uzupełniania fenotypów utraty funkcji kukurydzy, do funkcjonalnego charakteryzowania domen białkowych, do analizy efektów białkowych poza celem lub do badania przedawkowania białka po stronie kukurydzy, co czyni ją potężnym narzędziem do badań białek w systemie uprawy kukurydzy. Praca ta zawiera dokładny protokół generowania szczepu konia trojańskiego, a następnie standardowe protokoły infekcji w celu zastosowania tej metody do trzech różnych typów tkanek kukurydzy.

Wprowadzenie

Biotroficzny patogen Ustilago maydis jest czynnikiem wywołującym chorobę pleśni kukurydzianej¹. Infekuje wszystkie nadziemne części kukurydzy, powodując powstawanie dużych guzów, które zawierają melanizowane, czarne zarodniki. Szacuje się, że na poziomie globalnym U. maydis powoduje roczną utratę około 2% plonów kukurydzy, podczas gdy nowotwory są cenione jako gastronomiczny przysmak w Meksyku. Infekcja roślin jest inicjowana przez appressorium, które wydziela enzymy lizujące ścianę komórkową, aby wniknąć do pierwszej warstwy komórek naskórka kukurydzy. Z pierwotnego miejsca infekcji U. maydis rośnie wewnątrzkomórkowo i międzykomórkowo, atakując od jednej do dwóch warstw komórek każdego dnia^1,2. Udana infekcja powoduje przerost roślin, który przekształca się w widoczne guzy po pięciu dniach od infekcji^1,3,4. Podczas wszystkich etapów infekcji strzępki grzybów wnikają w błonę cytoplazmy rośliny bez bezpośredniego kontaktu z cytoplazmą gospodarza^1,2. Ciasna przestrzeń apoplazmatyczna między infekującymi strzępkami a błoną plazmatyczną rośliny jest uważana za miejsce interakcji gospodarz/patogen, zwane strefą interakcji biotroficznej. W celu pokonania wrodzonego układu odpornościowego rośliny, U. maydis wydziela szereg białek efektorowych do strefy interakcji biotroficznej¹. Niektóre efektory są pobierane przez komórki roślinne, podczas gdy inne pozostają w strefie interakcji biotroficznej^5,6,7,8. Jednym z efektorów apoplastycznych jest UmPit2, który oddziałuje z apoplastycznymi proteazami kukurydzy, aby zapobiec uwalnianiu peptydu sygnałowego ZmZIP1 z ZmPROZIP przez aktywność proteazy apoplastycznej^9,10.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci U. maydis stał się nie tylko modelem genetyki grzybów w interakcji roślina-patogen, ale także cennym narzędziem w biotechnologii ze względu na dobrze poznany cykl życia, łatwą dostępność genetyczną i heterologiczną ekspresję wydzielanych białek^11,12,13. Określono sygnały zarówno dla konwencjonalnego, jak i niekonwencjonalnego wydzielania białek, co pozwala na kontrolę modyfikacji potranslacyjnych¹⁴. Ostatnio U. maydis został wykorzystany jako koń trojański do badania małych, wydzielanych białek kukurydzy in situ¹⁵. Podejście oparte na koniu trojańskim zostało z powodzeniem wykorzystane do analizy funkcji małego, wydzielanego białka ZmMAC1, które bierze udział w rozwoju innych. ZmMAC1 indukuje podział peryklinalny komórek pluripotencjalnych i specyfikację losu komórek nowo powstałych komórek¹⁵. Tą samą metodą ujawniono biologiczną funkcję peptydu ZmZIP1 związanego z uszkodzeniem kukurydzy. Wydzielanie przez U. maydis kukurydzy ZmZIP1 spowodowało upośledzenie tworzenia guza¹⁰. W związku z tym podejście oparte na koniu trojańskim stanowi cenną alternatywę dla badań białek in situ o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, która nie wymaga generowania stabilnych linii transformacji kukurydzy ani infiltracji tkanek heterologicznie wyrażonymi i oczyszczonymi białkami. W szczególności strategia konia trojańskiego umożliwia wydzielanie dowolnego heterologicznego białka do apoplastu kukurydzy i bezpośrednie porównanie zakażonych i niezakażonych komórek roślinnych w tej samej tkance.

Ten protokół ilustruje główne kroki do wygenerowania szczepu konia trojańskiego U. maydis w celu zbadania interesującego białka. Ponadto zawiera dokładne informacje na temat procedur infekcji trzech różnych typów tkanek kukurydzy (dorosłe liście, frędzle i kłosy) U. maydis, co jest warunkiem wstępnym do badania progresji infekcji czasoprzestrzennej i funkcji białek w tych tkankach docelowych. Nie podano dalszych specyfikacji dotyczących amplifikacji genów kukurydzy i technik obrazowania mikroskopowego, ponieważ etapy te są specyficzne dla celu i zależne od instrumentu. W związku z tym protokół ten jest skierowany do doświadczonych użytkowników standardowych technik biologii molekularnej.

Protokół

1. Budowa konia trojańskiego U. maydis

UWAGA: Zobacz Rysunek 1.

1. Amplifikacja interesującego genu z cDNA kukurydzy przy użyciu starterów specyficznych dla genu i polimerazy DNA z korektą. Sklonuj podstawowy produkt PCR i przekształć konstrukt w E. coli zgodnie z instrukcjami dostawcy plazmidu. Sprawdź poprawność sekwencji genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą sekwencjonowania Sangera przed użyciem do następnych etapów klonowania.
   nuta: Specyfikacje PCR muszą być zoptymalizowane ze względu na specyficzność sekwencji starterów i optymalne warunki reakcji polimerazy DNA.
2. Zaprojektuj startery do amplifikacji genu kukurydzy będącego przedmiotem zainteresowania bez sekwencji kodującej peptyd sygnałowy (SP).
3. Przedłuż 5' koniec podkładu odwrotnego z motywem RSIATA i miejscem cięcia NcoI (Tabela 1).
4. Amplifikować gen kukurydzy za pomocą polimerazy DNA z korektą przy użyciu konstruktu PCR wygenerowanego w 1.1 jako matrycy PCR.
5. Podwójnie trawić produkt PCR i plazmid transformacyjny U. maydis, p123-P_{Umpit2-Sp Umpit2-Zm} mac1-mCherry-Ha¹⁵, za pomocą XbaI i NcoI. Oczyść strawiony produkt PCR i plazmid.
6. Związać strawiony produkt PCR do matrycy p123-P_{Umpit2-Sp Umpit2-Zm} mac1-mCherry-Ha przy użyciu ligazy DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta. Przekształć produkt ligacji w E. coli i zweryfikuj prawidłową sekwencję genu zainteresowania za pomocą sekwencjonowania Sangera.
7. Linearyzuj gen p123-P_{Um pit2-Sp Um pit2-Zm} of interest-mCherry-Ha za pomocą enzymu restrykcyjnego SspI i przekształć DNA w solopatogenny szczep U. maydis SG200¹⁶. Wyizoluj transformanty U. maydis przez selekcję karboksyny i potwierdź izolowane transformanty za pomocą analizy Southern blot¹⁶.
   nuta: Dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania należy wyizolować i przeanalizować co najmniej trzy niezależne transformanty U. maydis w celu oszacowania wszelkich efektów fenotypowych losowych mutacji tła.

2. Pożywki hodowlane

1. Przygotuj płynne podłoże YEPSlight ¹⁶: 1,0% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 0,4% (w/v) baktopeptonu i 0,4% (w/v) sacharozy. Rozpuścić wszystkie składniki w ddH₂O i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; Autoklawowanie w wyższej temperaturze, przez dłuższy czas lub wielokrotnie obniżyłoby jakość podłoża.
2. Przygotuj agar ziemniaczany z dekstrozą (PD-agar)²⁰: 3,9% (w/v) agar z dekstrozą ziemniaczaną i 1,0% (w/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (f.c. 0,01 M). Wymieszaj wszystkie składniki bezpośrednio w butelce do autoklawowania i dodaj ddH₂O plus mieszadło magnetyczne. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min; Autoklawowanie w wyższej temperaturze, przez dłuższy czas lub wielokrotnie obniżyłoby jakość podłoża.
3. Przygotuj PD-Charcoal agar²⁰: 3,9% (w/v) agaru z dekstrozą ziemniaczaną, 1% (w/v) węgla drzewnego i 1,0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (f.c. 0,01 M). Wymieszaj wszystkie składniki bezpośrednio w butelce do autoklawowania i dodaj ddH₂O plus mieszadło magnetyczne. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min; Autoklawowanie w wyższej temperaturze, przez dłuższy czas lub wielokrotnie obniżyłoby jakość podłoża.

3. Infekcja roślin

1. Należy wcześniej przeprowadzić analizę podziału komórek kukurydzy w odpowiedzi na białko dostarczone przez konia trojańskiego (np. zliczanie komórek w oparciu o mikroskopię). Proliferacja komórek kukurydzy wywołana przez U. maydis, a następnie tworzenie się nowotworu rozpoczyna się około 4-5 dni po zakażeniu. Ilościowa ocena choroby jest zależna od tkanki i powinna być wykonywana od 6 do 14 dni po zakażeniu.
   nuta: Poszczególne odmiany kukurydzy wykazują różny poziom podatności na zakażenie U. maydis. Kukurydza cvs. W23, A188, Gaspe flint, Early Golden Bantam czy Va35 wykazują podatność na ten patogen i dlatego są odpowiednimi odmianami do badań nad koniem trojańskim.
2. Przygotowanie inokulum U. maydis
   1. Włączenie szczepu progenitorowego SG200 jako kontroli negatywnej do wszystkich eksperymentów z końmi trojańskimi w celu oszacowania skutków ubocznych zakażenia szczepem transgenicznym. W tym przypadku użyj szczepu U. maydis wyrażającego niewydzielaną wersję białka będącego przedmiotem zainteresowania jako kontrolę negatywną. Jednak ze względu na praktyczność (np. większe badania przesiewowe) szczep progenitorowy może być łatwiejszym wyborem kontroli.
   2. Przed rozpoczęciem eksperymentu oszacuj, jakie ilości kultury infekcji są potrzebne. Należy pamiętać, że zakażenie każdej rośliny wymaga 1 - 1,5 ml zawiesiny U. maydis w zależności od rodzaju tkanki kukurydzy.
      nuta: Około 1 ml kultury na noc wystarcza do rozcieńczenia do OD₆₀₀ 0,2 w 20 ml_lekkiej pożywki YEPS, a 25 ml kultury U. maydis z OD₆₀₀ 0,8-1,0 jest wystarczające do zakażenia 13-16 roślin.
   3. Zeskrobać U. maydis z płytki agarowej PD za pomocą sterylnej pipety Pasteura, zaszczepić w 5 ml_lekkiej pożywki YEPS i pozwolić kulturze rosnąć w temperaturze 28 °C z ciągłym wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 16 godzin.
   4. Przed zakażeniem należy zbadać kulturę inokulacji U. maydis za pomocą standardowej mikroskopii świetlnej pod kątem prawidłowego wzrostu i zanieczyszczenia bakteryjnego przy 400-krotnym powiększeniu.
      nuta: W odpowiedniej kulturze widoczny jest tylko grzyb w kształcie cygara (Rysunek 2).
   5. Zmieszać 900 μl świeżego_światła YEPS ze 100 μl nocnej hodowli i zmierzyć OD₆₀₀ przy użyciu_{pożywki świetlnej} YEPS jako ślepej próby w analizie spektrofotometru.
   6. Rozcieńczyć kulturę przez noc świeżą_lekką pożywką YEPS do OD₆₀₀ 0,2 i pozwolić kulturze rosnąć w temperaturze 28 °C z ciągłym wstrząsaniem przy 200 obr./min, aż do osiągnięcia środkowej fazy wzrostu wskazanej przez OD_{600 nm} 0,8-1,0,
      UWAGA: W tych warunkach komórki U. maydis namnażają się co 2 godziny, a więc pożądany OD₆₀₀ osiąga się po 4-5 godzinach hodowli.
   7. Zebrać komórki przy OD₆₀₀ 0,8-1,0, wirując z prędkością 3,000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
   8. Umyj osad komórkowy jeden raz za pomocą ddH₂O. W tym celu dodać jedną objętość kultury ddH₂O, wirować z 3000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
   9. Ostrożnie zawiesić osad komórkowy w ddH₂O za pomocą szklanej pipety o pojemności 20 ml, dostosowując w ten sposób końcową wartość OD₆₀₀ do 3,0 (dla testu na koniu trojańskim) lub 1,0 (dla oceny choroby).
3. Weryfikacja konia trojańskiego: w roślinie wydzielanie białka fuzyjnego kukurydzy
   1. Zainfekuj siewki kukurydzy szczepem konia trojańskiego¹⁷.
   2. Wykonaj obrazowanie mikroskopowe zakażonych siewek po 2-3 dniach od zakażenia za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. W tym celu należy wyciąć prostokątny kawałek liścia 1 cm poniżej punktu wstrzyknięcia, umieścić próbkę na szkiełku mikroskopowym i dodać kroplę ddH₂O. Aby uwidocznić białko fuzyjne mCherry, należy wzbudzić próbkę przy λ= 561 nm i zarejestrować emisję przy λ= 580 - 630 nm.
4. Zakażenie dorosłych liści kukurydzy
   1. Uprawiać rośliny kukurydzy do stadium dojrzałych liści (gdy co najmniej 7 liści wyrasta w łodydze).
      nuta: Faza ta osiągana jest po czterech tygodniach od siewu w warunkach szklarniowych 14 godzin, 28 °C w dzień/10 godzin, 22 °C w rytmie nocnym odmiany W23. Czas trwania może się różnić w zależności od odmiany kukurydzy i warunków szklarniowych.
   2. Przenieść posiew U. maydis (patrz 3.2.9) do strzykawki o pojemności 3 ml z igłą podskórną 20G x 1.
   3. Ostrożnie dociśnij łodygę, aby zlokalizować tkankę merystemu w łodydze. Podstawę merystemu można odróżnić po przejściu od twardszej łodygi do bardziej miękkiej tkanki.
   4. Zaznacz merystem na łodydze za pomocą długopisu.
   5. Wstrzyknąć 1,5 ml kultury U. maydis 1 cm powyżej merystema pędu lub merystema kwiatostanowego.
   6. Oceń objawy choroby po 6 i 12 dniach od zakażenia.
5. Zakażenie frędzli
   1. Uprawiaj rośliny kukurydzy aż do osiągnięcia fazy frędzli.
      nuta: Szczegółowe kalendarium rozwoju pylników i frędzli w odmianie kukurydzy. W23 był wcześniej opisany ^18,19. Frędzle zawierające pylniki pre-mejotyczne są bardzo podatne na zakażenie U. maydis; W odmianie kukurydzy Frędzle W23 są wielkości 4 - 7 cm.
   2. Ostrożnie dociśnij łodygę, aby zlokalizować frędzel w łodydze.
   3. Zaznacz końcówkę i podstawę frędzla na łodydze za pomocą długopisu.
   4. Przenieść posiew U. maydis (patrz 3.2.9) do strzykawki o pojemności 3 ml z igłą podskórną 20G x 1.
   5. Wstrzyknąć 1,5 ml inokulum wokół frędzla. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum, powoli umieść po 0,5 ml na końcówce, środkowej części i podstawie frędzla zaznaczonej pisakiem.
   6. Oceń objawy choroby po 10 dniach od zakażenia.
6. Zakażenie uszu
   UWAGA: Rozwój tkanek ucha różni się w zależności od różnych odmian kukurydzy i warunków szklarniowych i musi być uważnie obserwowany przed inokulacją. Uszy zaczynające wyrastać z jedwabiu są bardzo podatne na zakażenie U. maydis.
   1. Przenieść posiew U. maydis (patrz 3.2.9) do strzykawki o pojemności 3 ml z igłą podskórną 20 G x 1.
   2. Wstrzyknąć igłę do zaszczepiania w przestrzeń między liśćmi łuski tak głęboko, jak to możliwe, nie uszkadzając ucha.
   3. Uwolnij 1,5 ml inokulum wokół ucha.
   4. Wyjąć strzykawkę z igłą i ostrożnie wmasować kolbę, aby równomiernie rozprowadzić roztwór U. maydis.
   5. Oceń objawy choroby po 14 dniach od zakażenia.
7. Potwierdzić żywotność inokulum U. maydis
   1. Upuść 10 μl inokulum na płytkę z agarem z węgla drzewnego PD i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 dni.
      nuta: Jeśli odpowiednia kultura U. maydis jest w stanie tworzyć włókna, widoczna staje się puszysta, biała grzybnia (Rysunek 5)

Wyniki

Konstrukcje dla U. maydis Doświadczenia typu koń trojański są klonowane do plazmidu p123-P_Umpit2-Sp_Hmpit2-gen zainteresowania-mCherry-HaBadany gen kukurydzy jest połączony z mCherry reporter fluorescencyjny i epitop Kwas hialuronowy-tag. Ekspresja białka fuzyjnego znajduje się pod kontrolą U. maydis Hmpit2 promotor aktywowany specyficznie podczas infekcji

Dyskusja

Nowoczesne badania nad uprawami wymagają protokołów analizy molekularnej na poziomie genetycznym i białkowym. Dostępność genetyczna poprzez transformację jest niedostępna lub jest nieefektywna i czasochłonna w przypadku większości gatunków roślin uprawnych, takich jak kukurydza. Co więcej, wiarygodne narzędzia genetyczne, takie jak systemy reporterowe promotorów, są rzadkie, co utrudnia badanie funkcji białek in situ z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w różnych miejscach tkanki. Białka apoplastyczne możn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka 2 ml	B. Braun	4606027V
23 G x 1 1/4 igła podskórna	B. Braun	4657640
Bacto Peptone	BD	211677
cDNA z kukurydzy			z tkanki kukurydzy wyrażającej gen zainteresowania
Węgiel drzewny	Sigma-Aldrich	05105
Konfokalny laserowy mikroskop			wykorzystuje lokalnie dostępny sprzęt
Kuweta (10 mm x 4 mm x 45 mm)	Sarstedt	67742
Inkubator-wytrząsarka ustawiona na 28 ° C, 200 obr./min			korzystać z lokalnie dostępnego sprzętu
Mikroskop świetlny z 400-krotnym powiększeniem			korzystać z lokalnie dostępnego sprzętu
Nco I	NEB	R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha			prosimy o kontakt z autorem korespondencyjnym
Pipeta Pasteura (szklana, długa końcówka)	VWR	14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO	Thermo Fisher Scientific	K280002	można wymienić na inne podstawowe wektory klonowania, takie jak pENTR lub pJET
Agar ziemniaczany i dekstroza	VWR	90000-745
Sharpie Pen			używać lokalnie dostępnego sprzętu
Spektrofotometr			używać lokalnie dostępnego sprzętu
Ssp I	NEB	R0132
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389
T4 Ligaza DNA	NEB	M0202
TRIS	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Xba I	NEB	R0145
Ekstrakt drożdżowy	BD	212750

skaningowy