Ta praca opisuje klonowanie szczepu konia trojańskiego Ustilago maydis w celu dostarczania in situ wydzielanych białek kukurydzy do trzech różnych typów tkanek kukurydzy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie Ustilago maydis jako konia trojańskiego do dostarczania białek kukurydzianych in situ
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zainspirowani mitem o koniu trojańskim Homera, zaprojektowaliśmy patogen kukurydzy Ustilago maydis, aby dostarczał wydzielane białka do apopplastu kukurydzy, umożliwiając analizę fenotypową in vivo. Metoda ta nie opiera się na transformacji kukurydzy, ale wykorzystuje genetykę drobnoustrojów i zdolności wydzielnicze patogenów. W ten sposób umożliwia inspekcję in vivo wydzielanych białek dostarczanych z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w różnych rodzajach miejsc infekcji i tkanek. Strategia konia trojańskiego może być wykorzystana do przejściowego uzupełniania fenotypów utraty funkcji kukurydzy, do funkcjonalnego charakteryzowania domen białkowych, do analizy efektów białkowych poza celem lub do badania przedawkowania białka po stronie kukurydzy, co czyni ją potężnym narzędziem do badań białek w systemie uprawy kukurydzy. Praca ta zawiera dokładny protokół generowania szczepu konia trojańskiego, a następnie standardowe protokoły infekcji w celu zastosowania tej metody do trzech różnych typów tkanek kukurydzy.
Wprowadzenie
Biotroficzny patogen Ustilago maydis jest czynnikiem wywołującym chorobę pleśni kukurydzianej1. Infekuje wszystkie nadziemne części kukurydzy, powodując powstawanie dużych guzów, które zawierają melanizowane, czarne zarodniki. Szacuje się, że na poziomie globalnym U. maydis powoduje roczną utratę około 2% plonów kukurydzy, podczas gdy nowotwory są cenione jako gastronomiczny przysmak w Meksyku. Infekcja roślin jest inicjowana przez appressorium, które wydziela enzymy lizujące ścianę komórkową, aby wniknąć do pierwszej warstwy komórek naskórka kukurydzy. Z pierwotnego miejsca infekcji U. maydis rośnie wewnątrzkomórkowo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Budowa konia trojańskiego U. maydis
UWAGA: Zobacz Rysunek 1.
- Amplifikacja interesującego genu z cDNA kukurydzy przy użyciu starterów specyficznych dla genu i polimerazy DNA z korektą. Sklonuj podstawowy produkt PCR i przekształć konstrukt w E. coli zgodnie z instrukcjami dostawcy plazmidu. Sprawdź poprawność sekwencji genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą sekwencjonowania Sangera przed użyciem do następnych etapów klonowania.
nuta: Specyfikacje PCR muszą być zoptymalizowane ze względu na specyficzność sekwencji star....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Konstrukcje dla U. maydis Doświadczenia typu koń trojański są klonowane do plazmidu p123-PUmpit2-SpHmpit2-gen zainteresowania-mCherry-HaBadany gen kukurydzy jest połączony z mCherry reporter fluorescencyjny i epitop Kwas hialuronowy-tag. Ekspresja białka fuzyjnego znajduje się pod kontrolą U. maydis Hmpit2 promotor aktywowany specyficznie podczas infekcji
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nowoczesne badania nad uprawami wymagają protokołów analizy molekularnej na poziomie genetycznym i białkowym. Dostępność genetyczna poprzez transformację jest niedostępna lub jest nieefektywna i czasochłonna w przypadku większości gatunków roślin uprawnych, takich jak kukurydza. Co więcej, wiarygodne narzędzia genetyczne, takie jak systemy reporterowe promotorów, są rzadkie, co utrudnia badanie funkcji białek in situ z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w różnych miejscach tkanki. Białka apoplastyczne możn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Thomasowi Dresselhausowi, Martinowi Parniske, Noureddine Djella i Arminowi Hildebrandowi za udostępnienie przestrzeni laboratoryjnej i materiału roślinnego. Pierwotne prace nad metodą konia trojańskiego były wspierane przez stypendium podoktorskie Leopoldina i projekt NSF IOS13-39229. Prace przedstawione w tym artykule były wspierane przez SFB924 (projekty A14 i B14) DFG.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka 2 ml | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 igła podskórna | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA z kukurydzy | z tkanki kukurydzy wyrażającej gen zainteresowania | ||
| Węgiel drzewny | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Konfokalny laserowy mikroskop | wykorzystuje lokalnie dostępny sprzęt | ||
| Kuweta (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Inkubator-wytrząsarka ustawiona na 28 ° C, 200 obr./min | korzystać z lokalnie dostępnego sprzętu | ||
| Mikroskop świetlny z 400-krotnym powiększeniem | korzystać z lokalnie dostępnego sprzętu | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | prosimy o kontakt z autorem korespondencyjnym | ||
| Pipeta Pasteura (szklana, długa końcówka) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | można wymienić na inne podstawowe wektory klonowania, takie jak pENTR lub pJET |
| Agar ziemniaczany i dekstroza | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie Pen | używać lokalnie dostępnego sprzętu | ||
| Spektrofotometr | używać lokalnie dostępnego sprzętu | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 Ligaza DNA | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Ekstrakt drożdżowy | BD | 212750 |
Bibliografia
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Jour....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
