Artykuł metodologiczny

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

DOI:

10.3791/58754

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transient receptor potential channels (TRPCs) kanonicznej podrodziny TRP to nieselektywne kanały kationowe, które odgrywają istotną rolę w homeostazie wapnia, szczególnie w magazynowaniu wapnia, co jest kluczowe dla utrzymania prawidłowego funkcjonowania uwalniania pęcherzyków synaptycznych i wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych. W związku z tym kanały TRPC są zaangażowane w różne choroby ludzkie, w tym zaburzenia sercowo-naczyniowe, takie jak przerost serca, zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona i zaburzenia neurologiczne, takie jak ataksja rdzeniowo-móżdżkowa. W związku z tym kanały TRPC stanowią potencjalny cel farmakologiczny w chorobach człowieka. Jednak molekularne mechanizmy bramkowania w tych kanałach są nadal niejasne. Trudność w uzyskaniu dużych ilości stabilnego, jednorodnego i oczyszczonego białka była czynnikiem ograniczającym w badaniach nad określaniem struktury, szczególnie w przypadku białek błonowych ssaków, takich jak kanały jonowe TRPC. W tym miejscu przedstawiamy protokół ekspresji białek błonowych kanałów jonowych ssaków na dużą skalę przy użyciu zmodyfikowanego systemu transferu genów bakulowirusa i oczyszczania tych białek za pomocą chromatografii powinowactwa i wykluczania wielkości. Ponadto przedstawiamy protokół zbierania obrazów z mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek z oczyszczonego białka i wykorzystania tych obrazów do określenia struktury białka. Określanie struktury jest potężną metodą zrozumienia mechanizmów bramkowania i funkcji w kanałach jonowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wapń bierze udział w większości procesów komórkowych, w tym w kaskadach sygnałowych, kontroli transkrypcji, uwalnianiu neuroprzekaźników i syntezie cząsteczek hormonów1,2,3. Homeostatyczne utrzymanie wolnego wapnia cytozolowego ma kluczowe znaczenie dla zdrowia i funkcjonowania komórek. Jednym z głównych mechanizmów wewnątrzkomórkowej homeostazy wapnia jest wejście wapnia w magazynie (SOCE), proces, w którym wyczerpanie wapnia zmagazynowanego w retikulum endoplazmatycznym (ER) wyzwala otwarcie kanałów jonowych na błonie plazmatycznej, aby ułatwić uzupełnienie wapnia ER, który może być następnie wykorzystany w dalszej sygnalizacji4,5,6. Przejściowe kanały potencjału receptora (TRPC), które są przepuszczalnymi dla wapnia kanałami należącymi do nadrodziny TRP, zostały zidentyfikowane jako główny uczestnik SOCE7,8,9 .

Wśród siedmiu członków rodziny TRPC, TRPC3, TRPC6 i TRPC7 tworzą podgrupę homologów i są unikalne pod względem zdolności do aktywacji przez wtórny przekaźnik lipidowy diacyloglicerol (DAG), produkt degradacji sygnalizacyjnego lipidu fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforanu (PIP2)10,11. TRPC3 ulega silnej ekspresji w mięśniach gładkich oraz w obszarach mózgowych i móżdżku mózgu, gdzie odgrywa istotną rolę w sygnalizacji wapniowej, która wpływa na neuroprzekaźnictwo i neurogenezę12,13. Dysfunkcja TRPC3 została powiązana z zaburzeniami ośrodkowego układu nerwowego, zaburzeniami sercowo-naczyniowymi i niektórymi nowotworami, takimi jak gruczolakorak jajnika14,15,16. W związku z tym TRPC3 jest obiecującym celem farmaceutycznym w leczeniu tych chorób. Rozwój specyficznie ukierunkowanych leków działających na TRPC3 był ograniczony przez brak zrozumienia mechanizmów aktywacji molekularnej TRPC3, w tym miejsc wiązania lipidów17,18. Opisaliśmy pierwszą strukturę o rozdzielczości atomowej ludzkiego kanału TRPC3 (hTRPC3) i jego dwóch miejsc wiązania lipidów w stanie zamkniętym, dostarczając ważnych informacji na temat tych mechanizmów19.

Kluczowym czynnikiem dla określenia struktury białka błonowego w wysokiej rozdzielczości jest uzyskanie białka o wysokiej jakości. Odpowiednie badania przesiewowe warunków ekspresji i oczyszczania niezbędnych do uzyskania wysokiej jakości białka mogą być czasochłonnym i kosztownym przedsięwzięciem. W tym miejscu przedstawiamy protokół opisujący szczegółowo, w jaki sposób identyfikujemy optymalne warunki do ekspresji i oczyszczania hTRPC3, który zachowywał się źle w naszym wstępnym badaniu przesiewowym. Przedstawiamy kilka kluczowych punktów dotyczących rozwiązywania problemów i optymalizacji zachowania białek, które stanowią solidną podstawę dla naszych badań nad mikroskopią krioelektronową (cryo-EM). Używamy zmodyfikowanego wektora generującego bakulowirusa (pEG), opracowanego przez Gouaux i współpracowników, który jest zoptymalizowany pod kątem testów przesiewowych i wydajnego generowania bakulowirusa w komórkach ssaków20. Ta metoda ekspresji jest odpowiednia do szybkiej i opłacalnej nadekspresji białek w błonie komórkowej ssaków. Łączymy użycie tego wektora z metodą wstępnego przesiewowego wykrywania fluorescencji opartą na chromatografii z wykluczeniem wielkości (FSEC)21. Metoda ta wykorzystuje znacznik białka zielonej fluorescencji (GFP) połączony z konstruktem będącym przedmiotem zainteresowania i poprawia wizualizację białka docelowego w małych, rozpuszczonych próbkach całokomórkowych. Pozwala to na badanie przesiewowe stabilności białek w obecności różnych detergentów i dodatków, z mutacjami termostabilizującymi, a także pozwala na wykorzystanie niewielkiej liczby komórek z transfekcji przejściowej na małą skalę. W ten sposób można szybko przebadać wiele warunków przed przejściem do oczyszczania białek na dużą skalę. Po ekspresji, badaniach przesiewowych i oczyszczeniu przedstawiamy protokół uzyskiwania i przetwarzania obrazów z cryo-EM w celu wygenerowania de novo określenia strukturalnego białka. Wierzymy, że opisane tutaj podejścia posłużą jako uogólniony protokół do badań strukturalnych receptorów kanałów TRP i innych białek błonowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transformacja komórek DH10α w celu wytworzenia DNA bakmidowego

  1. Zsyntetyzuj interesujący Cię gen i sklonuj go do zmodyfikowanej wersji wektora pEG zawierającej bliźniaczy znacznik paciorkowca, znacznik His8 i GFP z miejscem rozszczepienia trombiny na końcu N (pFastBacI)20.
  2. Przekształć kompetentne komórki, dodając 5 ng plazmidu zawierającego pożądany gen w pFastBacI do 50 μl komórek DH10α w probówce o pojemności 1,5 ml i inkubuj przez 10 minut na lodzie. Szok termiczny komórek przez 45 s w temperaturze 42 °C. Dodać 200 μl super optymalnego bulionu z represorem katabolicznym (SOC) do probówki i inkubować przez 4 - 8 godzin w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 225 obr./min.
  3. Płytka 5 μl komórek na płytce agarowej bacmid LB (50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml tetracykliny, 100 μg/ml Bluo-gal i 40 μg/ml izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu [IPTG], agar).
  4. Inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Wskaźnik Bluo-gal barwi kolonie, w których nadal występuje ekspresja lacZ (insercja wektorowa nie powiodła się), co pozwala na wybór białych (pomyślnie przekształconych) kolonii.
  5. Ostrożnie wybierz izolowaną białą kolonię, unikając wszelkich białych kolonii, które mają kontakt z niebieskimi koloniami, i hoduj komórki przez noc w 6 ml pożywki bakmidowej LB (50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml tetracykliny) w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej przy 225 obr./min.

2. Bakteryjny preparat do izolacji DNA bakterii Bacmid

  1. Aby wyizolować DNA bakterii, odwiruj komórki Escherichia coli przez 10 minut w temperaturze 2880 x g.
  2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl roztworu do ponownego zawieszania komórek z zestawu do minipreparatu (patrz tabela materiałów) przez pipetowanie. Upewnij się, że osad jest całkowicie i jednorodnie zawieszony. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówek o pojemności 1,5 ml.
  3. Dodaj 200 μl roztworu do lizy komórek z zestawu miniprep i wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Inkubować do 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu lizy komórek. Dodaj 200 μl roztworu neutralizacyjnego z zestawu miniprep i wymieszaj kilka razy, odwracając probówkę, aby zatrzymać reakcję lizy.
  4. Wirować przez 10 minut w temperaturze 21 130 x g w wirówce stołowej. Zebrać 600 μl supernatantu w probówce o pojemności 2 ml. Dodać 600 μl roztworu fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (patrz tabela materiałów) i dokładnie wymieszać, aby wyekstrahować DNA z pozostałych produktów lizy komórek.
    UWAGA: Roztwór fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Może powodować oparzenia chemiczne i może być rakotwórczy. Noś rękawiczki i fartuch laboratoryjny zapinany na guziki. Praca pod wyciągiem. Te niebezpieczne odpady należy utylizować w odpowiedni sposób.
  5. Wirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 21130 x g w wirówce stołowej. Widoczne będą dwie oddzielne fazy ciekłe. Ostrożnie przenieść 300 μl górnej fazy wodnej do nowej probówki. Dodaj 600 μl 100% etanolu, aby przepłukać DNA. Delikatnie odwróć rurkę, aby wymieszać.
    UWAGA: Nie wiruj, ponieważ może to spowodować ścinanie DNA bakmida.
  6. Schłodzić probówki, umieszczając je w zamrażarce o temperaturze -20 °C na 10 minut. Wirować przez 10 minut w temperaturze 21 130 x g w wirówce stołowej. Odrzucić supernatant i zachować osad DNA.
  7. Dodaj 1 ml 70% etanolu, aby umyć granulki. Delikatnie odwróć rurkę, aby wymieszać. Wirować przez 10 minut przy 21 130 x g w wirówce stołowej. Wyrzucić supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na powietrzu przez około 5 minut lub do momentu, gdy w probówce nie będzie widać płynu, a osad DNA stanie się przezroczysty.
  8. Zawiesić suchy granulat w 50 μl sterylnej, pozbawionej DNaz, dejonizowanej wody. Zmierz stężenie DNA.
    UWAGA: Nie zamrażaj DNA bakterii. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni.

3. Transfekcja komórek owadów Sf9 za pomocą Bacmid w celu wytworzenia Bakulowirusa P1

  1. Wysiew: 0,9 x 106 komórek Sf9 / basenik w 2 ml odpowiedniej pożywki (patrz tabela materiałów) w każdym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować komórki w temperaturze 27 °C przez 20 minut, aby ułatwić przyłączenie do płytki.
    UWAGA: Hodowle komórkowe stanowią potencjalne zagrożenie biologiczne. Pracuj w zatwierdzonym okapie z przepływem laminarnym przy użyciu technik aseptycznych i zapoznaj się z wytycznymi instytucjonalnymi i rządowymi dotyczącymi zalecanej odzieży ochronnej i prawidłowej utylizacji odpadów przed wykonaniem eksperymentów.
  2. Po przyłączeniu dodać 8 μl odczynnika do transfekcji (patrz Tabela materiałów) do 100 μl pożywki na każdą studzienkę z 6-dołkowej płytki transfekowanej w sterylnej probówce. Dodać 6 μg bakmidowego DNA do 100 μl pożywki w oddzielnej sterylnej probówce. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Połączyć oba roztwory i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Zastąp pożywkę w 6 dołkach 2 ml świeżej pożywki. Dodaj mieszaninę z poprzedniego kroku do każdej studzienki kroplami (200 μl na studzienkę). Delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić wymieszanie roztworu transfekcji z podłożem.
    UWAGA: Nie obracaj ani nie potrząsaj płytką, ponieważ spowoduje to oderwanie się komórek.
  4. Inkubować komórki przez 5 dni (120 godzin) w inkubatorze nawilżanym w temperaturze 27 °C. Przed pobraniem należy sprawdzić fluorescencję GFP, aby upewnić się, że wirus jest wytwarzany w dużym odsetku komórek; jeśli procent jest niski, w razie potrzeby wydłuż czas inkubacji (patrz Rysunek 1C).
  5. Zebrać supernatant zawierający wirusa P1 (około 2 ml z każdej studzienki). Przefiltrować pożywkę zawierającą wirusa P1 do probówek o pojemności 2 ml za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i małego filtra 0,2 μm. Dodać sterylną płodową surowicę bydlęcą (FBS) do końcowego stężenia 1%.
    UWAGA: Ten zapas wirusa P1 powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C i chroniony przed światłem.

4. Zakażenie komórek owadów Sf9 bakulowirusem P1 w celu wytworzenia Bakulowirusa P2

  1. Przygotować 200 ml (lub pożądaną objętość) komórek Sf9 o stężeniu 0,8 - 0,9 x 106 komórek/ml w odpowiednim podłożu (patrz Tabela Materiałów) w płaskodennej kolbie hodowlanej Erlenmeyera o wystarczającej wielkości.
    UWAGA: W przypadku hodowli zawiesiny użyta objętość nie powinna przekraczać 40% całkowitej pojemności kolby.
  2. Dodać w stosunku 1:2500 (v/v) zapasu wirusa P1 od 3,5 do hodowli zawiesiny komórek Sf9. Inkubować przez czas optymalnej ekspresji wirusa (zwykle 48 - 120 godzin, w zależności od budowy białka) w temperaturze 27 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 115 obr./min.
    UWAGA: Względną ekspresję wirusa można określić, przeglądając fluorescencję wirusa GFP w próbce hodowli.
  3. Odwirować zawiesinę komórkową przez 40 minut przy 11,520 x g i zebrać supernatant zawierający wirusa P2. Przefiltrować supernatant za pomocą jednorazowych filtrów 0,2 μm. Dodaj FBS do końcowego stężenia 0,5%.
    UWAGA: Ten zapas wirusa P2 powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C i chroniony przed światłem.
  4. Uzyskaj miano wirusa P2 za pomocą komórek Sf9easy lub licznika wirusów.

5. Zakażenie komórek ssaków HEK293 bakulowirusem P2 w celu ekspresji białek na dużą skalę

  1. Przygotować pożądaną objętość hodowli zawiesinowej komórek ssaków HEK293 (do przygotowania zamrożonych siatek zaleca się 4 - 6 l) o stężeniu 3,5 - 3,8 x 106 komórek/ml w pożywce ekspresyjnej (patrz tabela materiałów) uzupełnionej 1% (v/v) sterylnym FBS w kolbach hodowlanych Erlenmeyera o odpowiedniej wielkości.
    UWAGA: W przypadku hodowli zawiesiny użyta objętość nie powinna przekraczać 40% całkowitej objętości kolby.
  2. Dodać 8% (v/v) roztworu podstawowego wirusa P2 z kroku 4.3 do hodowli zawiesiny komórkowej HEK293. Inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 135 obr./min.
  3. Dodać 10 mM maślanu sodu w 12 - 18 godzin po zakażeniu. Inkubować przez czas optymalnej ekspresji białka (zwykle 36 - 72 h) w temperaturze 30 °C.
  4. Zbierać komórki przez odwirowywanie przez 20 minut przy 2 880 x g. Umyj komórki przez ponowne zamieszanie w około 100 ml soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) na litr zebranych komórek. Ponownie odwirować przez 20 minut przy 2.880 x g i zebrać osad komórek.
    UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Granulki komórkowe można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu oczyszczenia.
    UWAGA: Ciekły azot może spowodować oparzenia kriogeniczne lub obrażenia. Może to spowodować odmrożenia. Może wypierać tlen i powodować szybkie uduszenie. Nosić rękawice izolujące przed zimnem i osłonę twarzy.
  5. Zebrać małe 1 ml plony w różnych punktach czasowych i rozpuścić przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, kołysząc lub mieszając w obecności różnych detergentów i/lub dodatków. Te małe, rozpuszczone próbki całokomórkowe można klarować przez ultrawirowanie w temperaturze 235 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i prowadzić jako próbkę o objętości 30 μl na kolumnie chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) (patrz tabela materiałów) w celu określenia najlepszego czasu na ekspresję i najlepszych warunków rozpuszczania.
    UWAGA: W przypadku hTRPC3 badanie przesiewowe obejmowało różne o wartościach pH od 4,0 - 9,5 i stężeniach soli 50 - 500 mM; różne składy jonowe (takie jak MgCl2 lub NaCl); różne detergenty o krytycznych wartościach stężenia miceli (CMC) 0,1 - 20 mM; dodatki redukujące, takie jak ditiotreitol, tris(2-karboksyetylo)fosfina i β-merkaptoetanol; oraz dodatek chelatujący wapń kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA).

6. Oczyszczanie białka hTRPC3 z zamrożonych osadów komórkowych

  1. Rozmrozić osad w buforze zawierającym 20 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 0,8 μM aprotyniny, 2 μg/ml leupeptyny, 2 mM pepstatyny A i 1% digitoniny, używając 100 ml buforu na litr zebranych komórek. Po rozmrożeniu zapewnić jednorodność roztworu, pipetując lub mieszając. Pozostawić do rozpuszczenia na 2 godziny w temperaturze 4 °C w zlewce zanurzonej w lodzie, obracając mieszadło.
  2. Usunąć resztki komórek przez ultrawirowanie w temperaturze 235 000 × g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Sprawdzić ilość białka, umieszczając próbkę o objętości 30 μl na kolumnie SEC (patrz tabela materiałów) za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i uwidocznić białko docelowe za pomocą sygnału wyjściowego GFP.
  3. Rozpuszczone białko (supernatant) inkubować z żywicą o powinowactwie do kobaltu przez 1-2 godziny w temperaturze 4 °C. Sprawdzić wiązanie białka z żywicą, umieszczając próbkę o objętości 30 μl na kolumnie SEC.
    UWAGA: Jeśli nastąpiło wiązanie z białkami, docelowe białko znakowane GFP zostanie zachowane w kolumnie, a nie znalezione w przepływie. W związku z tym żaden sygnał GFP nie będzie obecny w pozycji odpowiadającej docelowej wielkości białka, gdy przepływ jest prowadzony na HPLC.
  4. Przemyć żywicę 10 objętościami buforu w kolumnie (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 15 mM imidazolu i 0,1% digitoniny). Sprawdź utratę białka, przeprowadzając próbkę o objętości 30 μl na kolumnie SEC.
    UWAGA: Jeśli nastąpiła utrata białka z kolumny, docelowe białko oznaczone GFP zostanie znalezione w buforze do płukania, który przeszedł przez kolumnę. W związku z tym sygnał GFP będzie obecny w pozycji odpowiadającej docelowej wielkości białka, gdy bufor płuczący jest uruchamiany na HPLC. Jeśli nastąpiła utrata białka, może być konieczne obniżenie stężenia imidazolu w buforze do przemywania w celu zapobieżenia zakłóceniu wiązania znacznika His z kolumną powinowactwa.
  5. Eluować hTRPC3 związany z żywicą za pomocą buforu (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazolu i 0,1% digitoniny). Dodać trombinę w stosunku molowym 1:20 (w celu rozszczepienia znacznika GFP) i dodać 10 mM EDTA (czynnik stabilizujący hTRPC3) do eluowanej próbki i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 4 °C. Sprawdzić, czy białko zostało wymyte, uruchamiając 90 μl próbki rozcieńczonej w stosunku 1:100 na kolumnie SEC i sprawdzając obecność sygnału GFP w pozycji odpowiadającej docelowej wielkości białka.
    UWAGA: W tym momencie można również zobaczyć sygnał tryptofanu z całkowitego białka w elucji. W elucji pozostanie tylko białko oczyszczone z powinowactwa docelowego, a sygnały GFP i tryptofanu będą miały prawie identyczny profil. Jeśli białko docelowe nie jest widoczne w dużej ilości w elucji, ale nie zostało utracone podczas przepływu lub przemywania, białko prawdopodobnie pozostało związane z kolumną i może być eluowane przy użyciu wyższego stężenia imidazolu w buforze.
  6. Zagęścić eluat do 500 μl lub mniej w 15 ml odśrodkowej probówce filtracyjnej 100K (patrz tabela materiałów), wirując z prędkością 2,880 x g w temperaturze 4 °C w odstępach co 5 minut. Ponownie zawiesić białko, pipetując roztwór w górę i w dół między wirowaniami, aby uniknąć nadmiernego zagęszczenia.
    UWAGA: Czas wirowania może ulec skróceniu, gdy objętość zbliża się do pożądanej objętości końcowej.
  7. Załaduj koncentrat do kolumny SEC w buforze (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA i 0,1% digitoniny). Biegać.
  8. Połączyć frakcje pikowe zawierające nienaruszony tetramer TRPC3, jak to uwidoczniono za pomocą sygnału absorbancji UV, i ponownie zagęścić do końcowego stężenia co najmniej 5 mg/ml.

7. Badania przesiewowe białek za pomocą mikroskopii elektronowej w barwieniu ujemnym

  1. Włącz maszynę do wyładowań jarzeniowych. Ustaw program rozładowywania siatki pokrytej węglem za pomocą argonu i tlenu przez 30 s. Uruchom program, aby powłoka węglowa na miedzianych siatkach o oczkach 400 była hydrofilowa przed dodaniem roztworu białkowego.
  2. Przygotuj pięć 40 μl kropli sterylnej wody i dwie 40 μl kropli 1% roztworu mrówczanu uranylu (na folii laboratoryjnej, papierze woskowanym lub podobnej powierzchni, patrz Tabela materiałów). Weź siatkę z kroku 7.1 i dodaj 2,5 μl próbki białka 5 mg/ml (50 - 200 μM) na ciemną stronę i pozostaw na 1 minutę.
  3. Po 1 minutach wysuszyć siatkę za pomocą bibuły filtracyjnej. Nie dotykaj bibuły filtracyjnej bezpośrednio do powierzchni siatki; Zamiast tego przyłóż bibułę do krawędzi kropli cieczy i pozwól, aby działanie kapilarne wciągnęło ciecz z siatki do bibuły filtracyjnej.
  4. Zanurz siatkę w pierwszej kropli wody. Osuszyć bibułą filtracyjną i powtórzyć z pozostałymi kroplami wody i pierwszą kroplą mrówczanu uranylu. Pozostaw drugą kroplę mrówczanu uranylu na 1 minutę, a następnie wysusz bibułą filtracyjną. Pozostaw kratkę do całkowitego wyschnięcia na powietrzu (około 1 minuty) przed przechowywaniem.
    UWAGA: Ten protokół barwienia może nie być idealny dla wszystkich kombinacji białka i detergentu. Należy przetestować różne stężenia barwnika mrówczanu uranylu i różny czas ekspozycji na plamę, jeśli powyższe kroki nie zapewniają plamy o dobrym kontraście.
  5. Zobrazuj siatki pod mikroskopem elektronowym (patrz tabela materiałów), aby sprawdzić jakość cząstek białka. Upewnij się, że mikrofotografie pokazują liczne cząstki, które są jednorodne pod względem ogólnego wyglądu i rozmieszczenia, wykazują dobry kontrast i pasują do przewidywanej wielkości białka docelowego.
  6. Wygeneruj wstępne, dwuwymiarowe (2D) klasyfikacje o niskiej rozdzielczości przy użyciu 50 - 100 mikrofotografii (patrz przetwarzanie danych – krok 10), aby sprawdzić, czy cząstki reprezentują różne widoki jednej spójnej struktury.
    UWAGA: Mikrofotografie i wstępne klasy 2D o wystarczającej jakości, jak opisano powyżej, są silnym wskaźnikiem, że protokół został wystarczająco zoptymalizowany pod kątem oczyszczania białek. W tym momencie uzasadnione jest przygotowanie i przesiewanie siatek krioelektromagnetycznych.

8. Przygotowanie próbki EM

  1. Wyładowanie jarzeniowe złotą, dziurawą siatką węglową (patrz tabela materiałów), jak opisano w kroku 7.1.
  2. Nanieść 2,5 μl skoncentrowanej próbki białka hTRPC3 (5 mg/ml) na siatkę. Osusz siatkę przez 1,5 s, używając siły kleksa 1 i czasu oczekiwania 5 s przy 100% wilgotności i 4 °C, a następnie zanurz siatkę w ciekłym etanie chłodzonym ciekłym azotem za pomocą maszyny do witryfikacji.
    UWAGA: Wilgotność, temperatura, siła kleksa, czas blot i czas oczekiwania zostały użyte w badaniu autorów hTRPC319. Może być konieczna ich wymiana w celu wytworzenia optymalnego szklistego lodu dla innych białek i detergentów.
  3. Za pomocą mikroskopu kriogenicznego (patrz Tabela materiałów) należy przesiewać zamrożone siatki pod kątem optymalnych warunków lodowych (patrz tabela materiałów) i ręcznie wyświetlać obszary grubego lodu (kwadraty siatki, które wydają się mniejsze i ciemniejsze), cienkiego lodu (kwadraty siatki, które wydają się większe i jaśniejsze) oraz średniego lodu.
    UWAGA: Grubszy lód często zawiera więcej cząstek, podczas gdy cieńszy lód często zapewnia lepszy kontrast i rozdzielczość. Użyj ręcznego przesiewania obrazów, aby określić, które warunki lodowe skutkują dużą liczbą monorozproszonych cząstek o dobrym kontraście i rozdzielczości. Po zweryfikowaniu dobrych warunków przejdź do zbierania obrazów pod mikroskopem kriogenicznym 300 kV.

9. Gromadzenie danych EM

  1. Korzystając z automatycznego programu akwizycji, rejestruj stosy obrazów w trybie zliczania w superrozdzielczości z binarnym rozmiarem piksela 1,074 A na mikroskopie elektronowym działającym pod napięciem 300 kV z nominalnym powiększeniem 130 000X bezpośredniego detektora elektronów.
  2. Frakcjonowanie dawki każdego obrazu do 40 klatek z całkowitym czasem naświetlania 8 s, z 0,2 s na klatkę i szybkością dawki 6,76 e− Å−2 s−1 (nominalne wartości rozmycia wahały się od 1,0 do 2,5 μm w eksperymencie autorów).

10. Przetwarzanie danych EM

  1. Zaimplementuj korekcję ruchu zsumowanych stosów filmowych22 i oszacuj wartości rozmycia23 za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych (patrz Tabela materiałów)24.
  2. Wybierz cząstki z mikrofotografii. Użyj tych wybranych cząstek, aby skonstruować wstępną klasyfikację 2D bez odniesień za pomocą software24. Wybierz idealne średnie klasy 2D, które zostaną użyte jako szablony do automatycznego wybierania cząstek dla całego zestawu danych.
  3. Ręcznie sprawdzaj jakość automatycznie wybieranych cząstek i usuwaj złe cząstki. Użyj wielu rund klasyfikacji 2D, aby oczyścić wybrane cząstki.
  4. Wygeneruj początkowy model25. Badany 2D wybrał cząstki do trójwymiarowej (3D) klasyfikacji (około 5 klas) przy użyciu symetrii C1 i wstępnej rekonstrukcji filtra dolnoprzepustowego 60 A jako modelu referencyjnego. Określ, które klasy mają cechy o wysokiej rozdzielczości, i połącz cząstki w ramach takiej klasy.
  5. Dalsze rozdrobnienie cząstek przy użyciu lokalnego zagęszczenia z zastosowaną symetrią C4 (w przypadku hTRPC3) i limitem wysokiej rozdzielczości dla wyrównania cząstek ustawionym na 4,5 Å26.

11. Budynek modelarski

  1. Zbuduj model (patrz Tabela materiałów dla używanego oprogramowania). W przypadku hTRPC3 należy użyć domeny transbłonowej (TMD) banku danych o strukturze białka przejściowego potencjału receptora 4 (TRPM4) (PDB) 5wp6 jako przewodnika27. Wykorzystaj nieporęczne pozostałości i przewidywanie struktury wtórnej, aby pokierować budową de novo.
  2. Poddaj początkowy model rzeczywistemu udoskonaleniu przestrzeni za pomocą ograniczeń struktury drugorzędnej28. Ręcznie sprawdź udoskonalony model i zmodyfikuj go ponownie w razie potrzeby (patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z używanym oprogramowaniem).
  3. Zastosuj krzywe korelacji powłoki Fouriera (FSC), aby obliczyć różnicę między modelem końcowym a mapą EM w celu walidacji wyrafinowanej struktury. Oceń geometrie modeli atomowych (patrz Tabela materiałów dla używanego oprogramowania)29,30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny przegląd protokołu do wyrażania i oczyszczania hTRPC3 jest pokazany w Rysunek 1A. Obraz płytki bakimidowej hTRPC3 z idealnymi białymi koloniami, podobnymi do tej wybranej do oczyszczania DNA bakmida, pokazano na Rysunek 1B. Stwierdziliśmy, że 48 h jest idealne do wyraźnego barwienia Bluo-gal przy zachowaniu obecności izolowanych kolonii. Szczytowa produkcja wirusa P2 dla hTRPC3, jak uwidoczniono za pomocą fluorescenc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strukturalne oznaczanie białek za pomocą cryo-EM zrewolucjonizowało dziedzinę biologii strukturalnej w ciągu ostatnich kilku lat, dzięki opracowaniu nowych kamer i algorytmów, które znacznie przyspieszają określanie struktury białek, które nie krystalizują łatwo, w szczególności białek błonowych. Pomimo wszystkich ostatnich postępów w technice cryo-EM, przygotowanie oczyszczonych białek o jakości i ilości wystarczającej do umożliwienia obrazowania wysokiej jakości często pozostaje czasochłonne, kosztowne i stanowi wyzwan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy G. Zhao i X. Meng za wsparcie w zbieraniu danych w zestawie zaawansowanej mikroskopii krioelektronowej Davida Van Andela. Jesteśmy wdzięczni zespołowi VARI High-Performance Computing za wsparcie obliczeniowe. Wyrażamy naszą wdzięczność N. Clemente, D. Duesowi, J. Floramo, Y. Huangowi, Y. Kimowi, C. Muellerowi, B. Rothowi i Z. Ruanowi za komentarze, które znacznie ulepszyły ten manuskrypt. Dziękujemy D. Nadziejce za wsparcie redakcyjne dla tego manuskryptu. Prace te były wspierane przez wewnętrzne fundusze VARI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

2 > Thermo-Fisher SHKE8000

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pEG BacMam vector (pFastBacI)addgene31488
DH10α cellsLife Technologies10361-012
S.O.C. mediaCorning46003CRdo transformacji komórek DH10α dla
płytek hodowlanych Bacmid BacmamTeknovaL5919do hodowli przekształconych komórek DH10α
Wytrząsarka do inkubacji do komórek bakteryjnychInfors HTMultitron standard
Inkubowany wytrząsarka orbitalna do komórek owadów Inkubator
Reach-in do komórek ssakówThermo-Fisher3951
Wytrząsarka orbitalna stołowaThermo-FisherSHKE416HP stosowanaw inkubatorze CO2 Reach-in do komórek
ssakówInkubatorVWR1535do płytek bakteryjnych
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106do ekstrakcji i oczyszczania plazmidu
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowyInvitrogen15593031do ekstrakcji DNA
Komórki Sf9Life Technologies12659017komórki owadów do produkcji wirusa
Sf-900 podłożaGibco12658-027pożywka z komórek owadów
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100do transfekcji komórek owadów
lipofektamina, 2000Invitrogen11668-027do transfekcji komórek sutkowych
Filtr strzykawkowy 0,2 mmVWR28145-501do filtracji wirusa P1
Kolby filtracyjne 0,2 mm 500ml resevoirCorning430758do filtrowania wirusa P2
Kolba hodowlana Erlenmeyera (płaskie dno 2L)Gene MateF-5909-2000do hodowli komórek owadów
Kolba hodowlana Erlenmeyera (z przegrodą 2L)Gene MateF-5909-2000Bdo hodowli komórek ssaków
Spektrofotometr nanodrop 2000Thermo-FisherND-2000do oznaczania stężeń DNA i białek
HEK293ATCCCRL-3022komórki ssaków do produkcji białka
Freestyle 293 ekspresja MediumGibco1238-018pożywka komórkowa ssaków do ekspresji białek
Kwas masłowy Sól sodowaAcros263195000do amplifikacji ekspresji białek
PMSFAcros215740500inhibitor proteazy
Aprotynina z płuc bydlęcychSigma-AldrichA1153-100MGinhibitor proteazy
chlorowodorek leupeptynySigma-Aldrich24125-16-4inhibitor proteazy
pepstatyna AFisher ScientificBP2671-250inhibitor proteazy
digitoninaEMD Millipore300410detergent - do rozpuszczania białka z błony
imidazolSigma792527do elucji białka z kolumny żywicznej
Żywica TALONClonetech635504do oczyszczania powinowactwa za pomocą kolumn inkubacyjnych His-tag
superose6GE29091596; 29091597do HPLC i FPLC
Prominence Prominence Modular HPLCSystem ShimadzuZobacz poniżej
Moduł kontrolera"CBM20A
Solvent Delivery System"LC30AD
Detektor fluorescencji"RF20AXS
Autosampler z chłodzeniem"SIL20ACHT
Czysty system FPLC z frakcjonatoremAkta
trombina (alfa)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Ludzka alfado rozszczepiania znacznika GFP
Amicon Ultra 15 ml 100K odśrodkowa rurka filtracyjnaMilliporeUFC910008do zagęszczania białka
EDTAFisherE478500do stabilizacji białka
siatki miedziane powlekane węglem 400 meshTed Pella Inc.Kratki 01754-Fdo plam ujemnych
Quantifoil dziurawa siatka węglowa (złoto, 1,2/1,3 i cienkie; μ m rozmiar/przestrzeń otworu, 300 oczek)Mikroskopia elektronowa NaukiQ3100AR1.3siatki do Cryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIdo przygotowania siatek próbek za pomocą ciekłego etanu zamrażanie
ciekłego azotuDura-CylUN1977
etan gazAirgasUN1035
Solarus Plasma SystemGatanModel 950do czyszczenia kratek przed zamrażanie próbek
Mikroskop elektronowy Tecnai SpiritFEIdo obrazowania EM barwienia ujemnego
Mikroskop elektronowy Talos ArcticaFEIdo badań przesiewowych i obrazowania siatek Cryo-EM w niskiej rozdzielczości
Mikroskop elektronowy Titan KriosFEIdo obrazowania Cryo-EM o wysokiej rozdzielczości
Oprogramowanie
Gautomatchhttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/do wybierania cząstek z mikrofotografii
Oprogramowanie Relion 2.1https://github.com/3dem/reliondo konstruowania klasyfikacji 2D i 3D
Oprogramowanie CryoSPARChttps://cryosparc.com/do generowania wstępnego modelu struktury
Oprogramowanie Frealignhttp://grigoriefflab.janelia.org/frealigndo udoskonalania cząstki
Oprogramowanie Coothttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/do budowy modelu
Oprogramowanie MolProbityhttp://molprobity.biochem.duke.edu/do oceny geometrii modelu atomowego
Oprogramowanie SerialEMhttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/do automatycznej akwizycji stosu obrazów szeregowych
OprogramowanieMortionCor2do korekcji ruchu zsumowanych stosów filmowych
Oprogramowanie GCTFhttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/do pomiaru wartości rozmycia w stosach filmowych
Phenix.real_space_refine oprogramowaniehttps://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.htmldo udoskonalania początkowego modelu 3D w przestrzeni rzeczywistej
CO http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353(2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001(2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852(2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792(2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

TRPC3 ExpressionProtein PurificationAffinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyCryo Electron MicroscopyBaculovirus SystemHEK293 CellsDetergent SolubilizationStructural DeterminationIon Channel

Powiązane artykuły