Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

W naszych czasach techniki mikroskopii świetlnej zapewniające obrazowanie w wysokiej/super rozdzielczości w nieruchomych i żywych próbkach szybko się rozwijają. Techniki superrozdzielcze, takie jak odpowiednio wymuszone zubożenie emisji (STED), mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM) i mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji (PALM) lub bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), są dostępne na rynku i umożliwiają obrazowanie struktur subkomórkowych ukazujących szczegóły niemal w skali molekularnej^1,2,3,4,5,6. Jednak podejścia te nadal mają ograniczone zastosowanie w eksperymentach obrazowania na żywo, w których duże objętości muszą być wizualizowane z prędkością akwizycji wielu klatek na sekundę. Odmiany wysoce dynamicznych procesów regulowanych przez błonę plazmatyczną, np. endo-/egzocytoza, adhezja, migracja lub sygnalizacja, zachodzą z dużą prędkością w dużych objętościach komórkowych. Niedawno, aby wypełnić tę lukę, zaproponowano zintegrowaną technikę mikroskopii o nazwie spinning disk-TIRF (SD-TIRF)⁷. Szczegółowo, mikroskopia TIRF pozwala na specyficzną izolację i lokalizację błony plazmatycznej^8,9, podczas gdy mikroskopia SD jest jedną z najbardziej czułych i szybkich technik obrazowania na żywo do wizualizacji i śledzenia organelli subkomórkowych w cytoplazmie^10,11. Połączenie obu technik obrazowania w jednym ustawieniu zostało już zrealizowane w przeszłości^12,13, jednak prezentowany tutaj mikroskop (Rysunek 1) ostatecznie spełnia kryteria wykonywania eksperymentów obrazowania na żywo SD-TIRF wyżej wymienionych procesów z prędkością 3 klatek na sekundę. Ponieważ mikroskop ten jest dostępny na rynku, celem tego manuskryptu jest szczegółowe opisanie i dostarczenie narzędzi i protokołów open source do akwizycji, rejestracji i wizualizacji obrazów związanych z mikroskopią SD-TIRF.

Konfiguracja opiera się na odwróconym mikroskopie podłączonym do dwóch jednostek skanujących za pomocą niezależnych portów - lewy port jest połączony z modułem SD, a tylny port z modułem skanera dla eksperymentów TIRF i fotoaktywacji/wybielania. Do wzbudzenia można użyć do 6 laserów (405/445/488/515/561/640 nm). Do wzbudzenia i detekcji sygnału fluorescencji zastosowano odpowiednio obiektyw TIRF 100x/NA1.45 oil lub 60x/NA1.49 oil. Emitowane światło jest rozdzielane przez zwierciadło dichroiczne (561 nm długoprzepustowe lub 514 nm długoprzepustowe) i filtrowane przez różne filtry pasmowo-przepustowe (o szerokości 55 nm wyśrodkowane przy 525 nm, o szerokości 54 nm wyśrodkowane przy 609 nm odpowiednio dla zielonej i czerwonej fluorescencji) umieszczone przed dwiema kamerami EM-CCD. Należy pamiętać, że więcej szczegółów technicznych dotyczących konfiguracji znajduje się w Zobiak i wsp.⁷. W konfiguracji TIRF, jednostka SD jest przesuwana poza ścieżkę światła w ciągu około 0,5 sekundy, dzięki czemu te same dwie kamery mogą być używane do wykrywania, co pozwala na szybsze przełączanie między dwoma modalnościami obrazowania w porównaniu do około 1 s, które było zgłaszane w przeszłości¹³. Ta funkcja umożliwia jednoczesną akwizycję dwukanałową, dzięki czemu można wykonać 4-kanałowe obrazowanie SD-TIRF z niespotykaną wcześniej szybkością i dokładnością. Co więcej, wyrównanie między obrazami SD i TIRF nie jest konieczne. Wyrównanie obrazu między dwiema kamerami musi być jednak sprawdzone przed rozpoczęciem eksperymentu i w razie potrzeby skorygowane. W poniższym protokole procedura korekcji rejestracji została zaimplementowana w samodzielnie napisanym makrze ImageJ. Co więcej, makro zostało zaprojektowane głównie tak, aby umożliwić jednoczesną wizualizację zbiorów danych SD i TIRF pomimo ich różnej wymiarowości. Samo oprogramowanie do akwizycji nie zapewniało tych funkcji.

1. Przygotowanie komórek

1. Dwa dni przed eksperymentem wysiewaj 3*10⁵ komórek HeLa lub NIH3T3 w 2 ml pełnego podłoża wzrostowego na dołek 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Upewnij się, że komórki są obsługiwane w okapie z przepływem laminarnym przez cały czas trwania tego protokołu.
2. Na dzień przed eksperymentem należy przygotować odczynniki do transfekcji zgodnie z zaleceniami producenta lub empirycznie ustalonym protokołem, np.:
   1. Rozcieńczyć 1 μg RFP-Lifeact i 1 μg YFP-Vinculin w sumie 200 μl zredukowanej pożywki surowicy. Krótko odczynnik do transfekcji należy krótko przemieszać, dodać 4 μl do 200 μl DNA i ponownie przetrząsnąć. Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Dodaj całą mieszankę transfekcyjną kroplami bezpośrednio do komórek. Wymieszać, potrząsając płytką i umieścić ją z powrotem w inkubatorze.
3. W dniu eksperymentu przygotuj próbkę do obrazowania na żywo:
   1. Przygotować roztwór fibronektyny o stężeniu 10 μg/ml w PBS, aby pokryć szklaną powierzchnię naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 mm. Używaj tylko wysokiej jakości szkiełek nakrywkowych ze szkła o grubości 0,17 mm, aby uzyskać optymalną wydajność TIRF i unikaj plastikowych naczyń dolnych. Pozostaw roztwór na szklanej powierzchni na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyjmij go i pozostaw naczynie do wyschnięcia na powietrzu.
   2. Rozcieńczyć roztwór kulek wielofluorescencyjnych o stężeniu 0,1 μm do gęstości 1,8 x^10,9 cząstek na ml w wodzie destylowanej i dodawać roztwór przez 30-60 s do powierzchni szkła pokrytego fibronektyną. Natychmiast usuń roztwór i pozostaw naczynie do wyschnięcia na powietrzu.
      UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy płaszczyzna TIRF powinna zostać znaleziona przed zasiewem komórek i/lub w celu uzyskania 2-kolorowego obrazu referencyjnego do rejestracji obrazu opartego na koralikach.
   3. Przygotować 0,1 M roztwór kwasu askorbinowego (AA) i rozcieńczyć go do końcowego stężenia 0,1 mM w pożywce wzrostowej (pożywka AA). Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Jeśli to możliwe, użyj pożywki do hodowli komórkowych zoptymalizowanej pod kątem fluorescencji, takiej jak pożywka wolna od fenolronów i o zredukowanej (rybo-) flawinie. AA jest środkiem przeciwutleniającym, który może zmniejszyć efekty fototoksyczne podczas obrazowania na żywo¹⁴. Przetestowaliśmy to z powodzeniem w tym teście, tj. więcej komórek wydawało się zdrowych w zastosowanych warunkach niż bez dodatku AA. Jednak pH pożywki zostało obniżone o 0,17 jednostki pH.
   4. Umyj komórki 2 ml PBS, dodaj 250 μl trypsyny-EDTA i poczekaj, aż komórki całkowicie się odłączą (2-3 minuty w inkubatorze o temperaturze 37 °C). Ostrożnie zawiesić komórki w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki AA za pomocą pipety i dodać ją do 4 ml pożywki AA w probówce do hodowli komórkowych o pojemności 15 ml. Umieścić zawiesinę komórek z lekko uchyloną pokrywką w inkubatorze nastawionym na 37 °C i 5% CO₂ w pobliżu mikroskopu.
   5. Dodaj 1 ml podgrzanej pożywki AA do naczynia ze szklanym dnem i umieść je w uchwycie podgrzanego mikroskopu (patrz następny akapit).

2. Obrazowanie na żywo

1. Rozpocznij kontrolę otoczenia mikroskopu, aby uzyskać stabilną temperaturę 37 °C, 5% CO₂ i wilgotną atmosferę.
   UWAGA: W tym przypadku zastosowano małą komorę inkubacyjną z górnym stopniem, która umożliwiła stabilne ustawienia w ciągu około 15 minut. Większe inkubatory będą potrzebowały więcej czasu, aby osiągnąć stabilne warunki.
2. Ustal wszystkie ustawienia akwizycji pod mikroskopem przed nałożeniem zawiesiny komórek:
   1. Ustaw przedział czasowy na 30 s, a czas trwania na 60-90 min. Aktywuj funkcję automatycznego ustawiania ostrości sprzętowego autofokusa dla każdego punktu czasowego (wartość "1").
   2. Dostosuj ekspozycję i wzmocnienie kamery, a także moc lasera dla każdego kanału. Wysokie poziomy wzmocnienia, krótki czas naświetlania i niska moc lasera są zalecane w celu zmniejszenia fototoksyczności.
      UWAGA: Przedstawione tutaj dane zostały uzyskane przy ekspozycji 200 ms, poziomie wzmocnienia 500 i 20% mocy lasera, która odpowiada intensywności wzbudzenia odpowiednio 0,5 W/cm² dla 488 nm i 1 W/cm² dla 561 nm.
   3. Ustaw stos z dla kanałów wirującego dysku na 10 μm z odstępem 0,4 μm. Dezaktywuj stosy z dla kanałów TIRF. Ustaw dolne przesunięcie na "0", tj. najniższa płaszczyzna będzie pozycją ostrości sprzętowego autofokusa.
   4. Aktywuj funkcję wielopunktową "pozycje stolika".
      UWAGA: W 30-sekundowym przedziale czasu można zarejestrować do 3 pozycji.
3. Znajdź koraliki fluorescencyjne z oświetleniem epifluorescencyjnym przy oczce lub na ekranie komputera, a następnie aktywuj jeden kanał TIRF i ustaw kąt oświetlenia na wartość oznaczającą oświetlenie TIRF. Aktywuj autofokus, naciskając przycisk na panelu mikroskopu i wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła offsetowego. Uzyskaj zestaw danych 2-kolorowych, tj. TIRF-488 i TIRF-561, w celu późniejszej rejestracji obrazu na podstawie koralików (patrz punkt 3.1).
   1. Opcjonalnie: Aby zapewnić oświetlenie TIRF, dodać kilka mikrolitrów swobodnie unoszącej się zawiesiny fluorescencyjnych wielokolorowych kulek (patrz punkt 1.3.2.). Aktywuj podgląd na żywo kanału TIRF i zwiększ kąt oświetlenia. Nieprzylegające koraliki znikną poza kątem krytycznym, zapewniając prawidłowe oświetlenie TIRF⁸.
4. Ponownie wymieszaj zawiesinę komórek, odwracając zamkniętą probówkę 2-3 razy i nałóż 1 ml komórek do naczynia do obrazowania.
5. Szybko znajdź podwójnie transfekowane komórki z niskim poziomem oświetlenia epifluorescencyjnego. Wyśrodkuj komórki w podglądzie kamery na żywo za pomocą jasnego oświetlenia pola i zaznacz pozycję. Znajdź kolejne 1-2 interesujące miejsca i zapisz je na liście pozycji.
   UWAGA: Na początku komórki mogą łatwo się odłączyć z powodu ruchu sceny, dlatego ustaw 4-5 pozycji i ponownie sprawdź wszystko przed rozpoczęciem akwizycji obrazu. Następnie odrzuć 1-2 pozycje.
6. Rozpocznij pobieranie danych, klikając przycisk "Sekwencja".

3. Przetwarzanie końcowe obrazu w ImageJ

1. W celu wygenerowania hiperstosu bez rejestracji w FIJI¹⁵, napisano makro o nazwie "SD-TIRF_helper", które można zastosować do 2-4 kanałowych zestawów danych poklatkowych SD-TIRF. Zapisz plik "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" w podfolderze FIJI "makra" i uruchom makro klikając na polecenie menu "Wtyczki>Makra>Uruchom...".
   1. Jeśli kanały kolorów wymagają korekty pasowania, wybierz tę opcję i utwórz nowe odniesienie pasowania oparte na ściegach (plik punktu orientacyjnego) lub użyj istniejącego pliku, który został utworzony wcześniej.
      UWAGA: Wtyczka turboreg ¹⁶ zostanie zastosowana do obrazów referencyjnych koralików fluorescencyjnych. Zainstaluj wtyczkę w oprogramowaniu FIJI zgodnie z ogólnymi wytycznymi dotyczącymi instalacji wtyczek.
   2. Zaimportuj dane za pomocą importera formatów biologicznych i wybierz hyperstack jako opcję przeglądania. Załaduj zestaw danych obrazu, wybierz serię SD w pierwszym kroku i serię TIRF w drugim kroku. FIJI wyświetli dane posortowane według kanału i pozycji etapu, tj. zwykle wszystkie kanały SD i wszystkie kanały TIRF pojawiają się jako jeden hyperstack dla każdej wybranej pozycji etapu.
      UWAGA: Import danych jest możliwy z różnych typów plików, na przykład serii TIFF lub typów plików zależnych od platformy, takich jak *.nd. Typ pliku nie może zostać rozpoznany tylko wtedy, gdy nie został wyeksportowany przez oprogramowanie do akwizycji jako niezależny format TIFF bez kompresji.
   3. Zastosuj korektę rejestracji do odpowiednich kanałów, wczytując wcześniej określony plik punktów orientacyjnych.
   4. Wybierz żądaną tabelę wyszukiwania kolorów (LUT) dla każdego kanału SD i TIRF i połącz je w jeden, wielowymiarowy hyperstack.
      UWAGA: Podczas przetwarzania kanałów TIRF pewna liczba płaszczyzn z o zerowych wartościach intensywności jest dodawana na górze dolnej płaszczyzny, która jest zgodna z liczbą płaszczyzn z w zestawie danych SD. Ten krok jest ważny dla wizualizacji końcowego hyperstacka. Ta metodologia jest poprawna, ponieważ głębokość oświetlenia TIRF (mniej niż 200 nm⁷) jest mniejsza niż rozmiar kroku z stosu SD (400 nm).

Aby pokazać potencjał obrazowania SD-TIRF, opracowano test, który powinien ujawnić czasoprzestrzenną organizację kompleksów adhezyjnych komórka-matryca i ich interakcję z cytoszkieletem podczas adhezji komórkowej. Dlatego przylegające komórki HeLa lub, alternatywnie, NIH3T3 transfekowano YFP-Vinculin i RFP-Lifeact przez 18-24 godziny, trypsynizowano i wysiewano na szklanych naczyniach pokrytych fibronektyną. Te linie komórkowe zostały wybrane ze względu na ich wyraźny cytoszkielet i wyższą odporność w eksperymentach obrazowania na żywo, w przeciwieństwie do, na przykład, komórek pierwotnych. Mogą one nie wytrzymać obrazowania w bardzo wrażliwym stanie, tak jak po leczeniu trypsyną. Pod mikroskopem wybrano komórki wykazujące ekspresję YFP/RFP, a proces adhezji obserwowano podczas 60-minutowego filmu poklatkowego (Rysunek 2 i Filmy 1 i 2). Ten konkretny test rzadko i nie był jasno opisany w literaturze17,18. Co więcej, powstawanie adhezji zostało głównie zbadane np. w migrujących komórkach19,20. W związku z tym musieliśmy dostosować tę metodologię (linia komórkowa, powłoka, pożywka, skład) w celu przeprowadzenia eksperymentów opisanych w tym artykule.

Zgodnie z oczekiwaniami, komórki na początku miały okrągły kształt i tylko słabo przylegały, podczas gdy wypukłości membrany wyczuwały otoczenie i stykały się z podłożem. Kontakty komórkowo-matrycowe wzmacniały się szybko po powstaniu tzw. powstających zrostów20,21 (Rysunek 2A, kanał TIRF-488, punkty czasowe 0-4,5 min). Te ostatnie są plamkowatymi, dodatnimi strukturami winkuliny po brzusznej stronie komórki. Struktury były wyraźnie widoczne na zdjęciach z TIRF. Na początku tworzenia się adhezji aktyna była równomiernie rozprowadzona w komórce i nie lokalizowała się w tych wczesnych kompleksach (Rysunek 2A, kanał SD-561). Z biegiem czasu kompleksy adhezyjne powiększały się i dojrzewały do zrostów ogniskowych (Rysunek 2C). Te wydłużone struktury były widoczne głównie na obrzeżach komórki (ryc. 2A + B) i wynikały z sił wywieranych przez włókna aktoomiozyny. Włókna te zaczęły łączyć się z kompleksami adhezyjnymi, przyciągając je w ten sposób w kierunku środka komórki i indukując wzmocnienie zrostów macierzy komórkowej, a także wiązanie włókien aktynowych21. Najwyraźniej komórka również uległa spłaszczeniu w wyniku tworzenia się sieci aktynowej (Rysunek 2A, widok XZ). Obrazowanie SD okazało się tutaj metodą z wyboru, ponieważ pozwoliło na wizualizację tego procesu z wysoką czułością, rozdzielczością przestrzenną i z pełnej perspektywy. W poprzednim raporcie17, sam TIRF mógł jedynie spekulować na temat pochodzenia zrostów obwodowych, podczas gdy obrazowanie SD-TIRF wyraźnie ujawniło jego związek z filopodiami (Rysunek 2B, punkt czasowy 17 min, biały grot strzałki). Rzeczywiście, włókna aktyny wyłaniające się dośrodkowo ze zrostów ogniskowych stały się widoczne po 27 minutach (Rysunek 2B, żółty grot strzałki).

Jednak ustawienia akwizycji tych eksperymentów, tj. szybkość akwizycji, intensywność wzbudzenia i wzmocnienie detektora, muszą być dokładnie ocenione. Interwał 30 s/punkt czasowy, umożliwiający akwizycję wielopunktową, wydaje się być idealny, podczas gdy intensywność promieniowania lasera wzbudzającego (między 0,5-1 W/cm²) musi być brana pod uwagę krytycznie. Rysunek 2D pokazuje komórkę w innym miejscu w tym samym eksperymencie, której nie udało się przyłączyć do podłoża. Możliwe, że efekty fototoksyczne wpłynęły na biologię komórki w tym miejscu, co ostatecznie spowodowało bulgotanie błony po około 60 minutach, prawdopodobnie przypominające apoptozę (Film 2). To po raz kolejny pokazało, w jaki sposób wrażliwe komórki mogą reagować na fototoksyczność i że ważne jest znalezienie właściwej równowagi między ilością wprowadzanego światła a usuwanymi informacjami. Zmniejszenie mocy lasera, liczby obrazów w stosie z lub zwiększenie wzmocnienia może być właściwą strategią zmniejszania fototoksyczności. Wszystkie te ustawienia powinny być jednak dostosowane na poziomie, który nadal pozwala na osiągnięcie wystarczającej rozdzielczości i stosunku sygnału do szumu, umożliwiając wydobycie informacji ilościowych z zarejestrowanego filmu poklatkowego.

Rysunek 1: Schematyczny rysunek konfiguracji SD-TIRF. Tryb obrazowania SD: 6 różnych linii laserowych (405/445/488/515/561/640nm, zielone linie) jest sprzężonych z konfokalnym zespołem skanującym (CSU), przechodząc przez SD (pozycja "IN") i pustą kostkę filtrującą w korpusie mikroskopu (MIC). Emisja fluorescencji z próbki (SPEC) jest rzutowana przez otworki SD i rozdzielana przez różne zwierciadła dichroiczne, np. w celu jednoczesnej akwizycji zielonego/czerwonego lub żółtego/cyjanowego, na dwie różne kamery EM-CCD (C1 i C2). Filtry fluorescencyjne są umieszczone przed kamerami (nie pokazano). Ur. Tryb obrazowania TIRF: linie laserowe są sprzężone ze skanerem TIRF (TIRF). Wieloliniowy rozdzielacz wiązki w MIC kieruje wiązkę na próbkę, a światło emisyjne omija SD ("OUT") w celu maksymalizacji transmisji. Fluorescencja jest wykrywana przez te same kamery i filtry emisyjne, które opisano w A. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Zobiak i wsp. 7 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki rozprzestrzeniania się komórek i tworzenia adhezji przy użyciu mikroskopii SD-TIRF. Podwójnie transfekowaną komórkę HeLa eksprymującą RFP-Lifeact (czerwony, kanał SD-561) i YFP-Winkulinę (zielony, kanał TIRF-488) poddano trypsynizacji i ponownie wysiewano na szklanych szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną. Tworzenie się zrostów staje się łatwo widoczne, zaczynając od małych powstających zrostów (plamek winkulinowo-dodatnich) po 0 minutach, które rozwijają się w większe zrosty ogniskowe po około 5 minutach. Aktyna korowa jest widoczna po około 10 minutach i rozciąga się na obrzeżach komórek (patrz ramki po 12 i 24,5 minutach). Ur. Powiększony widok obszaru w ramce A (ramka w 45 minucie) przedstawia rozprzestrzenianie się komórek i przejście od zrostów powstających do ogniskowych, a także zrostów związanych z filopodiami (biały grot strzałki) i tworzenie włókien naprężeniowych (patrz kadr w 27 minucie, żółty grot strzałki). C. Kymogram przerywanej żółtej linii narysowanej w A. D. (Foto-) Toksyczne działanie na komórki lub inne niezdrowe komórki może spowodować, że nie przyczepią się one do podłoża. Warunki obrazowania muszą być krytycznie ocenione w celu wykluczenia fototoksyczności. Podziałka = 5 μm (w A i D) i 2 μm (w B i C). Widoki XZ w A i D są rzutami ortogonalnymi wyodrębnionymi z narysowanych na nich przerywanych białych linii (dół = podłoże). Obrazy były liniowo wzmacniane przez kontrast i filtrowane medianami za pomocą jądra 3x3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film 1: Rekonstrukcja 3D sekwencji timelapse na Rys. 2A. Sekwencja obrazu została wyrenderowana za pomocą oprogramowania do obrazowania 3D. Czas trwania: 42,5 min. Szybkość akwizycji: Pozyskano 2 dwukanałowe stosy SD-TIRF na minutę (łącznie 56 klatek). Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Film 2: Film z sekwencją poklatkową na Rys. 2C. Czas trwania: 60 min. Szybkość akwizycji: Pozyskano 2 dwukanałowe stosy SD-TIRF na minutę (łącznie 56 klatek). Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.