Method Article

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

DOI:

10.3791/58756

⸱

January 21st, 2019

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W żywych komórkach procesy takie jak tworzenie się adhezji obejmują rozległe zmiany strukturalne w błonie plazmatycznej i wnętrzu komórki. Aby zobrazować te wysoce dynamiczne zdarzenia, połączono dwie uzupełniające się techniki mikroskopii świetlnej, które umożliwiają szybkie obrazowanie żywych próbek: mikroskopię wirującego dysku (SD) do szybkiego rejestrowania objętości w wysokiej rozdzielczości oraz mikroskopię fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do precyzyjnej lokalizacji i wizualizacji błony plazmatycznej. Zaprezentowany zostanie kompleksowy i kompletny protokół obrazowania, który poprowadzi nas przez proces przygotowania próbki, kalibracji mikroskopu, tworzenia i akwizycji obrazu, co zaowocuje wielokolorowymi seriami obrazowania na żywo SD-TIRF o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej. Wszystkie niezbędne kroki przetwarzania obrazu w celu wygenerowania wielowymiarowych zestawów danych obrazowania na żywo, tj. rejestracja i kombinacja poszczególnych kanałów, są dostarczane w samodzielnie napisanym makrze dla oprogramowania open source ImageJ. Obrazowanie białek fluorescencyjnych podczas inicjacji i dojrzewania kompleksów adhezyjnych, a także tworzenie sieci cytoszkieletu aktyny, wykorzystano jako dowód słuszności tego nowatorskiego podejścia. Połączenie mikroskopii 3D o wysokiej rozdzielczości i TIRF zapewniło szczegółowy opis tych złożonych procesów zachodzących w środowisku komórkowym, a jednocześnie precyzyjną lokalizację cząsteczek związanych z błoną, wykrytych przy wysokim stosunku sygnału do tła.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszych czasach techniki mikroskopii świetlnej zapewniające obrazowanie w wysokiej/super rozdzielczości w nieruchomych i żywych próbkach szybko się rozwijają. Techniki superrozdzielcze, takie jak odpowiednio wymuszone zubożenie emisji (STED), mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM) i mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji (PALM) lub bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), są dostępne na rynku i umożliwiają obrazowanie struktur subkomórkowych ukazujących szczegóły niemal w skali molekularnej1,2,3,4,5,6. Jednak podejścia te nadal mają ograniczone zastosowanie w eksperymentach obrazowania na żywo, w których duże objętości muszą być wizualizowane z prędkością akwizycji wielu klatek na sekundę. Odmiany wysoce dynamicznych procesów regulowanych przez błonę plazmatyczną, np. endo-/egzocytoza, adhezja, migracja lub sygnalizacja, zachodzą z dużą prędkością w dużych objętościach komórkowych. Niedawno, aby wypełnić tę lukę, zaproponowano zintegrowaną technikę mikroskopii o nazwie spinning disk-TIRF (SD-TIRF)7. Szczegółowo, mikroskopia TIRF pozwala na specyficzną izolację i lokalizację błony plazmatycznej8,9, podczas gdy mikroskopia SD jest jedną z najbardziej czułych i szybkich technik obrazowania na żywo do wizualizacji i śledzenia organelli subkomórkowych w cytoplazmie10,11. Połączenie obu technik obrazowania w jednym ustawieniu zostało już zrealizowane w przeszłości12,13, jednak prezentowany tutaj mikroskop (Rysunek 1) ostatecznie spełnia kryteria wykonywania eksperymentów obrazowania na żywo SD-TIRF wyżej wymienionych procesów z prędkością 3 klatek na sekundę. Ponieważ mikroskop ten jest dostępny na rynku, celem tego manuskryptu jest szczegółowe opisanie i dostarczenie narzędzi i protokołów open source do akwizycji, rejestracji i wizualizacji obrazów związanych z mikroskopią SD-TIRF.

Konfiguracja opiera się na odwróconym mikroskopie podłączonym do dwóch jednostek skanujących za pomocą niezależnych portów - lewy port jest połączony z modułem SD, a tylny port z modułem skanera dla eksperymentów TIRF i fotoaktywacji/wybielania. Do wzbudzenia można użyć do 6 laserów (405/445/488/515/561/640 nm). Do wzbudzenia i detekcji sygnału fluorescencji zastosowano odpowiednio obiektyw TIRF 100x/NA1.45 oil lub 60x/NA1.49 oil. Emitowane światło jest rozdzielane przez zwierciadło dichroiczne (561 nm długoprzepustowe lub 514 nm długoprzepustowe) i filtrowane przez różne filtry pasmowo-przepustowe (o szerokości 55 nm wyśrodkowane przy 525 nm, o szerokości 54 nm wyśrodkowane przy 609 nm odpowiednio dla zielonej i czerwonej fluorescencji) umieszczone przed dwiema kamerami EM-CCD. Należy pamiętać, że więcej szczegółów technicznych dotyczących konfiguracji znajduje się w Zobiak i wsp.7. W konfiguracji TIRF, jednostka SD jest przesuwana poza ścieżkę światła w ciągu około 0,5 sekundy, dzięki czemu te same dwie kamery mogą być używane do wykrywania, co pozwala na szybsze przełączanie między dwoma modalnościami obrazowania w porównaniu do około 1 s, które było zgłaszane w przeszłości13. Ta funkcja umożliwia jednoczesną akwizycję dwukanałową, dzięki czemu można wykonać 4-kanałowe obrazowanie SD-TIRF z niespotykaną wcześniej szybkością i dokładnością. Co więcej, wyrównanie między obrazami SD i TIRF nie jest konieczne. Wyrównanie obrazu między dwiema kamerami musi być jednak sprawdzone przed rozpoczęciem eksperymentu i w razie potrzeby skorygowane. W poniższym protokole procedura korekcji rejestracji została zaimplementowana w samodzielnie napisanym makrze ImageJ. Co więcej, makro zostało zaprojektowane głównie tak, aby umożliwić jednoczesną wizualizację zbiorów danych SD i TIRF pomimo ich różnej wymiarowości. Samo oprogramowanie do akwizycji nie zapewniało tych funkcji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek

  1. Dwa dni przed eksperymentem wysiewaj 3*105 komórek HeLa lub NIH3T3 w 2 ml pełnego podłoża wzrostowego na dołek 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Upewnij się, że komórki są obsługiwane w okapie z przepływem laminarnym przez cały czas trwania tego protokołu.
  2. Na dzień przed eksperymentem należy przygotować odczynniki do transfekcji zgodnie z zaleceniami producenta lub empirycznie ustalonym protokołem, np.:
    1. Rozcieńczyć 1 μg RFP-Lifeact i 1 μg YFP-Vinculin w sumie 200 μl zredukowanej pożywki surowicy. Krótko odczynnik do transfekcji należy krótko przemieszać, dodać 4 μl do 200 μl DNA i ponownie przetrząsnąć. Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Dodaj całą mieszankę transfekcyjną kroplami bezpośrednio do komórek. Wymieszać, potrząsając płytką i umieścić ją z powrotem w inkubatorze.
  3. W dniu eksperymentu przygotuj próbkę do obrazowania na żywo:
    1. Przygotować roztwór fibronektyny o stężeniu 10 μg/ml w PBS, aby pokryć szklaną powierzchnię naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 mm. Używaj tylko wysokiej jakości szkiełek nakrywkowych ze szkła o grubości 0,17 mm, aby uzyskać optymalną wydajność TIRF i unikaj plastikowych naczyń dolnych. Pozostaw roztwór na szklanej powierzchni na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyjmij go i pozostaw naczynie do wyschnięcia na powietrzu.
    2. Rozcieńczyć roztwór kulek wielofluorescencyjnych o stężeniu 0,1 μm do gęstości 1,8 x10,9 cząstek na ml w wodzie destylowanej i dodawać roztwór przez 30-60 s do powierzchni szkła pokrytego fibronektyną. Natychmiast usuń roztwór i pozostaw naczynie do wyschnięcia na powietrzu.
      UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy płaszczyzna TIRF powinna zostać znaleziona przed zasiewem komórek i/lub w celu uzyskania 2-kolorowego obrazu referencyjnego do rejestracji obrazu opartego na koralikach.
    3. Przygotować 0,1 M roztwór kwasu askorbinowego (AA) i rozcieńczyć go do końcowego stężenia 0,1 mM w pożywce wzrostowej (pożywka AA). Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Jeśli to możliwe, użyj pożywki do hodowli komórkowych zoptymalizowanej pod kątem fluorescencji, takiej jak pożywka wolna od fenolronów i o zredukowanej (rybo-) flawinie. AA jest środkiem przeciwutleniającym, który może zmniejszyć efekty fototoksyczne podczas obrazowania na żywo14. Przetestowaliśmy to z powodzeniem w tym teście, tj. więcej komórek wydawało się zdrowych w zastosowanych warunkach niż bez dodatku AA. Jednak pH pożywki zostało obniżone o 0,17 jednostki pH.
    4. Umyj komórki 2 ml PBS, dodaj 250 μl trypsyny-EDTA i poczekaj, aż komórki całkowicie się odłączą (2-3 minuty w inkubatorze o temperaturze 37 °C). Ostrożnie zawiesić komórki w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki AA za pomocą pipety i dodać ją do 4 ml pożywki AA w probówce do hodowli komórkowych o pojemności 15 ml. Umieścić zawiesinę komórek z lekko uchyloną pokrywką w inkubatorze nastawionym na 37 °C i 5% CO2 w pobliżu mikroskopu.
    5. Dodaj 1 ml podgrzanej pożywki AA do naczynia ze szklanym dnem i umieść je w uchwycie podgrzanego mikroskopu (patrz następny akapit).

2. Obrazowanie na żywo

  1. Rozpocznij kontrolę otoczenia mikroskopu, aby uzyskać stabilną temperaturę 37 °C, 5% CO2 i wilgotną atmosferę.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano małą komorę inkubacyjną z górnym stopniem, która umożliwiła stabilne ustawienia w ciągu około 15 minut. Większe inkubatory będą potrzebowały więcej czasu, aby osiągnąć stabilne warunki.
  2. Ustal wszystkie ustawienia akwizycji pod mikroskopem przed nałożeniem zawiesiny komórek:
    1. Ustaw przedział czasowy na 30 s, a czas trwania na 60-90 min. Aktywuj funkcję automatycznego ustawiania ostrości sprzętowego autofokusa dla każdego punktu czasowego (wartość "1").
    2. Dostosuj ekspozycję i wzmocnienie kamery, a także moc lasera dla każdego kanału. Wysokie poziomy wzmocnienia, krótki czas naświetlania i niska moc lasera są zalecane w celu zmniejszenia fototoksyczności.
      UWAGA: Przedstawione tutaj dane zostały uzyskane przy ekspozycji 200 ms, poziomie wzmocnienia 500 i 20% mocy lasera, która odpowiada intensywności wzbudzenia odpowiednio 0,5 W/cm² dla 488 nm i 1 W/cm² dla 561 nm.
    3. Ustaw stos z dla kanałów wirującego dysku na 10 μm z odstępem 0,4 μm. Dezaktywuj stosy z dla kanałów TIRF. Ustaw dolne przesunięcie na "0", tj. najniższa płaszczyzna będzie pozycją ostrości sprzętowego autofokusa.
    4. Aktywuj funkcję wielopunktową "pozycje stolika".
      UWAGA: W 30-sekundowym przedziale czasu można zarejestrować do 3 pozycji.
  3. Znajdź koraliki fluorescencyjne z oświetleniem epifluorescencyjnym przy oczce lub na ekranie komputera, a następnie aktywuj jeden kanał TIRF i ustaw kąt oświetlenia na wartość oznaczającą oświetlenie TIRF. Aktywuj autofokus, naciskając przycisk na panelu mikroskopu i wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła offsetowego. Uzyskaj zestaw danych 2-kolorowych, tj. TIRF-488 i TIRF-561, w celu późniejszej rejestracji obrazu na podstawie koralików (patrz punkt 3.1).
    1. Opcjonalnie: Aby zapewnić oświetlenie TIRF, dodać kilka mikrolitrów swobodnie unoszącej się zawiesiny fluorescencyjnych wielokolorowych kulek (patrz punkt 1.3.2.). Aktywuj podgląd na żywo kanału TIRF i zwiększ kąt oświetlenia. Nieprzylegające koraliki znikną poza kątem krytycznym, zapewniając prawidłowe oświetlenie TIRF8.
  4. Ponownie wymieszaj zawiesinę komórek, odwracając zamkniętą probówkę 2-3 razy i nałóż 1 ml komórek do naczynia do obrazowania.
  5. Szybko znajdź podwójnie transfekowane komórki z niskim poziomem oświetlenia epifluorescencyjnego. Wyśrodkuj komórki w podglądzie kamery na żywo za pomocą jasnego oświetlenia pola i zaznacz pozycję. Znajdź kolejne 1-2 interesujące miejsca i zapisz je na liście pozycji.
    UWAGA: Na początku komórki mogą łatwo się odłączyć z powodu ruchu sceny, dlatego ustaw 4-5 pozycji i ponownie sprawdź wszystko przed rozpoczęciem akwizycji obrazu. Następnie odrzuć 1-2 pozycje.
  6. Rozpocznij pobieranie danych, klikając przycisk "Sekwencja".

3. Przetwarzanie końcowe obrazu w ImageJ

  1. W celu wygenerowania hiperstosu bez rejestracji w FIJI15, napisano makro o nazwie "SD-TIRF_helper", które można zastosować do 2-4 kanałowych zestawów danych poklatkowych SD-TIRF. Zapisz plik "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" w podfolderze FIJI "makra" i uruchom makro klikając na polecenie menu "Wtyczki>Makra>Uruchom...".
    1. Jeśli kanały kolorów wymagają korekty pasowania, wybierz tę opcję i utwórz nowe odniesienie pasowania oparte na ściegach (plik punktu orientacyjnego) lub użyj istniejącego pliku, który został utworzony wcześniej.
      UWAGA: Wtyczka turboreg 16 zostanie zastosowana do obrazów referencyjnych koralików fluorescencyjnych. Zainstaluj wtyczkę w oprogramowaniu FIJI zgodnie z ogólnymi wytycznymi dotyczącymi instalacji wtyczek.
    2. Zaimportuj dane za pomocą importera formatów biologicznych i wybierz hyperstack jako opcję przeglądania. Załaduj zestaw danych obrazu, wybierz serię SD w pierwszym kroku i serię TIRF w drugim kroku. FIJI wyświetli dane posortowane według kanału i pozycji etapu, tj. zwykle wszystkie kanały SD i wszystkie kanały TIRF pojawiają się jako jeden hyperstack dla każdej wybranej pozycji etapu.
      UWAGA: Import danych jest możliwy z różnych typów plików, na przykład serii TIFF lub typów plików zależnych od platformy, takich jak *.nd. Typ pliku nie może zostać rozpoznany tylko wtedy, gdy nie został wyeksportowany przez oprogramowanie do akwizycji jako niezależny format TIFF bez kompresji.
    3. Zastosuj korektę rejestracji do odpowiednich kanałów, wczytując wcześniej określony plik punktów orientacyjnych.
    4. Wybierz żądaną tabelę wyszukiwania kolorów (LUT) dla każdego kanału SD i TIRF i połącz je w jeden, wielowymiarowy hyperstack.
      UWAGA: Podczas przetwarzania kanałów TIRF pewna liczba płaszczyzn z o zerowych wartościach intensywności jest dodawana na górze dolnej płaszczyzny, która jest zgodna z liczbą płaszczyzn z w zestawie danych SD. Ten krok jest ważny dla wizualizacji końcowego hyperstacka. Ta metodologia jest poprawna, ponieważ głębokość oświetlenia TIRF (mniej niż 200 nm7) jest mniejsza niż rozmiar kroku z stosu SD (400 nm).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby pokazać potencjał obrazowania SD-TIRF, opracowano test, który powinien ujawnić czasoprzestrzenną organizację kompleksów adhezyjnych komórka-matryca i ich interakcję z cytoszkieletem podczas adhezji komórkowej. Dlatego przylegające komórki HeLa lub, alternatywnie, NIH3T3 transfekowano YFP-Vinculin i RFP-Lifeact przez 18-24 godziny, trypsynizowano i wysiewano na szklanych naczyniach pokrytych fibronektyną. Te linie komórkowe zostały wybrane ze względu na ich wyraźny cytoszkielet i wyższ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pracy przedstawiono pierwsze udane zastosowanie mikroskopii SD i TIRF w konfiguracji odpowiedniej do wykonywania eksperymentów obrazowania żywych komórek, tj. uzyskano wysokie wskaźniki akwizycji, takie jak 2 stosy obrazów SD-TIRF na minutę w 3 różnych pozycjach stolika, co odpowiada łącznie 168 klatkom (około 3 klatki na sekundę). Nieliczne mikroskopy SD-TIRF, które zostały opisane wcześniej12,13, to przede wszystkim brak wystarczająco dużej prędkości...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bardzo dziękujemy społeczności naukowej Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Hamburg-Eppendorf za wsparcie nas próbkami do oceny. Mianowicie dziękujemy Sabine Windhorst za komórki NIH3T3, Andrei Mordhorst za YFP-Vinculin i Maren Rudolph za RFP-Lifeact.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroskop i akcesoria
SD-TIRF MikroskopVisitron Systems
Ti z doskonałym systemem ustawiania ostrościNikonOdwrócony statyw
mikroskopowy CSU-W1 T2YokogawaWirujący dysk w konfiguracji z dwoma kamerami
iLAS2 Skaner TIRF/FRAPfirmy Roper Scientific
Evolve Kamery PhotometrixEM-CCD
Stopień PiezoZLudl Electronic ProductsZmotoryzowany stopień
Z Bioprecision2 Stopień XYLudl Electronic ProductsZmotoryzowany stopień XY
Górna komora inkubacyjnaOkolabBold LineTemperatura, CO2 i wilgotność
Hodowla komórkowa
HeLa komórki raka szyjki macicyDSMZACC-57
NIH3T3 fibroblastyDSMZACC-59
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)Gibco14190144
Trypsyna-EDTA 0,05%Gibco25300054
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle + GlutaMAX-I (DMEM)Gibco31966-021
OptiMEMGibco31985070Zredukowana pożywka w surowicy
Surowica cielęca płodu (FCS)Gibco10500064
Penicylina/Streptomycyna (PenStrep)Gibco15140148
Pełna pożywka (DMEM uzupełniona o 10% FCS i 1% PenStrep)
TurboFectThermoFisher ScientificR0531Transfekcja odczynnik
Kwas askorbinowy (AA)SigmaA544-25G
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowychSarstedt83.392
Naczynia ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-10-C35mm, 0.17mm szkło nakrywkowe
Fibronektyna, osocze bydlęceThermoFisher Scientific33010018
Neubauer ulepszona komoraVWR631-0696
Koraliki TetraSpeckThermoFisher ScientificT7279
Plasmids
RFP-LifeactMaren Rudolph, Instytut Mikrobiologii Medycznej, Uniwersyteckie Centrum Medyczne Hamburg Eppendorf, Niemcy
YFP-VinculinAndrea Mordhorst, Instytut Mikrobiologii Medycznej, Uniwersyteckie Centrum Medyczne w Hamburgu Eppendorf, Niemcy<
strong>Software i wtyczki
VisiViewVisitron SystemsVersion 3
ImageJVersion 1.52c
Wtyczkahttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"ta publikacjahttps://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmerWersja 6.2.2
Turboreg

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
  2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  7. Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
  8. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
  9. Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
  10. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  11. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
  12. Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024(2009).
  13. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  14. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  17. Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
  18. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  19. Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
  20. Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
  21. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  22. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  23. Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
  24. Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
  25. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spinning Disk MicroscopyTIRF MicroscopyLive Cell ImagingAdhesion FormationCytoskeletal NetworkFluorescent ProteinsImage RegistrationMicroscope CalibrationSample PreparationMulti Color Imaging

Related Articles