Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

Summary

Przedstawiamy metodę analizy aktywności dimeryzacji domeny 4-hydroksy-tamoksyfenu zależnej od receptora estrogenowego alfa ligandu za pomocą testu dwuhybrydowego u ssaków.

Abstract

Receptor estrogenowy alfa (ERα) jest estrogennym regulatorem transkrypcji zależnym od ligandu. Sekwencja białka ERα jest wysoce konserwatywna wśród gatunków. Uważa się, że funkcja ERαs człowieka i myszy jest identyczna. Wykazujemy różnicowy wpływ 4-hydroksy-tamoksyfenu (4OHT) na aktywność dimeryzacji domeny wiążącej ligand (LBD) u myszy i człowieka za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków (M2H). Test M2H może wykazać skuteczność aktywności homodimeryzacji LBD w komórkach ssaków, wykorzystując transfekcję dwóch plazmidów ekspresji białek (fuzja domeny wiążącej DNA GAL4 [DBD] LBD i fuzja domeny transaktywacji VP16 [VP16AD] LBD) oraz plazmidu reporterowego lucyferazy reagującego na element GAL4 (GAL4RE). Kiedy LBD fuzji GAL4DBD i fuzji VP16AD LBD wytwarzają dimer w komórkach, ten kompleks białkowy wiąże się z GAL4RE, a następnie aktywuje ekspresję genu lucyferazy poprzez aktywność transkrypcyjną zależną od VP16AD. Aktywacja lucyferazy za pośrednictwem 4OHT jest wyższa w komórkach HepG2, które zostały transfekowane mysim plazmidami ekspresji białka fuzyjnego ERα LBD, niż w ludzkich komórkach transfekowanych plazmidem o ekspresji białka fuzyjnego ERα LBD. Wynik ten sugeruje, że skuteczność zależnej od 4OHT mysiej aktywności homodimerycznej ERα LBD jest wyższa niż ludzkiego ERα LBD. Ogólnie rzecz biorąc, wykorzystanie testu M2H nie jest idealne do oceny aktywności dimeryzacji receptora jądrowego LBD, ponieważ agonistyczne ligandy zwiększają podstawowy poziom aktywności LBD, co utrudnia wykrycie aktywności dimeryzacji LBD. Stwierdziliśmy, że 4OHT nie zwiększa podstawowej aktywności ERα LBD. Jest to kluczowy czynnik umożliwiający określenie i wykrycie zależnej od 4OHT aktywności dimeryzacji LBD w celu pomyślnego zastosowania testu M2H. Testy M2H oparte na ERα LBD mogą być stosowane do badania częściowej aktywności agonistycznej selektywnych modulatorów receptora estrogenowego (np. 4OHT) w różnych typach komórek ssaków.

Introduction

Receptor estrogenowy alfa (ERα) jest estrogennym regulatorem transkrypcji zależnym od ligandu. Sekwencja aminokwasowa ERα jest wysoce konserwatywna wśród gatunków. Ze względu na większą homologię między ludzkim i mysim ERα, funkcja tych receptorów jest uważana za identyczną, a zróżnicowana aktywność substancji estrogenowych (np. tamoksyfenu) u tych gatunków jest spowodowana różnicami w metabolizmie chemicznym gatunku, a nie różnicami strukturalnymi ERα. ERα ma wysoce konserwatywne struktury domenowe, które są powszechne w nadrodzinie receptorów jądrowych (NR), oznaczonych domenami od A do F. Domena E lub domena wiążąca ligand (LBD) obejmuje kieszeń wiążącą ligand i funkcję aktywacji transkrypcji 2, nazwaną AF-2. Domena F jest zlokalizowana bezpośrednio przylegająca do domeny E i jest najbardziej zmienną domeną spośród NR. Nawet między człowiekiem a myszą ERα homologia domeny F jest znacznie niższa niż w innych domenach¹. Związany z ligandem LBD ERα zwiększa homodimeryzację białka ERα w celu bezpośredniego związania specyficznego elementu DNA reagującego na estrogen w celu regulacji transkrypcji genu zależnego od liganda (klasyczne działanie ERα). Badania krystalograficzne ujawniły różnicowe pozycjonowanie helisy 12 (domena rdzenia AF-2) z dimerami LBD związanymi z estradiolem (E2) lub 4-hydroksy-tamoksyfenem (4OHT)^2,3. Domena ERα F (45 aminokwasów) łączy helisę 12 bezpośrednio. Nie ma jednak informacji dotyczących wpływu tego rozszerzenia 45 aminokwasów (domena F) z helisy 12 na dimeryzację ERα LBD. W tym badaniu wykazujemy wkład domeny F w specyficzną dla gatunku homodimeryzację ERα LBD zależną od 4OHT za pomocą testu dwuhybrydowego (M2H) u ssaków.

Test M2H to metoda demonstrowania interakcji białko-białko w komórkach ssaków, wprowadzająca trzy różne plazmidowe DNA: dwa plazmidy o ekspresji białek, które wyrażają fuzję domeny wiążącej DNA GAL4 (DBD) ERα LBD i fuzję VP16AD ERα LBD, oraz plazmid reporterowy o ekspresji lucyferazy sfuzji GAL4RE. Kiedy fuzja GAL4DBD ERα LBD i fuzja VP16AD ERα LBD oddziałują (tworzą dimer) w komórkach, ten kompleks białkowy wiąże się z GAL4RE, a następnie aktywuje ekspresję genu lucyferazy poprzez funkcję transaktywacji zależną od VP16AD. Poziom homodimeryzacji LBD można ocenić na podstawie aktywności lucyferazy.

Test dwuhybrydowy (Y2H) drożdży jest alternatywną metodą opartą na tej samej zasadzie, która wykorzystuje drożdże jako środowisko gospodarza. Poprzednie doniesienia z użyciem systemu Y2H wykazały, że ludzki ERα LBD z obciętą domeną F zwiększa rekrutację koaktywatora zależnego od E2, stwierdzając, że domena F zapobiega transkrypcji za pośrednictwem E2⁴. Wynik ten jest niespójny z innymi raportami, które wykazały osłabioną aktywność transkrypcyjną ludzkiego ERα obciętego w domenie F w komórkach ssaków^5,6. Niedawno nasze badanie, przy użyciu systemu M2H, wykazało, że zależna od E2 aktywność rekrutacji koaktywatora ludzkiego ERα LBD jest zmniejszana przez skrócenie domeny F w komórkach ssaków i jest zgodna z aktywnością transkrypcyjną¹. Obserwacje te sugerują, że fizjologiczna rola interakcji białko-białko różni się w zależności od typu komórki i kontekstu. Test M2H może wykazać aktywność interakcji białko-białko w tym samym kontekście komórkowym, który jest używany do określania aktywności transkrypcyjnej. Daje to przewagę testu M2H w porównaniu z Y2H lub innymi analizami interakcji białko-białko in vitro.

Pozostają pytania dotyczące molekularnych mechanizmów częściowej agonistycznej aktywności selektywnych modulatorów receptora estrogenowego (SERM) (np. 4OHT) do regulacji transkrypcji za pośrednictwem ERα. Testy M2H oparte na ERα LBD mogą być stosowane do badania mechanizmu częściowej aktywności agonistycznej SERM w różnych typach komórek ssaków.

Protocol

1. Przygotowanie plazmidów do testu dwuhybrydowego u ssaków

1. Użyj następujących plazmidów: pG5-Luc, pBIND-ERαEF i pACT-ERαEF.
   UWAGA: Plazmidy są dostępne u autorów na życzenie i są wysyłane na bibule filtracyjnej. pG5-Luc jest plazmidem reporterowym, który zawiera pięć powtórzeń elementów reagujących na GAL4 połączonych z jednostką ekspresji lucyferazy (Figura 1A). pBIND-ERαEF jest plazmidem ekspresji białka dla GAL4DBD skondensowanych białek ERα LBD. pBIND-ERαEF zawiera jednostkę ekspresji lucyferazy Renilla do normalizacji skuteczności transfekcji (Rysunek 1B). pACT-ERαEF jest plazmidem ekspresji białka dla białek ERα LBD z fuzją VP16AD (Rysunek 1C). Schemat wyrażonej struktury białka z plazmidów jest pokazany na Rysunek 2.
2. Przygotuj plazmidowe DNA.
   1. Wytnij obszar obciążony plazmidem z papieru za pomocą czystych nożyczek i włóż go do probówki o pojemności 1,5 ml. Załóż rękawiczki i użyj czystej pęsety, aby podnieść papier załadowany plazmidem. Dodać 100 μl buforu Tris-EDTA (TE) (pH 8,0) i dobrze odwirować.
   2. Dodać 1 μl roztworu plazmidowego DNA z kroku 1.2.1 do właściwych komórek Escherichia coli (patrz tabela materiałów) i trzymać probówkę na lodzie przez 15 minut.
   3. Wstrząs termiczny kompetentnych komórek z dodatkiem plazmidu; inkubować probówkę (probówki) w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 30 s, a następnie trzymać je na lodzie przez 2 minuty.
   4. Dodać 250 μl super optymalnego bulionu z pożywką do tłumienia katabolitów (SOC) (o temperaturze pokojowej) do probówki (probówek) i wyhodować z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 30 min.
   5. Umieścić 100 μl hodowli E. coli na wstępnie podgrzanej płytce bulionu Luria (LB) ze 100 μg/ml ampicyliny (naczynie o średnicy 10 cm) i wyhodować w temperaturze 37 °C przez noc.
   6. Wybierz jedną kolonię z talerza i dodaj ją do 14 ml probówki zawierającej 2 ml wspaniałego bulionu (TB) ze 100 μg/ml ampicyliny. Hodowlę należy przeprowadzić z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C aż do uzyskania lekkiego zmętnienia podłoża.
   7. Dodać 1 ml pożywki z etapu 1.2.6 do autoklawizowanej szklanej kolby o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml gruźlicy ze stężeniem 100 μg/ml ampicyliny. Hodowla z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 20-24 godziny.
   8. Przenieść wyhodowaną bakterię E. coli do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 3 450 x g w temperaturze pokojowej przez 30 minut za pomocą wirnika z odchylanym kubełkiem. Wyrzuć pożywkę. Przechowywać granulki E. coli w temperaturze -80 °C.
   9. Dodać 3 ml roztworu do ponownego zawieszania komórek (patrz tabela materiałów) do osadu E. coli i całkowicie go zawiesić. Dodać 3 ml roztworu do lizy komórek (patrz tabela materiałów), delikatnie wymieszać probówkę, odwracając ją 10 razy i trzymać na lodzie przez 5 minut (punktualnie utrzymywać czas). Dodać 6 ml roztworu neutralizującego (patrz tabela materiałów), wymieszać probówkę równomiernie, stukając, a następnie trzymać ją na lodzie przez 10 minut.
   10. Odwirować probówkę o sile 3 450 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut za pomocą wirnika kubełkowego. Przenieść roztwór zawierający DNA do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać 10 ml żywicy oczyszczającej DNA (patrz tabela materiałów). Delikatnie zawieś żywicę.
   11. Odwirować probówkę o masie 625 x g przez 1 minutę za pomocą wirnika uchylno-kubełkowego. Wyrzuć roztwór i trzymaj żywicę na dnie.
   12. Dodaj 15 ml roztworu do przemywania kolumny (80 mM octanu potasu, 8,5 mM Tris-HCl [pH 7,5], 40 μM EDTA i 55% etanolu) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i delikatnie potrząśnij, aby zawiesić żywicę. Powtórz krok 1.2.11.
       UWAGA: Roztwór do płukania kolumny należy przygotować przy użyciu wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC) lub wody wolnej od nukleaz.
   13. Dodać 5 ml roztworu do przemywania kolumny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zawiesić żywicę za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Nałóż żywicę na kolumnę (patrz Tabela materiałów), która jest ustawiona na kolektorze próżniowym. Odkurz kolumnę, aż żywica wyschnie. Dodać 6 ml roztworu do przemywania kolumny do kolumny i odkurzyć.
   14. Gdy żywica wizualnie wyschnie, odłącz zbiornik od kolumny. Przenieś dolną część kolumny (żywicy) do probówki o pojemności 1,5 ml. Odwirować kolumnę z maksymalną prędkością przez 2 minuty za pomocą mikrowirówki, aby całkowicie wysuszyć żywicę.
   15. Przenieś dolną część kolumny (żywicy) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj 300 μl wody wolnej od nukleaz do kolumny i poczekaj, aż cała żywica nasiąknie.
   16. Odwirować kolumnę z maksymalną prędkością przez 1 minutę w celu zebrania roztworu zawierającego plazmidowe DNA (200 - 250 μl).
   17. Potraktować roztwór zawierający DNA chloroformem fenolowym (1:1), a następnie chloroformem w następujący sposób.
       1. Dodać taką samą objętość chloroformu fenolowego (1:1) do roztworu zawierającego DNA (200-250 μl), dobrze wstrząsnąć i odwirować z maksymalną prędkością przez 2 minuty za pomocą mikrowirówki. Zebrać górną warstwę (roztwór zawierający DNA) i dodać ją do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz ten krok 1x.
       2. Dodać taką samą objętość chloroformu do roztworu zawierającego DNA (200 - 250 μl), dobrze wstrząsnąć i odwirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Zebrać górną warstwę (roztwór zawierający DNA) i dodać ją do probówki o pojemności 1,5 ml.
          UWAGA: Endotoksyna (lipopolisacharyd) indukuje sygnalizację komórkową w niektórych komórkach. Aby uniknąć takiego nieprzewidywalnego efektu, zaleca się wykonanie kroku 1.2.17, który może zmniejszyć zanieczyszczenie endotoksynami.
   18. Wytrącić plazmidowe DNA za pomocą techniki wytrącania etanolu w następujący sposób.
       1. Do roztworu zawierającego DNA dodać 1/9 objętości mieszaniny DNA 3 M octanu sodu (pH 5,5) i 20 razy objętość 3M octanu sodu 100% etanolu do roztworu zawierającego DNA. Na przykład do 250 μl roztworu DNA (końcowa objętość to 555,8 μl 3 M octanu sodu i 278 μl 100% etanolu) dodać 27,8 μl roztworu DNA.
       2. Utrzymywać roztwór w temperaturze -80 °C przez co najmniej 20 minut. Wirować z maksymalną prędkością przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić roztwór i zachować osad. Dodaj 200 μl 75% etanolu i wypłucz wnętrze tubki. Wirować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić roztwór i zachować osad. Wysuszyć osad DNA za pomocą koncentratora próżniowego.
       3. Dodać 100 - 250 μl buforu TE (pH 8,0) do probówki. Rozpuścić osad DNA i sprawdzić stężenie DNA za pomocą spektrofotometru o długości fali 260 nm. Utrzymuj stężenie DNA na poziomie około 0,5 mg/ml.

2. Test dwuhybrydowy u ssaków

1. Utrzymuj komórki.
   1. Hodowla ludzkich komórek HepG2 raka wątrobowokomórkowego w kolbie do hodowli tkankowej o pojemności 750 ml i długości 175^cm2 z minimalną ilością niezbędnych pożywek (MEM) wolnych od czerwieni fenolowej uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS; inaktywowaną termicznie), 2 mM L-glutaminą i 1% roztworem penicyliny-streptomycyny (antybiotyki) w celu utrzymania komórek.
   2. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO₂ , aż komórki zlewają się w około 90%.
      UWAGA: Aby zmniejszyć aktywność tła estrogenowego, we wszystkich eksperymentach M2H należy stosować pożywkę wolną od czerwieni fenolowej. Ten krok powinien być wykonywany wewnątrz czystej ławki/szafy bezpieczeństwa biologicznego. Komórki powinny być utrzymywane zgodnie z ogólnym protokołem hodowli komórek ssaków⁷.
2. Przygotuj komórki do transfekcji.
   UWAGA: Następujące czynności proceduralne należy wykonać wewnątrz czystej ławki/szafy bezpieczeństwa biologicznego. Na tym etapie komórki są za każdym razem hodowane/inkubowane w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO₂ .
   1. Ponownie przełóż 90% zlewających się komórek na płytki 24-dołkowe; przepłucz komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
   2. Dodać 7 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA do kolby hodowlanej i moczyć komórki przez 1 - 2 minuty, trzymając kolbę hodowlaną w czystej ławce w temperaturze pokojowej. Usunąć część roztworu trypsyny-EDTA i pozostawić 1 - 2 ml roztworu w kolbie hodowlanej. Inkubować kolbę hodowlaną w inkubatorze przez 1 - 2 minuty.
   3. Uderz w dno kolby, aby odłączyć komórki i sprawdzić je pod mikroskopem.
      UWAGA: Jeśli komórki są nadal podłączone do kolby, inkubować przez kolejne 1-2 minuty, a następnie powtórzyć krok 2.2.3.
   4. Zawieś komórki w MEM wolnym od czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% FBS (inaktywowany termicznie) węglem drzewnym), 2 mM L-glutaminy i 1% roztworu penicyliny i streptomycyny.
      UWAGA: FBS pozbawiony węgla drzewnego musi być stosowany w celu zmniejszenia wpływu endogennego estrogenu pochodzącego z surowicy.
   5. Policz liczbę komórek i komórki nasienne na 24-dołkowej płytce o gęstości 1,2 x 10⁵ komórek/dołek. Przypisz trzy dołki do każdego punktu danych (trzykrotnie).
   6. Hoduj komórki przez noc. Przejdź do kroku 2.4.1.
3. Przygotuj mieszaninę DNA do transfekcji.
   UWAGA: Następujące plazmidowe DNA są transfekowane w jednym dołku: 100 ng plazmidu reporterowego pG5-Luc, 50 ng plazmidów ekspresyjnych dla białek fuzyjnych GAL4DBD (pBIND) i 50 ng plazmidów ekspresyjnych dla białek fuzyjnych VP16AD (pACT).
   1. Aby przeanalizować zależną od liganda aktywność dimeryzacji ERα LBD, przygotuj następujące kombinacje (Rysunek 3). Kombinacja (i): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pACT oraz pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT. Kombinacja (ii): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pACT-hERαEF oraz pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT-mERαEF. Kombinacja (iii): pG5-Luc + pBIND + pACT-hERαEF oraz pG5-Luc + pBIND + pACT-mERαEF.
      UWAGA: Kombinacja (i) reprezentuje podstawowy poziom doświadczalny odpowiednio ludzkiego ERα LBD i mysiego ERα LBD. Jeśli wynik wykazuje niezwykle wysoki poziom z samym ligandem, metoda ta jest niewykonalna do stosowania z tym ligandem (np. dietylstilbestrolem [DES]). Kombinacja (ii) reprezentuje odpowiednio poziomy dimeryzowanego ludzkiego ERα LBD i dimeryzowanego mysiego ERα LBD. Kombinacja (iii) oznacza kontrole ujemne; Tego zestawu należy używać tylko wtedy, gdy eksperyment jest wykonywany po raz pierwszy w celu oceny poziomu tła systemu.
   2. Przed zmieszaniem należy obliczyć całkowitą wymaganą ilość DNA na podstawie liczby studzienek do transfekcji. W przypadku eksperymentów przeprowadzanych w trzech powtórzeniach i w pięciu punktach danych, należy zmieszać następujące plazmidowe DNA w dwóch probówkach o pojemności 1,5 μl dla kombinacji (i) i (ii): pG5-Luc, 5 (punkty danych) x 3 (studzienki) x 100 ng = 1,500 ng (15 μL); pBIND-mERαEF, 5 (punkty danych) x 3 (studzienki) x 50 ng = 750 ng (7,5 μL); pACT (dla kombinacji i) lub pACT-mERαEF (dla kombinacji ii), 5 (punkty danych) x 3 (studzienki) x 50 ng = 750 ng (7,5 μL).
      UWAGA: Stężenie każdego roztworu plazmidowego DNA wynosi 0,1 μg/μL.
   3. Wytrącić mieszaninę DNA za pomocą techniki wytrącania etanolu. Do mieszaniny DNA dodać 1/9 objętości mieszaniny DNA 3 M octanu sodu (pH 5,5) i 20 razy objętość 3M octanu sodu 100% etanolu do mieszaniny DNA. Następnie przekręć rurkę.
      UWAGA: Na przykład dodać 3,4 μl 3 M octanu sodu i 34 μl 100% etanolu do 30 μl mieszaniny plazmidowego DNA, której przykładem jest krok 2.3.2. Ten krok pomaga utrzymać niezmienny stan transfekcji i nie jest konieczne wykonywanie tego kroku w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   4. Przechowywać mieszaninę przez noc w temperaturze -20 °C. Odwirowywać ją z maksymalną prędkością przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić roztwór (osad jest niewidoczny). Dodać 120 μl 75% etanolu do probówki; Następnie wypłucz wnętrze tuby. Wirować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić roztwór i suszyć mieszaninę DNA za pomocą koncentratora próżniowego przez 30 minut.
4. Wykonaj transfekcję.
   UWAGA: Poniższe czynności należy wykonywać na czystej ławce lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   1. Następnego ranka opłucz komórki wysiane na 24-dołkowej płytce (z kroku 2.2.6) 2x 0,5 ml PBS (temperatura pokojowa).
   2. Dodaj ciepły (37 °C) świeży fenol MEM bez czerwieni uzupełniony 10% FBS (inaktywowany termicznie) i 2 mM L-glutaminy bez antybiotyków do każdej studzienki (0,5 ml pożywki/dołek). Komórki należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO₂ .
   3. Zawiesić wysuszoną mieszaninę plazmidowego DNA (z kroku 2.3.4) w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco (bez surowicy, bez czerwieni fenolowej, bez glutaminy; 13 μl/basenik). Oblicz ilości DMEM na podstawie liczby dołków do transfekcji.
      UWAGA: 15 dołków dla kombinacji (i) x 13 μL = 195 μL i 15 dołków dla kombinacji (ii) x 13 μL = 195 μL.
   4. Zawiesić odczynnik do transfekcji (patrz tabela materiałów; 1,5 μl/studzienkę) w DMEM (12,5 μl/basenik) w innej probówce o pojemności 1,5 ml. Obliczyć ilości odczynnika do transfekcji i DMEM na podstawie liczby dołków do transfekcji.
      UWAGA: 30 [15 dołków dla kombinacji (i) i 15 dołków dla kombinacji (ii)] x 1,5 μl odczynnika do transfekcji + 30 x 12,5 μl DMEM = 420 μL.
   5. Dodać równą ilość pożywki odczynnika do transfekcji (z kroku 2.4.4) do każdej probówki (z kroku 2.4.3). Inkubować probówki przez 5 - 10 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: 200 μl pożywki odczynnikowej do transfekcji + 195 μl kombinacji (i) mieszaniny DNA = 395 μL i 200 μl pożywki odczynnika do transfekcji + 195 μl mieszaniny (ii) mieszaniny DNA = 395 μL. Ważne jest, aby dodać równą objętość odczynnika do transfekcji do probówek z kombinacją (i) i (ii). Na tym etapie nie jest konieczne zużywanie pożywki.
   6. Dodać połączoną mieszaninę (z etapu 2.4.5) do każdego dołka (25 μl/basenik) płytki 24-dołkowej (z etapu 2.4.2) i inkubować komórki przez 6 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO₂
   .
   7. Usunąć podłoże do transfekcji z płytki 24-dołkowej. Dodaj ciepły (37 °C) świeży MEM bez czerwieni fenolowej uzupełniony 10% FBS (inaktywowany termicznie) węglem drzewnym, 2 mM L-glutaminy, 1% roztworu penicyliny i streptomycyny oraz liganda (zawieszonego w etanolu) (0,5 ml podłoża / studzienkę). Hodować komórki przez 16 - 18 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO₂ .
5. Zbierz próbki.
   1. Przepłukać komórki 1 ml PBS, a następnie dodać 100 μl 1x pasywnego buforu do lizy (patrz Tabela materiałów).
   2. Energicznie potrząśnij 24-dołkowymi płytkami za pomocą mieszalnika wirowego, aby odłączyć komórki.
   3. Płytki (lizaty komórkowe) zamrozić 1x ciekłym azotem lub zachować je w temperaturze -80 °C przed analizą. Bezpośrednio przed badaniem energicznie potrząśnij płytkami na wytrząsarce, aż osiągną temperaturę pokojową.
      UWAGA: Proces ten zapobiega nieregularnie pojawiającym się anomalnym wartościom aktywności lucyferazy.
6. Wykonaj test podwójnej lucyferazy.
   1. Przygotować odczynniki do systemu testów podwójnej lucyferazy (patrz tabela materiałów).
      1. Aby zrobić bufor substratu do testu lucyferazy (LAS), dodaj cały bufor do testu lucyferazy do substratu do testu lucyferazy, który znajduje się w szklanej brązowej butelce. Przechowywać bufor LAS w temperaturze -20 °C.
         UWAGA: Przed użyciem bufor LAS należy ogrzać do temperatury pokojowej.
      2. Aby zrobić bufor substratu lucyferazy Renilla (RLS), wymieszaj substrat lucyferazy Renilla i bufor lucyferazy Renilla w stosunku 1:50. Przygotuj świeży bufor RLS dla każdego testu i użyj czarnej probówki lub probówki zacienionej folią aluminiową. Obliczanie ilości buforu zabezpieczeń na poziomie wiersza tworzącego nowy bufor.
         UWAGA: Przed użyciem bufor RLS należy ogrzać do temperatury pokojowej.
   2. Umieścić odczynniki w czytniku mikropłytek.
      1. Przewody iniekcyjne umyć 2x 70% etanolem, a następnie przewody 2x umyć wodą.
         UWAGA: Jest to ważne, aby zapobiec zakłóceniu wyników testu.
      2. Ustawić bufor LAS na linię wtryskiwacza P (pierwsze wstrzyknięcie) i ustawić bufor RLS na linię wtryskiwacza M (drugie wstrzyknięcie). Nie mieszaj tych. Bufor zabezpieczeń wiersza hamuje aktywność lucyferazy.
   3. Nałożyć 10 μl pobranych próbek (z etapu 2.5.3) na 96-dołkową białą płytkę z tworzywa sztucznego.
   4. Zastosuj następujące ustawienia do czytnika mikropłytek. W przypadku wtryskiwacza P należy użyć objętości 50 μl, opóźnienia 2 s i prędkości 50 μL/s. W przypadku wtryskiwacza M należy użyć objętości 50 μl, opóźnienia 2 s i prędkości 50 μL/s. Ustaw czas integracji na 15 s. Ustaw temperaturę na 25 °C.
   5. Uruchomić czytnik mikropłytek.
   6. Zapisz wartości aktywności lucyferazy (IPValue) i wartości aktywności lucyferazy Renilla (IMValue) za pomocą programu do akwizycji danych (patrz tabela materiałów).
   7. Po zebraniu danych umyć przewody iniekcyjne (patrz krok 2.6.2.1).
7. Przeprowadzanie analizy danych.
   1. Użyj znormalizowanych wartości (IPValue/IMValue) do analizy danych.
   2. Ustawić znormalizowaną wartość kombinacji (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + pACT] z nośnikiem (ligand 0 nM) jako 1 w celu obliczenia poziomu podstawowego i homodimeryzowanego poziomu ERα LBD. Poziomy są reprezentowane jako "Aktywność względna".

Results

Rysunek 3 przedstawia schemat możliwych odpowiedzi w kombinowanych (i) i kombinacjach (ii) komórek transfekowanych plazmidem. Wyniki eksperymentu są pokazane w Rysunek 4. Aktywność kombinacji (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT) wykazuje stymulację przez 10 nM E2 (Figura 4A), ponieważ ERα LBD zawiera zależną od ligandu domenę funkcyjną transaktywacji, AF-2. Agonista (np. E2), który wią...

Discussion

W niniejszym artykule opisaliśmy protokół testu M2H, koncentrując się na warunkach testu do wykrywania aktywności homodimeryzacyjnej ERα LBD jako przykładu. Ogólnie rzecz biorąc, test M2H nie jest popularny w ocenie zależnej od ligandu aktywności dimeryzacji ERα LBD. Wynika to z faktu, że ERα LBD posiada funkcję aktywacji transkrypcji; których aktywność w niektórych przypadkach zakłóca wyniki testu M2H. Jednak, jak pokazujemy tutaj, test M2H może być stosowany do analizy aktywności dimeryzacji LBD niektórych substancji, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pG5-Luc	Promega	E249A	Składnik systemu dwuhybrydowego dla ssaków szach-mat
pBIND	Promega	E245A	Składnik systemu dwuhybrydowego dla ssaków CheckMate
pACT	Promega	E246A	Składnik systemu dwuhybrydowego dla ssaków CheckMate
One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E. coli	Invitrogen	C404010
Wirnik	SORVALL	75006445
Wiadra wahadłowe	SORVALL	75006441
Roztwór do ponownego zawieszania komórek (CRA)	Promega	A7112
Roztwór do lizy komórek (CLA)	Promega	A7122
Roztwór neutralizacyjny (NSA)	Promega	A7131
Roztwór do płukania kolumn (CWB)	Promega	A8102
Wizard Midipreps Żywica oczyszczająca DNA	Promega	A7701
Wizard Midicolumns	Promega	A7651
MEM, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej	Gibco	51200038
L-glutamina (200 mM)	Gibco	A2916801
0,5% Trypsyna-EDTA (10x)	Gibco	15400054
Penicylina-Streptomycyna (100x)	Sigma-Aldrich	P0781
BenchMark płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gemini-Bio	100-106	Węgiel inaktywowany termicznie
: dekstran usuwający płodową surowicę bydlęcą	Gemini-Bio	100-119	Inaktywowany termicznie
DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej	31053028 Gibco		do transfekcji
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027
Pasywny bufor do lizy 5X	Promega	E1941
System testów reporterowych z podwójną lucyferazyą	Promega	E1980
Czytnik mikropłytek SpectraMax L	Urządzenia molekularne Oprogramowanie
SoftMax Pro	Urządzenia molekularne