Artykuł metodologiczny

Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

DOI:

10.3791/58758

⸱

19 grudnia 2018

 , 
1Reproductive Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (NIH)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy metodę analizy aktywności dimeryzacji domeny 4-hydroksy-tamoksyfenu zależnej od receptora estrogenowego alfa ligandu za pomocą testu dwuhybrydowego u ssaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptor estrogenowy alfa (ERα) jest estrogennym regulatorem transkrypcji zależnym od ligandu. Sekwencja białka ERα jest wysoce konserwatywna wśród gatunków. Uważa się, że funkcja ERαs człowieka i myszy jest identyczna. Wykazujemy różnicowy wpływ 4-hydroksy-tamoksyfenu (4OHT) na aktywność dimeryzacji domeny wiążącej ligand (LBD) u myszy i człowieka za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków (M2H). Test M2H może wykazać skuteczność aktywności homodimeryzacji LBD w komórkach ssaków, wykorzystując transfekcję dwóch plazmidów ekspresji białek (fuzja domeny wiążącej DNA GAL4 [DBD] LBD i fuzja domeny transaktywacji VP16 [VP16AD] LBD) oraz plazmidu reporterowego lucyferazy reagującego na element GAL4 (GAL4RE). Kiedy LBD fuzji GAL4DBD i fuzji VP16AD LBD wytwarzają dimer w komórkach, ten kompleks białkowy wiąże się z GAL4RE, a następnie aktywuje ekspresję genu lucyferazy poprzez aktywność transkrypcyjną zależną od VP16AD. Aktywacja lucyferazy za pośrednictwem 4OHT jest wyższa w komórkach HepG2, które zostały transfekowane mysim plazmidami ekspresji białka fuzyjnego ERα LBD, niż w ludzkich komórkach transfekowanych plazmidem o ekspresji białka fuzyjnego ERα LBD. Wynik ten sugeruje, że skuteczność zależnej od 4OHT mysiej aktywności homodimerycznej ERα LBD jest wyższa niż ludzkiego ERα LBD. Ogólnie rzecz biorąc, wykorzystanie testu M2H nie jest idealne do oceny aktywności dimeryzacji receptora jądrowego LBD, ponieważ agonistyczne ligandy zwiększają podstawowy poziom aktywności LBD, co utrudnia wykrycie aktywności dimeryzacji LBD. Stwierdziliśmy, że 4OHT nie zwiększa podstawowej aktywności ERα LBD. Jest to kluczowy czynnik umożliwiający określenie i wykrycie zależnej od 4OHT aktywności dimeryzacji LBD w celu pomyślnego zastosowania testu M2H. Testy M2H oparte na ERα LBD mogą być stosowane do badania częściowej aktywności agonistycznej selektywnych modulatorów receptora estrogenowego (np. 4OHT) w różnych typach komórek ssaków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptor estrogenowy alfa (ERα) jest estrogennym regulatorem transkrypcji zależnym od ligandu. Sekwencja aminokwasowa ERα jest wysoce konserwatywna wśród gatunków. Ze względu na większą homologię między ludzkim i mysim ERα, funkcja tych receptorów jest uważana za identyczną, a zróżnicowana aktywność substancji estrogenowych (np. tamoksyfenu) u tych gatunków jest spowodowana różnicami w metabolizmie chemicznym gatunku, a nie różnicami strukturalnymi ERα. ERα ma wysoce konserwatywne struktury domenowe, które są powszechne w nadrodzinie receptorów jądrowych (NR), oznaczonych domenami od A do F. Domena E lub domena wiążąca ligand (LBD) obejmuje kieszeń wiążącą li....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie plazmidów do testu dwuhybrydowego u ssaków

  1. Użyj następujących plazmidów: pG5-Luc, pBIND-ERαEF i pACT-ERαEF.
    UWAGA: Plazmidy są dostępne u autorów na życzenie i są wysyłane na bibule filtracyjnej. pG5-Luc jest plazmidem reporterowym, który zawiera pięć powtórzeń elementów reagujących na GAL4 połączonych z jednostką ekspresji lucyferazy (Figura 1A). pBIND-ERαEF jest plazmidem ekspresji białka dla GAL4DBD skondensowanych białek ERα LBD. pBIND-ERαEF zawiera jednostkę ekspresji lucyferazy Renilla do normalizacji skuteczności transfekcji (Rysunek 1B

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 3 przedstawia schemat możliwych odpowiedzi w kombinowanych (i) i kombinacjach (ii) komórek transfekowanych plazmidem. Wyniki eksperymentu są pokazane w Rysunek 4. Aktywność kombinacji (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pACT) wykazuje stymulację przez 10 nM E2 (Figura 4A), ponieważ ERα LBD zawiera zależną od ligandu domenę funkcyjną transaktywacji, AF-2. Agonista (np. E2), który wią.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule opisaliśmy protokół testu M2H, koncentrując się na warunkach testu do wykrywania aktywności homodimeryzacyjnej ERα LBD jako przykładu. Ogólnie rzecz biorąc, test M2H nie jest popularny w ocenie zależnej od ligandu aktywności dimeryzacji ERα LBD. Wynika to z faktu, że ERα LBD posiada funkcję aktywacji transkrypcji; których aktywność w niektórych przypadkach zakłóca wyniki testu M2H. Jednak, jak pokazujemy tutaj, test M2H może być stosowany do analizy aktywności dimeryzacji LBD niektórych substancji, .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują doktorom Sueyoshi i Wang z Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS) za ich krytyczne odczytanie manuskryptu, a Tannerowi Jeffersonowi za przeprowadzenie procedur na filmie. Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grant 1ZIAES070065 (dla K.S.K.) z Wydziału Badań Wewnętrznych NIEHS.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pG5-LucPromegaE249ASkładnik systemu dwuhybrydowego dla ssaków szach-mat
pBINDPromegaE245ASkładnik systemu dwuhybrydowego dla ssaków CheckMate
pACTPromegaE246ASkładnik systemu dwuhybrydowego dla ssaków CheckMate
One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E. coliInvitrogenC404010
WirnikSORVALL75006445
Wiadra wahadłoweSORVALL75006441
Roztwór do ponownego zawieszania komórek (CRA)PromegaA7112
Roztwór do lizy komórek (CLA)PromegaA7122
Roztwór neutralizacyjny (NSA)PromegaA7131
Roztwór do płukania kolumn (CWB)PromegaA8102
Wizard Midipreps Żywica oczyszczająca DNAPromegaA7701
Wizard MidicolumnsPromegaA7651
MEM, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowejGibco51200038
L-glutamina (200 mM)GibcoA2916801
0,5% Trypsyna-EDTA (10x)Gibco15400054
Penicylina-Streptomycyna (100x)Sigma-AldrichP0781
BenchMark płodowa surowica bydlęca (FBS)Gemini-Bio100-106Węgiel inaktywowany termicznie
: dekstran usuwający płodową surowicę bydlęcąGemini-Bio100-119Inaktywowany termicznie
DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej31053028 Gibcodo transfekcji
Lipofectamine 2000Invitrogen11668027
Pasywny bufor do lizy 5XPromegaE1941
System testów reporterowych z podwójną lucyferazyąPromegaE1980
Czytnik mikropłytek SpectraMax LUrządzenia molekularne Oprogramowanie
SoftMax ProUrządzenia molekularne
wirówki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
  2. Brzozowski, A. M., et al. Mo....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

4 hydroksytamoksyfenplazmid reporterowy lucyferazydomena wi ca DNA bia ka GAL4domena transaktywacyjna VP16kom rki HepG2traktowanie estradiollemselektywne modulatorze receptora estrogenowego

Powiązane artykuły