Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę określania powinowactwa wiązania w równowadze i w roztworze z wysoką czułością na dużą skalę. Poprawia to analizę ilościową wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA. Metoda opiera się na zautomatyzowanych pomiarach anizotropii fluorescencji w kontrolowanym systemie dostarczania.

Streszczenie

Dokładna kwantyfikacja interakcji czynnika transkrypcyjnego (TF)-DNA jest niezbędna do zrozumienia regulacji ekspresji genów. Ponieważ istniejące podejścia mają znaczne ograniczenia, opracowaliśmy nową metodę określania powinowactwa do wiązania TF-DNA z wysoką czułością na dużą skalę. Test opiera się na ustalonej zasadzie anizotropii fluorescencji (FA), ale wprowadza ważne ulepszenia techniczne. Po pierwsze, mierzymy pełną krzywą miareczkowania kompetycyjnego FA w pojedynczym dołku, włączając TF i znakowane fluorescencyjnie referencyjne DNA do porowatej matrycy żelu agarozowego. Nieznakowany oligomer DNA jest ładowany na górze jako konkurent i poprzez dyfuzję tworzy gradient czasoprzestrzenny. Powstały gradient FA jest następnie odczytywany za pomocą dostosowanej konfiguracji mikroskopu epifluorescencyjnego. Ta ulepszona konfiguracja znacznie zwiększa czułość wykrywania sygnału FA, umożliwiając wiarygodne ilościowe określenie zarówno słabego, jak i silnego wiązania, nawet w przypadku cząsteczek o podobnej masie cząsteczkowej. W ten sposób możemy zmierzyć jedną krzywą miareczkowania na dołek płytki wielodołkowej, a dzięki procedurze dopasowania możemy wyodrębnić zarówno bezwzględną stałą dysocjacji (K_D), jak i stężenie aktywnego białka. Testując wszystkie warianty mutacji jednopunktowych danej sekwencji wiązania konsensusu, możemy zbadać cały krajobraz specyficzności wiązania TF, zazwyczaj na jednej płytce. Uzyskane macierze wagowe pozycji (PWM) przewyższają te uzyskane za pomocą innych metod w przewidywaniu zajętości TF in vivo. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy przewodnik dotyczący implementacji HiP-FA w konwencjonalnym zautomatyzowanym mikroskopie fluorescencyjnym i potoku analizy danych.

Wprowadzenie

Biorąc pod uwagę centralną rolę czynników transkrypcyjnych (TF) w regulacji genów, określenie ich preferencji wiązania w sposób ilościowy ma ogromne znaczenie. Przełomowe badania von Hippela wprowadziły pogląd, że regulatorowe TF szybko rozpoznają DNA, tak że ich wiązanie jest dobrze opisane przez równowagę termodynamiczną, podczas gdy dalsze zdarzenia rekrutacji polimerazy RNA do promotora są kontrolowane przez wolniejszą kinetykę¹. Ostatnie badania wiązania in vivo sugerują, że ten obraz jest prawdopodobnie bardziej złożony^2,3; Niemniej jednak te ogólne założenia służą jako dobre przybliżenia i wspierały wiele podejść obliczeniowych do znajdowania elementów regulatorowych CIS i przewidywania wyrażeń na podstawie sekwencji^4,5,6. Podczas gdy wiązanie równowagowe zostało z powodzeniem zastosowane jako koncepcja, obecne metody określania interakcji TF-DNA koncentrują się na specyficzności wiązania i zazwyczaj nie mierzą bezpośrednio powinowactwa wiązania w stanie równowagi. Systematyczny pomiar wiązania TF-DNA stanowi spore wyzwanie techniczne, a istniejące metody mają kilka różnych ograniczeń.

Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje głębokie sekwencjonowanie (ChIP-seq)⁷, najbardziej rozpowszechniona technika in vivo, nie pozwala na pomiar powinowactwa wiązania ani dokładnej lokalizacji miejsc wiązania we fragmentach genomu. Kilka metod in vitro, w tym ślad DNazy⁸, przesunięcie ruchliwości elektroforetycznej (EMSA)⁹, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)¹⁰ i termoforeza w mikroskali¹¹ są w stanie zmierzyć powinowactwo wiązań, ale mają stosunkowo niską przepustowość. I odwrotnie, techniki o wysokiej przepustowości, w tym mikromacierze wiążące białka¹², HT-SELEX^13,14 i bakteryjna jednohybrydowa (B1H)¹⁵ nie są w stanie zmierzyć powinowactwa wiązania i zazwyczaj dają zbyt specyficzne sekwencje wiązania, co wynika głównie z rygorystycznej selekcji lub niezbędnych etapów mycia. Nowsze osiągnięcia obejmują oparte na głębokim sekwencjonowaniu HiTS-FLIP¹⁶, SELEX-seq¹⁷ oraz oparte na mikrofluidyce MITOMI¹⁸ lub SMILE-Seq¹⁹, które pozwalają na ekstrakcję bezwzględnych powinowactw wiązania; jednak polegają na pomiarze intensywności fluorescencji znakowanego TF i DNA. Sygnały fluorescencyjne stają się zatem ograniczające przy niskich stężeniach białka i przy określaniu niskich wartości_{K D} (< ~10 nM). Co więcej, wiązanie TF-DNA w tych metodach zachodzi na cienkich powierzchniach, co stwarza problemy z niespecyficznym wiązaniem i/lub tłem autofluorescencji, co utrudnia dokładne ilościowe określenie słabego wiązania.

Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy nową metodę określania krajobrazów powinowactwa TF-DNA w stanie równowagi i w roztworze, którą nazwaliśmy anizotropią fluorescencji o wysokiej wydajności (HiP-FA)²⁰. Technika ta opiera się na ustalonym teście anizotropii fluorescencji (FA) ²¹, ale zmodyfikowana w celu pomiaru stałych wiązania z wysoką czułością i na dużą skalę przy użyciu dostosowanego zautomatyzowanego mikroskopu i konfiguracji analitycznej.

Test FA monitoruje interakcję fluorescencyjnie znakowanych gatunków (takich jak oligomer DNA) z partnerem wiążącym, w tym przypadku TF, poprzez pomiar rotacji molekularnej znakowanej cząsteczki. Po związaniu się z TF jego prędkość obrotowa zmniejsza się ze względu na większy promień hydrodynamiczny i masę cząsteczkową związanego kompleksu, co powoduje wzrost FA. Dokładny pomiar bardzo silnego wiązania (K_D < ~1 nM) wymaga użycia niskich stężeń znakowanego, referencyjnego DNA (c < ~1 nM). Jest to trudne do osiągnięcia za pomocą komercyjnego urządzenia, takiego jak standardowy czytnik mikropłytek. Ponadto zwykle konieczna jest duża różnica wielkości (10-100 razy) między związanymi i niezwiązanymi kompleksami, co uniemożliwia pomiar interakcji między domenami wiążącymi TF a krótkimi oligomerami DNA, które zwykle mają mniej więcej podobną masę cząsteczkową. Wreszcie, pełna krzywa miareczkowania zwykle wymaga przygotowania i pomiaru wielu studzienek zawierających szereg stężeń dla gatunków miareczkujących.

Aby rozwiązać te problemy, używamy zestawu mikroskopii szerokokątnej, zmodyfikowanego tak, aby osiągnąć wysoką czułość wykrywania i umożliwić pomiary FA w różnych pozycjach z pojedynczego dołka. Dzięki temu możemy monitorować interakcje wiążące między gatunkami o podobnej masie cząsteczkowej i wysokim powinowactwie. Wyższą przepustowość uzyskuje się poprzez pomiar FA w formatach płytek wielodołkowych i przeprowadzenie całej serii miareczkowania w jednym dołku przy użyciu kontrolowanego systemu dostarczania (Rysunek 1a). Ponadto, stosując test wiązania konkurencyjnego, ekstrahujemy nie tylko stałe wiązania, ale także stężenie aktywnego białka. Jest to ważna cecha testu, ponieważ tylko część wyrażonych cząsteczek TF jest aktywna z powodu nieprawidłowego fałdowania lub degradacji białek. Układ eksperymentalny oparty jest na komercyjnym mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w stoliki piezoelektryczne XY i Z. Zmodernizowaliśmy system o zewnętrzne wzbudzenie laserowe, a następnie wykryliśmy dwie emitowane składowe polaryzacji liniowej na chipie kamery EM-CCD o wysokiej wydajności kwantowej do wykrywania światła (Rysunek 1b i 1c). System wykorzystuje obiektyw o dużej aperturze numerycznej (NA) sprzężony z ultraczułym czujnikiem, dzięki czemu zapewnia bardzo czułe pomiary FA. Rejestrując fluorescencyjne stosy z, interakcje wiążące można mierzyć wzdłuż optycznej osi z przy użyciu heterogenicznej matrycy dla reagentów. Wszystkie te modyfikacje można łatwo wdrożyć w istniejącym systemie i są one opłacalne.

Stosujemy konkurencyjny test wiązania, w którym mierzy się powinowactwo wiązania nieznakowanego oligomeru DNA w porównaniu do fluorescencyjnie znakowanego DNA, które służy jako punkt odniesienia. TF i referencyjny DNA są włączane w ustalonych stężeniach do porowatej matrycy żelu agarozowego (wielkość porów ~1 μm), która stanowi nieoddziałujące środowisko dla wiązania. Referencyjne DNA jest znakowane Cy5. Barwnik ten okazał się dobrze nadający się do pomiarów FA ze względu na stosunkowo długi czas trwania fluorescencji (~1ns) i emisję fluorescencji w dalekiej czerwieni widma widzialnego (tło o niskiej autofluorescencji). Stężenie TF jest molowo nadmiarowe w stosunku do DNA referencyjnego Cy5, co zapewnia, że całe referencyjne DNA jest związane z białkiem. Roztwór nieznakowanego DNA konkurenta jest następnie osadzany na powierzchni żelu i dyfunduje wewnątrz porowatej matrycy, ustanawiając gradient stężenia c(z, t), który zmienia się w zależności od położenia z płaszczyzny ogniskowej i czasu t (Rysunek 1a, Rysunek 2a-2c). TF związany z DNA referencyjnym Cy5 jest zatem lokalnie wystawiony na różne stężenia konkurencyjnego DNA, który konkuruje o wiązanie, co prowadzi do dynamicznie zmieniającego się FA DNA referencyjnego Cy5 FA_REF(z, t) (Figura 2b i 2c).

Aby określić stężenie konkurencji c(z,t), mierzymy w oddzielnych studzienkach ( studnie kalibracyjne) dynamicznie zmieniający się sygnał FA Nile Blue (NB) FA_NB(z,t) (Rysunek 2a i 3). Barwnik ten interkaluje się w DNA i w ten sposób działa jako czujnik DNA dla DNA konkurencji. Dzięki temu kontrolowanemu systemowi dostarczania można zmierzyć dziesiątki do setek różnych powinowactw wiązania DNA-białko na jednej płytce wielodołkowej (format płytki 96- lub 384-dołkowej). Pomiar jest następnie wykonywany sekwencyjnie, aż do całkowitego przemieszczenia znakowanego referencyjnego DNA z TF. Określiliśmy specyficzność wiązania dla danego czynnika, mierząc powinowactwo wszystkich 3 N mutacji jednozasadowych w sekwencji konsensusu o długości N. HiP-FA wymaga niewielkich ilości białka (~pmols na krzywą miareczkowania) i wykazuje niską zmienność w oznaczaniu K_Ds [współczynnik zmienności (CV) < 20%], umożliwiając jednocześnie pomiary w stosunkowo dużej skali. Metoda może być przeprowadzana ręcznie lub w pełni zautomatyzowana za pomocą systemu zrobotyzowanego, co skutkuje jeszcze niższymi CV (Rysunek 4, górny panel). Stałe dysocjacji są mierzone z dużą dokładnością do 0,5 nM. W przypadku ekstremalnie wysokich powinowactw (K_D < 500 pM) stosujemy standardowe miareczkowanie konkurencyjne (Rysunek 5) ze względu na niedokładności w pomiarze stężeń DNA konkurentów na niskich poziomach (< 100 nM).

HiP-FA może być zaimplementowany na prawie każdym standardowym, odwróconym, epifluorescencyjnym mikroskopie fluorescencyjnym, pod warunkiem dostępności zautomatyzowanego stolika XY i stolika piezoelektrycznego osi z. Komponenty optyczne zostały zbudowane w oparciu o zautomatyzowaną konfigurację szerokokątną wyposażoną w obiektyw dalekiego zasięgu. W praktyce test można dostosować do celów o innych cechach (w szczególności roboczej, odległości i apertury numerycznej). Wymaga to jednak optymalizacji parametrów (odległości między plastrami Z, porowatość i wysokość żelu agarozowego itp.). Możliwe jest również użycie innych rodzajów laserów lub kamery. Szczegółowy opis całej procedury eksperymentalnej i analizy danych znajduje się poniżej w sekcji dotyczącej protokołu.

Protokół

1. Mikroskopia polaryzacyjna

1. W przypadku szerokokątnego oświetlenia laserowego należy skupić linię 638 nm ciągłego lasera diodowego (40 mW) na aperturze światłowodu wielomodowego w celu oczyszczenia wiązki. Zamontuj polaryzator liniowy na wyjściu światłowodu, aby ustawić polaryzację światła laserowego.
2. Zablokuj składową wzbudzenia emitowanego światła za pomocą lustra dichroicznego (odcięcie 640 nm) i filtra pasmowoprzepustowego (pasmowoprzepustowe 700/75).
3. Niech sygnał fluorescencji przejdzie przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej, który rozdziela emitowane światło na jego prostopadłe i równoległe spolaryzowane składowe. Następnie należy skupić wiązkę nieodbitą (składową równoległą) i wiązkę odbitą (składową prostopadłą) za pomocą soczewki achromatycznej o ogniskowej 200 mm na chipie podświetlanej od tyłu kamery EM-CCD (Rysunek 1b i 1c). Użyj lustra, aby wyregulować kierunek wiązki prostopadłej w kierunku soczewki.

2. Projektowanie i testowanie referencyjnego oligomeru DNA znakowanego fluorescencyjnie

1. Określ sekwencję rdzenia referencyjnego DNA: metoda opiera się na teście konkurencyjnym, który mierzy stałą dysocjacji (K_D2) między czynnikiem transkrypcyjnym a nieznakowanym konkurencyjnym oligomerem DNA, który konkuruje o wiązanie z fluorescencyjnie znakowanym DNA, którego powinowactwo do TF działa jak odniesienie (K_D1). Sekwencja konsensusu uzyskana z innych źródeł, takich jak ślad DNazy lub bakteryjna hybryda 1, może służyć jako punkt wyjścia^5,15.
   UWAGA: Z reguły odpowiednie referencyjne DNA ma od 3 do 7-krotny spadek powinowactwa do TF w porównaniu z sekwencją konsensusu.
2. Zmierz za pomocą HiP-FA K_D1s 2-3 wstępnych pojedynczych mutacji sekwencji konsensusu uzyskanej w poprzednim kroku. Spróbuj zmutować pozycje w sekwencji konsensusu, które nie są zbyt szczegółowe, aby uniknąć całkowitej utraty wiązania.
   UWAGA: Ważne jest, aby sekwencja referencyjna była związana przez interesujący nas czynnik transkrypcyjny (użyliśmy w tym protokole Giant Gt), ale nie za mocno, tak aby słabsi konkurenci mogli ją prześcignąć przy wysokich stężeniach.
3. Rozciągnij motyw rdzenia (zazwyczaj 8-12 par podstaw) do długości 16 par zasad lub więcej, dodając symetryczną sekwencję flankującą po obu stronach (dodaj boczne łańcuchy, aby zapewnić prawidłowe wiązanie). W razie potrzeby (na przykład w przypadku dłuższych domen z licytacją) użyj dłuższych sekwencji (testem HiP-FA przetestowano do ~50 par zasad za pomocą testu HiP-FA).
   UWAGA: Uważaj, aby nie dodawać zasad, które powinny tworzyć ektopowe miejsca wiązania. Użyj narzędzi obliczeniowych, które przewidują miejsca powiązań z dostępnych PWM, aby ułatwić ten proces (np. PySite²²).
4. Jako znakowane referencyjne DNA, uporządkuj oligomery, które są znakowane fluorescencyjnie na przedniej lub odwrotnej nici na końcu 3' lub 5'. Użyć, na przykładample, Cy5, Bodipy-650 lub innego odpowiedniego barwnika o stężeniu 10 μM (100 μM 10x zapas) w wodzie i rozcieńczać stopniowo, jak opisano w kroku 3.1.
5. Przygotuj 500 ml 1x buforu wiążącego, dodając 33 mM buforu fosforanu potasu (pH = 7,0), 90 mM NaCl i 0,01% niejonowego detergentu w wodzie destylowanej. Przygotuj również 3x bufor wiążący, który zawiera te same składniki, z wyjątkiem trzykrotnych stężeń. W przypadku użycia buforu wiążącego 3x jako roztworu podstawowego dla buforu wiążącego 1x, należy przygotować objętość > 500 ml; w przeciwnym razie przygotuj 250 ml.
   UWAGA: Ta kompozycja została zoptymalizowana pod kątem stabilności czynnika transkrypcyjnego i zapobiegania dimeryzacji S-transferazy glutationowej (GST).
6. Zmierz za pomocą zestawu mikroskopowego opisanego w kroku 1 FA 200 μl buforu wiążącego zawierającego 0,8 nM znakowanego referencyjnego DNA w obecności różnej ilości TF w 96-dołkowej płytce mikroskopii ze szklanym dnem (5-6 dołków o różnych stężeniach TF) w celu określenia stężenia TF do użycia. Wykonać serię miareczkowania z rosnącą ilością TF i wybrać do testu stężenie, dla którego krzywa osiąga plateau, wskazując na całkowite związanie referencyjnego oligomeru DNA.
   UWAGA: Optymalne stężenie TF zależy od wartości stałych dysocjacji TF-DNA. Ogólnie rzecz biorąc, niższe K_Ds wymagają niższych stężeń.

3. Wyżarzanie oligomerów

1. Aby wyżarzyć oligomery DNA znakowanego referencyjnego DNA (sekwencja określona w poprzednim kroku), należy zmieszać 7 μl 10 mM znakowanego barwnikiem roztworu jednoniciowego DNA i 7 μl 10 mM stężenia jego nieznakowanego odwrotnego dopełniacza w 186 μl wody.
2. W przypadku konkurencyjnych sekwencji DNA zmieszać 20 μl 100 mM roztworów (w wodzie, dostarczonej przez producenta) jednoniciowego DNA z przodu z 20 μl 100 mM odpowiedniego odwrotnego jednoniciowego DNA dla każdej indywidualnej sekwencji konkurenta, która ma być zmierzona.
3. Wyżarzanie należy przeprowadzić oddzielnie w standardowym cyklerze PCR, podgrzewając roztwory do 70 °C przez 3 minuty i obniżając temperaturę do RT z szybkością 0,1 K/s. Jeśli używana maszyna do PCR nie obsługuje gradientów temperatury w tym tempie, po prostu wykonuj stopniowe inkubacje ze spadającymi temperaturami (testowano 99 cykli po 3 s z -0,4 K na cykl).

4. Przygotowanie żelu

UWAGA: Poniższa sekcja wyjaśnia przygotowanie dwóch różnych rodzajów żeli: 1) studzienki miareczkowe zawierają żele z białkiem i są używane do określania K_Ds dla odpowiednich sekwencji DNA konkurencji, oraz 2) studnie kalibracyjne wykorzystują NB do określania stężenia DNA w każdym danym punkcie czasowym i wysokości akwizycji. Nacisk kładziony jest na przygotowanie eksperymentu na płytce 96-dołkowej, ale wskazane są również odpowiednie objętości dla formatu płytki 384-dołkowej.

1. Rozpuścić 0,5% w/v agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze wiążącym, gotując ją w laboratoryjnej kuchence mikrofalowej. Po całkowitym rozpuszczeniu ponownie wyreguluj objętość za pomocą ddH₂O, aby skompensować możliwe parowanie.
   UWAGA: Dla wygody przygotuj zapas 10-20 10 ml porcji żeli i rozpuść je w temperaturze 75°C, gdy będą potrzebne. Zapasy żelowe można przechowywać w RT.
   UWAGA: Uważaj, aby nie dopuścić do przegrzania roztworu żelu w kuchence mikrofalowej. Preferowane są krótkie odstępy czasu nagrzewania z wytrząsaniem pomiędzy nimi.
2. Aby przygotować studzienki do miareczkowania i kalibracji, należy najpierw stopić dwie podwielokrotności żelu o pojemności 10 ml w temperaturze 75 °C pod wpływem wstrząsu.
   1. Użyj 240 μl (w tym 20% narzutu) dla każdego zawodnika (n = liczba sekwencji zawodników).
   2. Użyj tej samej objętości żelu do kalibracji NB, aby zapewnić równą temperaturę i lepkość obu żeli.
   3. Następnie ustaw temperaturę na 35 °C i poczekaj, aż temperatura się zrównoważy.
3. Do studzienek miareczkowych dodać 1,4 nM (stężenie końcowe) zhybrydyzowanego referencyjnego DNA (otrzymanego w etapie 3), białka TF (stężenie końcowe C_TF = 20-60 nM, jak oznaczono w kroku 2.6), DTT (0,2 mM) i bufor wiążący w całkowitej objętości n x 200 μL lub n x 13 μL w formie płytki 96- lub 384-dołkowej, odpowiednio (plus narzut). Dokładnie wymieszaj, odwracając/wstrząsając (nie wirować).
4. Powoli dodawać 200 μl na dołek w formacie płytki 96-dołkowej (13 μl/dołek na 386 dołków) roztworu żelu przygotowanego w poprzednim kroku do dołków miareczkowych, płytki studzienkowej.
5. W przypadku dołków kalibracyjnych należy najpierw dodać 5 nM NB do stopionego żelu na zewnątrz studzienek (całkowita objętość zależy od zastosowanego formatu płytki dołkowej i liczby dołków kalibracyjnych; zwykle wystarczy 5-6 na płytkę dołka).
6. Odpipetować 200 μl (13 μl dla płytki 384-dołkowej) żelu zawierającego NB powoli w dołkach miareczkowania płytki dołkowej i upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
   UWAGA: Zastosowanie pipet elektronicznych lub robotyki znacznie zwiększa odtwarzalność.
7. Pozostawić żel do zestalenia się przez 10 minut w temperaturze pokojowej i kolejne 10 minut w temperaturze 4 °C (w razie potrzeby usunąć kondensację ze szkła). Upewnij się, że wszystkie te kroki wykonujesz na idealnie poziomej powierzchni, aby uniknąć niejednorodnych powierzchni żelowych.
   UWAGA: Żele zawierające białko są zwykle stabilne przez co najmniej kilka godzin w temperaturze 4 °C.

5. Dodawanie rozwiązania DNA konkurencji

UWAGA: Następujące roztwory powinny być przygotowane przed rozpoczęciem miareczkowania i dodawane do dołków kalibracyjnych i miareczkowych jednocześnie.

1. Dodaj wyżarzone, znakowane referencyjne DNA i białko w 3-krotnym buforze wiążącym o 3 razy wyższych stężeniach niż podwielokrotności żelu.
   1. Zmieszać 20 μl otrzymanego roztworu z 40 μl każdego wyżarzonego roztworu konkurencyjnego DNA otrzymanego w kroku 3.
   2. Dla każdej studzienki kalibracyjnej wymieszać 20 μl 3x buforu wiążącego zawierającego 15 mM roztworu NB z 40 μl wyżarzonego DNA konkurenta (odpowiednia jest dowolna sekwencja o tej samej długości).
      UWAGA: W przypadku płytek 384-dołkowych należy użyć łącznie 21 μl zamiast 60 μl.
2. Opcjonalnie należy sprawdzić spektroskopowo jednorodność poziomów wysokości żelu w różnych dołkach płytki, mierząc absorbancję przy 380 nm za pomocą wielodołkowego czytnika płytek (wartości absorbancji są proporcjonalne do wysokości żelu).
3. Dodać 50 μl (7 μl dla formatu płytki 384-dołkowej) zmieszanych roztworów DNA konkurencji (wyżarzonych w kroku 3) na wierzch żeli. Spróbuj dodać wszystkie konkurencyjne rozwiązania tak równocześnie, jak to możliwe, używając elektronicznych pipet wielokanałowych lub 96-kanałowej głowicy pipetowej, jeśli jest dostępna. Po dodaniu konkurencyjnych roztworów umieść płytkę na stoliku mikroskopu i natychmiast rozpocznij pomiary (krok 7).

6. Akwizycja obrazu

1. Sekwencyjnie pobieraj szeregi czasowe stosów z (np. użyj 12 płaszczyzn i 100-300 ms czasu oświetlenia). Unikaj robienia zdjęć zbyt blisko powierzchni studni (< ~ 1,4 μm z płytkami użytymi w niniejszym dokumencie), aby wykluczyć jakiekolwiek odchylenie polaryzacji.
2. Wykonaj 10-25 cykli pomiarów, aż do całkowitego rozwiązania znakowanego referencyjnego DNA z TF. Punkt końcowy jest zwykle osiągany po 1-2 godzinach, w zależności od kinetyki wiązania i dyfuzyjności konkurencyjnego DNA.

7. Ekstrakcja FA(z,t) z surowych danych

1. Po zobrazowaniu płytki studzienkowej oblicz na podstawie surowych obrazów fluorescencyjnych średnie wartości pikseli obszarów zainteresowania dla równoległych (I₌) i prostopadłych (I₊) spolaryzowanych składowych intensywności (Rysunek 1c). Można to zrobić automatycznie za pomocą oprogramowania HiP-FA ²³.
   UWAGA: Oprogramowanie HiP-FA, instrukcję obsługi i zestaw danych testowych można pobrać pod adresem²³. Alternatywnie, można użyć innego specjalnie napisanego oprogramowania, aby wyodrębnić I₌ i I₊ i przeprowadzić dalszą analizę krzywych miareczkowania, jak opisano szczegółowo poniżej.
2. Oblicz FA dla każdej studni. Dla każdego dołka skrypt oblicza FA(z,t) w każdej pozycji z i punkcie czasowym t zgodnie z:
   Równanie 1:
   Gdzie G jest współczynnikiem G instrumentu, który koryguje wszelkie odchylenia w kierunku kanału prostopadłego.
3. Określić współczynnik G zestawu mikroskopowego, mierząc FA wszelkich roztworów zawierających barwnik fluorescencyjny o znanej anizotropii. Wyodrębnij dwie składowe polaryzacji sygnału, a następnie użyj równania 1, aby uzyskać G, znając FA roztworu (G = 1,15 w tej konfiguracji).

8. Krzywa kalibracyjna do oznaczania stężenia DNA konkurenta z FA_NB

1. Wyżarz 120 μl każdego oligomeru odniesienia do przodu i do tyłu (stężenie podstawowe 100 mM; można użyć dowolnej losowej sekwencji o tej samej długości co sekwencja konkurenta) i wymieszać ze 120 μl 3x buforu wiążącego zawierającego NB (15 nM).
2. Przygotować serię rozcieńczeń z rozcieńczeniami 1:2 w 1x buforze wiążącym w sumie 6 rozcieńczeń. Zmieszać 50 μl tych rozcieńczeń z 200 μl 0,5% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia (T > 35 °C) w 1x buforze wiążącym zawierającym 5 nM NB w trzech egzemplarzach.
3. Dodać 200 μl każdego z 6 roztworów przygotowanych w poprzednim kroku do płytki 96-dołkowej i przechowywać płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, aby zapewnić całkowite zżelowanie, a następnie 1 godzinę w temperaturze RT. Zmierzyć_{wartość FA w} roztworach za pomocą zestawu HiP-FA.
4. Wyodrębnij FA_NB (z,t) zgodnie z poprzednim krokiem i dopasuj dane za pomocą równania Hilla:
   Równanie 2:
   Gdzie C_DNA jest stężeniem oligomeru DNA; k stężenie oligomerów DNA, przy którym zajęta jest połowa miejsc wiązania; FA_max jest stałą normalizacji; a n jest współczynnikiem Hilla. k, FA_max i n są ustawiane jako parametry swobodne podczas procedury dopasowania.
5. Wprowadź trzy parametry uzyskane z procedury dopasowania w oprogramowaniu HiP-FA (w lewym dolnym panelu).
6. Powtarzaj wyznaczanie krzywej kalibracyjnej co kilka miesięcy lub po wprowadzeniu zmian w konfiguracji mikroskopii.

9. Oznaczanie stężeń DNA konkurentów

1. Użyj oprogramowania HiP-FA, aby wyodrębnić c(z,t) z pomiarów _{FA NB}(z,t) (Rysunek 3). Najpierw uzyskaj krzywą kalibracyjną zgodnie z opisem w poprzednim rozdziale i wprowadź parametry dopasowania do oprogramowania (szczegółowe informacje znajdują się w instrukcji).
2. Użyj programu, aby automatycznie ekstrapolować c(z,t) dla c < 100 nM (szczegóły w instrukcji) za pomocą równania 3 (Rysunek 3b), które opisuje jednowymiarową dyfuzję konkurencyjnego DNA w matrycy żelu agarozowego, przy założeniu swobodnej dyfuzji.
   Równanie 3:
   gdzie C₀ jest początkowym stężeniem DNA konkurenta; erf to funkcja błędu; z jest pozycją; D jest współczynnikiem dyfuzji konkurencyjnego DNA; a t₀ jest czasem rozpoczęcia pomiarów. Używane parametry swobodne to C₀ i z/.

10. Konwencjonalne miareczkowanie konkurencyjne z HIP-FA dla bardzo silnego wiązania DNA

1. Seryjnie rozcieńczyć różne konkurencyjne oligomery DNA w rzędach płytki 96-dołkowej (lub płytki 384-dołkowej) w stężeniach: 0, 1,25, 3,5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900 i 4000 nM. Dodaj referencyjną DNA znakowaną Cy5 (1 nM) i TF (20-50 nM) w stałym stężeniu, o całkowitej objętości 200 μl na studzienkę w buforze wiążącym (Rysunek 5a). Odczekaj 40 minut, aż zostanie osiągnięta równowaga termodynamiczna i uzyskaj (z konfiguracją HiP-FA) stosy z dla każdego dołka (uzyskanie kilku obrazów na dołek zmniejsza zmienność poprzez uśrednienie obliczonych wartości FA).
2. Skonstruuj krzywe miareczkowania wiązania równowagi i dopasuj je do równania 4 (Rysunek 5b). K_Ds oznaczone za pomocą konwencjonalnego miareczkowania kompetycyjnego są identyczne z tymi uzyskanymi przez HIP-FA przy użyciu matrycy żelu agarozowego²⁰.

11. Procedura dopasowania krzywych miareczkowania FA

1. Wyświetlić w oprogramowaniu HiP-FA zrekonstruowane krzywe miareczkowania dla poszczególnych sekwencji konkurencji FA(z,t) = f[c(z,t)] i wizualnie sprawdzić jakość danych (szczegółowe informacje znajdują się w instrukcji). W razie potrzeby należy doprecyzować parametry stosowane do oznaczania stężeń DNA konkurenta w kroku 10.
2. Dopasuj każdą pojedynczą krzywą miareczkowania automatycznie, korzystając z równania 4, które daje rozwiązanie analityczne dla konkurencyjnych testów miareczkowania²⁴.
   równanie 4:
   Gdzie:
   
   
   
   gdzie R_T jest stężeniem białka; L_T jest nieznakowanym, a L_ST jest znakowanym stężeniem DNA; K_D2 jest stałą dysocjacji, którą należy wyznaczyć; R_T jest stężeniem białka aktywnego; a A i B są parametrami normalizacji.
   
   Najpierw wyznacz K_D1, który służy jako odniesienie do określania różnych wartości K_D2. K_D1 można łatwo określić za pomocą testu, wybierając sekwencję DNA odniesienia barwnika jako sekwencję nieznakowanego DNA konkurencji (patrz instrukcja).
3. Wprowadź uzyskaną wartość K_D1 do oprogramowania i oblicz wartości K_D2 dla całego konkurencyjnego DNA na płytce.
   UWAGA: Swobodne parametry procedury montażu to K,_D2, _{R, T}, A i B.
4. Eksportuj stałą dysocjacji K_{, D2} i stężenie aktywnego białka R_{, T}, dla wszystkich indywidualnych studzienek miareczkowania płytki, klikając przycisk "Eksportuj" w oprogramowaniu.

12. Budowa PWM, specyficzność interakcji białko-DNA i pseudozliczenia

Utwórz sekwencyjne logo dla różnych PWM-ów za pomocą narzędzia online WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi), jak opisano wcześniej²⁰.

Wyniki

Zastosowaliśmy HiP-FA do TF sieci genów segmentacji^25,26, która generuje wzór ciała przednio-tylnego zarodków Drosophila, głównie poprzez regulację transkrypcji. Z tej sieci wybraliśmy domenę bZIP TF Giant (Gt) do szczegółowej analizy (Rysunek 4). Ponieważ czynniki transkrypcyjne o pełnej długości są trudne do ekspresji i dają w większości takie same preferencje wiązania, jak ich domeny wiążące DNA (DBD)¹³, użyliśmy DBD połączonego z GST i wyraziliśmy konstrukt w białkach fuzyjnych GST E.coli, aby uzyskać takie same wyniki, jak same DBD²⁰.

Sekwencja konsensusu Gt (ATTACGTAAC) reprezentuje najsilniejszą sekwencję wiążącą, którą określiliśmy w sposób opisany powyżej. Następnie zbadaliśmy wpływ na energię wiązania wszystkich możliwych mutacji jednopunktowych w obrębie 10-merowej sekwencji konsensusu Gt (w sumie 30), otoczonych dodatkowymi zasadami na końcach 5' i 3'. Zmierzyliśmy dwie kontrpróby, których próbki żelu zostały wyprodukowane przy użyciu automatyzacji, oraz jedną dodatkową replikę wyprodukowaną ręcznie dla porównania. K_Ds wahał się od 0,6 do > 2000 nM dla pojedynczo zmutowanych sekwencji, a także potwierdziliśmy całkowity brak wiązania z sekwencją "niewiążącą" (dane nie pokazane).

Specyficzność wiązania TF-DNA jest zazwyczaj modelowana za pomocą macierzy wagi pozycji (PWM), w której każdemu możliwemu nukleotydowi przypisuje się wynik w każdej pozycji motywu wiązania. PWM zakłada, że każda pozycja przyczynia się do siły wiązania niezależnie i w większości przypadków stanowi wystarczający model dla preferencji wiązania TF²⁷. Wygenerowane poprawione PWM na podstawie naszych pomiarów powinowactwa zgodnie z ustalonymi procedurami^28,29 i porównaliśmy je z dwoma PWM opisanymi wcześniej w literaturze. Pierwszy opiera się na liczbie częstości nukleotydów z miejsc wiązania zidentyfikowanych przez ślad DNA^4,5, a drugi PWM uzyskano przez selekcję bakteryjną jednohybrydową (B1H). ¹⁵

Wysokie podobieństwo PWM dla trzech powtórzeń (Rysunek 4, górny panel), w tym dla próbki przygotowanej ręcznie (replika 3), świadczy o wysokiej powtarzalności metody HiP-FA. Podczas gdy PWM uzyskane przez HiP-FA są ogólnie podobne do PWM uzyskanych innymi metodami (Rysunek 4, dolny panel), istnieją znaczne odchylenia: na pozycji 2 (strzałka), początek rdzenia motywu bZIP, mutacje T>(G,C,A) prowadzą do całkowitej utraty wiązania w motywie otrzymanym przez HiP-FA, który jest zgodny z motywem B1H, ale nie z tym uzyskanym za pomocą śladu DNazy, w którym wiązanie pozostaje stosunkowo silne dla zasad (G,A). I odwrotnie, w pozycji 7 (szara strzałka) mutacja T>C prowadzi do znacznie silniejszego wiązania niż oczekiwano na podstawie wcześniej zmierzonych PWM.

Inne odchylenia są subtelniejsze, ale nie mniej ważne. Ogólnie rzecz biorąc, HiP-FA PWM jest mniej specyficzny niż pozostałe dwa, co odzwierciedla fakt, że wiele mutacji z konsensusu nadal skutkuje umiarkowanie silnym wiązaniem. Można to określić ilościowo za pomocą zawartości informacyjnej (IC). Układ scalony wynosi 11,5 bita dla macierzy HiP-FA (średnia z trzech powtórzeń), w porównaniu do IC = 13,4 bita i 16,8 bitów odpowiednio dla macierzy DNazy i B1H. Ogólnie (choć nie powszechnie) PWM uzyskane za pomocą HiP-FA są mniej specyficzne niż te uzyskane innymi metodami, na podstawie 26 badanych TF²⁰.

Rysunek 1:Schematyczne przedstawienia testu HIP-FA i konfiguracji eksperymentalnej. a) System dostarczania żelu do miareczkowania DNA konkurenta w pojedynczych studzienkach. (b) Konfiguracja mikroskopii HIP-FA. Dostosowany zautomatyzowany mikroskop szerokokątny z detekcją spolaryzowanego światła fluorescencyjnego w kamerze EM-CCD. (c) Surowy obraz fluorescencyjny z dwoma obszarami zainteresowania użytymi do wyznaczenia równoległych (czerwonych) i prostopadłych (zielonych) spolaryzowanych składowych. d) Typowy układ płytki 96-dołkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Surowe dane FA i zrekonstruowane krzywe miareczkowania. (a) Typowa trajektoria FA(z,t) dla studzienki kalibracyjnej zawierającej NB. lit. b), c) Trajektorie czasowe FA(z,t) dla dwóch studzienek miareczkowych mierzących wiązanie z silnym (b) i bardziej umiarkowanym (c) konkurentem wiążącym DNA. d, e) Odpowiednie zrekonstruowane pomiary miareczkowania FA i dopasowane krzywe dla silnego (d) i umiarkowanego (e) wiązania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Określanie stężenia konkurencyjnego DNA c(z,t) za pomocą błękitu nilowego (NB). (a) Krzywa kalibracji stężenia FA dla 16 par zasad oligomerów DNA. W konwencjonalnej serii miareczkowania, NB jest zatopiony w żelu agarozowym wraz z różnymi stężeniami DNA konkurencji. Powinowactwo NB do DNA jest niezależne od sekwencji²⁰; w związku z tym te same krzywe kalibracyjne można wykorzystać do wyznaczenia c(z,t) dla różnych sekwencji DNA o tej samej długości. b) Profil dyfuzji w czasie DNA konkurenta na dowolnej wysokości z wyznaczony przy użyciu pięciu studzienek kalibracyjnych. Dla każdego cyklu pomiarowego średnie FA czterech studzienek zawierających NB są wyświetlane jako białe kropki. Krzywe są dopasowywane za pomocą równania 3 (biała linia, pojedyncze studzienki w kolorze), a c(z,t) przy niskich stężeniach (C < ~100 nM) jest wyznaczane za pomocą ekstrapolowanej krzywej dopasowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Specyfika powiązań rodziny domen bZIP TF Giant (Gt). TPWM HIP-FA składające się z trzech powtórzeń: dwóch przygotowanych przy użyciu automatyzacji i jednego przygotowanego ręcznie (górny panel) są porównywane z PWM wygenerowanymi przez ślad DNazy i metodą selekcji bakteryjnej jednej hybrydy (B1H) (dolny panel). Ogólnie rzecz biorąc, motywy wiązań HIP-FA zgadzają się z wcześniejszymi danymi, ale również wykazują znaczące różnice, co zostało podkreślone czarnymi i szarymi strzałkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Konwencjonalne miareczkowanie konkurencyjne z użyciem HIP-FA. (a) Projekt płytki pokazuje 8 różnych konkurencyjnych DNA seryjnie rozcieńczonych w buforze wiążącym w jednym rzędzie 96-dołkowej płytki. Mapa cieplna FA jest pokazana dla różnych dowolnych sił wiązania. b) Miareczkowanie konkurencyjne trzech konkurencyjnych DNA wiążących się z TF Bcd o różnym powinowactwie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

HiP-FA to nowa, kompleksowa metoda określania krajobrazów preferencji wiązań interakcji TF-DNA. Mierzy powinowactwo wiązania wariantów motywu mutacji DNA, unikając wszelkich podstawowych założeń, że preferencje wiązania znajdują odzwierciedlenie w częstości występowania nukleotydów w zestawie spoiw ponadprogowych. Pomiar odbywa się w roztworze bez unieruchomienia i mechanicznej lub chemicznej ingerencji w reakcję wiązania, jak najdokładniej przybliżając warunki równowagi. Kontrolowany system dostarczania umożliwia pomiar pełnej krzywej miareczkowania w jednym dołku i zwiększa zarówno przepustowość, jak i niezawodność, jednocześnie oszczędzając białko. Korzystanie z obiektywu z dużą aperturą numeryczną i kamerą EM-CCD o wysokiej skuteczności zbierania światła pozwala na bardzo czułe wykrywanie światła fluorescencyjnego. W związku z tym przy tej konfiguracji można dokładnie wykryć niewielkie zmiany FA tak niskie, jak 10-15 mP; W praktyce oznacza to, że każda reakcja wiązania, w której wzrost masy po związaniu jest minimalny (tak niski, jak stosunek mas wynoszący 2), jest łatwo wykrywalna. Zwykle nie ma to miejsca w przypadku systemów komercyjnych, takich jak czytniki mikropłytek. Ze względu na wysoką czułość, HiP-FA rozszerza zakres stałych dysocjacji, które można niezawodnie zmierzyć, na zakres pikomolarny. Energie wiązania są określane dokładnie dla wielu rzędów wielkości.

Aby ocenić jakość zmienionych PWM, przeprowadziliśmy dwa rodzaje analiz²⁰. Przetestowaliśmy, dla pięciu czynników sieci genów segmentacji, jak dobrze różne PWM mogą przewidywać eksperymentalne profile ChIP-seq w regionach genomowych 21 genów segmentacji. W drugim teście użyliśmy modelu sekwencja do ekspresji⁴ , który przewiduje wzorce ekspresji wzmacniaczy segmentacji na podstawie preferencji wiązania i stężenia białek uczestniczących TF. W obu ćwiczeniach stwierdziliśmy, że mniej specyficzne PWM HiP-FA działają znacznie lepiej niż bardziej specyficzne PWM z footprintingiem i PWM B1H²⁰.

W przeciwieństwie do metod de novo, HiP-FA wymaga pewnej wcześniejszej wiedzy na temat preferencji wiązania danego TF. Jednak sekwencje konsensusu są znane dla wielu TF, a wiele istniejących metod może je dostarczyć 13,14,15. W razie potrzeby prawdziwą optymalną sekwencję wiązania można znaleźć iteracyjnie.

Użyliśmy referencyjnych oligomerów DNA znakowanych fluorescencyjnie Cy5 i Bodipy-650. Barwniki te okazały się dobrze sprawdzać w pomiarach FA, ponieważ anizotropia związanego i niezwiązanego znakowanego referencyjnego DNA była największa spośród różnych testowanych barwników. Zapewnia to maksymalny zakres dynamiczny dla wartości FA. Ogólnie rzecz biorąc, każdy barwnik fluorescencyjny o żywotności fluorescencji ≥ 1 ns może być odpowiedni, ale najpierw musi zostać przetestowany. Jeśli to możliwe, zaleca się stosowanie barwników fluoryzujących w zakresie bliskiej podczerwieni, aby zminimalizować autofluorescencję białek.

Najbardziej krytycznym etapem procedury eksperymentalnej jest pipetowanie żelu do płytek dołka. Dobra odtwarzalność wymaga, aby objętości żelu były jak najbardziej jednolite. Zmiany wysokości żelu są przekładane na zmiany dyfuzyjności dla konkurencyjnego oligomeru DNA, a tym samym na pozorne zmiany powinowactwa podczas oceny danych. Jest to główne źródło wariancji w replikacji technicznej. Zastosowanie pipety elektronicznej lub technik automatyzacji poprawia odtwarzalność. Pęcherzyków powietrza w żelu można uniknąć, powolnemu i ostrożnemu pipetowaniu. Ważne jest również, aby dodać wszystkie konkurencyjne roztwory do dołków miareczkowych z jak najmniejszym opóźnieniem. Aby uzyskać najlepszą powtarzalność, cały proces można zautomatyzować za pomocą robota pipetującego z inkubatorami ciepła. Kluczowym elementem przeniesienia protokołu do automatyzacji jest niezbędna optymalizacja temperatury inkubatora i czasu inkubacji. Upewnij się, że znajdziesz optymalną równowagę między lepkością żelu (tj. nie za zimno) a stabilnością białek (tj. nie za gorąco). Zależy to zarówno od szybkości dozowania żeli do studzienek, jak i od stabilności użytego białka.

HiP-FA wykorzystuje kontrolowany system dostarczania dla konkurencyjnych oligomerów DNA. Aby skonstruować krzywe miareczkowania, konieczne jest wyznaczenie konkurencyjnego stężenia DNA c(z,t) dla każdej danej pozycji z w matrycy żelu i punkcie czasowym t. Jest to kolejny krytyczny krok, ponieważ określenie K_Ds zależy bezpośrednio od c(z,t). W tym celu stosuje się studzienki kalibracyjne zawierające barwnik NB jako czujnik stężenia DNA (Rysunek 1d, Rysunek 2a). Zwykle wystarczą 3-5 dołków kalibracyjnych zawierających NB na płytkę. Przed oceną jakiegokolwiek eksperymentu HiP-FA należy skonstruować krzywą kalibracyjną NB na potrzeby konfiguracji, wykonując konwencjonalną serię miareczkowania NB rozpuszczonego w żelu agarozowym z konkurencyjnym DNA o dowolnej sekwencji w różnych stężeniach (Rysunek 3a), jak wyjaśniono szczegółowo w kroku 8. W przypadku bardzo silnego wiązania (K_D < 500 pM) ekstrapolacja stosowana do oznaczania niskich stężeń konkurencyjnego DNA staje się ograniczająca, ponieważ jest mniej dokładna niż pomiar bezpośredni. Jednak w przypadku TF o tak niskim_{K D s}konfiguracja HiP-FA może być użyta do przeprowadzenia konwencjonalnego miareczkowania konkurencyjnego w buforze wiążącym bez użycia matrycy żelu agarozowego (Figura 5). Na przykład jedno pełne miareczkowanie z 12 różnymi stężeniami konkurencyjnego DNA można przeprowadzić w jednym rzędzie 96-dołkowej płytki.

Kontrolowany system dostarczania wymaga również szybkiej kinetyki wiązania TF-DNA i stabilnych białek, ponieważ dyfuzja przez żel agarozowy jest dynamiczna (choć powolna). Obie właściwości można testować bezpośrednio za pomocą konfiguracji HiP-FA, śledząc, w miarę upływu czasu, FA interesujących TF po związaniu z ich odpowiednim fluorescencyjnie znakowanym referencyjnym DNA. Zmierzyliśmy wskaźniki K_ON i K_OFF dla badanych czynników i stwierdziliśmy, że są one rzędu milisekund do^{sekund 20}, zgodnie z innymi badaniami³⁰. Jest to wystarczająco szybkie, aby zapewnić, że pomiary odbywają się w stanie równowagi. W przypadku innych reakcji wiązania o wolniejszej kinetyce, dyfuzyjność konkurenta można dostroić poprzez obniżenie jego stężenia lub zmniejszenie wielkości porów żelu. W przypadku badanych TF, z których wszystkie mają szybkie T_OFF (~sekundy), łączny czas pomiaru wynoszący około 1-2 h jest wystarczający do zapewnienia równowagi termodynamicznej przy każdym pomiarze.

Innym potencjalnym problemem związanym z białkiem jest tworzenie się agregatów białkowych, które mogą zmieniać pomiary FA. Stosowanie innych warunków buforowych zawierających różne dodatki (takie jak środki powierzchniowo czynne) może w razie potrzeby zapobiec tworzeniu się agregatów.

Pracowaliśmy przy założeniu liniowości PWM; jednak HIP-FA można skalować tak, aby obejmował wszystkie możliwe mutacje dinukleotydowe sekwencji konsensusu. Wreszcie, HiP-FA można dostosować do pomiaru innych typów interakcji wiązania. Warunkiem wstępnym jest dostępność odpowiedniej cząsteczki referencyjnej związanej przez białko, która może być znakowana fluorescencyjnie. Dzięki kontrolowanemu systemowi dostarczania można wygenerować gradient stężenia dla dowolnego rodzaju liganda; W związku z tym interakcje białko-białko i lek-białko mogą być mierzone z podobnie wysoką dokładnością i przepustowością.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomery	Eurofins		Niestandardowa synteza
16- / 18-bp DNA-oligomery	Eurofins		Niestandardowa synteza
Nile Blue A	Sigma	N5632-25G
Sensoplate plus mikropłytka 96- lub 384-dołkowa, PS	Greiner	655891	175 &mikro; m grube szklane dno
384 Well Sensoplate,	Greiner	788896
Agaroza, niska temperatura żelowania	Sigma	A9414-50G
Chlorek sodu	Merck	1.06404.1000
Tween-20	Sigma	P1379-1L
Di-Potassium wodorofosforan trójwodny	Merck	1.05099.1000
Diwodorofosforan potasu	Merck	1.04873.1000
Element Q-POD Merck	Millipore	ZMQSP0DE1
Millipak 40 Filtr złota gamma	Merck Millipore	MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 System oczyszczania wody	Merck Millipore	ZRXQ003WW
Quantum TIX	Merck Millipore	QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol	Sigma	43815-1G
Mastercycler gradient	Eppendorf	Z316083
Probówka SafeSeal 1,5 ml	Sarstedt	72.706.200
Probówka 15 ml	Sarstedt	62.554.502
Kubek Multiply-Pro 0,2 ml PP	Sarstedt	72.737.002
KONFIGURACJA MIKROSKOPII:
Zautomatyzowany mikroskop szerokokątny	LEICA	DMI6000
Obiektyw dalekiego zasięgu	LEICA	HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Suchy
638 nm liniowy ciągły laser diodowy	Omicron	PHOxX 638-40, 40mW
Podświetlana kamera EM-CCD	Andor	iXon DV897
Lustro dichroiczne	AHF	640nm odcięcie
Filtr pasmowo-przepustowy	AHF	ET pasmowoprzepustowy 700/75
Polaryzator liniowy	Thorlabs	LPVISC050-MP2
Rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej	Thorlabs	BS010
Soczewka achromatyczna	Thorlabs	Ogniskowa
Światłowód wielomodowy	Optronis	FVP600660710
SYSTEM ROBOTYCZNY: < / strong>
Nasz system robotyczny obejmuje stacje robocze Biomek NXP z 96-kanałową głowicą i pipetorami Span-8, połączone serwo-wahadłem, są używane do wszystkich etapów przenoszenia cieczy. Dodatkowo system wyposażony jest w wytrząsarki orbitalne oraz czytnik mikropłytek (Paradigm, Molecular device) obsługiwany przez chwytak Span-8	Beckman Coulter	Biomek NXP
SOFTWARE:
Język programowania	National Instruments	Labview 9.0
Script dla oprogramowania HiP-FA dostępny pod adresem			https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA