Artykuł metodologiczny

Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58763

⸱

7 lutego 2019

 ,  ,  ,  , 
1Gene Center and Department of Biochemistry, Center for Protein Science Munich (CIPSM), Ludwig-Maximilians-Universität München

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę określania powinowactwa wiązania w równowadze i w roztworze z wysoką czułością na dużą skalę. Poprawia to analizę ilościową wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA. Metoda opiera się na zautomatyzowanych pomiarach anizotropii fluorescencji w kontrolowanym systemie dostarczania.

Streszczenie

Dokładna kwantyfikacja interakcji czynnika transkrypcyjnego (TF)-DNA jest niezbędna do zrozumienia regulacji ekspresji genów. Ponieważ istniejące podejścia mają znaczne ograniczenia, opracowaliśmy nową metodę określania powinowactwa do wiązania TF-DNA z wysoką czułością na dużą skalę. Test opiera się na ustalonej zasadzie anizotropii fluorescencji (FA), ale wprowadza ważne ulepszenia techniczne. Po pierwsze, mierzymy pełną krzywą miareczkowania kompetycyjnego FA w pojedynczym dołku, włączając TF i znakowane fluorescencyjnie referencyjne DNA do porowatej matrycy żelu agarozowego. Nieznakowany oligomer DNA jest ładowany na górze jako konkurent i poprzez dyfuzję tworzy gradient czasoprzestrzenny. Powstały gradient FA jest następnie odczytywany za pomocą dostosowanej konfiguracji mikroskopu epifluorescencyjnego. Ta ulepszona konfiguracja znacznie zwiększa czułość wykrywania sygnału FA, umożliwiając wiarygodne ilościowe określenie zarówno słabego, jak i silnego wiązania, nawet w przypadku cząsteczek o podobnej masie cząsteczkowej. W ten sposób możemy zmierzyć jedną krzywą miareczkowania na dołek płytki wielodołkowej, a dzięki procedurze dopasowania możemy wyodrębnić zarówno bezwzględną stałą dysocjacji (KD), jak i stężenie aktywnego białka. Testując wszystkie warianty mutacji jednopunktowych danej sekwencji wiązania konsensusu, możemy zbadać cały krajobraz specyficzności wiązania TF, zazwyczaj na jednej płytce. Uzyskane macierze wagowe pozycji (PWM) przewyższają te uzyskane za pomocą innych metod w przewidywaniu zajętości TF in vivo. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy przewodnik dotyczący implementacji HiP-FA w konwencjonalnym zautomatyzowanym mikroskopie fluorescencyjnym i potoku analizy danych.

Wprowadzenie

Biorąc pod uwagę centralną rolę czynników transkrypcyjnych (TF) w regulacji genów, określenie ich preferencji wiązania w sposób ilościowy ma ogromne znaczenie. Przełomowe badania von Hippela wprowadziły pogląd, że regulatorowe TF szybko rozpoznają DNA, tak że ich wiązanie jest dobrze opisane przez równowagę termodynamiczną, podczas gdy dalsze zdarzenia rekrutacji polimerazy RNA do promotora są kontrolowane przez wolniejszą kinetykę1. Ostatnie badania wiązania in vivo sugerują, że ten obraz jest prawdopodobnie bardziej złożony2,3; Niemniej jednak te ogólne założenia służą jako dobre przybliżenia i wspierały wiele podejść obliczeniowych do znajdowania elementów regulatorowych CIS i przewidywania wyrażeń na podstawie sekwencji4,5,6. Podczas gdy wiązanie równowagowe zostało z powodzeniem zastosowane jako koncepcja, obecne metody określania interakcji TF-DNA koncentrują się na specyficzności wiązania i zazwyczaj nie mierzą bezpośrednio powinowactwa wiązania w stanie równowagi. Systematyczny pomiar wiązania TF-DNA stanowi spore wyzwanie techniczne, a istniejące metody mają kilka różnych ograniczeń.

Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje głębokie sekwencjonowanie (ChIP-seq)7, najbardziej rozpowszechniona technika in vivo, nie pozwala na pomiar powinowactwa wiązania ani dokładnej lokalizacji miejsc wiązania we fragmentach genomu. Kilka metod in vitro, w tym ślad DNazy8, przesunięcie ruchliwości elektroforetycznej (EMSA)9, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)10 i termoforeza w mikroskali11 są w stanie zmierzyć powinowactwo wiązań, ale mają stosunkowo niską przepustowość. I odwrotnie, techniki o wysokiej przepustowości, w tym mikromacierze wiążące białka12, HT-SELEX13,14 i bakteryjna jednohybrydowa (B1H)15 nie są w stanie zmierzyć powinowactwa wiązania i zazwyczaj dają zbyt specyficzne sekwencje wiązania, co wynika głównie z rygorystycznej selekcji lub niezbędnych etapów mycia. Nowsze osiągnięcia obejmują oparte na głębokim sekwencjonowaniu HiTS-FLIP16, SELEX-seq17 oraz oparte na mikrofluidyce MITOMI18 lub SMILE-Seq19, które pozwalają na ekstrakcję bezwzględnych powinowactw wiązania; jednak polegają na pomiarze intensywności fluorescencji znakowanego TF i DNA. Sygnały fluorescencyjne stają się zatem ograniczające przy niskich stężeniach białka i przy określaniu niskich wartościK D (< ~10 nM). Co więcej, wiązanie TF-DNA w tych metodach zachodzi na cienkich powierzchniach, co stwarza problemy z niespecyficznym wiązaniem i/lub tłem autofluorescencji, co utrudnia dokładne ilościowe określenie słabego wiązania.

Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy nową metodę określania krajobrazów powinowactwa TF-DNA w stanie równowagi i w roztworze, którą nazwaliśmy anizotropią fluorescencji o wysokiej wydajności (HiP-FA)20. Technika ta opiera się na ustalonym teście anizotropii fluorescencji (FA) 21, ale zmodyfikowana w celu pomiaru stałych wiązania z wysoką czułością i na dużą skalę przy użyciu dostosowanego zautomatyzowanego mikroskopu i konfiguracji analitycznej.

Test FA monitoruje interakcję fluorescencyjnie znakowanych gatunków (takich jak oligomer DNA) z partnerem wiążącym, w tym przypadku TF, poprzez pomiar rotacji molekularnej znakowanej cząsteczki. Po związaniu się z TF jego prędkość obrotowa zmniejsza się ze względu na większy promień hydrodynamiczny i masę cząsteczkową związanego kompleksu, co powoduje wzrost FA. Dokładny pomiar bardzo silnego wiązania (KD < ~1 nM) wymaga użycia niskich stężeń znakowanego, referencyjnego DNA (c < ~1 nM). Jest to trudne do osiągnięcia za pomocą komercyjnego urządzenia, takiego jak standardowy czytnik mikropłytek. Ponadto zwykle konieczna jest duża różnica wielkości (10-100 razy) między związanymi i niezwiązanymi kompleksami, co uniemożliwia pomiar interakcji między domenami wiążącymi TF a krótkimi oligomerami DNA, które zwykle mają mniej więcej podobną masę cząsteczkową. Wreszcie, pełna krzywa miareczkowania zwykle wymaga przygotowania i pomiaru wielu studzienek zawierających szereg stężeń dla gatunków miareczkujących.

Aby rozwiązać te problemy, używamy zestawu mikroskopii szerokokątnej, zmodyfikowanego tak, aby osiągnąć wysoką czułość wykrywania i umożliwić pomiary FA w różnych pozycjach z pojedynczego dołka. Dzięki temu możemy monitorować interakcje wiążące między gatunkami o podobnej masie cząsteczkowej i wysokim powinowactwie. Wyższą przepustowość uzyskuje się poprzez pomiar FA w formatach płytek wielodołkowych i przeprowadzenie całej serii miareczkowania w jednym dołku przy użyciu kontrolowanego systemu dostarczania (Rysunek 1a). Ponadto, stosując test wiązania konkurencyjnego, ekstrahujemy nie tylko stałe wiązania, ale także stężenie aktywnego białka. Jest to ważna cecha testu, ponieważ tylko część wyrażonych cząsteczek TF jest aktywna z powodu nieprawidłowego fałdowania lub degradacji białek. Układ eksperymentalny oparty jest na komercyjnym mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w stoliki piezoelektryczne XY i Z. Zmodernizowaliśmy system o zewnętrzne wzbudzenie laserowe, a następnie wykryliśmy dwie emitowane składowe polaryzacji liniowej na chipie kamery EM-CCD o wysokiej wydajności kwantowej do wykrywania światła (Rysunek 1b i 1c). System wykorzystuje obiektyw o dużej aperturze numerycznej (NA) sprzężony z ultraczułym czujnikiem, dzięki czemu zapewnia bardzo czułe pomiary FA. Rejestrując fluorescencyjne stosy z, interakcje wiążące można mierzyć wzdłuż optycznej osi z przy użyciu heterogenicznej matrycy dla reagentów. Wszystkie te modyfikacje można łatwo wdrożyć w istniejącym systemie i są one opłacalne.

Stosujemy konkurencyjny test wiązania, w którym mierzy się powinowactwo wiązania nieznakowanego oligomeru DNA w porównaniu do fluorescencyjnie znakowanego DNA, które służy jako punkt odniesienia. TF i referencyjny DNA są włączane w ustalonych stężeniach do porowatej matrycy żelu agarozowego (wielkość porów ~1 μm), która stanowi nieoddziałujące środowisko dla wiązania. Referencyjne DNA jest znakowane Cy5. Barwnik ten okazał się dobrze nadający się do pomiarów FA ze względu na stosunkowo długi czas trwania fluorescencji (~1ns) i emisję fluorescencji w dalekiej czerwieni widma widzialnego (tło o niskiej autofluorescencji). Stężenie TF jest molowo nadmiarowe w stosunku do DNA referencyjnego Cy5, co zapewnia, że całe referencyjne DNA jest związane z białkiem. Roztwór nieznakowanego DNA konkurenta jest następnie osadzany na powierzchni żelu i dyfunduje wewnątrz porowatej matrycy, ustanawiając gradient stężenia c(z, t), który zmienia się w zależności od położenia z płaszczyzny ogniskowej i czasu t (Rysunek 1a, Rysunek 2a-2c). TF związany z DNA referencyjnym Cy5 jest zatem lokalnie wystawiony na różne stężenia konkurencyjnego DNA, który konkuruje o wiązanie, co prowadzi do dynamicznie zmieniającego się FA DNA referencyjnego Cy5 FAREF(z, t) (Figura 2b i 2c).

Aby określić stężenie konkurencji c(z,t), mierzymy w oddzielnych studzienkach ( studnie kalibracyjne) dynamicznie zmieniający się sygnał FA Nile Blue (NB) FANB(z,t) (Rysunek 2a i 3). Barwnik ten interkaluje się w DNA i w ten sposób działa jako czujnik DNA dla DNA konkurencji. Dzięki temu kontrolowanemu systemowi dostarczania można zmierzyć dziesiątki do setek różnych powinowactw wiązania DNA-białko na jednej płytce wielodołkowej (format płytki 96- lub 384-dołkowej). Pomiar jest następnie wykonywany sekwencyjnie, aż do całkowitego przemieszczenia znakowanego referencyjnego DNA z TF. Określiliśmy specyficzność wiązania dla danego czynnika, mierząc powinowactwo wszystkich 3 N mutacji jednozasadowych w sekwencji konsensusu o długości N. HiP-FA wymaga niewielkich ilości białka (~pmols na krzywą miareczkowania) i wykazuje niską zmienność w oznaczaniu KDs [współczynnik zmienności (CV) < 20%], umożliwiając jednocześnie pomiary w stosunkowo dużej skali. Metoda może być przeprowadzana ręcznie lub w pełni zautomatyzowana za pomocą systemu zrobotyzowanego, co skutkuje jeszcze niższymi CV (Rysunek 4, górny panel). Stałe dysocjacji są mierzone z dużą dokładnością do 0,5 nM. W przypadku ekstremalnie wysokich powinowactw (KD < 500 pM) stosujemy standardowe miareczkowanie konkurencyjne (Rysunek 5) ze względu na niedokładności w pomiarze stężeń DNA konkurentów na niskich poziomach (< 100 nM).

HiP-FA może być zaimplementowany na prawie każdym standardowym, odwróconym, epifluorescencyjnym mikroskopie fluorescencyjnym, pod warunkiem dostępności zautomatyzowanego stolika XY i stolika piezoelektrycznego osi z. Komponenty optyczne zostały zbudowane w oparciu o zautomatyzowaną konfigurację szerokokątną wyposażoną w obiektyw dalekiego zasięgu. W praktyce test można dostosować do celów o innych cechach (w szczególności roboczej, odległości i apertury numerycznej). Wymaga to jednak optymalizacji parametrów (odległości między plastrami Z, porowatość i wysokość żelu agarozowego itp.). Możliwe jest również użycie innych rodzajów laserów lub kamery. Szczegółowy opis całej procedury eksperymentalnej i analizy danych znajduje się poniżej w sekcji dotyczącej protokołu.

Protokół

1. Mikroskopia polaryzacyjna

  1. W celu szerokopolowego oświetlenia laserowego skupić wiązkę ciągłego lasera diodowego o długości fali 638 nm (40 mW) na wlocie wielomodowego światłowodu optycznego w celu oczyszczenia wiązki. Na wyjściu światłowodu zamontować polaryzator liniowy, aby ustawić polaryzację światła laserowego.
  2. Zablokować komponent wzbudzenia emitowanego światła za pomocą lustra dichroicznego (odcięcie 640 nm) oraz filtra pasmowego (pasmo 700/75).
  3. Przesłać sygnał fluorescencyjny przez polaryzacyjny dzielnik wiązki, który rozdziela emitowane światło na prostopadłe i równoległe komponenty polaryzacji. Następnie skupić wiązkę nieodbita (komponent równoległy) oraz wiązkę odbitą (komponent prostopadły) za pomocą soczewki achromatycznej o ogniskowej 200 mm na matrycy kamery EM-CCD z tylnym podświetleniem (Rysunek 1b i 1c). Użyć lustra, aby skierować wiązkę prostopadłą w stronę soczewki.

2. Projektowanie i testowanie znakowanego fluorescencyjnie referencyjnego oligomeru DNA

  1. Wyznacz sekwencję rdzeniową referencyjnego DNA: metoda opiera się na teście konkurencyjnym, który mierzy stałą dysocjacji (KD2) pomiędzy czynnikiem transkrypcyjnym a nieznakowanym konkurencyjnym oligomerem DNA, który konkuruje o wiązanie z fluorescencyjnie znakowanym DNA, którego powinowactwo do TF służy jako referencyjne (KD1). Sekwencja konsensus uzyskana z innych źródeł, takich jak mapowanie śladów DNazy (DNase footprinting) lub bakteryjny system 1-hybrid, może służyć jako punkt wyjścia5,15.
    UWAGA: Jako ogólną zasadę przyjmuje się, że odpowiednie referencyjne DNA wykazuje od 3 do 7-krotny spadek powinowactwa wiązania do TF w porównaniu z sekwencją konsensus.
  2. Zmierz za pomocą HiP-FA wartości KD1 dla 2-3 próbnych pojedynczych mutacji sekwencji konsensus wyznaczonej w poprzednim kroku. Staraj się mutować pozycje w sekwencji konsensus, które nie są zbyt specyficzne, aby uniknąć całkowitej utraty wiązania.
    UWAGA: Ważne jest, aby sekwencja referencyjna była wiązana przez badany czynnik transkrypcyjny (w tym protokole zastosowano Giant Gt), ale nie zbyt silnie, tak aby słabsze konkurenty mogły go wyprzeć przy wysokich stężeniach.
  3. Rozszerz motyw rdzeniowy (zazwyczaj 8-12 par zasad) do długości 16 par zasad lub więcej, dodając symetryczne sekwencje flankujące po obu stronach (dodaj łańcuchy boczne dla zapewnienia prawidłowego wiązania). Jeśli jest to konieczne (na przykład dla dłuższych domen wiążących), zastosuj dłuższe sekwencje (w teście HiP-FA przetestowano sekwencje o długości do ~50 par zasad).
    OSTRZEŻENIE: Należy uważać, aby nie dodać zasad, które mogą stworzyć egzotopowe miejsca wiązania. Aby ułatwić ten proces, należy korzystać z narzędzi obliczeniowych przewidujących miejsca wiązania na podstawie dostępnych PWM (np. PySite22).
  4. Jako znakowane referencyjne DNA zamów oligomery znakowane fluorescencyjnie na nici forward lub reverse na końcu 3' lub 5'. Użyj na przykład Cy5, Bodipy-650 lub innego odpowiedniego barwnika w stężeniu 10 µM (stok 10x 100 µM) w wodzie i rozcieńczaj stopniowo, zgodnie z opisem w kroku 3.1.
  5. Przygotuj 500 mL 1x buforu do wiązania, dodając do wody destylowanej 33 mM buforu fosforanowego potasu (pH = 7.0), 90 mM NaCl oraz 0,01% niejonowego detergentu. Przygotuj również 3x bufor do wiązania, zawierający te same składniki, ale w trzykrotnie większych stężeniach. W przypadku stosowania 3x buforu do wiązania jako roztworu stokowego dla 1x buforu do wiązania, przygotuj objętości > 500 mL; w przeciwnym razie przygotuj 250 mL.
    UWAGA: Skład ten został zoptymalizowany pod kątem stabilności czynnika transkrypcyjnego oraz zapobiegania dimeryzacji S-transferazy glutationowej (GST).
  6. Za pomocą zestawu mikroskopowego opisanego w kroku 1 zmierz FA dla 200 µL buforu do wiązania zawierającego 0,8 nM znakowanego referencyjnego DNA w obecności różnych ilości TF w 96-dołkowej płytce mikroskopowej z szklanym dnem (5-6 dołków z różnymi stężeniami TF), aby wyznaczyć stężenie TF do zastosowania. Przeprowadź serię miareczkową z rosnącą ilością TF i wybierz do testu stężenie, przy którym krzywa osiąga plateau, co wskazuje na całkowite związanie referencyjnego oligomeru DNA.
    UWAGA: Optymalne stężenie TF zależy od wartości stałych dysocjacji TF-DNA. Zazwyczaj niższe wartości KD wymagają niższych stężeń.

3. Wyżarzanie oligomerów

  1. Aby przeprowadzić anelowanie oligomerów DNA znakowanego DNA referencyjnego (sekwencja określona w poprzednim kroku), zmieszaj 7 µL roztworu jednoniciowego DNA forward o stężeniu 10 mM znakowanego barwnikiem oraz 7 µL nieznakowanego komplementarnego DNA reverse o stężeniu 10 mM w 186 µL wody.
  2. W przypadku sekwencji konkurującego DNA, zmieszaj 20 µL roztworów 100 mM (w wodzie, dostarczonych przez producenta) jednoniciowego DNA forward z 20 µL jednoniciowego DNA reverse o stężeniu 100 mM dla każdej z poszczególnych mierzonych sekwencji konkurujących.
  3. Przeprowadź anelowanie oddzielnie w standardowym termocyklerze PCR, nagrzewając roztwory do 70 °C przez 3 min, a następnie obniżając temperaturę do RT z szybkością 0,1 K/s. Jeśli używana maszyna do PCR nie obsługuje gradientów temperatury z taką szybkością, przeprowadź inkubacje stopniowe z obniżaniem temperatury (przetestowano 99 cykli po 3 s z obniżeniem o -0,4 K na cykl).

4. Przygotowanie żelu

UWAGA: Poniższa sekcja wyjaśnia przygotowanie dwóch różnych rodzajów żeli: 1) dołki miareczkowe zawierają żele z białkiem i służą do wyznaczenia wartości KD dla poszczególnych sekwencji konkurencyjnego DNA oraz 2) dołki kalibracyjne wykorzystują NB do wyznaczania stężenia DNA w każdym danym punkcie czasowym i na każdej wysokości akwizycji. Główny nacisk położono na przygotowanie eksperymentu na płytce 96-dołkowej, jednak wskazano również odpowiadające im objętości dla formatu płytki 384-dołkowej.

  1. Rozpuść 0,5% w/v agarozę o niskiej temperaturze topnienia w buforze wiążącym, gotując ją w laboratorycznej kuchence mikrofalowej. Po całkowitym rozpuszczeniu ponownie dostosuj objętość za pomocą ddH2O, aby zrekompensować ewentualne odparowanie.
    UWAGA: Dla wygody przygotuj zapas 10-20 aliquotów po 10 mL żeli i roztapiaj je w temperaturze 75°C w razie potrzeby. Zapasy żelu można przechowywać w temperaturze pokojowej.
    OSTROŻNIE: Należy uważać, aby nie doprowadzić do przegrzania roztworu żelu w kuchence mikrofalowej. Zaleca się krótkie odstępy czasu grzania z mieszaniem pomiędzy nimi.
  2. Aby przygotować dołki do miareczkowania i kalibracji, najpierw roztop dwa 10 mL aliquoty zapasu żelu w temperaturze 75 °C podczas mieszania.
    1. Użyj 240 µL (wliczając 20% zapasu) dla każdego konkurenta (n = liczba sekwencji konkurencyjnych).
    2. Użyj tej samej objętości żelu dla dołka kalibracyjnego NB, aby zapewnić taką samą temperaturę i lepkość obu żeli.
    3. Następnie ustaw temperaturę na 35 °C i poczekaj, aż temperatura się ustabilizuje.
  3. Do dołków do miareczkowania dodaj zhybrydyzowane referencyjne DNA (uzyskane w kroku 3) w stężeniu końcowym 1,4 nM, białko TF (stężenie końcowe CTF = 20-60 nM, określone w kroku 2.6), DTT (0,2 mM) oraz bufor wiążący do całkowitej objętości n x 200 µL lub n x 13 µL w przypadku płytki 96- lub 384-dołkowej, odpowiednio (plus zapas). Wymieszaj dokładnie poprzez odwracanie/wstrząsanie (nie używać vortexa).
  4. Powoli dodaj 200 µL na dołek w formacie płytki 96-dołkowej (13 µL/dołek dla 384 dołków) roztworu żelu przygotowanego w poprzednim kroku do dołków do miareczkowania na płytce.
  5. W przypadku dołków kalibracyjnych, najpierw dodaj 5 nM NB do roztopionego żelu poza dołkami (całkowita objętość zależy od użytego formatu płytki i liczby dołków kalibracyjnych; zazwyczaj 5-6 na płytkę jest wystarczające).
  6. Powoli pipetuj 200 µL (13 µL dla formatu płytki 384-dołkowej) żelu zawierającego NB do dołków kalibracyjnych na płytce, dbając o uniknięcie pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Stosowanie pipet elektronicznych lub robotyki znacznie zwiększa powtarzalność.
  7. Pozostaw żel do stężenia przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie przez kolejne 10 min w temperaturze 4 °C (jeśli to konieczne, usuń później kondensację ze szkła). Upewnij się, że wszystkie te kroki są wykonywane na idealnie poziomej powierzchni, aby uniknąć niejednorodnej powierzchni żelu.
    UWAGA: Żele zawierające białko są zazwyczaj stabilne przez co najmniej kilka godzin w temperaturze 4 °C.

5. Dodawanie roztworu konkurencyjnego DNA

UWAGA: Poniższe roztwory należy przygotować przed rozpoczęciem miareczkowania i dodać je jednocześnie do studzienek kalibracyjnych i miareczkowych.

  1. Dodaj wyżyłowany, znakowany referencyjny DNA oraz białko w 3x buforze wiążącym w stężeniach 3-krotnie wyższych niż w alikwotach zapasu żelu.
    1. Zmieszaj 20 µL otrzymanego roztworu z 40 µL każdego z roztworów wyżyłowanego DNA konkurencyjnego otrzymanych w kroku 3.
    2. Dla każdego dołka kalibracyjnego zmieszaj 20 µL 3x buforu wiążącego zawierającego 15 mM roztwór NB z 40 µL wyżyłowanego DNA konkurencyjnego (odpowiednia jest dowolna sekwencja o tej samej długości).
      UWAGA: W przypadku płytek 384-dołkowych użyj łącznie 21 µL zamiast 60 µL.
  2. Opcjonalnie sprawdź spektroskopowo jednorodność poziomów wysokości żelu w różnych dołkach płytki, mierząc absorbancję przy 380 nm za pomocą czytnika płytek wielodołkowych (wartości absorbancji są proporcjonalne do wysokości żelu).
  3. Dodaj 50 µL (7 µL dla formatu płytki 384-dołkowej) zmieszanych roztworów DNA konkurencyjnego (wyżyłowanych w kroku 3) na powierzchnię żeli. Staraj się dodać wszystkie roztwory konkurencyjne możliwie jednocześnie, używając elektronicznych pipet wielokanałowych lub 96-kanałowej głowicy pipetującej, jeśli jest dostępna. Po dodaniu roztworów konkurencyjnych umieść płytkę na stoliku mikroskopu i niezwłocznie rozpocznij pomiary (krok 7).

6. Pozyskiwanie obrazów

  1. Sekwencyjnie pozyskuj serie czasowe stosów z (np. stosując 12 płaszczyzn i czas naświetlania 100-300 ms). Unikaj wykonywania obrazów zbyt blisko powierzchni studzienki (< ~1,4 µm w przypadku płyt użytych w tej procedurze), aby wykluczyć jakiekolwiek odchylenie polaryzacyjne.
  2. Wykonaj 10-25 cykli pomiarów aż do całkowitego odwiązania znakowanego referencyjnego DNA od TF. Punkt końcowy jest zazwyczaj osiągany po 1-2 h, w zależności od kinetyki wiązania i dyfuzyjności konkurencyjnego DNA.

7. Ekstrakcja FA(z,t) z surowych danych

  1. Po wykonaniu obrazowania płytki wielodołkowej, oblicz na podstawie surowych obrazów fluorescencyjnych średnie wartości pikseli dla wybranych obszarów (ROI) w odniesieniu do równoległych (I=) i prostopadłych (I+) składowych natężenia polaryzacji (Rysunek 1c). Można to zrobić automatycznie za pomocą oprogramowania HiP-FA23.
    UWAGA: Oprogramowanie HiP-FA, instrukcja obsługi oraz zestaw danych testowych są dostępne do pobrania23. Alternatywnie można użyć dowolnego innego autorskiego oprogramowania do wyodrębnienia I= oraz I+ i przeprowadzenia dalszej analizy krzywych miareczkowania, zgodnie z poniższym szczegółowym opisem.
  2. Oblicz FA dla każdego dołka. Dla każdego dołka skrypt oblicza FA(z,t) dla każdej pozycji z oraz punktu czasowego t zgodnie z:
    Równanie 1:   Równanie anizotropii fluorescencji, funkcja FA(z,t), stosowane w analizie danych spektroskopowych.
    Gdzie G jest współczynnikiem G instrumentu, który koryguje wszelkie odchylenia w kierunku kanału prostopadłego.
  3. Wyznacz współczynnik G dla układu mikroskopowego poprzez pomiar FA dowolnych roztworów zawierających barwnik fluorescencyjny o znanej anizotropii. Wyodrębnij dwie składowe polaryzacji sygnału, a następnie użyj Równania 1, aby otrzymać wartość G, znając FA roztworu (G = 1,15 w tym układzie).

8. Krzywa kalibracyjna do oznaczania stężenia DNA konkurecyjnego z FANB

  1. Przeprowadzić hybrydyzację (annealing) 120 µL każdego bezpośredniego i odwrotnego oligomeru referencyjnego (stężenie roztworu stokowego 100 mM; można użyć dowolnej losowej sekwencji o tej samej długości co sekwencja konkurencji) i zmieszać z 120 µL 3x buforu wiążącego zawierającego NB (15 nM).
  2. Przygotować serię rozcieńczeń 1:2 w 1x buforze wiążącym (łącznie 6 rozcieńczeń). Zmieszać 50 µL tych rozcieńczeń z 200 µL 0,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (T > 35 °C) w 1x buforze wiążącym zawierającym 5 nM NB w trzech powtórzeniach.
  3. Przenieść po 200 µL z każdych z 6 roztworów przygotowanych w poprzednim kroku do płytki 96-dołkowej i przechowywać płytkę przez 1 h w 4 °C, aby zapewnić całkowite żelowanie, a następnie przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Zmierzyć FANB roztworów przy użyciu zestawu HiP-FA.
  4. Wyodrębnić FANB (z,t) zgodnie z poprzednim krokiem i dopasować dane przy użyciu równania Hilla:
    Równanie 2:   Równanie równowagi dla stężenia DNA; przedstawione jako FA(z,t) z parametrami dla analizy wiązania.
    Gdzie CDNA to stężenie oligomeru DNA; k to stężenie oligomerów DNA, przy którym zajęte jest połowa miejsc wiązących; FAmax to stała normalizacji; a n to współczynnik Hilla. Parametry k, FAmax i n są ustawione jako parametry wolne podczas procedury dopasowania.
  5. Wprowadzić trzy parametry uzyskane z procedury dopasowania do oprogramowania HiP-FA (w lewym dolnym panelu).
  6. Powtarzać wyznaczanie krzywej kalibracyjnej co kilka miesięcy lub po wprowadzeniu zmian w konfiguracji mikroskopu.

9. Wyznaczenie stężeń DNA konkurenta

  1. Użyć oprogramowania HiP-FA do wyodrębnienia c(z,t) z pomiarów FANB(z,t) (Rysunek 3). Najpierw należy uzyskać krzywą kalibracyjną zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji i wprowadzić parametry dopasowania do oprogramowania (szczegóły znajdują się w instrukcji).
  2. Użyć programu do automatycznej ekstrapolacji c(z,t) dla c < 100 nM (szczegóły w instrukcji) przy użyciu równania 3 (Rysunek 3b), które opisuje jednowymiarową dyfuzję konkurencyjnego DNA w matrycy żelu agarozowego, zakładając dyfuzję swobodną.
    Równanie 3:   Równanie dyfuzji ciepła: \( c(z,t) = C_0 \left( 1 + \text{erf}\left(\frac{-z}{\sqrt{4D(t+t_0)}} \right) \right) \)
    Gdzie C0 to początkowe stężenie konkurencyjnego DNA; erf to funkcja błędu; z to pozycja; D to współczynnik dyfuzji konkurencyjnego DNA; a t0 to czas rozpoczęcia pomiarów. Wykorzystanymi parametrami swobodnymi są C0 oraz z/Symbol pierwiastka z zmienną D; reprezentacja równania matematycznego do celów edukacyjnych..

10. Konwencjonalne miareczkowanie konkurencyjne z użyciem HIP-FA dla bardzo silnego wiązania z DNA

  1. Wykonaj rozcieńczenia szeregowe różnych oligomerów konkurencyjnego DNA w rzędach płytki 96-dołkowej (lub 384-dołkowej) w stężeniach: 0, 1,25, 3,5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900 oraz 4000 nM. Dodaj znakowane Cy5 referencyjne DNA (1 nM) oraz TF (20-50 nM) w stałym stężeniu, tak aby całkowita objętość w każdym dołku wynosiła 200 µL w buforze wiążącym (Rysunek 5a). Odczekaj 40 min do osiągnięcia równowagi termodynamicznej, a następnie wykonaj (za pomocą zestawu HiP-FA) serie obrazów z-stack dla każdego dołka (pozyskanie kilku obrazów na dołek zmniejsza zmienność poprzez uśrednienie obliczonych wartości FA).
  2. Wykreśl krzywe miareczkowania wiązania w stanie równowagi i dopasuj je do Równania 4 (Rysunek 5b). Wartości KD wyznaczone za pomocą konwencjonalnego miareczkowania konkurencyjnego są identyczne z tymi uzyskanymi metodą HIP-FA z wykorzystaniem matrycy z żelu agarozowego20.

11. Procedura dopasowania krzywych miareczkowania FA

  1. Wyświetl w oprogramowaniu HiP-FA zrekonstruowane krzywe miareczkowania dla poszczególnych sekwencji konkurentów FA(z,t) = f[c(z,t)] i wizualnie sprawdź jakość danych (szczegóły znajdują się w instrukcji). W razie potrzeby doprecyzuj parametry użyte do wyznaczania stężeń konkurencyjnego DNA w kroku 10.
  2. Dopasuj automatycznie każdą pojedynczą krzywą miareczkowania za pomocą równania 4, które stanowi rozwiązanie analityczne dla testów miareczkowania konkurencyjnego24.
    Równanie 4:   Równanie równowagi statycznej, FA=A×(2√(d²−3e)cos(θ/3)−d)/(3Kd₁+2√(d²−3e)cos(θ/3)−d)+B.
    Gdzie:    Równanie obliczania odległości, formuła ze zmiennymi K, L, R w analizie naukowej.
    Równanie chemiczne, formuła równowagi, e=(LT-RT)KD1+(LST-RT)KD2+K'D1K'D2, koncepcja fizyczna.
    Formuła równowagi statycznej na schemacie: f = -KD1 KD2 RT, równania analizy sił.
    Równanie theta, formuła arccos, obliczenia trygonometryczne, wyrażenie matematyczne.
    Przy czym RT to stężenie białka; LT to stężenie nieznakowanego DNA, a LST to stężenie znakowanego DNA; KD2 to stała dysocjacji do wyznaczenia; RT to stężenie aktywnego białka; natomiast A i B to parametry normalizacji.

    Najpierw wyznacz KD1, który służy jako punkt odniesienia do wyznaczania różnych wartości KD2. Wartość KD1 można łatwo wyznaczyć za pomocą testu, wybierając sekwencję referencyjnego DNA z barwnikiem jako sekwencję nieznakowanego DNA konkurenta (patrz instrukcja).
  3. Wprowadź uzyskaną wartość KD1 do oprogramowania i oblicz wartości KD2 dla wszystkich konkurencyjnych DNA na płytce.
    UWAGA: Parametrami swobodnymi procedury dopasowania są KD2, RT, A oraz B.
  4. Wyeksportuj stałą dysocjacji KD2 oraz stężenie aktywnego białka RT dla wszystkich poszczególnych dołków miareczkowania na płytce, klikając przycisk „Export” w oprogramowaniu.

12. Konstrukcja PWM, specyficzność oddziaływania białko-DNA oraz pseudoliczniki

Utwórz logotypy sekwencji (sequence logos) dla różnych PWM przy użyciu narzędzia online WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi), zgodnie z wcześniej opisaną procedurą20.

Wyniki

Zastosowaliśmy metodę HiP-FA w odniesieniu do czynników transkrypcyjnych (TFs) sieci genów segmentacyjnych25,26, która odpowiada za tworzenie wzorca ciała w osi przednio-tylnej zarodków Drosophila, głównie poprzez regulację transkrypcyjną. Z tej sieci wybrano czynnik transkrypcyjny Giant (Gt) z domeną bZIP do szczegółowej analizy (Rysunek 4). Ponieważ pełnej długości czynniki transkrypcyjne są trudne do ekspresji i wykazują w większości takie same preferencje wiązania jak ich domeny wiążące DNA (DBD)13, wykorzystaliśmy DBD połączoną z GST i wyekspresowaliśmy ten konstrukt w E.coli; białka fuzyjne GST zapewniają takie same wyniki jak same domeny DBD20.

Sekwencja konsensuse Gt (ATTACGTAAC) reprezentuje najsilniejszą sekwencję wiążącą, którą określiliśmy zgodnie z powyższym opisem. Następnie zbadaliśmy wpływ na energię wiązania wszystkich możliwych mutacji punktowych w obrębie 10-merowej sekwencji konsensuse Gt (łącznie 30), flankowanej dodatkowymi zasadami na końcach 5' i 3'. Wykonaliśmy dwa pomiary powtórne, których próbki do żelu zostały przygotowane automatycznie, oraz jeden dodatkowy pomiar wykonany ręcznie w celu porównania. Wartości KDs dla sekwencji z pojedynczą mutacją mieściły się w zakresie od 0,6 do > 2000 nM; potwierdziliśmy również całkowity brak wiązania z sekwencją „niewiążącą” (dane nie przedstawiono).

Specyficzność wiązania TF-DNA jest zazwyczaj modelowana przy użyciu macierzy wag pozycyjnych (PWM), w której każdemu możliwemu nukleotydowi w każdej pozycji motywu wiązania przypisywana jest określona wartość. PWM zakłada, że każda pozycja niezależnie wpływa na siłę wiązania i w większości przypadków stanowi wystarczający model preferencji wiązania TF27. Wygenerowaliśmy zrewidowane macierze PWM na podstawie naszych pomiarów powinowactwa, stosując uznane procedury28,29, i porównaliśmy je z dwiema macierzami PWM opisanymi wcześniej w literaturze. Pierwsza z nich opiera się na liczbach częstotliwości nukleotydów z miejsc wiązania zidentyfikowanych metodą footprintingu DNA4,5, natomiast druga macierz PWM została uzyskana za pomocą bakteryjnej selekcji jednohybrydowej (B1H).15

Wysokie podobieństwo PWM dla trzech powtórzeń (Rysunek 4, górny panel), w tym dla próbki przygotowanej ręcznie (powtórzenie 3), wykazuje wysoką powtarzalność metody HiP-FA. Chociaż PWM uzyskane za pomocą HiP-FA są ogólnie podobne do PWM uzyskanych innymi metodami (Rysunek 4, dolny panel), występują istotne odchylenia: w pozycji 2 (czarna strzałka), na początku rdzenia motywu bZIP, mutacje T>(G,C,A) prowadzą do całkowitej utraty wiązania w motywie otrzymanym za pomocą HiP-FA, co jest zgodne z motywem B1H, ale nie z motywem uzyskanym metodą sekwencjonowania z wykorzystaniem nukleazy DNase (DNase footprinting), w której wiązanie pozostaje stosunkowo silne dla zasad (G,A). I odwrotnie, w pozycji 7 (szara strzałka) mutacja T>C prowadzi do znacznie silniejszego wiązania, niż wynikałoby to z wcześniej zmierzonych PWM.

Inne odchylenia są subtelniejsze, ale równie istotne. Ogólnie PWM dla HiP-FA jest mniej specyficzny niż dwa pozostałe, co odzwierciedla fakt, że wiele mutacji względem konsensusu wciąż skutkuje umiarkowanie silnym wiązaniem. Można to określić ilościowo za pomocą zawartości informacji (IC). IC wynosi 11,5 bita dla macierzy HiP-FA (średnia z trzech powtórzeń), w porównaniu do IC = 13,4 bita i 16,8 bita dla macierzy z footprintingu DNase oraz B1H, odpowiednio. Zazwyczaj (choć nie w każdym przypadku) PWM uzyskane metodą HiP-FA są mniej specyficzne niż te otrzymane innymi metodami, co oparto na badaniach 26 czynników TF20.

Eksperyment dyfuzyjny z użyciem Cy5-DNA w żelu agarozowym, detekcja fluorescencyjna, schemat układu laserowego.
Rycina 1:Schematyczne przedstawienie analizy HIP-FA i układu eksperymentalnego. (a) System dostarczania do żelu w celu miareczkowania konkurencyjnego DNA w pojedynczych studzienkach. (b) Układ mikroskopowy HIP-FA. Dostosowany zautomatyzowany mikroskop szerokopolowy z detekcją polaryzowanego światła fluorescencyjnego na kamerze EM-CCD. (c) Surowy obraz fluorescencyjny z dwoma obszarami zainteresowania (ROI) wykorzystanymi do wyznaczenia składowej spolaryzowanej równolegle (czerwona) i prostopadle (zielona). (d) Typowy układ płytki 96-dołkowej. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wykres analizy fluorescencyjnej i wykresy KD wiązania porównujące silne i umiarkowane ligandy, analiza danych.
Rycina 2: Surowe dane FA i zrekonstruowane krzywe miareczkowania. (a) Typowa trajektoria FA(z,t) dla dołka kalibracyjnego zawierającego NB. (b,c) Trajektorie czasowe FA(z,t) dla dwóch dołków miareczkowania mierzących wiązanie do silnego (b) i bardziej umiarkowanego (c) konkurenta wiążącego DNA. (d, e) Odpowiadające im zrekonstruowane pomiary miareczkowania FA i dopasowane krzywe dla wiązania silnego (d) i umiarkowanego (e). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza wiązania DNA; wykresy przedstawiające stężenie konkurencyjnego DNA względem ΔFA, stężenie względem cyklu.
Rysunek 3: Wyznaczanie stężenia konkurencyjnego DNA c(z,t) przy użyciu Nile Blue (NB). (a) Krzywa kalibracyjna FA-stężenie dla 16-par zasad oligomerów DNA. W konwencjonalnej serii miareczkowania NB jest osadzony w żelu agarozy wraz z różnymi stężeniami konkurencyjnego DNA. powinowactwo NB do DNA jest niezależne od sekwencji20; zatem te same krzywe kalibracyjne mogą być stosowane do wyznaczania c(z,t) dla różnych sekwencji DNA o tej samej długości. (b) Profil dyfuzji czasowej konkurencyjnego DNA na dowolnej wysokości z wyznaczony przy użyciu pięciu studni kalibracyjnych. Dla każdego cyklu pomiarowego średnie wartości FA z czterech studni zawierających NB są przedstawione jako białe kropki. Krzywe zostały dopasowane przy użyciu równania 3 (biała linia, poszczególne studnie w kolorze), a c(z,t) przy niskich stężeniach (C < ~100 nM) jest wyznaczane za pomocą ekstrapolowanej krzywej dopasowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie metody HiP-FA; wykres logo sekwencji; zautomatyzowana vs manualna analiza footprintingu DNA.
Rysunek 4: Specyficzność wiązania rodziny domen bZIP czynnika transkrypcyjnego Giant (Gt). Macierze PWM HIP-FA z trzech powtórzeń: dwóch przygotowanych automatycznie i jednego przygotowanego manualnie (panel górny) są porównane z macierzami PWM wygenerowanymi metodą footprintingu DNase oraz metodą selekcji bakteryjnego jednego hybrydy (B1H) (panel dolny). Ogólnie motywy wiązania HIP-FA są zgodne z wcześniejszymi danymi, ale wykazują również istotne różnice, zaznaczone czarnymi i szarymi strzałkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Mapa cieplna anizotropii fluorescencji FA i krzywe wiązania; test konkurencji DNA; wyznaczanie Kd.
Rycina 5: Konwencjonalne miareczkowanie konkurencyjne z użyciem HIP-FA. (a) Projekt płytki przedstawia 8 różnych DNA konkurencyjnych rozcieńczonych seryjnie w buforze wiążącym w jednym rzędzie płytki 96-dołkowej. Przedstawiono mapę cieplną FA dla różnych dowolnych sił wiązania. (b) Miareczkowanie konkurencyjne trzech DNA konkurencyjnych wiążących się z TF Bcd z różnym powinowactwem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

HiP-FA to nowa, kompleksowa metoda określania krajobrazów preferencji wiązań interakcji TF-DNA. Mierzy powinowactwo wiązania wariantów motywu mutacji DNA, unikając wszelkich podstawowych założeń, że preferencje wiązania znajdują odzwierciedlenie w częstości występowania nukleotydów w zestawie spoiw ponadprogowych. Pomiar odbywa się w roztworze bez unieruchomienia i mechanicznej lub chemicznej ingerencji w reakcję wiązania, jak najdokładniej przybliżając warunki równowagi. Kontrolowany system dostarczania umożliwia pomiar pełnej krzywej miareczkowania w jednym dołku i zwiększa zarówno przepustowość, jak i niezawodność, jednocześnie oszczędzając białko. Korzystanie z obiektywu z dużą aperturą numeryczną i kamerą EM-CCD o wysokiej skuteczności zbierania światła pozwala na bardzo czułe wykrywanie światła fluorescencyjnego. W związku z tym przy tej konfiguracji można dokładnie wykryć niewielkie zmiany FA tak niskie, jak 10-15 mP; W praktyce oznacza to, że każda reakcja wiązania, w której wzrost masy po związaniu jest minimalny (tak niski, jak stosunek mas wynoszący 2), jest łatwo wykrywalna. Zwykle nie ma to miejsca w przypadku systemów komercyjnych, takich jak czytniki mikropłytek. Ze względu na wysoką czułość, HiP-FA rozszerza zakres stałych dysocjacji, które można niezawodnie zmierzyć, na zakres pikomolarny. Energie wiązania są określane dokładnie dla wielu rzędów wielkości.

Aby ocenić jakość zmienionych PWM, przeprowadziliśmy dwa rodzaje analiz20. Przetestowaliśmy, dla pięciu czynników sieci genów segmentacji, jak dobrze różne PWM mogą przewidywać eksperymentalne profile ChIP-seq w regionach genomowych 21 genów segmentacji. W drugim teście użyliśmy modelu sekwencja do ekspresji4 , który przewiduje wzorce ekspresji wzmacniaczy segmentacji na podstawie preferencji wiązania i stężenia białek uczestniczących TF. W obu ćwiczeniach stwierdziliśmy, że mniej specyficzne PWM HiP-FA działają znacznie lepiej niż bardziej specyficzne PWM z footprintingiem i PWM B1H20.

W przeciwieństwie do metod de novo, HiP-FA wymaga pewnej wcześniejszej wiedzy na temat preferencji wiązania danego TF. Jednak sekwencje konsensusu są znane dla wielu TF, a wiele istniejących metod może je dostarczyć 13,14,15. W razie potrzeby prawdziwą optymalną sekwencję wiązania można znaleźć iteracyjnie.

Użyliśmy referencyjnych oligomerów DNA znakowanych fluorescencyjnie Cy5 i Bodipy-650. Barwniki te okazały się dobrze sprawdzać w pomiarach FA, ponieważ anizotropia związanego i niezwiązanego znakowanego referencyjnego DNA była największa spośród różnych testowanych barwników. Zapewnia to maksymalny zakres dynamiczny dla wartości FA. Ogólnie rzecz biorąc, każdy barwnik fluorescencyjny o żywotności fluorescencji ≥ 1 ns może być odpowiedni, ale najpierw musi zostać przetestowany. Jeśli to możliwe, zaleca się stosowanie barwników fluoryzujących w zakresie bliskiej podczerwieni, aby zminimalizować autofluorescencję białek.

Najbardziej krytycznym etapem procedury eksperymentalnej jest pipetowanie żelu do płytek dołka. Dobra odtwarzalność wymaga, aby objętości żelu były jak najbardziej jednolite. Zmiany wysokości żelu są przekładane na zmiany dyfuzyjności dla konkurencyjnego oligomeru DNA, a tym samym na pozorne zmiany powinowactwa podczas oceny danych. Jest to główne źródło wariancji w replikacji technicznej. Zastosowanie pipety elektronicznej lub technik automatyzacji poprawia odtwarzalność. Pęcherzyków powietrza w żelu można uniknąć, powolnemu i ostrożnemu pipetowaniu. Ważne jest również, aby dodać wszystkie konkurencyjne roztwory do dołków miareczkowych z jak najmniejszym opóźnieniem. Aby uzyskać najlepszą powtarzalność, cały proces można zautomatyzować za pomocą robota pipetującego z inkubatorami ciepła. Kluczowym elementem przeniesienia protokołu do automatyzacji jest niezbędna optymalizacja temperatury inkubatora i czasu inkubacji. Upewnij się, że znajdziesz optymalną równowagę między lepkością żelu (tj. nie za zimno) a stabilnością białek (tj. nie za gorąco). Zależy to zarówno od szybkości dozowania żeli do studzienek, jak i od stabilności użytego białka.

HiP-FA wykorzystuje kontrolowany system dostarczania dla konkurencyjnych oligomerów DNA. Aby skonstruować krzywe miareczkowania, konieczne jest wyznaczenie konkurencyjnego stężenia DNA c(z,t) dla każdej danej pozycji z w matrycy żelu i punkcie czasowym t. Jest to kolejny krytyczny krok, ponieważ określenie KDs zależy bezpośrednio od c(z,t). W tym celu stosuje się studzienki kalibracyjne zawierające barwnik NB jako czujnik stężenia DNA (Rysunek 1d, Rysunek 2a). Zwykle wystarczą 3-5 dołków kalibracyjnych zawierających NB na płytkę. Przed oceną jakiegokolwiek eksperymentu HiP-FA należy skonstruować krzywą kalibracyjną NB na potrzeby konfiguracji, wykonując konwencjonalną serię miareczkowania NB rozpuszczonego w żelu agarozowym z konkurencyjnym DNA o dowolnej sekwencji w różnych stężeniach (Rysunek 3a), jak wyjaśniono szczegółowo w kroku 8. W przypadku bardzo silnego wiązania (KD < 500 pM) ekstrapolacja stosowana do oznaczania niskich stężeń konkurencyjnego DNA staje się ograniczająca, ponieważ jest mniej dokładna niż pomiar bezpośredni. Jednak w przypadku TF o tak niskimK D skonfiguracja HiP-FA może być użyta do przeprowadzenia konwencjonalnego miareczkowania konkurencyjnego w buforze wiążącym bez użycia matrycy żelu agarozowego (Figura 5). Na przykład jedno pełne miareczkowanie z 12 różnymi stężeniami konkurencyjnego DNA można przeprowadzić w jednym rzędzie 96-dołkowej płytki.

Kontrolowany system dostarczania wymaga również szybkiej kinetyki wiązania TF-DNA i stabilnych białek, ponieważ dyfuzja przez żel agarozowy jest dynamiczna (choć powolna). Obie właściwości można testować bezpośrednio za pomocą konfiguracji HiP-FA, śledząc, w miarę upływu czasu, FA interesujących TF po związaniu z ich odpowiednim fluorescencyjnie znakowanym referencyjnym DNA. Zmierzyliśmy wskaźniki KON i KOFF dla badanych czynników i stwierdziliśmy, że są one rzędu milisekund dosekund 20, zgodnie z innymi badaniami30. Jest to wystarczająco szybkie, aby zapewnić, że pomiary odbywają się w stanie równowagi. W przypadku innych reakcji wiązania o wolniejszej kinetyce, dyfuzyjność konkurenta można dostroić poprzez obniżenie jego stężenia lub zmniejszenie wielkości porów żelu. W przypadku badanych TF, z których wszystkie mają szybkie TOFF (~sekundy), łączny czas pomiaru wynoszący około 1-2 h jest wystarczający do zapewnienia równowagi termodynamicznej przy każdym pomiarze.

Innym potencjalnym problemem związanym z białkiem jest tworzenie się agregatów białkowych, które mogą zmieniać pomiary FA. Stosowanie innych warunków buforowych zawierających różne dodatki (takie jak środki powierzchniowo czynne) może w razie potrzeby zapobiec tworzeniu się agregatów.

Pracowaliśmy przy założeniu liniowości PWM; jednak HIP-FA można skalować tak, aby obejmował wszystkie możliwe mutacje dinukleotydowe sekwencji konsensusu. Wreszcie, HiP-FA można dostosować do pomiaru innych typów interakcji wiązania. Warunkiem wstępnym jest dostępność odpowiedniej cząsteczki referencyjnej związanej przez białko, która może być znakowana fluorescencyjnie. Dzięki kontrolowanemu systemowi dostarczania można wygenerować gradient stężenia dla dowolnego rodzaju liganda; W związku z tym interakcje białko-białko i lek-białko mogą być mierzone z podobnie wysoką dokładnością i przepustowością.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy J. Müllerowi za klony cDNA oraz członkom laboratorium z Galii, w szczególności S. Bergeltowi, za cenne rady i ożywioną dyskusję. Prace te były wspierane przez SFB 646, Regulatory Networks in Genome Expression and Maintenance (C.J., P.B.), Center for Integrated Protein Science (U.G.) oraz Graduate School for Quantitative Biosciences Munich (M.S.). U.G. dziękuje za wsparcie ze strony Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF: ebio - Innovationswettbewerb Systembiologie) oraz Fundacji Humboldta (Alexander von Humboldt, profesura).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomeryEurofinsNiestandardowa synteza
16- / 18-bp DNA-oligomeryEurofinsNiestandardowa synteza
Nile Blue ASigmaN5632-25G
Sensoplate plus mikropłytka 96- lub 384-dołkowa, PSGreiner655891175 &mikro; m grube szklane dno
384 Well Sensoplate,Greiner788896
Agaroza, niska temperatura żelowaniaSigmaA9414-50G
Chlorek soduMerck1.06404.1000
Tween-20SigmaP1379-1L
Di-Potassium wodorofosforan trójwodnyMerck1.05099.1000
Diwodorofosforan potasuMerck1.04873.1000
Element Q-POD MerckMilliporeZMQSP0DE1
Millipak 40 Filtr złota gammaMerck MilliporeMPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 System oczyszczania wodyMerck MilliporeZRXQ003WW
Quantum TIXMerck MilliporeQTUMOTIX1
DL-DithiothreitolSigma43815-1G
Mastercycler gradientEppendorfZ316083
Probówka SafeSeal 1,5 mlSarstedt72.706.200
Probówka 15 mlSarstedt62.554.502
Kubek Multiply-Pro 0,2 ml PPSarstedt72.737.002
KONFIGURACJA MIKROSKOPII:
Zautomatyzowany mikroskop szerokokątnyLEICADMI6000
Obiektyw dalekiego zasięguLEICAHCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Suchy
638 nm liniowy ciągły laser diodowyOmicronPHOxX 638-40, 40mW
Podświetlana kamera EM-CCDAndoriXon DV897
Lustro dichroiczneAHF640nm odcięcie
Filtr pasmowo-przepustowyAHFET pasmowoprzepustowy 700/75
Polaryzator liniowyThorlabsLPVISC050-MP2
Rozdzielacz wiązki polaryzacyjnejThorlabsBS010
Soczewka achromatycznaThorlabsOgniskowa
Światłowód wielomodowyOptronisFVP600660710
SYSTEM ROBOTYCZNY: < / strong>
Nasz system robotyczny obejmuje stacje robocze Biomek NXP z 96-kanałową głowicą i pipetorami Span-8, połączone serwo-wahadłem, są używane do wszystkich etapów przenoszenia cieczy. Dodatkowo system wyposażony jest w wytrząsarki orbitalne oraz czytnik mikropłytek (Paradigm, Molecular device) obsługiwany przez chwytak Span-8Beckman CoulterBiomek NXP
SOFTWARE:
Język programowaniaNational InstrumentsLabview 9.0
Script dla oprogramowania HiP-FA dostępny pod adresemhttps://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA
200 mm

Bibliografia

  1. Berg, O. G., von Hippel, P. H. Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters. Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).
  2. Hammar, P., et al. Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation. Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation. Nature. 451, 535-540 (2008).
  5. Schroeder, M. D., et al. Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila. PLoS Biology. 2, 271(2004).
  6. He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression. PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).
  7. Wilson, M. D., et al. Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21. Science. 322, 434-438 (2008).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).
  9. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).
  10. Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).
  11. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, (2010).
  12. Berger, M. F., et al. Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities. Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).
  13. Nitta, K. R., et al. Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution. eLife. 4, (2015).
  14. Jolma, A., et al. DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  15. Noyes, M. B., et al. A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system. Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).
  16. Nutiu, R., et al. Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument. Nature Biotechnology. 29, (2011).
  17. Riley, T. R., et al. SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes. Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).
  18. Maerkl, S. J., Quake, S. R. A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors. Science. 315, 233-237 (2007).
  19. Isakova, A., et al. SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors. Nature Methods. 14, 316-322 (2017).
  20. Jung, C., et al. True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy. Nature Communications. 9, 1605(2018).
  21. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).
  22. Github. , Available from: https://github.com/Reutern/PySite (2018).
  23. Github. , Available from: https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA (2018).
  24. Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).
  25. St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-220 (1992).
  26. Pankratz, M., Jäckle, H. The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 467-516 (1993).
  27. Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions. Genetics. 191, (2012).
  28. Noureddine, M. A., et al. Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts. PLoS Genetics. 5, 1000462(2009).
  29. Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA. Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).
  30. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Anizotropia fluorescencjimatryca z elu agarozowegomikroskopia epifluorescencyjnapomiar sta ej dysocjacjimacierz wag pozycyjnychkrajobraz specyficzno ci wi zaniazautomatyzowany mikroskop fluorescencyjnypotok analizy danych
Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.