Mikronizacja mechaniczna lipoaspiratów w terapii regeneracyjnej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania frakcji naczyniowej zrębu z tkanki tłuszczowej poprzez szereg procesów mechanicznych, które obejmują emulgację i wielokrotne wirowanie.

Streszczenie

Frakcja naczyniowa zrębu (SVF) stała się narzędziem regeneracyjnym dla różnych chorób; jednak ustawodawstwo ściśle reguluje kliniczne zastosowanie produktów komórkowych z użyciem kolagenazy. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania wstrzykiwalnej mieszaniny komórek SVF i natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanki tłuszczowej w procesie czysto mechanicznym. Lipoaspiraty umieszcza się w wirówce i odwirowuje w temperaturze 1 200 x g przez 3 minuty. Środkowa warstwa jest zbierana i dzielona na dwie warstwy (tłuszcz o dużej gęstości na dole i tłuszcz o niskiej gęstości na górze). Górna warstwa jest bezpośrednio emulgowana przez przesuwanie między strzykawkami, z szybkością 20 ml / s przez 6 do 8 razy. Zemulgowany tłuszcz jest odwirowywany przy 2 000 x g przez 3 minuty, a lepka substancja pod warstwą oleju jest zbierana i definiowana jako macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)/żel SVF. Olej z wierzchniej warstwy jest zbierany. Około 5 ml oleju dodaje się do 15 ml tłuszczu o dużej gęstości i emulguje przez przesunięcie między strzykawkami, z szybkością 20 ml / s przez 6 do 8 razy. Zemulgowany tłuszcz jest odwirowywany przy 2.000 x g przez 3 minuty, a lepką substancją jest również żel ECM/SVF. Po przeszczepieniu żelu ECM/SVF nagim myszom, przeszczep jest pobierany i oceniany za pomocą badania histologicznego. Wynik pokazuje, że produkt ten ma potencjał do regeneracji do normalnej tkanki tłuszczowej. Ta procedura jest prostą, skuteczną procedurą dysocjacji mechanicznej w celu zagęszczenia komórek SVF osadzonych w ich naturalnym wspierającym ECM w celach regeneracyjnych.

Wprowadzenie

Terapie komórkami macierzystymi wprowadzają zmianę paradygmatu naprawy i regeneracji tkanek, dzięki czemu mogą oferować alternatywny schemat terapeutyczny dla różnych chorób¹. Komórki macierzyste (np. indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste i embrionalne komórki macierzyste) mają ogromny potencjał terapeutyczny, ale są ograniczone ze względu na regulację komórkową i względy etyczne. Mezenchymalne komórki zrębowe/macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) są łatwe do uzyskania z lipoaspiratów i nie podlegają tym samym ograniczeniom; W związku z tym stał się idealnym typem komórki dla praktycznej medycyny regeneracyjnej2. Ponadto są nieimmunogenne i mają obfite zasoby z autologicznego tłuszczu ³.

Obecnie, ASC są uzyskiwane głównie przez trawienie tkanki tłuszczowej za pośrednictwem kolagenazy. Frakcja naczyniowa zrębu (SVF) tkanki tłuszczowej zawiera ASC, śródbłonkową komórkę progenitorową, perycyty i komórki odpornościowe. Chociaż wykazano, że enzymatyczne uzyskiwanie dużej gęstości SVF/ASC ma korzystne działanie, ustawodawstwo w kilku krajach ściśle reguluje kliniczne zastosowanie produktów na bazie komórek przy użyciu kolagenazy⁴. Trawienie tkanki tłuszczowej kolagenazą przez 30 min do 1 h w celu uzyskania komórek SVF zwiększa ryzyko zarówno powstania materiału egzogennego w preparacie, jak i zanieczyszczenia biologicznego. Hodowla adherentna i oczyszczanie ASC, które trwa od dni do tygodni, wymaga specjalnego sprzętu laboratoryjnego. Ponadto w większości badań komórki SVF i ASC są używane w zawiesinie. Bez ochrony macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) lub innego nośnika, wolne komórki są wrażliwe, powodują słabą retencję komórek po wstrzyknięciu i pogarszają wynik terapeutyczny⁵. Wszystkie te powody ograniczają dalsze stosowanie terapii komórkami macierzystymi.

Aby uzyskać ASC z tkanki tłuszczowej bez trawienia za pośrednictwem kolagenazy, opracowano kilka procedur przetwarzania mechanicznego, w tym wirowanie, mechaniczne siekanie, szatkowanie, puree i mielenie^6,7,8,9. Uważa się, że metody te kondensują tkanki i ASC poprzez mechaniczne rozbijanie dojrzałych adipocytów i ich pęcherzyków zawierających olej. Co więcej, preparaty te, zawierające wysokie stężenia ASC, wykazały znaczny potencjał terapeutyczny jako medycyna regeneracyjna w modelach zwierzęcych^8,9,10.

W 2013 roku Tonnard et al. wprowadzili technikę szczepienia nanotłuszczami, która polega na wytwarzaniu emulgowanych lipoaspiratów poprzez przetwarzanie międzystrzykawkowe ¹¹. Siła ścinająca wytworzona przez przesunięcie między strzykawkami może selektywnie rozbijać dojrzałe adipocyty. Na podstawie ich ustaleń opracowaliśmy czysto mechaniczną metodę przetwarzania, która usuwa większość lipidów i płynów z lipoaaspiratów, pozostawiając tylko komórki SVF i frakcjonowany ECM, czyli ECM/SVF-gel¹². W tym artykule opisujemy szczegóły procesu mechanicznego przetwarzania tkanki tłuszczowej pochodzącej z człowieka w celu wytworzenia żelu ECM/SVF.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki w Szpitalu Nanfang w Kantonie, Chiny. Tkankę tłuszczową pobrano od zdrowych dawców, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Szpitalu Nanfang i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (Chiny).

1. Przygotowanie żelu ECM/SVF

1. Zbierz tłuszcz.
   1. Wykonaj liposukcję na człowieku za pomocą 3-miliportowej kaniuli wieloportowej, która zawiera kilka ostrych bocznych otworów o średnicy 1 mm, przy ciśnieniu ssania -0,75 atm.
   2. Zbierz 200 ml lipoaspiratów w sterylnej torbie.
2. Przygotuj tłuszcz Colemana.
   1. Przenieś lipoaspiraty do czterech probówek o pojemności 50 ml i pozwól zebranemu tłuszczowi stać nieruchomo przez 10 minut.
   2. Zbierz tłuszcz z górnej warstwy do dwóch probówek o pojemności 50 ml za pomocą pipety z szeroką końcówką do przeniesienia i wyrzuć płynną część z dolnej warstwy.
   3. Używając probówek o pojemności 50 ml, odwirować warstwę tłuszczu o sile 1 200 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 minuty.
   4. Zdefiniuj górną warstwę (około 80 ml) jako tłuszcz Colemana.
   5. Przenieś górne 2/3 tłuszczu Colemana do probówki o pojemności 20 ml za pomocą pipety z szeroką końcówką i zdefiniuj tę porcję jako tłuszcz o niskiej gęstości.
   6. Przenieś dolną 1/3 tłuszczu Colemana do innej probówki o pojemności 20 ml za pomocą pipety z szeroką końcówką i zdefiniuj tę porcję jako tłuszcz o dużej gęstości.
3. Wyprodukuj żel ECM/SVF z tłuszczu o niskiej gęstości.
   1. Za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 20 ml połączonych złączem Luer-Lock typu żeńskiego (o średnicy wewnętrznej 2,4 mm) należy wprowadzić 20 ml tłuszczu o niskiej gęstości.
   2. Utrzymuj stabilną prędkość zmiany biegów (na poziomie 20 ml/s) i powtórz od 6 do 8 razy.
   3. Odwirować mieszaninę przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
   4. Zbierz porcję oleju znajdującą się na górze w probówce o pojemności 10 ml za pomocą pipety z szeroką końcówką w temperaturze pokojowej do dalszego użycia.
   5. Zbierz lepką substancję w środkowej warstwie, którą jest żel ECM/SVF (Rysunek 1A), za pomocą pipety z szeroką końcówką i wyrzuć płyn z dolnej warstwy.
4. Wyprodukuj żel ECM/SVF z tłuszczu o dużej gęstości.
   1. Dodać 5 ml oleju (zebranego z kroku 1.3.4) do 15 ml tłuszczu o dużej gęstości.
   2. Mieszaj zmieszany tłuszcz między strzykawkami od 6 do 8 razy, aż do momentu, gdy w emulsji pojawi się kłaczek.
   3. Odwirować mieszaninę przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
   4. Wylej porcję oleju na wierzchu.
   5. Zebrać lepką substancję w środkowej warstwie (żel ECM/SVF) za pomocą pipety z szeroką końcówką i wyrzucić płyn z dolnej warstwy.
   6. Wymieszać żel ECM/SVF z kroków 1.3.5 i 1.4.5.

2. Model przeszczepu żelu ECM/SVF dla myszy nude

1. Znieczulenie nagich myszy (8 tygodni, samica) znieczuleniem wziewnym izofluranem (1% - 3%) w sali operacyjnej dla zwierząt.
2. Przenieść żel ECM/SVF do strzykawki o pojemności 1 ml.
3. Połączyć strzykawkę o pojemności 1 ml z kaniulą infiltracyjną.
4. Włóż kaniulę podskórnie do każdego boku myszy.
5. Wstrzyknąć 0,3 ml żelu ECM/SVF.

3. Pobieranie tkanek 3, 15 i 90 dni po wstrzyknięciu ECM/SVF-żelu

1. Znieczulenie myszy znieczuleniem wziewnym izofluranem (1% - 3%).
2. Poświęć myszy metodą zwichnięcia szyjki macicy.
3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej grzbietowej skóry myszy nożyczkami chirurgicznymi.
4. Wypreparuj i zbierz przeszczepy tłuszczu po obu stronach myszy. Osadź przeszczepy tłuszczu w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez noc.
5. Odwodnić tkankę w rosnących stężeniach etanolu: 70% etanolu, dwie przemiany po 1 godzinie; 80% etanolu, jedna zmiana, 1 godzina; 95% etanolu, jedna zmiana, 1 godzina; 100% etanolu, trzy przemiany po 1,5 h każda; ksylen, trzy przemiany, 1,5 h każda.
6. Naciekać tkankę woskiem parafinowym (58 - 60 °C), dwie przemiany po 2 godziny każda.
7. Osadź tkankę w blokach parafiny. Wytnij odcinki o grubości około 4 μm i umieść je na szkiełkach.

4. Barwienie hematoksyliną i eozyną

1. Odparafinować szkiełka parafinowe poprzez namoczenie ich w ksylenie I, II i III (po 10 minut).
2. Uwodnić skrawki tkanki, przepuszczając je przez malejące stężenia (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) kąpieli etanolowych przez 3 minuty każda.
3. Opłucz skrawki tkanki w wodzie destylowanej (5 min).
4. Wybarwić skrawki tkanek w hematoksylinie przez 5 minut.
5. Opłucz skrawki chusteczki pod bieżącą wodą z kranu przez 20 minut. Odbarwiaj w 1% kwaśnym alkoholu (1% HCl w 70% alkoholu) przez 5 s. Płucz pod bieżącą wodą z kranu, aż skrawki znów staną się niebieskie.
6. Dodaj dwie do trzech kropli barwnika Eozyna Y bezpośrednio na szkiełka za pomocą pipety i pozwól barwnikowi zastygnąć przez 10 minut.
7. Myj szkiełka w wodzie z kranu przez 1 - 5 minut.
8. Odwadniać szkiełka w rosnących stężeniach (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) etanolu przez 3 minuty każda.
9. Wyczyść szkiełka z ksylenu I i II na 5 minut każda.
10. Zamontuj prowadnice w mediach montażowych.

5. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Odparafinować skrawki tkanek w ksylenie I, II i III (po 5 minut).
2. Uwodnij skrawki tkanki, przepuszczając je przez kąpiele alkoholowe o różnych stężeniach (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) przez 3 minuty każda.
3. Inkubować skrawki w 3% roztworze_H2O2w metanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
4. Opłucz szkiełka 2x wodą destylowaną po 5 minut każda.
5. Upuść slajdy do kosza na slajdy. Dodać 300 ml 10 mM buforu cytrynianowego (pH 6,0) i inkubować szkiełka w temperaturze 95-100 °C przez 10 minut.
6. Schłodzić szkiełka w RT przez 20 minut.
7. Przepłukać szkiełka 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) po 5 minut.
8. Na szkiełka dodać 100 μl 10% płodowej surowicy bydlęcej i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
9. Inkubować skrawki z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego (świnka morska anty-mysia Perilipin, 1:400) w temperaturze 4 °C przez noc.
10. Przepłukać szkiełka za pomocą PBS 3x, po 5 minut każda.
11. Inkubować skrawki z drugorzędowym roztworem przeciwciał (anty-świnka morska kóz-488 IgG) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
12. Przepłukać szkiełka za pomocą PBS 3x, po 5 minut każda.
13. Wytrzyj wodę wokół sekcji czystą bibułą.
14. Wrzuć 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) i sprzężoną izolektynę Alexa Fluor 488 do okręgu, aby zakryć sekcję na szkiełku.
15. Zamontuj szkiełka nakrywkowe i pozostaw je do wyschnięcia w ciemności.
16. Obserwuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Wyniki

Po przetworzeniu tłuszczu metodą Colemana do postaci żelu ECM/SVF, objętość usuniętego oleju stanowi 80% objętości końcowej, a jedynie 20% tkanki tłuszczowej zachowanej pod warstwą oleju jest uznawane za żel ECM/SVF (Rycina 1A). Żel ECM/SVF ma gładką, przypominającą ciecz teksturę, która umożliwia jego podanie przez cienką igłę 27 G; natomiast tłuszcz metodą Colemana składa się z integralnej struktury tłuszczowej z dużymi włóknami i może być ...

Dyskusja

Terapia regeneracyjna oparta na komórkach macierzystych wykazała ogromne potencjalne korzyści w różnych chorobach. ASC są znakomitymi kandydatami terapeutycznymi, ponieważ są łatwe do uzyskania i mają zdolność do naprawy tkanek i regeneracji nowych tkanek¹⁵. Istnieją jednak ograniczenia w rozszerzaniu jego zastosowania klinicznego, ponieważ wymaga skomplikowanych procedur izolowania komórek i kolagenazy do przetwarzania⁶. Dlatego tak ważne jest opracowanie prostej techniki ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alexa Fluor 488-sprzężona izolektyna GS-IB4	Sondy molekularne	I21411
perylipina przeciw myszym świnkom morskim	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
pipeta z szeroką końcówką	Celltreat	229211B
Mikroskop konfokalny	Leica	TCS SP2
nago ładny	Southern Mdical University	/
mikroskop świetlny	Olympus	/
50 ml probówka	Cornig	430828
sterylna torba	Laishi	/
mikrotom	Leica	Wirówka CM1900
	Heraus